Summary
Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili.
Abstract
Man mano che la nostra comprensione della neurobiologia è progredita, le analisi molecolari vengono spesso eseguite su piccole aree cerebrali come la corteccia prefrontale mediale (mPFC) o il nucleo accumbens. La sfida di questo lavoro consiste nel sezionare l'area corretta preservando il microambiente da esaminare. In questo articolo viene descritto un metodo semplice e a basso costo utilizzando risorse prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Questo metodo mantiene l'acido nucleico e le proteine mantenendo il tessuto congelato durante tutto il processo. I cervelli sono tagliati in sezioni da 0,5 a 1,0 mm utilizzando una matrice cerebrale e disposti su una piastra di vetro congelato. I punti di riferimento all'interno di ogni sezione vengono confrontati con un riferimento, ad esempio l'atlante del cervello del mouse di Allen, e le regioni vengono sezionate usando un punzone a base di bisturi freddo o di biopsia. Il tessuto viene poi immagazzinato a -80 gradi centigradi fino all'uso. Attraverso questo processo ratto e topo mPFC, nucleo accumbens, ippocampo ventrale e altre regioni sono stati analizzati con successo utilizzando qRT-PCR e assaggi occidentali. Questo metodo è limitato alle regioni cerebrali che possono essere identificate da punti di riferimento chiari.
Introduction
Questo lavoro illustra la dissezione delle regioni cerebrali congelate per l'estrazione di acido nucleico o proteina di alta qualità utilizzando un riferimento, come l'Atlante del cervello del mouse Allen1, come guida. In questa tecnica, i cervelli sono congelati da flash e vengono conservati a -80 gradi centigradi per la sezionamento e la dissezione successivi, pur essendo mantenuti in condizioni congelate. Questo processo permette al ricercatore di raccogliere un gran numero di cervelli in una sessione e successivamente sezionarli per una raccolta accurata di più regioni del cervello.
La raccolta accurata di regioni di interesse cerebrali (ROI) è spesso necessaria quando si risponde a domande relative all'espressione genica e proteica. Mentre farmacologia, elettrofisiologia e optogenetica possono essere utilizzate su roditori selvatici o geneticamente modificati per aiutare a chiarire i cambiamenti molecolari alla base dei comportamenti osservati2,3,4, la misurazione dei cambiamenti indotti nei trascrittomi e nei proteomi è spesso utilizzata per sostenere questi risultati. Tecniche come la narrazione quantitativa inversa della polimerasi di trascrizione inversa (RT-qPCR), il gonfiore occidentale, RNAseq5, MAPSeq6 e HPLC7 sono robuste e relativamente basse in termini di costi, consentendo a molti laboratori di studiare cambiamenti molecolari indotti all'interno di piccole regioni cerebrali2,4,5,6.
Ci sono diversi modi per estrarre e purificare l'acido nucleico o la proteina dalle regioni cerebrali8,9,10,11,12. Molti laboratori raccolgono le regioni del cervello raffreddando e tagliando i cervelli sul ghiaccio al momento del raccolto9,13. Anche se questo approccio può portare ad acido nucleico e proteine di alta qualità, è un po 'limitato nel tempo in quanto la degradazione all'interno del microambiente del tessuto può avvenire a queste temperature. Ciò può essere particolarmente vero quando si tenta di sezionare un gran numero di animali o ROI in una sola seduta. Mantenere i campioni congelati aiuta a mantenere molecole bersaglio labili, fornendo al ricercatore il tempo per confrontare attentamente i punti di riferimento su entrambi i lati di ogni sezione nello sforzo di raccogliere campioni relativamente puri. La cattura laser è un altro modo per raccogliere tessuti per l'analisi dell'RNA o delle proteine dalle aree cerebrali10. Questa procedura è superiore alla dissezione meccanica in quanto i ROI molto piccoli e di forma irregolare possono essere identificati e isolati. Tuttavia, la cattura laser è limitata dall'uso di costose attrezzature e reagenti, richiede molto tempo e può anche essere più suscettibile alla degradazione del campione.
La dissezione di micropunch sui tessuti congelati non è nuova. I primi documenti di Miklos Palkovits e altri descrivono le tecniche di base nel dettaglio14,15. Questa presentazione segue in gran parte il lavoro originale, con alcuni miglioramenti per facilitare l'efficienza e ridurre i costi delle attrezzature necessarie. Per esempio, le sezioni cerebrali sono fatte in un blocco cerebrale congelato piuttosto che su un criostato. Questo produce sezioni più spesse che riduce il numero di sezioni necessarie per raccogliere campioni di ROI. Questo metodo seziona anche i campioni su una piastra di vetro congelato che si trova sul ghiaccio secco all'interno di una scatola isolata. Questo produce una fase di subcongelamento sul banco su cui lavorare. Le sezioni sezionate in questo modo sono facilmente manipolabili, consentendo al ricercatore di confrontare entrambi i lati di ogni sezione con un riferimento al fine di limitare la contaminazione da regioni al di fuori del ROI desiderato.
I vantaggi di questo protocollo sono che 1) il cervello è mantenuto in una condizione congelata durante tutto il processo, che aiuta a preservare le proteine e l'acido nucleico e dà al ricercatore il tempo di raccogliere con attenzione i ROI, e 2) i reagenti necessari sono poco costosi e si trovano nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. In questo processo, interi cervelli sono sezionato a 0,5–1,0 mm in una matrice cerebrale e collocati su una piastra di vetro congelato che viene continuamente raffreddata con ghiaccio secco. Punti di riferimento trovati nell'Atlante del cervello di Allen1 o in altri atlanti cerebrali16,17 vengono utilizzati per identificare le regioni di interesse, che vengono poi sezionati utilizzando un pugno a freddo o bisturi. Poiché il tessuto non viene mai scongelato, le regioni raccolte in questo modo forniscono RNA e proteine di alta qualità per le analisi a valle.
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Protocol
Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in modo etico e umano come stabilito dalle linee guida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Indiana University e National Institutes of Health (NIH).
NOTA: Tutti gli utensili e le superfici devono essere lavati con un solvente appropriato per rimuovere le nucleasi18 prima di iniziare qualsiasi lavoro.
1. Memorizzazione del cervello
- Rimuovere rapidamente i cervelli dai topi selvatici adulti monottana CD1 del peso di circa 30 g utilizzando un approccio convenzionale13 e flash-freeze per 60 secondi in azoto liquido o isopentane pre-raffreddati con ghiaccio secco.
- Conservare cervelli congelati a -80 gradi centigradi in un foglio di alluminio o in tubi conici fino all'uso.
2. Preparazione della matrice cerebrale
- Ventiquattro ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita (vedi Tabella dei materiali)su una pila di confezioni di congelatori scongelati. Sandwich i lati della matrice tra due confezioni congelatore assicurandosi di lasciare circa 0,5 cm tra la parte inferiore degli slot del rasoio e la parte superiore dei pacchetti di gel (Figura 1A). Posizionare un foglio di alluminio alle estremità per facilitare il raffreddamento.
NOTA: Quando si acquista una matrice del cervello, acquistare uno che è abbastanza grande per racchiudere l'intero volume del cervello da sezionare. - Posizionare la scatola contenente la matrice cerebrale e le confezioni del congelatore in un congelatore -20 gradi con il sojar superiore durante la notte.
3. Impostazione di una lastra di vetro congelata
NOTA: Lo scopo di questa configurazione è quello di preparare una superficie congelata su cui sezionare le sezioni cerebrali.
- Mettere il ghiaccio in una scatola isolata fino a circa 5 cm dall'alto. Posizionare quindi uno strato di ghiaccio secco di 2,5 cm sopra il ghiaccio e coprire con lastre di plastica nera per facilitare la visualizzazione del campione (Figura 1B, Figura 1C).
- Posizionare una lastra di vetro (dovrebbe solo adattarsi all'apertura della scatola) sulla parte superiore della plastica e posizionare il ghiaccio secco sulla parte superiore della piastra negli angoli lontani (Figura 1C).
- Prendi la matrice cerebrale congelata dal freezer e inserisci il cervello da tagliare la corteccia verso l'alto. Lasciare ed eseguire l'ancognimento alla temperatura nella scatola per 10 min.
- Regolare la posizione del cervello nella matrice con pinze fredde in modo che il seno sagittale e il seno trasversale si allineano con le scanalature perpendicolari del blocco (Figura 1D). Ciò contribuirà a garantire sezioni simmetriche per una più facile dissezione. Punte di tocco di pinze per asciugare il ghiaccio brevemente per raffreddare prima di regolare il cervello.
- Una volta che il cervello è in posizione, posizionare una lama fredda del rasoio vicino al suo centro e premere la lama di circa 1 mm nel tessuto. Aggiungere lame refrigerate alle estremità rostrale e caudale per aiutare a mantenere il cervello in posizione (Figura 2A e Figura 2B).
- Partendo dall'estremità rostrale, aggiungere le lame una alla volta, posizionandole negli slot e premendole delicatamente verso il basso nel tessuto di circa 1 mm (Figura 2B). Continuare ad aggiungere lame a intervalli di 1 mm lavorando verso l'estremità caudale.
- Assicurarsi che il cervello non si sposta durante questo periodo. Allineare le lame orizzontalmente e verticalmente (Figura 2B). Per tagliare le sezioni in larghezze di 0,5 mm, possono essere utilizzate lame a microtomi a basso profilo (vedere Tabella dei materiali). Posizionarli tra le lame del rasoio più grandi (Figura 2C).
- Una volta che le lame sono in posizione, premere verso il basso in cima al gruppo con le dita, palmo o qualche altra superficie piana (Figura 2C, Figura 2D). Rocciare il gruppo di lame lentamente da un lato all'altro per spostarli attraverso il tessuto.
NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere del tempo (1-2 min) e richiede pazienza. Ci dovrebbe essere resistenza alle lame che si muovono attraverso il tessuto. Facile ingresso significa che il cervello si sta scongelando e il blocco deve essere raffreddato con ghiaccio secco. - Quando tutte le lame hanno raggiunto il fondo degli slot, afferrare ogni lato del gruppo di lame e lavorare libero dalla matrice dondolando avanti e indietro.
NOTA: Prestare attenzione per evitare di tagliarsi sui bordi taglienti delle lame. - Una volta che il gruppo è libero, posizionare la pila, lato rostrale verso l'alto, sulla lastra di vetro (Figura 2E). Posizionare il ghiaccio secco accanto e/o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni per una separazione più facile.
- Posizionare la pila con bordi taglienti verso il basso sulla lastra di vetro e lame separate spostando la pila tra pollici e dita. Le lame devono separarsi l'una dall'altra con le sezioni attaccate.
- Allineare le sezioni sulla lastra di vetro da rostral a caudal (Figura 2F).
- Separare il tessuto dalle lame flettendo le lame tra le dita o separandolo con un secondo rasoio freddo (Figure 2G,2H,2I).
4. Sezioni di dissecting
- Apri l'Atlante del cervello del topo di Allen o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Alcuni punti di riferimento ovvi includono il commissure anteriore, il corpo calloso, i ventricoli laterali e l'ippocampo (Figura 3).
- Capovolgere la sezione da tagliare con pinze refrigerate e assicurarsi che la regione che sta per essere raccolta sia coerente in tutta la sezione. Durante la raccolta, consultare spesso l'atlante di riferimento per assicurarsi che si ottenga il ROI corretto.
NOTA: Una lente di ingrandimento o un microscopio di sezionato è spesso utile in questo processo. Una buona illuminazione è anche essenziale. Lampade a LED a basso wattaggio o una lampada fredda (vedi Tabella dei materiali) possono essere utilizzati a questo scopo. - Con un bisturi pulito o un punzone, tagliare nella sezione (Figura 4). Prechill ogni utensile prima di tagliare toccandolo brevemente per asciugare il ghiaccio. Spingere delicatamente la lama ma saldamente nel tessuto, dondolandola avanti e indietro per fare il taglio. Non spingere troppo forte o il tessuto si frattura.
NOTA: gli utensili si riscaldano nel tempo. Le lame leggermente riscaldate possono essere utili per fare tagli puliti e possono limitare la fratturazione, ma fai attenzione a evitare lo scongelamento dei tessuti. Raffreddare periodicamente gli utensili sul ghiaccio secco. - Una volta raccolto un ROI, metterlo in tubi etichettati da 1,5 mL presondati. Conservare i tessuti raccolti a -80 gradi centigradi fino a quando necessario.
- Elaborare il tessuto congelato raccolto in questo modo aggiungendo buffer RIPA freddo (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS e cocktail inibitori proteici (vedi Tabella dei materiali))per l'estrazione di proteine, o un solvente contenente guanidinium (vedi Tabella dei materiali ) per l'estrazione dell'RNA sul campione congelato e immediatamente omogeneizzare utilizzando un dounce di vetro o un omogenizzatore meccanico (vedi Tabella dei materiali). Table of Materials In questo modo, gli inibitori della proteasi e della nuclea sono in atto quando il campione si riscalda per proteggere le proteine e gli acidi nucleici dalla degradazione.
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Representative Results
Per convalidare questo metodo, la corteccia prefrontale mediale è stata raccolta da topi maschi di tipo selvatico CD1 adulti e l'RNA e la proteina sono stati estratti e caratterizzati. L'RNA è stato analizzato dall'elettroforesi capillare. L'RNA degradato mostra una perdita nell'intensità delle bande ribosomale 28S e 18S e mostra anche i prodotti di degradazione come uno striscio tra 25 e 200 nucleotidi (Figura 5A, campione 1). L'RNA di alta qualità mostra bande ribosomiche distinte con poco o nessun segnale nella regione a peso molecolare inferiore(Figura 5A, campione 2). In questa analisi vengono generati anche i numeri di integrità dell'RNA (RIN). I RIN sopra 7 indicano RNA di buona qualità19. L'RNA isolato dai campioni che utilizza il metodo di dissezione congelato mostra forti bande ribosomiche e alti valori di RIN confrontati molto favorevolmente con l'RNA preparato dal tessuto appena raccolto (Figura 5B).
Un vantaggio di questo metodo è che un gran numero di cervelli può essere rapidamente raccolto e conservato in una seduta per essere attentamente sezionato in un secondo momento. I ROI possono anche essere conservati senza che i tessuti vengano sconziati. Con questo metodo, un ricercatore può raccogliere una vasta e diversificata raccolta di ROI da cui si possono ottenere acido nucleico o proteina di alta qualità. Per confermare questo punto, l'RNA è stato estratto dal mPFC sezionato che era stato immagazzinato per diverse settimane (cervelli raccolti erano stati immagazzinati per diversi mesi). Tutti i campioni hanno prodotto RNA di alta qualità con bande ribosomiche distinte e RIN superiori a 8(Figura 5C).
L'analisi delle macchie occidentali è stata utilizzata per confermare l'integrità proteica dell'mPFC sezionato congelato come descritto in precedenza20. Le macchie occidentali mostrano un segnale ridotto di bersagli ad alto peso molecolare quando le proteine sono degradate. I prodotti di degradazione si presentano anche come uno striscio a pesi molecolari inferiori all'interno della colonna. Per questa analisi la proteina è stata raccolta, trasferita alla nitrocellulosa e sondata con anticorpi contro un bersaglio ad alto peso molecolare, KCC2, e la proteina di peso molecolare inferiore, actina (Figura 5D). In tutti i casi, le bande erano taglienti e distinte senza prodotti di ripartizione distinguibili sia per KCC2 che per actin. Questi esperimenti confermano che la dissezione dei ROI con questo metodo consente l'estrazione di RNA e proteine di alta qualità.
Figura 1: Preparazione delle superfici di lavoro congelate. (A) Un blocco cerebrale viene posto su una pila di confezioni di gel all'interno di una scatola isolata e viene quindi inserito tra due confezioni di gel aggiuntive. La lamina di alluminio è imballata ad ogni estremità del blocco per facilitare il raffreddamento durante la sezionamento. La scatola viene poi raffreddata durante la notte a -20 gradi centigradi. (B) Una lastra di vetro è abbinata per dimensioni con l'apertura di una scatola isolata. A tale scopo, è possibile utilizzare una cassetta di spedizione. Il ghiaccio viene aggiunto alla scatola fino a circa 5 cm dall'alto. La scatola viene poi congelata durante la notte a -20 gradi centigradi. (B, C) Poco prima di raccogliere il tessuto, uno strato uniforme di ghiaccio secco viene posto sopra il ghiaccio ad una profondità di circa 2,5 cm. Un foglio di plastica nera (per aiutare nella visualizzazione) viene posto sopra il ghiaccio secco seguito dalla piastra di vetro. Il ghiaccio secco è posto negli angoli più remoti, che raffredda l'aria appena sopra la piastra. Gli utensili possono essere raffreddati posandoli sul piatto, o toccandoli brevemente al ghiaccio secco. (D) Per garantire sezioni simmetriche, il cervello deve essere posizionato con pinze fredde in modo che il seno sagittale e il seno trasversale si allineano con le scanalature perpendicolari del blocco (frecce bianche). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cervello di sezionamento utilizzando un blocco cerebrale. (A) L'orientamento del cervello è ancorato da sedutre le tradizionali lame di rasoio monobordo nella corteccia ad una profondità di circa 1 mm. Il posizionamento uno nel mezzo e uno ad ogni estremità aiuta a mantenere il cervello in posizione. (B) Aggiungere le lame una alla volta fino a quando tutti gli slot sono riempiti. (C) Le lame a basso profilo possono essere inserite tra le lame convenzionali quando si desiderano sezioni da 0,5 mm (freccia rossa). (C, D) Il gruppo di lame viene spinto nel tessuto congelato con una pressione discendente moderata, utilizzando uno strumento piatto o il palmo o le dita della mano. Le lame possono essere lentamente cullate avanti e indietro per aiutarli a spostarli attraverso il tessuto. (E) Le sezioni vengono rimosse afferrando i lati delle lame del rasoio e utilizzando un movimento a dondolo e una pressione verso l'alto ferma (Attenzione: fare attenzione a evitare estremità taglienti delle lame). Sollevare il gruppo fuori dal blocco e posizionarlo sul lato anteriore sulla lastra di vetro congelato. Posizionare il ghiaccio secco adiacente alle lame per raffreddare completamente le sezioni prima di separarsi. (F) Separare le lame e disporre le sezioni in ordine. (G, H) Le sezioni possono essere rimosse dalle lame flettendo leggermente la lama con le dita in direzione delle frecce e spingendo la sezione fuori con una seconda lama fredda. (I) Alcune sezioni possono richiedere la rimozione riscaldando leggermente la lama del rasoio tra le dita e i pollici e quindi affettando rapidamente la sezione congelata con una seconda lama fredda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Determinazione dei ROI utilizzando punti di riferimento e l'atlante del cervello del mouse di Allen. In questo esempio, le sezioni cerebrali congelate sono a sinistra con le piastre corrispondenti dall'Atlante del cervello del mouse Allan a destra. I ROI (contorni punteggiati rossi) sono identificati confrontando i punti di riferimento visibili (forme nere) con l'Atlante del cervello del mouse di Allen. Punti di riferimento includono: fa e cc, corpus callosum, aco, commissur anteriore, VL, ventricolo laterale, V3, terzo venticolo. ROI di esempio: P/Il, corteccia prelimbica e fralimbica, ACB, nucleo accumbens, MA, corteccia motoria, CP, caudoputamen, HPF, giro ippocampo/dentato. Immagini dell'atlante coronale sul giusto credito: Allen Institute. Le immagini sono da piastre 40, 44, 55 e 71 (dall'alto verso il basso) e sono state ottenute da https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dissezione dei ROI. (A) Le sezioni vengono trattate utilizzando pinze che vengono raffreddate periodicamente sul ghiaccio secco. Entrambi i lati di ogni sezione devono essere confrontati con le immagini dell'atlante corrispondenti prima della dissezione. (B) i ROI vengono rimossi dalle sezioni cerebrali con bisturi freddo o (C)punzone di biopsia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi dell'RNA e delle proteine utilizzando il metodo di dissezione del cervello congelato. (A) Esempio di RNA povero e di buona qualità. La separazione elettroforetica del campione 1 mostra RNA degradato con deboli bande 28S e 18S e prodotti di degradazione tra 25 e 200 nucleotidi (nt). Il campione 2 mostra RNA di buona qualità con bande 28S e 18S forti e poco segnale a bassi pesi molecolari. I numeri di integrità dell'RNA riflettono questa differenza con il campione 1, RIN - 2,5 e il campione 2, RIN - 8,6. (B) Confronto tra l'RNA estratto dalla corteccia prefrontale mediale dei topi congelata e quella prefrontale appena dissecita. I campioni congelati sono stati conservati a -80 gradi centigradi per diversi mesi prima della dissezione. I campioni freschi sono stati lavorati subito dopo la raccolta. I valori di RIN da campioni raccolti con entrambi i metodi sono elevati, con forti bande 18S e 28S che indicano che l'acido nucleico è stato conservato. (C, D) mPFC è stato sezionato dal cervello congelato e l'RNA o la proteina è stata estratta. L'analisi dell'RNA (C) mostra che l'RNA di buona qualità è stato ottenuto per tutti i dodici campioni con riON elevati e poco prodotto di degradazione osservato. (D) L'analisi western delle macchie è stata effettuata sulla proteina totale ed è stata sondata per la presenza del canale ionico KCC2 ad alto peso molecolare (bande rosse, MW - 130 kDa). La banda KCC2 è chiaramente visibile senza osservare prodotti di scomposizione molecolare inferiori. Viene indicato anche il gene delle pulidi, Actin (bande verdi, MW 42 kDa). i campioni di mPFC provenienti da 12 cervelli sono etichettati 1-12. WB è l'acronimo di tutto il controllo del cervello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo lavoro descrive una tecnica per isolare piccole regioni specifiche del cervello limitando la degradazione dell'acido nucleico e delle proteine. Il danno ai tessuti cerebrali avviene rapidamente una volta che un organismo muore. Ciò è in parte dovuto a un rapido accumulo di glutammato extracellulare e alla conseguente eccitotossicità che si verifica21. L'RNA messaggero è particolarmente vulnerabile alla degradazione22,23. La ripartizione delle proteine e dell'acido nucleico è notevolmente ridotta a basse temperature, come evidenziato da un recente articolo che descrive l'attività biologica nelle cellule mammut congelate nel permafrost 28.000 anni fa24.
Con il metodo qui descritto, i cervelli sono congelati a scatto e gli strumenti e i tessuti vengono mantenuti sotto lo zero fino a quando non viene avviata l'estrazione di acido nucleico o proteine. I ROI congelati vengono quindi omogeneizzati nel buffer contenente inibitori di proteasi e nucleasi, proteggendo le molecole bersaglio dalla degradazione a temperature più elevate.
In questo processo, è importante identificare punti di riferimento chiari per individuare i ROI all'interno delle sezioni. I tratti in fibra del commissure anteriore e del corpo calloso funzionano bene per questo scopo, così come i ventricoli. Possono essere utilizzati anche cambiamenti nella forma dell'ippocampo quando ci si sposta da anteriore a posteriore. A seconda di quanto bene il cervello è allineato nella matrice, punti di riferimento possono essere inclinati, o mancanti. È necessario prestare attenzione prima di raccogliere i ROI da sezioni come questa, poiché le regioni contaminanti possono finire nel campione. Prima della raccolta, un ROI deve essere controllato su entrambi i lati della sezione per assicurarsi che sia coerente in tutta la sezione. La dissezione dei ROI è limitata ad aree ben definite del cervello che sono maggiori di circa 1 mm nella dimensione x-y.
Quando si sezionano i ROI, c'è la necessità di mantenere i tessuti congelati senza renderli troppo fragili. Tessuto troppo freddo si fratturerà quando la pressione viene applicata con un punzone o un bisturi. La regione di interesse è spesso difficile da identificare da altri frammenti quando ciò accade. Un modo per mitigare questo è quello di spostare brevemente le sezioni in una zona più calda della piastra (lontano dal ghiaccio secco). È anche importante mantenere pulita la lastra di vetro. Una volta che una sezione è stata elaborata, la piastra deve essere raschiata pulita con una lama di rasoio prima di passare alla successiva. Nel corso del tempo, l'acqua si condensa sulla piastra di dissezione dall'aria che può coprire o interferire in altro modo con il riconoscimento del campione. La pulizia della piastra viene eseguita raschiando il bordo tagliente di una lama di rasoio sulla superficie del vetro e asciugando il gelo e i detriti raccolti. I roI piccoli diventano indistinguibili da frammenti cerebrali indesiderati, quindi è molto importante mantenere un'area di lavoro pulita.
Molti laboratori utilizzano prodotti commerciali25 per proteggere l'RNA nei tessuti raccolti. Mentre le molecole labili sono ben conservate in questo modo, uno svantaggio è che la morfologia del tessuto è radicalmente cambiata. Di conseguenza, potrebbe essere difficile trovare le regioni di interesse utilizzando le mappe di riferimento. Dissezione ROI da cervelli snap-congelati prima di utilizzare questi prodotti può quindi essere un'opzione migliore.
Anche se ci siamo concentrati sulle fette coronali in questo lavoro, questo metodo dovrebbe funzionare bene per le sezioni horizonal e sagittale. Le mappe per questi orientamenti sono generalmente più basse nella risoluzione rispetto a quelle delle sezioni coronali. Tuttavia, questo sta cambiando rapidamente con le iniziative di gruppi come l'Allen Brain Institute. Un'altra considerazione è l'età dell'animale al raccolto. La morfologia dei giovani cervelli animali è molto diversa da quella dell'adulto e richiederà un atlante specializzato e una matrice cerebrale di dimensioni diverse. Risorse come developing Mouse Brain Atlas26 sono essenziali nella raccolta di campioni cerebrali accurati da topi più giovani.
Questo lavoro descrive un processo che può essere utilizzato per raccogliere piccole regioni dall'interno del cervello del roditore. La morfologia delle sezioni è ben conservata con affettare congelata, e come i tessuti sono tenuti congelati dal raccolto all'estrazione, la qualità dell'acido nucleico e proteine è alta. Questo processo ha il vantaggio rispetto alla dissezione del tessuto appena raccolto come cervelli campione da un grande gruppo di animali possono essere rapidamente raccolti e immagazzinati. Le regioni all'interno del cervello possono quindi essere identificate utilizzando punti di riferimento identificati in atlanti cerebrali comuni e raccolti ad un ritmo attento senza perdere molecole bersaglio. Questo metodo può essere una buona opzione per alcuni laboratori come gli strumenti e reggenti necessari sono poco costosi e prontamente disponibili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH, DA043982 e DA046196.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , Academic Press. (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , Academic Press. (1998).
- RNaseZap. Ambion. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
- Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
