Summary
Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein av høy kvalitet og RNA ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy.
Abstract
Etter hvert som vår forståelse av nevrobiologi har utviklet seg, utføres molekylære analyser ofte på små hjerneområder som medial prefrontal cortex (mPFC) eller nucleus accumbens. Utfordringen i dette arbeidet er å dissekere riktig område samtidig som mikromiljøet undersøkes. I denne artikkelen beskriver vi en enkel, rimelig metode ved hjelp av ressurser som er lett tilgjengelige i de fleste laboratorier. Denne metoden bevarer nukleinsyre og proteiner ved å holde vevet frosset gjennom hele prosessen. Hjernen er skåret i 0,5–1,0 mm seksjoner ved hjelp av en hjernematrise og ordnes på en frossen glassplate. Landemerker i hver del sammenlignes med en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas, og regioner dissekeres ved hjelp av en kald skalpell eller biopsipunch. Vev lagres deretter ved -80 °C til bruk. Gjennom denne prosessen rotte og mus mPFC, nucleus accumbens, dorsal og ventral hippocampus og andre regioner har blitt vellykket analysert ved hjelp av qRT-PCR og vestlige analyser. Denne metoden er begrenset til hjerneregioner som kan identifiseres av klare landemerker.
Introduction
Dette arbeidet illustrerer disseksjon av frosne hjerneregioner for utvinning av nukleinsyre eller protein av høy kvalitet ved hjelp av en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denne teknikken blir hjernen flash-frosset og lagret ved -80 °C for senere snitting og disseksjon mens de opprettholdes i frossen tilstand. Denne prosessen gjør det mulig for forskeren å høste et stort antall hjerner i en økt og senere dissekere dem for en nøyaktig samling av flere hjerneregioner.
Den nøyaktige samlingen av hjerneregioner av interesse (ROIer) er ofte nødvendig når du svarer på spørsmål knyttet til gen- og proteinuttrykk. Mens farmakologi, elektrofysiologi og optogenetikk kan brukes på villtype eller genmodifiserte gnagere for å bidra til å belyse molekylære endringer underbygge observert atferd2,3,4, målingen av induserte endringer i transkripsjoner og proteomer brukes ofte til å støtte disse funnene. Teknikker som kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR), western blotting, RNAseq5, MAPSeq6 og HPLC7 er robuste og relativt lave i pris, slik at mange laboratorier kan studere indusertmolekylære endringer i små hjerneregioner2,4,5,6.
Det er flere måter å trekke ut og rense nukleinsyre eller protein fra hjerneregioner8,9,10,11,12. Mange laboratorier høster hjerneregioner ved å kjøle og kutte hjerner på is på tidspunktet for innhøsting9,13. Selv om denne tilnærmingen kan resultere i kjernesyre og protein av høy kvalitet, er det noe tidsbegrenset som nedbrytning i mikromiljøet i vevet kan finne sted ved disse temperaturene. Dette kan være spesielt sant når du prøver å dissekere et stort antall dyr eller ROIer i en sittende. Holde prøver frosset bidrar til å opprettholde labile målmolekyler samtidig som forskeren tid til å nøye sammenligne landemerker på begge sider av hver seksjon i arbeidet med å samle relativt rene prøver. Laserfangst er en annen måte å samle vev for RNA eller proteinanalyse fra hjerneområder10. Denne prosedyren er bedre enn mekanisk disseksjon ved at svært små og uregelmessig formede ROIer kan identifiseres og isoleres. Laserfangst er imidlertid begrenset av bruk av dyrt utstyr og reagenser, er tidkrevende og kan også være mer utsatt for prøvenedbrytning.
Mikropunch disseksjon på frosne vev er ikke nytt. Tidlige papirer av Miklos Palkovits og andre beskriver de grunnleggende teknikkene i detalj14,15. Denne presentasjonen følger i stor grad det opprinnelige arbeidet, med noen forbedringer for å lette effektiviteten og redusere kostnadene for utstyret som trengs. For eksempel er hjerneseksjoner laget i en frossen hjerneblokk i stedet for på en kryostat. Dette gir tykkere seksjoner som reduserer antall seksjoner som trengs for å samle inn avkastningsprøver. Denne metoden dissekerer også prøver på en frossen glassplate som sitter på tørris i en isolert boks. Dette gir en sub-frysing scenen på benken som å jobbe. Seksjoner dissekert på denne måten er lett manipuleres, slik at forskeren kan sammenligne begge sider av hver seksjon med en referanse for å begrense forurensning fra regioner utenfor ønsket avkastning.
Fordelene med denne protokollen er at 1) hjernen holdes i en frossen tilstand gjennom hele prosessen, noe som bidrar til å bevare protein og nukleinsyre og gir forskeren tid til å nøye høste ROIer, og 2) reagensene som kreves er billig og finnes i de fleste molekylærbiologilaboratorier. I denne prosessen er hele hjernen delt til 0,5–1,0 mm i en hjernematrise og plassert på en frossen glassplate som kontinuerlig avkjøles med tørris. Landemerker funnet i Allen Brain Atlas1 eller andre hjerneatlas16,brukes 17 til å identifisere områder av interesse, som deretter dissekeres ved hjelp av enten et kaldt slag eller skalpell. Fordi vevet aldri tines, gir regioner høstet på denne måten høy kvalitet RNA og protein for nedstrøms analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr som brukes i denne studien ble behandlet på en etisk og human måte som fastsatt av Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og National Institutes of Health (NIH) retningslinjer.
MERK: Alle verktøy og overflater skal vaskes med et passende løsningsmiddel for å fjerne nukleone18 før du starter noe arbeid.
1. Lagring av hjerner
- Fjern raskt hjernen fra eutaniserte voksne CD1 wildtype mus som veier ca 30 g ved hjelp av en konvensjonell tilnærming13 og flash-fryse i 60 sekunder i enten flytende nitrogen eller isopentane pre-kjølt med tørr is.
- Oppbevar frosne hjerner ved -80 °C i aluminiumsfolie eller koniske rør til bruk.
2. Klargjøre hjernematrisen
- Tjuefire timer før dissekering vev, plassere en ren hjerne matrise (se Tabell over materialer) på en stabel med tint fryser pakker. Smør sidene av matrisen mellom to frysepakker og pass på å la ca. 0,5 cm mellom bunnen av barberhøvelsporene og toppen av gelpakningene (figur 1A). Plasser aluminiumsfolie på endene for å hjelpe til med kjøling.
MERK: Når du kjøper en hjernematrise, kjøp en som er stor nok til å omslutte hele volumet av hjernen som skal dissekeres. - Plasser esken som inneholder hjernematrisen og frysepakkene i en fryser på -20 °C med toppen på gløtt over natten.
3. Sette opp en frossen glassplate
MERK: Formålet med dette oppsettet er å lage en frossen overflate for å dissekere hjerneseksjoner.
- Legg is i en isolert boks opp til ca 5 cm fra toppen. Plasser deretter et 2,5 cm lag med tørris på toppen av isen og dekk med svart plastfolie for å hjelpe til med å visualisere prøven (Figur 1B, Figur 1C).
- Plasser en glassplate (skal bare passe i åpningen av boksen) på toppen av plasten og legg tørr is på toppen av platen i de fjerne hjørnene (Figur 1C).
- Ta den frosne hjernematrisen fra fryseren og sett inn hjernen for å bli kuttet cortex-side opp. La det likevektig til temperaturen i esken i 10 min. Hold lokket på esken i løpet av denne tiden.
- Juster hjernens posisjon i matrisen med kalde tang slik at den sagittal sinus og tverrgående sinus linje opp med vinkelrett spor av blokken (Figur 1D). Dette vil bidra til å sikre symmetriske seksjoner for enklere disseksjon. Trykk på spisser av tang for å tørke isen kort for å kjøle seg ned før du justerer hjernen.
- Når hjernen er på plass, plasser et kjølt barberblad nær midten og trykk bladet ca 1 mm inn i vevet. Tilsett kjølte blader til rosenkrantral- og haleender for å holde hjernen på plass (Figur 2A og figur 2B).
- Start på rosenkrantralenden, legg til kniver en om gangen, plasser dem i sporene og trykk dem forsiktig ned i vevet ca. 1 mm (Figur 2B). Fortsett å legge til kniver med 1 mm intervaller som arbeider mot den caudale enden.
- Pass på at hjernen ikke skifter i løpet av denne tiden. Linje opp bladene horisontalt og vertikalt (Figur 2B). For å kutte seksjoner i 0,5 mm bredder, kan mikrotomeblader med lav profil (se materialtabellen)brukes. Plasser disse mellom de større barberbladene (Figur 2C).
- Når bladene er på plass, trykker du ned på toppen av gruppen med fingre, håndflate eller en annen flat overflate (Figur 2C, Figur 2D). Rock gruppen av blader sakte fra side til side for å flytte dem gjennom vevet.
MERK: Dette kan ta litt tid (1–2 min) og krever tålmodighet. Det bør være motstand mot bladene som beveger seg gjennom vevet. Enkel inngang betyr at hjernen tiner og blokken skal avkjøles med tørris. - Når alle bladene har nådd bunnen av sporene, ta tak i hver side av gruppen av blader og arbeid fri for matrisen ved å gynge frem og tilbake.
MERK: Vær forsiktig for å unngå å skjære seg selv på de skarpe kantene på knivene. - Når gruppen er fri, plasser stabelen, rostral side opp, på glassplaten (Figur 2E). Plasser tørris ved siden av og/eller på toppen av stabelen for å fryse prøvene ytterligere for enklere separasjon.
- Plasser bunken med skarpe kanter ned på glassplaten og separate blader ved å skifte stabelen mellom tommel og fingre. Bladene skal skilles fra hverandre med seksjoner festet.
- Linje opp seksjoner på glassplaten fra rostral til caudal (Figur 2F).
- Separat vev fra bladene ved å bøye bladene mellom fingrene, eller ved å skille med en annen kald barberhøvel (Figur 2G,2H,2I).
4. Dissekere seksjoner
- Åpne Allen Mouse Brain Atlas eller en annen referanse og finn landemerker som er nødvendige for å identifisere områder av interesse. Noen åpenbare landemerker inkluderer den anterior kommissure, corpus callosum, laterale ventrikler, og hippocampus (Figur 3).
- Vend delen som skal kuttes med kjølte tang og sørg for at regionen som skal samles inn, er konsistent gjennom hele delen. Under høsting, se referanseatlaset ofte for å sikre at riktig avkastning oppnås.
MERK: Et forstørrelsesglass eller dissekeringmikroskop er ofte nyttig i denne prosessen. God belysning er også viktig. Lav wattstyrke LED-lamper eller en kul lampe (se Table of Materials) kan brukes til dette formålet. - Med en ren skalpell eller slag, skåret inn i avsnittet (Figur 4). Forkjøl hvert verktøy før du kutter ved å berøre det kort for å tørke is. Skyv bladet forsiktig, men godt inn i vevet, gynge det frem og tilbake for å gjøre kuttet. Ikke trykk for hardt eller vevet vil sprekke.
MERK: Verktøyene varmes opp over tid. Litt oppvarmede blader kan være nyttig i å gjøre rene kutt og kan begrense fracturing, men vær forsiktig med å unngå tining av vev. Avkjøl verktøy med jevne mellomrom på tørris. - Når en avkastning er høstet, plasser den i merkede, forhåndskjølte 1,5 ml rør. Oppbevar slaktevev ved -80 °C til det er nødvendig.
- Behandle frosset vev samlet på denne måten ved å legge til kald RIPA buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS og proteinhemmer cocktail (se Materialtabellen)) for proteinekstraksjon, eller et guanidiniumholdig løsningsmiddel (se materialtabellen) for RNA-ekstraksjon til den frosne prøven og umiddelbart homogenisere ved hjelp av enten et glassdounce eller mekanisk homogenisator (se materialtabellen). På denne måten er protease- og nukleoskehemmere på plass når prøven varmer for å beskytte protein- og nukleinsyrer mot nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere denne metoden ble den mediale prefrontale cortex samlet inn fra voksne CD1 wildtype hannmus og RNA og protein ble ekstrahert og karakterisert. RNA ble analysert av kapillær elektroforese. Degradert RNA viser et tap i intensiteten av 28S og 18S ribosomal band og viser også nedbrytningsprodukter som et smør mellom 25 og 200 nukleotider (Figur 5A, eksempel 1). Rna av høy kvalitet viser distinkte ribosomale bånd med lite eller ingen signal i den lavere molekylvektregionen (Figur 5A, prøve 2). RNA integritettall (RIN) genereres også i denne analysen. RIN over 7 indikerer god kvalitet RNA19. RNA isolert fra prøver ved hjelp av den frosne disseksjonsmetoden viser sterk ribosomal banding og høye RIN-verdier som sammenligner svært gunstig med RNA tilberedt av nyhøstet vev (Figur 5B).
En fordel med denne metoden er at et stort antall hjerner raskt kan høstes og lagres i en sittende for å bli nøye dissekert på et senere tidspunkt. ROIer kan også lagres uten at vevet blir tint. Med denne metoden kan en forsker samle en stor og variert samling av ROIer hvorhøykvalitet nukleinsyre eller protein kan oppnås. For å bekrefte dette punktet ble RNA hentet fra den dissekerte mPFC som hadde blitt lagret over flere uker (høstet hjerner hadde blitt lagret i flere måneder). Alle prøver produsert høy kvalitet RNA med distinkt ribosomal banding og RIN er over 8 (Figur 5C).
Western blot analyse ble brukt til å bekrefte protein integritet av frosne dissekert mPFC som tidligere beskrevet20. Vestlige blots viser redusert signal av høy molekylvekt mål når protein er degradert. Nedbrytningsproduktene vises også som et smør ved lavere molekylvekter i kolonnen. For denne analysen protein ble samlet, overført til nitrocellulose, og probed med antistoffer mot en høy molekylvekt mål, KCC2, og lavere molekylvekt protein, actin (Figur 5D). I alle tilfeller var båndene skarpe og distinkte uten merkbare sammenbruddsprodukter for verken KCC2 eller actin. Disse eksperimentene bekrefter at disseksjon av ROIer ved hjelp av denne metoden gjør det mulig å ekstraksjon av høykvalitet RNA og protein.
Figur 1: Klargjøre frosne arbeidsflater. (A) En hjerneblokk er plassert på en stabel med gelpakker i en isolert boks og blir deretter klemt mellom to ekstra gelpakker. Aluminiumsfolie er pakket i hver ende av blokken for å lette kjøling under snitting. Boksen avkjøles deretter over natten ved -20 °C. (B) En glassplate er matchet for størrelse med åpningen av en isolert boks. En forsendelsesboks kan brukes til dette formålet. Is legges til boksen til den er ca. 5 cm fra toppen. Boksen fryses deretter over natten ved -20 °C. - Jeg har ikke noe åsi. Like før du samler vev, plasseres et jevnt lag med tørris på toppen av isen på ca. 2,5 cm. Et ark med svart plast (for å hjelpe til med visualisering) plasseres over tørrisen etterfulgt av glassplaten. Tørris er plassert i de fjerne hjørnene, som kjøler luften like over platen. Verktøy kan avkjøles ved å legge dem på tallerkenen, eller ved å kort berøre dem til tørrisen. (D) For å sikre symmetriske seksjoner, bør hjernen plasseres med kalde tang slik at sagittal sinus og tverrgående sinus linje opp med vinkelrett spor av blokken (hvite piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Snitting hjernen ved hjelp av en hjerneblokk. (A) Retningen på hjernen er forankret ved å sette konvensjonelle enkeltkantbarberblad inn i cortex på en dybde på ca 1 mm. Plassere en i midten og en i hver ende bidrar til å holde hjernen i posisjon. (B) Legg til kniver en om gangen til alle sporene er fylt. (C) Lavprofilblader kan settes inn mellom konvensjonelle blader når 0,5 mm seksjoner er ønsket (rød pil). - Jeg harikke noeå si. Gruppen av blader skyves inn i det frosne vevet med moderat nedadgående trykk, ved hjelp av enten et flatt instrument eller håndflaten eller fingrene på hånden. Kniver kan sakte gynges frem og tilbake for å bevege dem gjennom vevet. (E) Seksjoner fjernes ved å gripe sidene av barberbladene og bruke en gyngebevegelse og fast oppadgående trykk (Forsiktig: Vær forsiktig så du unngår skarpe ender av bladene). Løft gruppen ut av blokken og plasser den fremre på den frosne glassplaten. Plasser tørris ved siden av bladene for å kjøle delene helt før du skiller. (F) Separat kniver og legg ut seksjoner i rekkefølge. - Jeg harikke noeå si. Seksjoner kan fjernes fra bladene ved å bøye bladet litt med fingrene i pilens retning og skyve delen av med et annet kaldt blad. (I) Noen seksjoner kan kreve fjerning ved å varme barberbladet litt mellom fingrene og tomlene og deretter raskt kutte av den frosne delen med et annet kaldt blad. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemme ROIer ved hjelp av landemerker og Allen Mouse Brain Atlas. I dette eksemplet er frosne hjerneseksjoner til venstre med tilsvarende plater fra Allan Mouse Brain Atlas til høyre. ROIer (røde stiplede konturer) identifiseres ved å sammenligne synlige landemerker (svarte former) med Allen Mouse Brain Atlas. Landemerker inkluderer: fa og cc, corpus callosum, aco, anterior commissur, VL, lateral ventricle, V3, tredje ventikkel. Eksempel ROIer: Pl/Il, prelimbic og infralimbic cortex, ACB, nucleus accumbens, MOs, motor cortex, CP, caudoputamen, HPF, hippocampus/dentate gyrus. Coronal atlas bilder på riktig kreditt: Allen Institute. Bilder er fra plater 40, 44, 55 og 71 (topp til bunn) og ble hentet fra https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dissekere ROIer. (A) Seksjoner håndteres ved hjelp av tang som avkjøles med jevne mellomrom på tørris. Begge sider av hver seksjon bør sammenlignes med de tilsvarende atlasbildene før disseksjon. (B) ROIer fjernes fra hjerneseksjoner med kald skalpell eller (C) biopsi punch. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av RNA og protein ved hjelp av frossen hjernedisseksjonsmetode. (A) Eksempel på dårlig versus god kvalitet RNA. Elektroforetisk separasjon av prøve 1 viser forringet RNA med svake 28S- og 18S-bånd og nedbrytningsprodukter mellom 25 og 200 nukleotider (nt). Eksempel 2 viser god kvalitet RNA med sterke 28S og 18S band og lite signal ved lave molekylvekter. RNA integritettall gjenspeiler denne forskjellen med prøve 1, RIN = 2,5 og eksempel 2, RIN = 8,6. (B) Sammenligning av RNA ekstrahert fra frosset versus nydisseket medial prefrontal cortex av mus. Frosne prøver ble oppbevart ved -80 °C i flere måneder før disseksjon. Ferske prøver ble behandlet umiddelbart etter innhøsting. RIN-verdier fra prøver samlet inn ved hjelp av begge metodene er høye, med sterke 18S- og 28S-bånd som indikerer at nukleinsyre er bevart. (C, D) mPFC ble dissekert fra frosne hjerner og RNA eller protein ble ekstrahert. (C) RNA-analyse viser at rna av god kvalitet ble oppnådd for alle de tolv prøvene med høyt RIN-er og lite nedbrytningsprodukt observert. (D) Western blot analyse ble gjort på totalt protein og ble undersøkt for tilstedeværelse av høy molekylvekt KCC2 ion kanal (røde bånd, MW = 130 kDa). KCC2-båndet er tydelig synlig uten lavere molekylvektnedbrytningsprodukter observert. Rengjøringsgenet Actin (grønne bånd, MW = 42 kDa) vises også. mPFC prøver fra 12 hjerner er merket 1-12. WB står for hele hjernekontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver en teknikk for å isolere små, spesifikke områder av hjernen samtidig som de begrenser nedbrytning av nukleinsyre og protein. Skade på hjernevev skjer raskt når en organisme dør. Dette skyldes delvis en rask oppbygging av ekstracellulær glutamat og den resulterende eksitotoksisiteten som oppstår21. Messenger RNA er spesielt utsatt for nedbrytning22,23. Nedbrytning av protein og nukleinsyre reduseres sterkt ved lave temperaturer, noe som gjenspeiles av en nylig artikkel som beskriver biologisk aktivitet i mammutceller frosset i permafrost for 28 000 år siden24.
Med metoden som er beskrevet her, blir hjernen snap frosset og verktøy og vev holdes under frysepunktet til nukleinsyre eller proteinutvinning er startet. Frosne ROIer homogeniseres deretter i buffer som inneholder protease- og nukleoskehemmere, og beskytter målmolekyler mot nedbrytning ved høyere temperaturer.
I denne prosessen er det viktig å identifisere klare landemerker for å finne ROIer i seksjonene. Fiberkanaler av den anterior commissure og corpus callosum fungerer godt for dette formålet, som gjør ventriklene. Endringer i formen på hippocampus som man beveger fremre til bakre kan også brukes. Avhengig av hvor godt hjernen er justert i matrisen, kan landemerkene være skjevt eller mangler. Forsiktighet bør utvises før du samler inn ROIer fra deler som dette, da forurensende områder kan ende opp i prøven. Før innsamling bør en avkastning kontrolleres på begge sider av delen for å sikre at den er konsekvent gjennom hele delen. Disseksjon av ROIer er begrenset til veldefinerte områder av hjernen som er større enn ca. 1 mm i x-y-dimensjonen.
Når du dissekerer ROIer, er det behov for å holde vev frosset uten å gjøre dem for sprø. Vev som er for kaldt vil brukket når trykket påføres med et slag eller skalpell. Interesseregionen er ofte vanskelig å identifisere fra andre fragmenter når dette skjer. En måte å redusere dette på er å flytte seksjonene kort til et varmere område av platen (vekk fra tørris). Det er også viktig å holde glassplaten ren. Når en seksjon er behandlet, bør platen skrapes ren med et barberblad før den går videre til neste. Over tid vil vann kondensere på disseksjonsplaten fra luften som kan dekke eller på annen måte forstyrre prøvegjenkjenningen. Rengjøring av platen gjøres ved å skrape den skarpe kanten av et barberblad over overflaten av glasset og tørke opp den oppsamlede frosten og rusk. Små ROIer blir umulig å skille fra uønskede hjernefragmenter, så det er svært viktig å opprettholde et rent arbeidsområde.
Mange laboratorier bruker kommersielle produkter25 for å beskytte RNA i høstet vev. Mens labilemolekyler er godt bevart på denne måten, er en ulempe at vevsmorfologien radikalt endres. Som et resultat kan det være vanskelig å finne regionene av interesse ved hjelp av referansekart. Dissekering av ROIer fra snap-frosne hjerner før du bruker disse produktene kan derfor være et bedre alternativ.
Selv om vi har fokusert på koronale skiver i dette arbeidet, bør denne metoden fungere godt for horisontale og sagittal seksjoner. Kart for disse orienteringene er generelt lavere i oppløsning sammenlignet med de for koronale seksjoner. Dette endrer seg imidlertid raskt med initiativer fra grupper som Allen Brain Institute. En annen vurdering er dyrets alder ved innhøsting. Morfologien til unge dyrehjerner er svært forskjellig fra den voksnes og vil kreve et spesialisert atlas og en annen størrelse hjernematrise. Ressurser som Developing Mouse Brain Atlas26 er avgjørende for å samle inn nøyaktige hjerneprøver fra yngre mus.
Dette arbeidet beskriver en prosess som kan brukes til å høste små regioner fra gnagerhjernen. Morfologien av seksjoner er godt bevart med frossen kutting, og ettersom vevet holdes frosset fra høst til ekstraksjon, er kvaliteten på nukleinsyre og protein høy. Denne prosessen har fordelen over disseksjon av nyinnsamlet vev som prøve hjerner fra en stor gruppe dyr kan raskt samles inn og lagres. Regioner i hjernen kan deretter identifiseres ved hjelp av landemerker identifisert i vanlige hjerneatlas og samles i et forsiktig tempo uten å miste målmolekyler. Denne metoden kan være et godt alternativ for noen laboratorier som verktøy og regenter som trengs er billig og lett tilgjengelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH, DA043982 og DA046196.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Mouse coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 505C | Cutting block |
| 0.5 mm Rat coronal brain matrice | Braintree Scientific | BS-SS 705C | Cutting block |
| 1.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-01 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Dot Scientific | 229443 | For storing frozen ROIs |
| 1.5 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-02 | |
| 2.0 mm Biopsy Punch with plunger | Electron Microscopy Sciences | 69031-03 | |
| 4-12% NuPage gel | Invitrogen | NPO323BOX | protein gradient gel |
| Bioanalyzer System | Agilent | 2100 | RNA analysis system |
| Dounce tissue grinder | Millipore Sigma | D8938 |
Glass tissue homogenizer |
| Dry Ice | |||
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner Industries Inc. | Model 180 | Cool lamp |
| Glass plates | LabRepCo | 11074010 | |
| HALT | ThermoFisher | 78440 | protease inhibitor cocktail |
| Low profile blades | Sakura Finetek USA Inc. | 4689 | |
| mouse anti-actin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | JLA20 | Antibody |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Used in initial RNA purity analysis |
| No. 15 surgical blade | Surgical Design Inc | 17467673 | |
| Odyssey Blocking buffer | LiCor Biosciences | 927-40000 | Western blocking reagent |
| Omni Tissue Master 125 | VWR | 10046-866 | Tissue homogenizer |
| rabbit anti-KCC2 antibody | Cell Signaling Technology | 94725S | Antibody |
| RNA Plus Micro Kit | Qiagen | 73034 | Used to extract RNA from small tissue samples |
| RNaseZap | Life Technologies | AM9780 | |
| Scalpel handle | Excelta Corp. | 16050103 | |
| Standard razor blades | American Line | 66-0362 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | Used to extract RNA from tissue |
References
- Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
- Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. , 054312 (2016).
- Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
- Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
- Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).
- Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
- Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
- Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , Academic Press. (2001).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , Academic Press. (1998).
- RNaseZap. Ambion. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
- Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
- Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. , (2019).
- Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).
- Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).
- Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).
- Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
- Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
