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Neuroscience

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Abstract

À medida que nossa compreensão da neurobiologia progrediu, análises moleculares são frequentemente realizadas em pequenas áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal medial (mPFC) ou núcleo accumbens. O desafio neste trabalho é dissecar a área correta, preservando o microambiente a ser examinado. Neste artigo, descrevemos um método simples e de baixo custo usando recursos prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Este método preserva o ácido nucleico e as proteínas mantendo o tecido congelado durante todo o processo. Os cérebros são cortados em seções de 0,5 a 1,0 mm usando uma matriz cerebral e dispostos em uma placa de vidro congelada. Marcos dentro de cada seção são comparados a uma referência, como o Atlas do Cérebro do Rato Allen, e as regiões são dissecadas usando um bisturi frio ou um soco de biópsia. O tecido é então armazenado a -80 °C até o uso. Através desse processo, o mPFC de ratos e ratos, núcleo accumbens, hipocampo dorsal e ventral e outras regiões foram analisados com sucesso utilizando ensaios qRT-PCR e ocidentais. Este método está limitado a regiões cerebrais que podem ser identificadas por marcos claros.

Introduction

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Este trabalho ilustra a dissecção de regiões cerebrais congeladas para extração de ácido nucleico ou proteína de alta qualidade usando uma referência, como o Allen Mouse Brain Atlas1, como guia. Nesta técnica, os cérebros são congelados e armazenados a -80 °C para secção posterior e dissecção enquanto são mantidos em uma condição congelada. Esse processo permite ao pesquisador colher um grande número de cérebros em uma sessão e depois dissecá-los para uma coleta precisa de múltiplas regiões cerebrais.

A coleta precisa de regiões cerebrais de interesse (ROIs) é frequentemente necessária ao responder perguntas relacionadas à expressão genética e proteica. Enquanto a farmacologia, a eletrofisiologia e a optogenética podem ser usadas em roedores selvagens ou geneticamente modificados para ajudar a elucidar mudanças moleculares que sustentam comportamentos observados2,3,4, a medição de alterações induzidas em transcriptomas e proteomas é frequentemente usada para apoiar esses achados. Técnicas como a reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), a mancha ocidental, RNAseq5,MAPSeq6 e HPLC7 são robustas e relativamente baixas de custo, permitindo que muitos laboratórios estudem alterações moleculares induzidas em pequenas regiões cerebrais22,4,5,6.

Existem várias maneiras de extrair e purificar o ácido nucleico ou proteína das regiões cerebrais8,,9,,10,,11,12. Muitos laboratórios colhem regiões cerebrais resfriando e cortando cérebros no gelo no momento da colheita9,13. Embora essa abordagem possa resultar em ácido nucleico e proteína de alta qualidade, é um pouco limitada, pois a degradação dentro do microambiente do tecido pode ocorrer a essas temperaturas. Isso pode ser particularmente verdadeiro ao tentar dissecar um grande número de animais ou ROIs em uma sessão. Manter amostras congeladas ajuda a manter moléculas alvo labile, ao mesmo tempo em que fornece ao pesquisador tempo para comparar cuidadosamente marcos em ambos os lados de cada seção no esforço de coletar amostras relativamente puras. A captura a laser é outra forma de coletar tecido para RNA ou análise de proteínas de áreas cerebrais10. Este procedimento é superior à dissecção mecânica em que os ROIs muito pequenos e de forma irregular podem ser identificados e isolados. No entanto, a captura a laser é limitada pelo uso de equipamentos caros e reagentes, é demorada e também pode ser mais suscetível à degradação da amostra.

A dissecção de microperfuração em tecidos congelados não é nova. Os primeiros trabalhos de Miklos Palkovits e outros descrevem as técnicas básicas em detalhes14,15. Esta apresentação segue em grande parte o trabalho original, com algumas melhorias para facilitar a eficiência e diminuir o gasto com os equipamentos necessários. Por exemplo, seções cerebrais são feitas em um bloco cerebral congelado em vez de em um criostato. Isso produz seções mais grossas, o que reduz o número de seções necessárias para coletar amostras de ROI. Este método também disseca amostras em uma placa de vidro congelada que se senta em gelo seco dentro de uma caixa isolada. Isso produz uma fase de subcongelamento no banco em que trabalhar. As seções dissecadas dessa forma são facilmente manipuladas, permitindo ao pesquisador comparar ambos os lados de cada seção com uma referência, a fim de limitar a contaminação de regiões fora do ROI desejado.

As vantagens deste protocolo são que 1) o cérebro é mantido em uma condição congelada durante todo o processo, o que ajuda a preservar proteína e ácido nucleico e dá ao pesquisador tempo para colher cuidadosamente os ROIs, e 2) os reagentes necessários são baratos e são encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Nesse processo, cérebros inteiros são seccionados em 0,5-1,0 mm em uma matriz cerebral e colocados em uma placa de vidro congelada que é continuamente resfriada com gelo seco. Marcos encontrados no Atlas do Cérebro Allen1 ou em outros atlas cerebrais16,17 são usados para identificar regiões de interesse, que são então dissecadas usando um soco frio ou bisturi. Como o tecido nunca é descongelado, as regiões colhidas dessa forma fornecem RNA de alta qualidade e proteína para análises a jusante.

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Protocol

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Os animais utilizados neste estudo foram tratados de forma ética e humana, conforme estabelecido pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e institutos nacionais de saúde (NIH).

NOTA: Todas as ferramentas e superfícies devem ser lavadas com um solvente apropriado para remover as nucleases18 antes de iniciar qualquer trabalho.

1. Armazenar cérebros

  1. Remova rapidamente os cérebros de camundongos adultos do tipo CD1 adultos que pesam aproximadamente 30 g usando uma abordagem convencional13 e congele por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentano pré-refrigerado com gelo seco.
  2. Armazene cérebros congelados a -80 °C em papel alumínio ou tubos cônicos até o uso.

2. Preparando a matriz cerebral

  1. Vinte e quatro horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa (ver Tabela de Materiais) em uma pilha de embalagens de congelador descongelados. Sanduiche as laterais da matriz entre duas embalagens de congelador certificando-se de deixar aproximadamente 0,5 cm entre a parte inferior das ranhuras de barbear e a parte superior das embalagens de gel(Figura 1A). Coloque papel alumínio nas extremidades para ajudar no resfriamento.
    NOTA: Ao comprar uma matriz cerebral, compre uma que seja grande o suficiente para envolver todo o volume do cérebro a ser dissecado.
  2. Coloque a caixa contendo a matriz cerebral e as embalagens do congelador em um congelador de -20 °C com a parte superior entreaberta durante a noite.

3. Configuração de uma placa de vidro congelada

NOTA: O objetivo desta configuração é preparar uma superfície congelada para dissecar seções cerebrais.

  1. Coloque gelo em uma caixa isolada até aproximadamente 5 cm da parte superior. Em seguida, coloque uma camada de gelo seco de 2,5 cm sobre cima do gelo e cubra com folhas de plástico preto para ajudar na visualização da amostra(Figura 1B, Figura 1C).
  2. Coloque uma placa de vidro (deve caber apenas na abertura da caixa) em cima do plástico e coloque gelo seco em cima da placa nos cantos mais distantes(Figura 1C).
  3. Pegue a matriz cerebral congelada do congelador e insira o cérebro para ser cortado lado a lado do córtex para cima. Deixe-o equilibrar-se à temperatura na caixa por 10 min. Mantenha a tampa na caixa durante este tempo.
  4. Ajuste a posição do cérebro na matriz com fórceps frios para que o seio sagital e o seio transversal se alinhem com as ranhuras perpendiculares do bloco(Figura 1D). Isso ajudará a garantir seções simétricas para uma dissecção mais fácil. Toque nas pontas dos fórceps para secar o gelo brevemente para esfriar antes de ajustar o cérebro.
  5. Uma vez que o cérebro esteja em posição, coloque uma lâmina de barbear resfriada perto de seu centro e pressione a lâmina aproximadamente 1 mm no tecido. Adicione lâminas refrigeradas nas extremidades rostral e caudal para ajudar a manter o cérebro no lugar (Figura 2A e Figura 2B).
  6. Começando na extremidade rostral, adicione lâminas uma de cada vez, colocando-as nas ranhuras e pressionando-as suavemente para baixo no tecido aproximadamente 1 mm(Figura 2B). Continue a adicionar lâminas em intervalos de 1 mm trabalhando em direção à extremidade caudal.
  7. Certifique-se de que o cérebro não mude durante este tempo. Alinere as lâminas horizontal e verticalmente(Figura 2B). Para cortar as seções em larguras de 0,5 mm, podem ser utilizadas lâminas de microtomo de baixo perfil (ver Tabela de Materiais). Coloque-as entre as lâminas de barbearmaiores (Figura 2C).
  8. Uma vez que as lâminas estejam no lugar, pressione para baixo na parte superior do grupo com dedos, palma ou alguma outra superfície plana(Figura 2C, Figura 2D). Balance o grupo de lâminas lentamente de um lado para o outro para movê-las através do tecido.
    NOTA: Isso pode levar algum tempo (1-2 min) e requer paciência. Deve haver resistência às lâminas que se movem através do tecido. Entrada fácil significa que o cérebro está descongelando e o bloco deve ser resfriado com gelo seco.
  9. Quando todas as lâminas atingirem o fundo das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e trabalhe livre da matriz balançando para frente e para trás.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar cortar-se nas bordas afiadas das lâminas.
  10. Uma vez que o grupo esteja livre, coloque a pilha, o lado rostral para cima, na placa de vidro(Figura 2E). Coloque gelo seco ao lado e/ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação.
  11. Coloque a pilha com bordas afiadas para baixo na placa de vidro e lâminas separadas, deslocando a pilha entre polegares e dedos. As lâminas devem ser separadas umas das outras com seções anexadas.
  12. Alinhe seções na placa de vidro de rostral a caudal(Figura 2F).
  13. Separe o tecido das lâminas flexionando as lâminas entre os dedos, ou separando-se com uma segunda navalha fria(Figuras 2G,2H,2I).

4. Dissecar seções

  1. Abra o Atlas do Cérebro do Rato Allen ou outra referência e encontre pontos de referência necessários para identificar regiões de interesse. Alguns marcos óbvios incluem a comissura anterior, o corpo caloso, os ventrículos laterais e o hipocampo(Figura 3).
  2. Gire a seção a ser cortada com fórceps refrigerados e certifique-se de que a região prestes a ser coletada seja consistente em toda a seção. Durante a colheita, consulte o atlas de referência com freqüência para certificar-se de que o ROI correto é obtido.
    NOTA: Uma lupa ou um microscópio de dissecação são muitas vezes úteis neste processo. Uma boa iluminação também é essencial. Lâmpadas LED de baixa potência ou uma lâmpada fria (ver Tabela de Materiais)podem ser usadas para este fim.
  3. Com um bisturi ou soco limpo, corte na seção(Figura 4). Pré-frite cada ferramenta antes de cortar tocando-a brevemente para secar gelo. Empurre a lâmina suavemente, mas firmemente para dentro do tecido, balançando-a para frente e para trás para fazer o corte. Não empurre muito forte ou o tecido vai fraturar.
    NOTA: As ferramentas se aquecerão com o tempo. Lâminas ligeiramente aquecidas podem ser úteis na realização de cortes limpos e podem limitar a fratura, mas tenha cuidado para evitar o descongelamento de tecidos. Arrefece periodicamente ferramentas em gelo seco.
  4. Uma vez que um ROI é colhido, coloque-o em tubos rotulados de 1,5 mL pré-refrigerados. Armazene tecidos colhidos a -80 °C até que seja necessário.
  5. Processe o tecido congelado coletado desta forma adicionando tampão RIPA frio (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS e coquetel inibidor de proteína (ver Tabela de Materiais))para extração de proteínas, ou um solvente contendo guanidinium (ver Tabela de Materiais) para extração de RNA para a amostra congelada e homogeneizar imediatamente usando um Dounce de vidro ou homogeneizador mecânico (ver Tabela de Materiais). Desta forma, os inibidores de protease e nuclease estão no lugar à medida que a amostra se aquece para proteger proteínas e ácidos nucleicos da degradação.

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Representative Results

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Para validar esse método, o córtex pré-frontal medial foi coletado de camundongos machos adultos do tipo CD1 e RNA e proteína foram extraídos e caracterizados. O RNA foi analisado por eletroforese capilar. O RNA degradado apresenta uma perda na intensidade das bandas ribossômicas 28S e 18S e também mostra produtos de degradação como uma mancha entre 25 e 200 nucleotídeos(Figura 5A, amostra 1). O RNA de alta qualidade mostra bandas ribossômicas distintas com pouco ou nenhum sinal na região de menor peso molecular (Figura 5A, amostra 2). Os números de integridade do RNA (RINs) também são gerados nesta análise. RiNs acima de 7 indicam RNA19de boa qualidade . O RNA isolado das amostras usando o método de dissecção congelada apresenta forte faixa ribossômica e altos valores de RIN comparando-se muito favoravelmente com o RNA preparado a partir de tecido recém-colhido(Figura 5B).

Uma vantagem deste método é que um grande número de cérebros pode ser rapidamente colhido e armazenado em uma sessão para ser cuidadosamente dissecado posteriormente. Os ROIs também podem ser armazenados sem que os tecidos sejam descongelados. Com este método, um pesquisador pode coletar uma grande e diversificada coleção de ROIs a partir do qual o ácido nucleico ou proteína de alta qualidade pode ser obtido. Para confirmar este ponto, o RNA foi extraído do mPFC dissecado que havia sido armazenado ao longo de várias semanas (cérebros colhidos foram armazenados por vários meses). Todas as amostras produziram RNA de alta qualidade com banda ribossômica distinta e RINs acima de 8 (Figura 5C).

A análise das manchas ocidentais foi utilizada para confirmar a integridade proteica do mPFC dissecado congelado, conforme descrito anteriormente20. As manchas ocidentais exibem sinais reduzidos de alvos de alto peso molecular quando a proteína é degradada. Os produtos de degradação também aparecem como uma mancha em pesos moleculares mais baixos dentro da coluna. Para esta análise foi coletada proteína, transferida para nitrocelulose, e sondada com anticorpos contra um alvo de alto peso molecular, KCC2, e a proteína de menor peso molecular, actina (Figura 5D). Em todos os casos, as bandas eram afiadas e distintas, sem produtos de quebra discerníveis para KCC2 ou actina. Esses experimentos confirmam que a dissecção de ROIs usando este método permite a extração de RNA e proteína de alta qualidade.

Figure 1
Figura 1: Preparação de superfícies de trabalho congeladas. (A)Um bloco cerebral é colocado em uma pilha de embalagens de gel dentro de uma caixa isolada e, em seguida, é sanduíche entre dois pacotes de gel adicionais. A folha de alumínio é embalada em cada extremidade do bloco para facilitar o resfriamento durante a secção. A caixa é então resfriada durante a noite a -20 °C. (B) Uma placa de vidro é combinada para o tamanho com a abertura de uma caixa isolada. Uma caixa de transporte pode ser usada para este fim. O gelo é adicionado à caixa até que esteja a aproximadamente 5 cm do topo. A caixa é então congelada durante a noite a -20 °C. (B, C) Pouco antes de coletar tecido, uma camada uniforme de gelo seco é colocada sobre o topo do gelo a uma profundidade de aproximadamente 2,5 cm. Uma folha de plástico preto (para ajudar na visualização) é colocada sobre o gelo seco seguido pela placa de vidro. O gelo seco é colocado nos cantos mais distantes, o que esfria o ar logo acima da placa. As ferramentas podem ser resfriadas colocando-as no prato, ou tocando-as brevemente no gelo seco. (D)Para garantir seções simétricas, o cérebro deve ser posicionado com fórceps frios para que o seio sagital e o seio transversal se alinhem com as ranhuras perpendiculares do bloco (setas brancas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Secção do cérebro usando um bloqueio cerebral. (A)A orientação do cérebro é ancorada por colocar lâminas convencionais de lâmina de lâmina de ponta única no córtex a uma profundidade de aproximadamente 1 mm. Colocar uma no meio e outra em cada extremidade ajuda a manter o cérebro em posição. (B) Adicione lâminas uma de cada vez até que todas as ranhuras estejam preenchidas. (C) As lâminas de baixo perfil podem ser inseridas entre as lâminas convencionais quando seções de 0,5 mm são desejadas (seta vermelha). (C, D) O grupo de lâminas é empurrado para dentro do tecido congelado com pressão moderada para baixo, usando um instrumento plano ou a palma ou os dedos da mão. As lâminas podem ser lentamente balançadas para frente e para trás para ajudar a movê-las através do tecido. (E) As seções são removidas agarrando as laterais das lâminas de barbear e usando um movimento de balanço e pressão firme para cima (Cuidado: Tenha cuidado para evitar pontas afiadas das lâminas). Levante o grupo para fora do bloco e coloque-o de lado anterior na placa de vidro congelado. Coloque gelo seco adjacente às lâminas para resfriar completamente as seções antes de se separar. (F) Separe as lâminas e coloque as seções em ordem. (G, H) As seções podem ser removidas das lâminas flexionando levemente a lâmina com os dedos na direção das setas e empurrando a seção com uma segunda lâmina fria. (I)Algumas seções podem exigir a remoção aquecendo ligeiramente a lâmina de barbear entre os dedos e os polegares e, em seguida, cortando rapidamente a seção congelada com uma segunda lâmina fria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinando roIs usando marcos e o Atlas do Cérebro do Rato Allen. Neste exemplo, seções cerebrais congeladas estão à esquerda com placas correspondentes do Allan Mouse Brain Atlas à direita. Os ROIs (contornos pontilhados vermelhos) são identificados comparando marcos visíveis (formas pretas) com o Atlas do Cérebro do Rato Allen. Os marcos incluem: fa e cc, corpus callosum, aco, comissário anterior, VL, ventrículo lateral, V3, terceiro ventilador. Exemplo de ROIs: Pl/Il, córtex pré-límbico e infralíbico, ACB, núcleo accumbens, MOs, córtex motor, CP, caudoputamen, HPF, hipocampo/corínpi dentato. Imagens do Atlas Coronal no crédito certo: Instituto Allen. As imagens são das placas 40, 44, 55 e 71 (de cima a baixo) e foram obtidas de https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Dissecando ROIs. (A) As seções são manuseadas com fórceps resfriados periodicamente em gelo seco. Ambos os lados de cada seção devem ser comparados com as imagens atlas correspondentes antes da dissecção. (B) Os ROIs são removidos de seções cerebrais com bisturi frio ou(C) perfuração de biópsia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise de RNA e proteína usando método de dissecção cerebral congelado. (A)Exemplo de RNA de má qualidade versus boa qualidade. A separação eletroforética da amostra 1 apresenta RNA degradado com bandas fracas 28S e 18S e produtos de degradação entre 25 e 200 nucleotídeos (nt). A amostra 2 mostra RNA de boa qualidade com bandas 28S e 18S fortes e pouco sinal em baixos pesos moleculares. Os números de integridade do RNA refletem essa diferença com a amostra 1, RIN = 2,5 e a amostra 2, RIN = 8,6. (B) Comparação do RNA extraído do córtex pré-frontal medial congelado versus recém-dissecado de camundongos. As amostras congeladas foram mantidas a -80 °C durante vários meses antes da dissecção. Amostras frescas foram processadas imediatamente após a colheita. Os valores de RIN das amostras coletadas usando ambos os métodos são elevados, com fortes bandas 18S e 28S indicando que o ácido nucleico foi preservado. (C, D) mPFC foi dissecado de cérebros congelados e RNA ou proteína foi extraído. ( C )Aanálise de RNA mostra que o RNA de boa qualidade foi obtido para todas as doze amostras com rins elevados e pouco produto de degradação observado. (D) A análise das manchas ocidentais foi feita sobre a proteína total e foi sondada para a presença do canal de íons KCC2 de alto peso molecular (bandas vermelhas, MW = 130 kDa). A banda KCC2 é claramente visível sem produtos de quebra de peso molecular inferiores observados. O gene de limpeza, Actin (faixas verdes, MW = 42 kDa) também é mostrado. As amostras de mPFC de 12 cérebros são rotuladas de 1 a 12. WB significa todo o controle cerebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Este trabalho descreve uma técnica para isolar pequenas regiões específicas do cérebro, limitando a degradação do ácido nucleico e da proteína. Danos aos tecidos cerebrais acontecem rapidamente quando um organismo morre. Isto deve-se, em parte, ao rápido acúmulo de glutamato extracelular e à excitotoxicidade resultante que ocorre21. O RNA mensageiro é particularmente vulnerável à degradação22,23. A discriminação de proteínas e ácido nucleico é muito reduzida a baixas temperaturas, como evidenciado por um artigo recente descrevendo a atividade biológica em células mamutes congeladas em permafrost 28.000 anos atrás24.

Com o método descrito aqui, os cérebros são congelados e ferramentas e tecidos são mantidos abaixo de congelamento até que o ácido nucleico ou extração de proteínas seja iniciado. Os ROIs congelados são então homogeneizados em buffer contendo inibidores de protease e nuclease, protegendo moléculas-alvo da degradação a temperaturas mais altas.

Nesse processo, é importante identificar marcos claros para identificar OSI dentro das seções. Os tratos de fibra da comissura anterior e do corpo caloso funcionam bem para este fim, assim como os ventrículos. Mudanças na forma do hipocampo à medida que se move anterior para posterior também podem ser usadas. Dependendo de quão bem o cérebro está alinhado na matriz, os marcos podem ser distorcidos, ou ausentes. Deve-se ter cuidado antes de coletar OSI de seções como esta, pois regiões contaminantes podem acabar na amostra. Antes da coleta, um ROI deve ser verificado em ambos os lados da seção para ter certeza de que é consistente em toda a seção. A dissecção de ROIs é limitada a áreas bem definidas do cérebro que são maiores que aproximadamente 1 mm na dimensão x-y.

Ao dissecar os ROIs, há a necessidade de manter os tecidos congelados sem torná-los muito frágeis. O tecido que está muito frio vai fraturar quando a pressão é aplicada com um soco ou bisturi. A região de interesse é muitas vezes difícil de identificar a partir de outros fragmentos quando isso acontece. Uma maneira de mitigar isso é mover brevemente as seções para uma área mais quente da placa (longe do gelo seco). Também é importante manter a placa de vidro limpa. Uma vez que uma seção é processada, a placa deve ser raspada limpa com uma lâmina de barbear antes de passar para a próxima. Com o tempo, a água se condensará na placa de dissecção do ar que pode cobrir ou interferir de outra forma com o reconhecimento da amostra. A limpeza da placa é feita raspando a borda afiada de uma lâmina de barbear através da superfície do vidro e limpando a geada e os detritos coletados. Pequenos ROIs tornam-se indistinguíveis de fragmentos cerebrais indesejados, por isso é muito importante manter uma área de trabalho limpa.

Muitos laboratórios usam produtos comerciais25 para proteger o RNA em tecidos colhidos. Enquanto as moléculas labiles são bem preservadas desta forma, uma desvantagem é que a morfologia do tecido é radicalmente alterada. Como resultado, pode ser difícil encontrar as regiões de interesse usando mapas de referência. Dissecar OS ROIs de cérebros congelados antes de usar esses produtos pode, portanto, ser uma opção melhor.

Embora tenhamos focado em fatias coronais neste trabalho, este método deve funcionar bem para seções horizontais e sagitais. Mapas para essas orientações são geralmente mais baixos em resolução em comparação com aqueles para seções coronais. No entanto, isso está mudando rapidamente com iniciativas de grupos como o Allen Brain Institute. Outra consideração é a idade do animal na colheita. A morfologia de cérebros de animais jovens é muito diferente da do adulto e exigirá um atlas especializado e uma matriz cerebral de tamanho diferente. Recursos como o Atlas26 do Cérebro do Rato em Desenvolvimento são essenciais na coleta de amostras cerebrais precisas de camundongos mais jovens.

Este trabalho descreve um processo que pode ser usado para colher pequenas regiões de dentro do cérebro de roedores. A morfologia das seções é bem preservada com o corte congelado, e à medida que os tecidos são mantidos congelados da colheita à extração, a qualidade do ácido nucleico e da proteína é alta. Este processo tem a vantagem sobre a dissecção de tecido recém-coletado, pois cérebros de amostra de um grande grupo de animais podem ser rapidamente coletados e armazenados. Regiões dentro do cérebro podem então ser identificadas usando marcos identificados em atlas cerebrais comuns e coletados em um ritmo cuidadoso sem perder moléculas-alvo. Este método pode ser uma boa opção para alguns laboratórios, pois as ferramentas e regentes necessários são baratos e prontamente disponíveis.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH, DA043982 e DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante
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Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

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