Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Эта процедура описывает сбор дискретных замороженных областей мозга для получения высококачественного белка и РНК с использованием недорогих и общедоступных инструментов.

Abstract

По мере того как наше вникание нейробиологии развивало, молекулярные анализы часто выполняются на малых зонах мозга such as медиальная префронтальная кора (mPFC) или accumbens ядра. Задача этой работы состоит в том, чтобы вскрыть правильную область при сохранении микросреды, которая будет рассмотрена. В этой статье мы описываем простой, недорогой метод с использованием ресурсов, легко доступных в большинстве лабораторий. Этот метод сохраняет нуклеиновой кислоты и белков, сохраняя ткани замороженными на протяжении всего процесса. Мозги разрезают на 0,5-1,0 мм с помощью матрицы мозга и устроены на замороженной стеклянной пластине. Ориентиры в каждом разделе сравниваются со ссылкой, такие как Аллен мышь мозга Атлас, и регионы вскрыты с помощью холодного скальпеля или биопсии удар. Ткань затем хранится при -80 градусах Цельсия до использования. Благодаря этому процессу крыса и мышь mPFC, ядро accumbens, дорсальный и брюшной гиппокамп и другие регионы были успешно проанализированы с помощью qRT-PCR и западных анализов. Этот метод ограничен областями мозга, которые могут быть определены четкими ориентирами.

Introduction

Эта работа иллюстрирует вскрытие замороженных областей мозга для извлечения высококачественной нуклеиновой кислоты или белка с помощью ссылки, такие как Аллен Мышь мозга Атлас1, в качестве руководства. В этом методе мозги замораживаются вспышкой и хранятся при -80 градусов по Цельсию для последующего отделения и вскрытия при сохранении в замороженном состоянии. Этот процесс позволяет исследователю собрать большое количество мозгов за один сеанс, а затем вскрыть их для точного сбора нескольких областей мозга.

Точный сбор областей мозга, представляющих интерес (ROIs) часто требуется при ответе на вопросы, связанные с геном и выражением белка. В то время как фармакология, электрофизиология и оптогенетика могут быть использованы на wildtype или генетически модифицированных грызунов, чтобы помочь прояснить молекулярные изменения, лежащие в основе наблюдаемого поведения2,3,4, измерение индуцированных изменений в транскриптомах и протеом часто используется для поддержки этих выводов. Такие методы, как количественные обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-qPCR), западные blotting, RNAseq5, MAPSeq6 и HPLC7 являются надежными и относительно низкими по стоимости, что позволяет многим лабораториям для изучения индуцированных молекулярных изменений в малых областях мозга2,4,5,6.

Есть несколько способов извлечения и очищения нуклеиновой кислоты или белка из областей мозга8,,9,,10,,11,,12. Многие лаборатории собирают мозг регионов путем охлаждения и резки мозгов на льду во время сбора урожая9,13. Хотя такой подход может привести к высокому качеству нуклеиновой кислоты и белка, он несколько ограничен по времени, поскольку деградация в микроокружении тканей может происходить при таких температурах. Это может быть особенно верно при попытке вскрыть большое количество животных или roIs в один присест. Сохранение образцов замороженных помогает поддерживать молекулы-цели лабила, обеспечивая исследователю время, чтобы тщательно сравнить ориентиры с обеих сторон каждого раздела в попытке собрать относительно чистые образцы. Лазерный захват является еще одним способом сбора ткани для РНК или анализа белка из областей мозга10. Эта процедура превосходит механическое вскрытие в том, что очень маленькие и неправильной формы ROIs могут быть определены и изолированы. Однако лазерный захват ограничен использованием дорогостоящего оборудования и реагентов, занимает много времени, а также может быть более восприимчив к деградации образцов.

Вскрытие микропунда на замороженных тканях не ново. Ранние работы Миклоша Палковича и других подробно описывают основные методы14,,15. Эта презентация в значительной степени соответствует первоначальной работе, с некоторыми улучшениями для облегчения эффективности и сокращения расходов на оборудование, необходимое. Например, участки мозга сделаны в замороженном мозговом блоке, а не на криостате. Это приводит к более толстым секциям, что уменьшает количество секций, необходимых для сбора образцов окупаемое окупаемое инвестиций. Этот метод также вскрывает образцы на замороженной стеклянной пластине, которая сидит на сухом льду в изолированной коробке. Это создает под-замораживания этапе на скамейке, на которой работать. Разделы, расчлененные таким образом, легко манипулируют, что позволяет исследователю сравнивать обе стороны каждого раздела со ссылкой, чтобы ограничить загрязнение из регионов за пределами желаемой рентабельности инвестиций.

Преимущества этого протокола в том, что 1) мозг находится в замороженном состоянии на протяжении всего процесса, что помогает сохранить белок и нуклеиновой кислоты и дает исследователю время, чтобы тщательно собирать ROIs, и 2) реагенты, необходимые являются недорогими и находятся в большинстве лабораторий молекулярной биологии. В этом процессе целые мозги разделены до 0,5-1,0 мм в матрице мозга и помещаются на замороженную стеклянную пластину, которая постоянно охлаждается сухим льдом. Ориентиры, найденные в Атласе мозга Аллена1 или других атласах мозга16,17 используются для выявления областей, представляющих интерес, которые затем вскрыты с помощью либо холодный пунш или скальпель. Поскольку ткань никогда не оттаяла, регионы, собранные таким образом, обеспечивают высокое качество РНК и белка для анализа ниже по течению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

К животным, использованным в этом исследовании, относились этически и гуманно, как это предусмотрено Руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Индианы (IACUC) и Национальными институтами здравоохранения (NIH).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты и поверхности должны быть промыты с соответствующим растворителем для удаления nucleases18 перед началом любой работы.

1. Хранение мозгов

  1. Быстро удалить мозг от эвтаназии взрослых cd1 диких мышей весом около 30 г с помощью обычного подхода13 и флэш-заморозки в течение 60 секунд либо в жидком азоте или иопентан предварительно охлажденных сухим льдом.
  2. Храните замороженные мозги при -80 градусов по Цельсию в алюминиевой фольге или конических трубках до использования.

2. Подготовка матрицы мозга

  1. За двадцать четыре часа до вскрытия ткани поместите чистую матрицу мозга (см. Таблицу Материалов)на стопку талых пакетов морозильной камеры. Сэндвич стороны матрицы между двумя морозильник пакеты убедившись, чтобы оставить около 0,5 см между нижней части бритвы слоты и верхней части гель пакеты (Рисунок 1A). Поместите алюминиевую фольгу на концах, чтобы помочь в охлаждении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При покупке матрицы мозга, купить тот, который является достаточно большим, чтобы укроза весь объем мозга, чтобы быть вскрыты.
  2. Поместите коробку, содержащую матрицу мозга и морозильник пакеты в морозильной камере -20 градусов с верхней приоткрытой ночь.

3. Установка замороженной стеклянной пластины

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой установки заключается в подготовке замороженных поверхностей, на которой для вскрытия участков мозга.

  1. Поместите лед в изолированную коробку примерно на 5 см сверху. Затем поместите 2,5 см слой сухого льда на вершине льда и накройте черной пластиковой пленкой, чтобы помочь в визуализации образца(Рисунок 1B, Рисунок 1C).
  2. Поместите стеклянную пластину (должна просто поместиться в отверстие коробки) на верхней части пластика и место сухой лед на верхней части пластины в дальних углах(рисунок 1C).
  3. Возьмите замороженную матрицу мозга из морозильной камеры и вставьте мозг, чтобы быть разрезаны коры вверх. Дайте ему уравновесить до температуры в коробке в течение 10 мин. Держите крышку на поле в течение этого времени.
  4. Отрегулируйте положение мозга в матрице с холодными щипками так, что sagittal sinus и поперечная пазов выстраиваются в линию с перпендикулярными канавками блока(Рисунок 1D). Это поможет обеспечить симметричные разделы для более легкого вскрытия. Коснитесь кончики щипцы, чтобы сухой лед кратко охладить перед регулировкой мозга.
  5. Как только мозг находится в положении, поместите охлажденное лезвие бритвы рядом с его центром и нажмите лезвие примерно 1 мм в ткани. Добавить охлажденные лезвия в ростральных и каудальных концах, чтобы помочь держать мозг на месте(Рисунок 2A и Рисунок 2B).
  6. Начиная с рострального конца, добавляйте лезвия по одному, помещая их в слоты и нажимая их аккуратно вниз в ткань примерно на 1 мм(рисунок 2B). Продолжайте добавлять лезвия с интервалом в 1 мм, работая к каудальном концу.
  7. Убедитесь, что мозг не смещается в течение этого времени. Выстраивайте лопасти горизонтально и вертикально(рисунок 2B). Для того, чтобы разрезать секции на ширину 0,5 мм, можно использовать низкопрофильные лезвия микротомов (см. Таблицу Материалов). Поместите их между большими лезвиями бритвы(Рисунок 2C).
  8. После того, как лезвия на месте, нажмите вниз на верхней части группы пальцами, ладонью или другой плоской поверхности(рисунок 2C, Рисунок 2D). Рок группы лезвий медленно из стороны в сторону, чтобы переместить их через ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время (1-2 мин) и требует терпения. Должно быть сопротивление лезвиям, движущимся через ткани. Легкий вход означает, что мозг тает и блок должен быть охлажден сухим льдом.
  9. Когда все лезвия достигли нижней части слотов, понять каждую сторону группы лезвий и работать без матрицы, качаясь вперед и назад.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Упражнение осторожность, чтобы избежать резки себя на острые края лезвия.
  10. Как только группа свободна, поместите стек, ростральную сторону вверх, на стеклянную пластину(рисунок 2E). Поместите сухой лед рядом с и / или на верхней части стека для дальнейшего замораживания образцов для облегчения разделения.
  11. Поместите стек с острыми краями вниз на стеклянную пластину и отдельные лезвия, перемещая стек между пальцами и пальцами. Лезвия должны отделяться друг от друга с прикрепленными секциями.
  12. Выстраивайте секции на стеклянной пластине от рострала до каудаля(рисунок 2F).
  13. Отделить ткань от лезвий путем сгибания лезвий между пальцами, или путем разделения со второй холодной бритвой(Рисунки 2G,2H,2I).

4. Рассекающие секции

  1. Откройте Атлас мозга Аллена Мыса или другую ссылку и найдите ориентиры, необходимые для определения регионов, представляющих интерес. Некоторые очевидные ориентиры включают передней commissure, корпус мозоли, боковые желудочки, и гиппокамп(Рисунок 3).
  2. Переверните раздел, который будет разрезан охлажденным и убедитесь, что область собирается быть собраны является последовательной всей секции. Во время уборки урожая, обратитесь к справочному атласу часто, чтобы убедиться, что правильная рентабельность инвестиций получена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: увеличительное стекло или расчленяющий микроскоп часто полезно в этом процессе. Хорошее освещение также имеет важное значение. Для этой цели можно использовать светодиодные лампы с низкой мощностью или прохладную лампу (см. таблицу материалов).
  3. С чистой скальпелем или пуншем, нарезать сечение(Рисунок 4). Прехлкаждый каждый инструмент, прежде чем резки, касаясь его кратко сухой лед. Нажмите лезвие мягко, но твердо в ткани, качая его вперед и назад, чтобы сделать разрез. Не нажимайте слишком сильно или ткань будет перелом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты будут нагреваться с течением времени. Слегка подогретые лезвия могут быть полезны в принятии чистых разрезов и может ограничить ГРП, но будьте осторожны, чтобы избежать оттаивания тканей. Периодически охлаждают инструменты на сухом льду.
  4. После того, как рентабельность инвестиций будет собрана, поместите ее в помеченные, прешилированные трубы 1,5 мл. Храните собранные ткани при -80 градусах по Цельсию до тех пор, пока это не понадобится.
  5. Обработка замороженных тканей, собранных таким образом, добавив холодный буфер RIPA (50 мм Трис, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% CHAPS и коктейль-ингибитор белка (см. Таблица материалов))для извлечения Table of Materialsбелка, или гванидина-содержащего растворителя (см. Таблица Материалов)для извлечения РНК в замороженный образец и немедленно гомогенизацию с помощью либо стеклянного Dounce или механического гомогенного материала). Таким образом, ингибиторы протеазы и нуклеаза на месте, как образец нагревается для защиты белка и нуклеиновых кислот от деградации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы проверить этот метод, медиальная префронтальная кора была собрана из взрослых CD1 диких мышей дикого типа и РНК и белка были извлечены и охарактеризованы. РНК была проанализирована с помощью капиллярного электрофорасиса. Деградированная РНК отображает потерю интенсивности 28S и 18S рибосомных полос, а также показывает продукты деградации как мазок между 25 и 200 нуклеотидов(рисунок 5A, образец 1). Высокое качество РНК показывает различные рибосомные полосы практически без сигнала в нижней молекулярной области веса(Рисунок 5A, образец 2). В этом анализе также генерируются номера целостности РНК (RINs). RINs выше 7 указывают на хорошее качество РНК19. РНК, выделенная из образцов с использованием метода замороженного вскрытия, отображает сильную рибосомную перевязку и высокие значения RIN, сравнивая очень благоприятно с РНК, приготовленную из свежесобранной ткани(рисунок 5B).

Одним из преимуществ этого метода является то, что большое количество мозгов может быть быстро собраны и храниться в один присест, чтобы быть тщательно вскрыты на более позднее время. ROIs также может храниться без тканей размораживаются. С помощью этого метода исследователь может собрать большую и разнообразную коллекцию ROIs, из которой могут быть получены высококачественные нуклеиновые кислоты или белок. Чтобы подтвердить этот момент, РНК была извлечена из расчлененных mPFC, которые хранились в течение нескольких недель (собранные мозги хранились в течение нескольких месяцев). Все образцы производятся высокое качество РНК с различными рибосомных полосирования и RINs выше 8(рисунок 5C).

Западный анализ побелки был использован для подтверждения целостности белка замороженных рассеченных mPFC, как ранее описано20. Западные помарки отображают уменьшенный сигнал целей высокого молекулярной массы когда протеин деградировал. Продукты деградации также отображаются как мазок при более низких молекулярных весах в колонке. Для этого анализа был собран белок, перенесен в нитроцеллюлозу и исследован антителами против высокомолекулярной цели веса, KCC2, и нижнего молекулярного белка веса, актина(Рисунок 5D). Во всех случаях полосы были острыми и отличались без заметных продуктов распада для KCC2 или actin. Эти эксперименты подтверждают, что вскрытие окупаемоки с помощью этого метода позволяет экстракцией высококачественной РНК и белка.

Figure 1
Рисунок 1: Подготовка замороженных рабочих поверхностей. (A) Блок мозга помещается на стопку гель пакеты в изолированной коробке, а затем зажатой между двумя дополнительными пакетами геля. Алюминиевая фольга упаковывается на каждом конце блока для облегчения охлаждения во время секции. Коробка затем охлаждается на ночь при -20 градусов по Цельсию. (B) Стеклянная пластина сопоставляется по размеру с отверстием изолированной коробки. Для этой цели можно использовать коробочку для доставки. Лед добавляется в коробку, пока он не находится примерно на 5 см от вершины. Коробка затем замораживается на ночь при -20 градусов по Цельсию. (B, C) Непосредственно перед сбором ткани на вершине льда на глубине около 2,5 см помещается единый слой сухого льда. Лист черного пластика (для помощи в визуализации) помещается над сухим льдом, а затем стеклянная пластина. Сухой лед помещается в дальних углах, который охлаждает воздух чуть выше пластины. Инструменты можно охладить, уложив их на тарелку или ненадолго прикоснувшись к сухому льду. (D) Для обеспечения симметричных разделов, мозг должен быть расположен с холодными щипками так, что sagittal паз и поперечный паз выстраиваются в линию с перпендикулярными канавками блока (белые стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Секция мозга с помощью мозгового блока. ()Ориентация мозга закреплена, сидя обычных одногранных лезвий бритвы в коре на глубине около 1 мм. Размещение одного в середине и один на каждом конце помогает держать мозг в положении. (B) Добавить лезвия по одному, пока все слоты заполнены. (C) Низкопрофильные лопасти могут быть вставлены между обычными лезвиями, когда 0,5 мм разделы желательно (красная стрелка). (C, D) Группа лезвий заталкивается в замороженную ткань при умеренном понижательном давлении, используя либо плоский инструмент, либо ладонь или пальцы рук. Клинки могут медленно качаться взад и вперед, чтобы помочь переместить их через ткани. (E) Разделы удаляются, схватив стороны лезвий бритвы и с помощью качания движения и фирмы повышательное давление (Осторожно: Будьте осторожны, чтобы избежать резких концов лезвия). Поднимите группу из блока и поместите ее на переднюю сторону вверх на замороженную стеклянную пластину. Поместите сухой лед рядом с лезвиями, чтобы полностью охладить секции перед отделением. (F) Отдельные лезвия и выложить разделы в порядке. (G, H) Разделы могут быть удалены из лезвий, сгибая лезвие слегка пальцами в направлении стрелки и толкая раздел с второго холодного лезвия. (Я) Некоторые разделы могут потребовать удаления, слегка согрев лезвие бритвы между пальцами и большими пальцами, а затем быстро нарезки от замороженных раздел со вторым холодным лезвием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Определение рентабельности инвестиций с использованием ориентиров и атласа мозга Аллена Мауса. В этом примере замороженные участки мозга находятся слева с соответствующими пластинами из атласа мозга Allan Mouse справа. ROIs (красные пунктирные очертания) идентифицируются путем сравнения видимых ориентиров (черные формы) с атласом мозга Аллена Мауса. Ориентиры включают в себя: fa и cc, корпус мозоли, ако, передний комиссар, VL, боковой желудочек, V3, третий вентиляционные. Пример ROIs: Pl / Il, прелимбической и инфралимической коры, ACB, ядро accumbens, МО, моторной коры, CP, caudoputamen, HPF, гиппокампа /зубной извилины. Изображения коронарного атласа на правом кредите: Институт Аллена. Изображения с листов 40, 44, 55 и 71 (сверху вниз) и были получены из https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Рассекание ROIs. (A) Разделы обрабатываются с помощью щипцы, которые охлаждаются периодически на сухом льду. Перед вскрытием обе стороны каждого раздела следует сравнивать с соответствующими изображениями атласа. (B) ROIs удаляются из секций мозга с холодным скальпелем или (C) биопсии удар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ РНК и белка с использованием метода замороженного рассечения мозга. (A) Пример бедных по сравнению с хорошим качеством РНК. Электрофоретическое разделение образца 1 отображает деградированную РНК со слабыми полосами 28S и 18S и продукты деградации между 25 и 200 нуклеотидами (nt). Пример 2 показывает хорошее качество РНК с сильными 28S и 18S полос и мало сигнала при низких молекулярных весах. Цифры целостности РНК отражают эту разницу с образцом 1, RIN 2.5 и образцом 2, RIN 8.6. (B) Сравнение РНК, извлеченных из замороженных и свежерасчлененной медиальной префронтальной коры мышей. Замороженные образцы хранились при -80 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев до вскрытия. Свежие образцы были обработаны сразу же после сбора урожая. Значения RIN из образцов, собранных с использованием обоих методов, являются высокими, с сильными 18S и 28S полос, указывающих на то, что нуклеиновая кислота была сохранена. (C, D) mPFC был расчленен из замороженных мозгов и РНК или белок был извлечен. (C) АНАЛИЗ РНК показывает хорошее качество РНК был получен для всех двенадцати образцов с высоким RINs и мало продукта деградации наблюдается. (D) Западный анализ помок был сделан на общий белок и был исследован на наличие высокого молекулярного веса Ионный канал KCC2 (красные полосы, МВт 130 kDa). Диапазон KCC2 хорошо виден без наблюдаемых продуктов с более низким молекулярным весом. Также показан ген домашнего хозяйства Actin (зеленые полосы, МВт и 42 кДа). образцы mPFC из 12 мозгов помечены 1-12. WB означает весь контроль мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта работа описывает метод изолировать небольшие, специфические области мозга, ограничивая деградацию нуклеиновой кислоты и белка. Повреждение тканей мозга происходит быстро, как только организм умирает. Это частично связано с быстрым накоплением внеклеточного глутамата и в результате эксктооксичность, которая происходит21. Messenger РНК особенно уязвима к деградации22,23. Распад белка и нуклеиновой кислоты значительно снижается при низких температурах, о чем свидетельствует недавняя статья, описывающая биологическую активность в клетках мамонта, замороженных в вечной мерзлоте 28 000 лет назад24.

С помощью метода, описанного в настоящем, мозг и оснастки заморожены и инструменты и ткани хранятся ниже замораживания до тех пор, пока нуклеиновая кислота или протеиновая экстракция не начнется. Замороженные ROIs затем гомогенизированы в буфере, содержащем ингибиторы протеазы и нуклеаза, защищая молекулы мишеней от деградации при более высоких температурах.

В этом процессе важно определить четкие ориентиры для определения рентабельности инвестиций в разделах. Волокно трактов передней commissure и корпус мозоли хорошо работать для этой цели, как и желудочков. Изменения в форме гиппокампа, как один движется передней к задней также могут быть использованы. В зависимости от того, насколько хорошо мозг выровнен в матрице, ориентиры могут быть искажены или отсутствуют. Следует проявлять осторожность, прежде чем собирать рентабельность инвестиций из разделов, как это, как загрязняющие регионы могут в конечном итоге в выборке. Перед сбором, рентабельность инвестиций должна быть проверена с обеих сторон раздела, чтобы убедиться, что она соответствует всему разделу. Рассечение рентабельности инвестиций ограничивается четко определенными областями мозга, которые превышают примерно 1 мм в измерении X-y.

При вскрытии ROIs, есть необходимость держать ткани замороженными, не делая их слишком хрупкими. Ткань, которая слишком холодно будет перелом, когда давление применяется с пуншем или скальпелем. Область интереса часто трудно определить из других фрагментов, когда это происходит. Один из способов смягчить это заключается в том, чтобы кратко переместить разделы в более теплой области пластины (вдали от сухого льда). Важно также, чтобы стеклянная пластина чистой. После того, как раздел обрабатывается, пластина должна быть Царапины чистой с лезвием бритвы, прежде чем перейти к следующему. Со временем вода будет конденсироваться на пластину вскрытия из воздуха, которая может покрыть или иным образом помешать распознаванию образцов. Очистка пластины осуществляется путем соскабливания острый край лезвия бритвы по всей поверхности стекла и вытирая собранные мороз и мусор. Небольшие ROIs становятся неотличимыми от нежелательных фрагментов мозга, поэтому очень важно поддерживать чистую рабочую зону.

Многие лаборатории используют коммерческие продукты25 для защиты РНК в собранных тканях. В то время как молекулы лабила хорошо сохранились таким образом, один недостаток заключается в том, что морфология ткани радикально изменилась. В результате может быть трудно найти интересуемые регионы с помощью справочных карт. Рассекая рентабельность инвестиций из оснастки замороженных мозгов перед использованием этих продуктов, следовательно, может быть лучшим вариантом.

Хотя мы сосредоточились на корональных ломтиках в этой работе, этот метод должен хорошо работать для горизонтальных и сагитальных секций. Карты для этих ориентаций, как правило, ниже по разрешению по сравнению с картами корональных секций. Тем не менее, это быстро меняется с инициативами от таких групп, как Институт мозга Аллена. Другим соображением является возраст животного при сборе урожая. Морфология мозга молодых животных сильно отличается от мозга взрослого и потребует специализированного атласа и матрицы мозга разного размера. Ресурсы, такие как Разработка мышь мозга Атлас26 имеют важное значение в сборе точных образцов мозга от молодых мышей.

Эта работа описывает процесс, который может быть использован для сбора небольших регионов из мозга грызунов. Морфология секций хорошо сохраняется с замороженной нарезкой, а поскольку ткани замораживаются от сбора урожая до добычи, качество нуклеиновой кислоты и белка высокое. Этот процесс имеет преимущество перед вскрытием свежесобранных тканей, так как образец мозга большой группы животных может быть быстро собран и сохранен. Регионы в мозге могут быть определены с помощью ориентиров, выявленных в общих атласах мозга и собранных в осторожном темпе, не теряя молекулы-мишени. Этот метод может быть хорошим вариантом для некоторых лабораторий, как инструменты и регенты необходимы недорогие и легко доступны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH, DA043982 и DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25, (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5, (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20, (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12, (63), (2018).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. Academic Press. (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. Academic Press. (1998).
  18. RNaseZap. Ambion. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
  19. Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265, (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8, (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9, (1), 4050 (2019).
  25. Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
  26. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter