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Neuroscience

Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

doi: 10.3791/60474 Published: April 23, 2020

Summary

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Abstract

A medida que nuestra comprensión de la neurobiología ha progresado, los análisis moleculares a menudo se realizan en pequeñas áreas cerebrales como la corteza prefrontal medial (mPFC) o núcleo accumbens. El reto de este trabajo es diseccionar el área correcta preservando al mismo tiempo el microambiente a examinar. En este artículo, describimos un método simple y de bajo costo utilizando recursos disponibles en la mayoría de los laboratorios. Este método preserva el ácido nucleico y las proteínas manteniendo el tejido congelado durante todo el proceso. Los cerebros se cortan en secciones de 0,5-1,0 mm usando una matriz cerebral y dispuestos en una placa de vidrio congelado. Las marcas de interés dentro de cada sección se comparan con una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas, y las regiones se diseccionan usando un bisturí frío o un punzón de biopsia. A continuación, el tejido se almacena a -80 oC hasta su uso. A través de este proceso mPFC de rata y ratón, núcleo accumbens, hipocampo dorsal y ventral y otras regiones se han analizado con éxito utilizando qRT-PCR y ensayos occidentales. Este método se limita a las regiones cerebrales que se pueden identificar por puntos de referencia claros.

Introduction

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Este trabajo ilustra la disección de regiones cerebrales congeladas para la extracción de ácido nucleico o proteína de alta calidad utilizando una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas1, como guía. En esta técnica, los cerebros se congelan con flash y se almacenan a -80 oC para su posterior seccionamiento y disección mientras se mantienen en una condición congelada. Este proceso permite al investigador cosechar un gran número de cerebros en una sesión y luego diseccionarlos para una colección precisa de múltiples regiones cerebrales.

La recopilación precisa de regiones cerebrales de interés (ROI) a menudo es necesaria al responder preguntas relacionadas con la expresión de genes y proteínas. Mientras que la farmacología, electrofisiología y optogenética se pueden utilizar en roedores de tipo salvaje o modificados genéticamente para ayudar a dilucidar los cambios moleculares que sustentan los comportamientos observados2,3,4, la medición de los cambios inducidos en transcriptomes y proteomes se utiliza a menudo para apoyar estos hallazgos. Técnicas como la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR), la hincha occidental, el RNAseq5,el MAPSeq6 y el HPLC7 son robustos y relativamente bajos en costo, lo que permite a muchos laboratorios estudiar los cambios moleculares inducidos dentro de las regiones cerebrales pequeñas2,,4,5,6.

Hay varias maneras de extraer y purificar el ácido nucleico o proteína de las regiones cerebrales8,9,10,11,12. Muchos laboratorios cosechan regiones cerebrales enfriando y cortando cerebros en hielo en el momento de la cosecha9,13. Si bien este enfoque puede dar lugar a ácido nucleico y proteína de alta calidad, es algo limitado en el tiempo, ya que la degradación dentro del microambiente del tejido puede tener lugar a estas temperaturas. Esto puede ser particularmente cierto cuando se intenta diseccionar un gran número de animales o IRO en una sola sesión. Mantener las muestras congeladas ayuda a mantener las moléculas diana lábiles mientras que proporciona al investigador tiempo para comparar cuidadosamente puntos de referencia en ambos lados de cada sección en el esfuerzo por recoger muestras relativamente puras. La captura láser es otra forma de recolectar tejido para el análisis de ARN o proteínas de las áreas cerebrales10. Este procedimiento es superior a la disección mecánica en el que se pueden identificar y aislar ROI muy pequeños y de forma irregular. Sin embargo, la captura láser está limitada por el uso de costosos equipos y reactivos, consume mucho tiempo y también puede ser más susceptible a la degradación de la muestra.

La disección de micropundado en tejidos congelados no es nueva. Los primeros trabajos de Miklos Palkovits y otros describen las técnicas básicas en detalle14,15. Esta presentación sigue en gran medida el trabajo original, con algunas mejoras para facilitar la eficiencia y disminuir el gasto del equipo necesario. Por ejemplo, las secciones cerebrales se hacen en un bloqueo cerebral congelado en lugar de en un criostato. Esto produce secciones más gruesas que reduce el número de secciones necesarias para recoger muestras de ROI. Este método también disecciona muestras en una placa de vidrio congelado que se sienta en hielo seco dentro de una caja aislada. Esto produce una etapa de subcongelación en el banco en el que trabajar. Las secciones diseccionadas de esta manera son fácilmente manipulables, lo que permite al investigador comparar ambos lados de cada sección con una referencia con el fin de limitar la contaminación de regiones fuera del ROI deseado.

Las ventajas de este protocolo son que 1) el cerebro se mantiene en una condición congelada durante todo el proceso, lo que ayuda a preservar la proteína y el ácido nucleico y da al investigador tiempo para cosechar cuidadosamente los IRO, y 2) los reactivos requeridos son baratos y se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. En este proceso, los cerebros enteros se seccionan a 0.5–1.0 mm en una matriz cerebral y se colocan en una placa de vidrio congelado que se enfría continuamente con hielo seco. Los lugares de interés que se encuentran en el Allen Brain Atlas1 u otros atlas cerebrales16,17 se utilizan para identificar las regiones de interés, que luego se diseccionan usando un puñetazo frío o un bisturí. Debido a que el tejido nunca se descongela, las regiones cosechadas de esta manera proporcionan ARN y proteínades de alta calidad para análisis posteriores.

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Protocol

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Los animales utilizados en este estudio fueron tratados de una manera ética y humana según lo establecido por las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana y los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

NOTA: Todas las herramientas y superficies deben lavarse con un disolvente adecuado para eliminar las nucleasas18 antes de comenzar cualquier trabajo.

1. Almacenar cerebros

  1. Retire rápidamente los cerebros de ratones de tipo salvaje CD1 adultos eutanasiados que pesen aproximadamente 30 g utilizando un enfoque convencionalde 13 y congelación de flash durante 60 segundos en nitrógeno líquido o isopentano preenfriado con hielo seco.
  2. Almacene los cerebros congelados a -80 oC en papel de aluminio o tubos cónicos hasta su uso.

2. Preparación de la matriz cerebral

  1. Veinticuatro horas antes de disección de tejido, coloque una matriz cerebral limpia (ver Tabla de Materiales)en una pila de paquetes de congelador descongelados. Sandwich los lados de la matriz entre dos paquetes de congelador asegurándose de dejar aproximadamente 0,5 cm entre la parte inferior de las ranuras de afeitar y la parte superior de los paquetes de gel(Figura 1A). Coloque papel de aluminio en los extremos para ayudar en el enfriamiento.
    NOTA: Al comprar una matriz cerebral, comprar uno que es lo suficientemente grande como para encerrar todo el volumen del cerebro para ser diseccionado.
  2. Coloque la caja que contiene la matriz cerebral y los paquetes de congelador en un congelador de -20 oC con la parte superior entreabierta durante la noche.

3. Configuración de una placa de vidrio congelado

NOTA: El propósito de esta configuración es preparar una superficie congelada en la que diseccionar secciones cerebrales.

  1. Coloque el hielo en una caja aislada hasta aproximadamente 5 cm de la parte superior. A continuación, coloque una capa de hielo seco de 2,5 cm sobre el hielo y cúbrala con láminas de plástico negras para ayudar a visualizar la muestra(Figura 1B, Figura 1C).
  2. Coloque una placa de vidrio (debe caber en la abertura de la caja) en la parte superior del plástico y coloque hielo seco en la parte superior de la placa en las esquinas lejanas(Figura 1C).
  3. Tome la matriz cerebral congelada del congelador e inserte el cerebro para ser cortado del lado de la corteza hacia arriba. Deje que se equilibre a la temperatura en la caja durante 10 minutos.
  4. Ajustar la posición del cerebro en la matriz con fórceps fríos para que el seno sagital sagital y el seno transversal se alineen con las ranuras perpendiculares del bloque(Figura 1D). Esto ayudará a garantizar secciones simétricas para facilitar la disección. Toque las puntas de los fórceps para secar el hielo brevemente para enfriar antes de ajustar el cerebro.
  5. Una vez que el cerebro esté en posición, coloque una cuchilla de afeitar refrigerada cerca de su centro y presione la hoja aproximadamente 1 mm en el tejido. Agregue cuchillas refrigeradas a los extremos rostral y caudal para ayudar a mantener el cerebro en su lugar(Figura 2A y Figura 2B).
  6. Comenzando en el extremo rostral, agregue las cuchillas una a la vez, colocándolas en las ranuras y presionándolas suavemente hacia abajo en el tejido aproximadamente 1 mm(Figura 2B). Continúe agregando cuchillas a intervalos de 1 mm trabajando hacia el extremo caudal.
  7. Asegúrese de que el cerebro no cambie durante este tiempo. Alinee las cuchillas horizontal y verticalmente(Figura 2B). Para cortar secciones en anchos de 0,5 mm, se pueden utilizar cuchillas de microtome de perfil bajo (ver Tabla de Materiales). Colóquelos entre las cuchillas de afeitar más grandes(Figura 2C).
  8. Una vez que las cuchillas estén en su lugar, presione hacia abajo en la parte superior del grupo con los dedos, la palma de la mano o alguna otra superficie plana(Figura 2C, Figura 2D). Mece el grupo de cuchillas lentamente de lado a lado para moverlas a través del tejido.
    NOTA: Esto puede tardar algún tiempo (1-2 min) y requiere paciencia. Debe haber resistencia a las cuchillas que se mueven a través del tejido. La entrada fácil significa que el cerebro se está descongelando y el bloque debe enfriarse con hielo seco.
  9. Cuando todas las cuchillas hayan llegado a la parte inferior de las ranuras, agarre cada lado del grupo de cuchillas y trabaje libre de la matriz balanceándose hacia adelante y hacia atrás.
    NOTA: Tenga cuidado para evitar cortarse en los bordes afilados de las cuchillas.
  10. Una vez que el grupo esté libre, coloque la pila, lado rostral hacia arriba, en la placa de vidrio(Figura 2E). Coloque hielo seco al lado y/o en la parte superior de la pila para congelar aún más las muestras para facilitar la separación.
  11. Coloque la pila con bordes afilados hacia abajo en la placa de vidrio y separe las cuchillas desplazando la pila entre los pulgares y los dedos. Las cuchillas deben separarse entre sí con secciones unidas.
  12. Alinee las secciones en la placa de vidrio de rostral a caudal (Figura 2F).
  13. Separe el tejido de las cuchillas flexionando las cuchillas entre los dedos o separándose con una segunda maquinilla de afeitar fría(Figuras 2G,2H,2I).

4. Sección de disección

  1. Abra el Allen Mouse Brain Atlas u otra referencia y encuentre los puntos de referencia necesarios para identificar las regiones de interés. Algunos puntos de referencia obvios incluyen la comisura anterior, el cuerpo calloso, los ventrículos laterales y el hipocampo(Figura 3).
  2. Voltee la sección a cortar con fórceps refrigerados y asegúrese de que la región a punto de ser recolectada sea consistente en toda la sección. Durante la cosecha, consulte el atlas de referencia a menudo para asegurarse de que se obtiene el ROI correcto.
    NOTA: Una lupa o un microscopio de disección a menudo es útil en este proceso. Una buena iluminación también es esencial. Para ello se pueden utilizar lámparas LED de baja potencia o una lámpara fría (ver Tabla de Materiales).
  3. Con un bisturí o punzón limpio, corte en la sección(Figura 4). Preenceles cada herramienta antes de cortarla tocándola brevemente para secar el hielo. Empuje la hoja suavemente pero firmemente en el tejido, balanceándola hacia adelante y hacia atrás para hacer el corte. No empuje demasiado fuerte o el tejido se fracturará.
    NOTA: Las herramientas se calentarán con el tiempo. Las cuchillas ligeramente calentadas pueden ser útiles para hacer cortes limpios y pueden limitar la fractura, pero tenga cuidado de evitar la descongelación del tejido. Enfríe periódicamente las herramientas sobre hielo seco.
  4. Una vez que se cosecha un ROI, colóquelo en tubos de 1,5 ml preenfriados y etiquetados. Conservar los tejidos cosechados a -80oC hasta que sea necesario.
  5. Procesar el tejido congelado recogido de esta manera mediante la adición de tampón RIPA frío (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS y cóctel inhibidor de proteínas (ver Tabla de Materiales))para extracción de proteínas, o un disolvente que contiene guanidinio (ver Tabla de Materiales)para la extracción de ARN a la muestra congelada y homogeneizar inmediatamente utilizando un Dounce de vidrio o un homogeneizador mecánico (ver Tabla de Materiales). De esta manera, los inhibidores de la proteasa y la nucleasa están en su lugar a medida que la muestra se calienta para proteger las proteínas y los ácidos nucleicos de la degradación.

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Representative Results

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Para validar este método, la corteza prefrontal medial se recogió de ratones machos de tipo salvaje CD1 adultos y ARN y proteínas fueron extraídos y caracterizados. El ARN fue analizado por electroforesis capilar. El ARN degradado muestra una pérdida en la intensidad de las bandas ribosomales 28S y 18S y también muestra los productos de degradación como un frotis entre 25 y 200 nucleótidos(Figura 5A,muestra 1). ARN de alta calidad muestra bandas ribosomales distintas con poca o ninguna señal en la región de menor peso molecular(Figura 5A,muestra 2). En este análisis también se generan números de integridad de ARN (RIN). Los RIN superiores a 7 indican ARN de buena calidad19. El ARN aislado de las muestras utilizando el método de disección congelada muestra bandas ribosomales fuertes y valores altos de RIN que se comparan muy favorablemente con el ARN preparado a partir de tejido recién cosechado(Figura 5B).

Una ventaja de este método es que un gran número de cerebros pueden ser cosechados rápidamente y almacenados en una sesión para ser cuidadosamente diseccionados en un momento posterior. Los IIF también se pueden almacenar sin descongelar los tejidos. Con este método, un investigador puede recoger una colección grande y diversa de ROIs de la que se puede obtener ácido nucleico o proteína de alta calidad. Para confirmar este punto, el ARN se extrajo del mPFC diseccionado que se había almacenado durante varias semanas (los cerebros cosechados se habían almacenado durante varios meses). Todas las muestras produjeron ARN de alta calidad con bandas ribosomales distintas y RIN por encima de 8(Figura 5C).

El análisis de la mancha occidental se utilizó para confirmar la integridad proteica de mPFC diseccionado congelado como se describió anteriormente20. Las manchas occidentales muestran una señal reducida de objetivos de alto peso molecular cuando la proteína se degrada. Los productos de degradación también aparecen como un frotis en pesos moleculares más bajos dentro de la columna. Para este análisis se recogió proteína, se transfirió a nitrocelulosa y se sondeó con anticuerpos contra una diana de alto peso molecular, KCC2, y la proteína de menor peso molecular, actina(Figura 5D). En todos los casos, las bandas eran nítidas y distintas, sin productos de descomposición discernibles ni para KCC2 ni para actina. Estos experimentos confirman que la disección de LOS IRO utilizando este método permite la extracción de ARN y proteínas de alta calidad.

Figure 1
Figura 1: Preparación de superficies de trabajo congeladas. (A) Un bloque cerebral se coloca en una pila de paquetes de gel dentro de una caja aislada y luego se intercala entre dos paquetes de gel adicionales. La lámina de aluminio se embala en cada extremo del bloque para facilitar el enfriamiento durante el seccionamiento. La caja se enfría durante la noche a -20 oC. (B) Una placa de vidrio se combina para el tamaño con la apertura de una caja aislada. Una caja de envío se puede utilizar para este propósito. El hielo se añade a la caja hasta que esté aproximadamente a 5 cm de la parte superior. La caja se congela durante la noche a -20 oC. (B, C) Justo antes de recoger tejido, se coloca una capa uniforme de hielo seco en la parte superior del hielo a una profundidad de aproximadamente 2,5 cm. Una hoja de plástico negro (para ayudar en la visualización) se coloca sobre el hielo seco seguido por la placa de vidrio. El hielo seco se coloca en las esquinas más lejanas, lo que enfría el aire justo encima de la placa. Las herramientas se pueden enfriar poniéndolas en el plato, o tocándolas brevemente al hielo seco. (D) Para asegurar secciones simétricas, el cerebro debe colocarse con fórceps fríos para que el seno sagital sagital y el seno transversal se alineen con las ranuras perpendiculares del bloque (flechas blancas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Seccionar el cerebro usando un bloqueo cerebral. (A) La orientación del cerebro está anclada al colocar cuchillas de afeitar convencionales de un solo borde en la corteza a una profundidad de aproximadamente 1 mm. Colocar una en el medio y otra en cada extremo ayuda a mantener el cerebro en posición. (B) Agregue las cuchillas una a la vez hasta que se llenen todas las ranuras. (C) Las cuchillas de perfil bajo se pueden insertar entre cuchillas convencionales cuando se desean secciones de 0,5 mm (flecha roja). (C, D) El grupo de cuchillas se introduce en el tejido congelado con presión descendente moderada, utilizando un instrumento plano o la palma o los dedos de la mano. Las cuchillas se pueden balancear lentamente hacia adelante y hacia atrás para ayudar a moverlas a través del tejido. (E) Las secciones se retiran agarrando los lados de las cuchillas de afeitar y usando un movimiento de balanceo y una presión firme hacia arriba (Precaución: Tenga cuidado de evitar los extremos afilados de las cuchillas). Levante el grupo fuera del bloque y colóquelo en el lado anterior hacia arriba en la placa de vidrio congelado. Coloque el hielo seco adyacente a las cuchillas para enfriar completamente las secciones antes de separarlas. (F) Separe las cuchillas y las secciones en orden. (G, H) Las secciones se pueden quitar de las cuchillas flexionando ligeramente la hoja con los dedos en la dirección de las flechas y empujando la sección hacia fuera con una segunda hoja fría. (I) Algunas secciones pueden requerir la eliminación calentando ligeramente la cuchilla de afeitar entre los dedos y los pulgares y luego cortar rápidamente la sección congelada con una segunda hoja fría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinación de los IIF utilizando puntos de referencia y el Atlas cerebral de ratón Allen. En este ejemplo, las secciones cerebrales congeladas están a la izquierda con las placas correspondientes del Atlas Cerebral Allan Mouse a la derecha. Los ROI (contornos de puntos rojos) se identifican comparando puntos de referencia visibles (formas negras) con el Atlas cerebral de ratón Allen. Lugares de interés incluyen: fa y cc, corpus callosum, aco, anterior commissur, VL, ventrículo lateral, V3, tercer venticle. Ejemplo de ROI: Pl/Il, corteza prelímbica e infralímbela, ACB, núcleo accumbens, MOs, corteza motora, CP, caudoputamen, HPF, hipocampo/dentado gyrus. Imágenes del Atlas coronal en el crédito correcto: Allen Institute. Las imágenes provienen de las placas 40, 44, 55 y 71 (de arriba a abajo) y se obtuvieron de https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Disección de ROIs. (A) Las secciones se manejan utilizando fórceps que se enfrían periódicamente sobre hielo seco. Ambos lados de cada sección deben compararse con las imágenes del atlas correspondientes antes de la disección. (B) los ROI se extraen de las secciones cerebrales con bisturí frío o(C)punción de biopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis del ARN y la proteína utilizando el método de disección cerebral congelada. (A) Ejemplo de ARN pobre frente a buena calidad. La separación electroforética de la muestra 1 muestra ARN degradado con bandas débiles de 28S y 18S y productos de degradación entre 25 y 200 nucleótidos (nt). La muestra 2 muestra ARN de buena calidad con bandas fuertes de 28S y 18S y poca señal a bajos pesos moleculares. Los números de integridad del ARN reflejan esta diferencia con la muestra 1, RIN a 2,5 y la muestra 2, RIN a 8,6. (B) Comparación del ARN extraído del ARN congelado frente a la corteza prefrontal medial recién diseccionada de ratones. Las muestras congeladas se mantuvieron a -80 oC durante varios meses antes de la disección. Las muestras frescas se procesaron inmediatamente después de la cosecha. Los valores de RIN de las muestras recogidas utilizando ambos métodos son altos, con bandas fuertes de 18S y 28S que indican que se ha conservado ácido nucleico. (C, D) mPFC se diseccionó de cerebros congelados y se extrajo ARN o proteína. (C) El análisis de ARN muestra que se obtuvo ARN de buena calidad para las doce muestras con rIN altos y poco producto de degradación observado. (D) El análisis de la mancha occidental se realizó sobre proteínas totales y se sondeó para la presencia del canal ion KCC2 de alto peso molecular (bandas rojas, MW a 130 kDa). La banda KCC2 es claramente visible sin productos de descomposición de menor peso molecular observados. También se muestra el gen de limpieza, Actin (bandas verdes, MW a 42 kDa). muestras de mPFC de 12 cerebros están etiquetadas 1-12. WB significa control cerebral completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Este trabajo describe una técnica para aislar pequeñas regiones específicas del cerebro mientras limita la degradación del ácido nucleico y la proteína. El daño a los tejidos cerebrales ocurre rápidamente una vez que un organismo muere. Esto se debe en parte a una rápida acumulación de glutamato extracelular y la excitotoxicidad resultante que se produce21. El ARN mensajero es particularmente vulnerable a la degradación22,23. La descomposición de la proteína y el ácido nucleico se reduce en gran medida a bajas temperaturas como lo demuestra un artículo reciente que describe la actividad biológica en células de mamut congeladas en permafrost hace 28.000años.

Con el método descrito en este documento, los cerebros se congelan a presión y las herramientas y tejidos se mantienen por debajo de la congelación hasta que se inicia la extracción de ácido nucleico o proteína. Los ROC congelados se homogeneizan en el tampón que contiene inhibidores de la proteasa y la nucleasa, protegiendo las moléculas diana de la degradación a temperaturas más altas.

En este proceso, es importante identificar puntos de referencia claros para identificar los IU dentro de las secciones. Las vías de fibra de la comisura anterior y el cuerpo calloso funcionan bien para este propósito, al igual que los ventrículos. También se pueden utilizar cambios en la forma del hipocampo a medida que uno se mueve de antes a posterior. Dependiendo de lo bien que el cerebro esté alineado en la matriz, los puntos de referencia pueden estar sesgados o faltantes. Se debe tener precaución antes de recoger los IRO de secciones como esta, ya que las regiones contaminantes pueden terminar en la muestra. Antes de la recopilación, se debe comprobar un ROI en ambos lados de la sección para asegurarse de que es coherente en toda la sección. La disección de LOS ROC se limita a áreas bien definidas del cerebro que son mayores que aproximadamente 1 mm en la dimensión x-y.

Al disecizar los IU, es necesario mantener los tejidos congelados sin que sean demasiado frágiles. El tejido demasiado frío se fracturará cuando se aplique presión con un punzón o bisturí. La región de interés es a menudo difícil de identificar a partir de otros fragmentos cuando esto sucede. Una manera de mitigar esto es mover brevemente las secciones a una zona más cálida de la placa (lejos del hielo seco). También es importante mantener la placa de vidrio limpia. Una vez que se procesa una sección, la placa debe rasparse limpiamente con una cuchilla de afeitar antes de pasar a la siguiente. Con el tiempo, el agua se condensará en la placa de disección del aire que puede cubrir o interferir de otro modo con el reconocimiento de la muestra. La limpieza de la placa se realiza raspando el borde afilado de una cuchilla de afeitar a través de la superficie del vidrio y limpiando la escarcha y los desechos recogidos. Los pequeños ROI se vuelven indistinguibles de los fragmentos cerebrales no deseados, por lo que es muy importante mantener un área de trabajo limpia.

Muchos laboratorios utilizan productos comerciales25 para proteger el ARN en los tejidos cosechados. Mientras que las moléculas lábiles están bien conservadas de esta manera, un inconveniente es que la morfología del tejido se cambia radicalmente. Como resultado, puede ser difícil encontrar las regiones de interés utilizando mapas de referencia. Por lo tanto, disecting ROIs de cerebros congelados antes de usar estos productos puede ser una mejor opción.

Aunque nos hemos centrado en las rodajas coronales en este trabajo, este método debería funcionar bien para secciones horizonales y sagitales. Los mapas para estas orientaciones son generalmente de menor resolución en comparación con los de las secciones coronales. Sin embargo, esto está cambiando rápidamente con iniciativas de grupos como el Allen Brain Institute. Otra consideración es la edad del animal en la cosecha. La morfología de los cerebros animales jóvenes es muy diferente a la del adulto y requerirá un atlas especializado y una matriz cerebral de diferente tamaño. Recursos como el Developing Mouse Brain Atlas26 son esenciales para recoger muestras cerebrales precisas de ratones más jóvenes.

Este trabajo describe un proceso que se puede utilizar para cosechar pequeñas regiones desde dentro del cerebro de roedores. La morfología de las secciones está bien conservada con corte congelado, y como los tejidos se mantienen congelados desde la cosecha hasta la extracción, la calidad del ácido nucleico y la proteína es alta. Este proceso tiene la ventaja sobre la disección de tejido recién recolectado como cerebros de muestra de un gran grupo de animales se pueden recoger y almacenar rápidamente. Las regiones dentro de los cerebros pueden ser identificadas usando puntos de referencia identificados en atlas cerebrales comunes y recogidos a un ritmo cuidadoso sin perder moléculas diana. Este método puede ser una buena opción para algunos laboratorios, ya que las herramientas y los regentes necesarios son baratos y fácilmente disponibles.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los NIH, DA043982 y DA046196.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Mouse coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 505C Cutting block
0.5 mm Rat coronal brain matrice Braintree Scientific BS-SS 705C Cutting block
1.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-01
1.5 mL microcentrifuge tubes Dot Scientific 229443 For storing frozen ROIs
1.5 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-02
2.0 mm Biopsy Punch with plunger Electron Microscopy Sciences 69031-03
4-12% NuPage gel Invitrogen NPO323BOX protein gradient gel
Bioanalyzer System Agilent 2100 RNA analysis system
Dounce tissue grinder Millipore Sigma
D8938
Glass tissue homogenizer
Dry Ice
Fiber-Lite Dolan-Jenner Industries Inc. Model 180 Cool lamp
Glass plates LabRepCo 11074010
HALT ThermoFisher 78440 protease inhibitor cocktail
Low profile blades Sakura Finetek USA Inc. 4689
mouse anti-actin antibody Developmental Studies Hybridoma Bank JLA20 Antibody
Nanodrop Thermo Scientific 2000C Used in initial RNA purity analysis
No. 15 surgical blade Surgical Design Inc 17467673
Odyssey Blocking buffer LiCor Biosciences 927-40000 Western blocking reagent
Omni Tissue Master 125 VWR 10046-866 Tissue homogenizer
rabbit anti-KCC2 antibody Cell Signaling Technology 94725S Antibody
RNA Plus Micro Kit Qiagen 73034 Used to extract RNA from small tissue samples
RNaseZap Life Technologies AM9780
Scalpel handle Excelta Corp. 16050103
Standard razor blades American Line 66-0362
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 Used to extract RNA from tissue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. Available from: https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas (2008).
  2. Kuleshova, E. P. Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology. Neuroscience and Behavioral Physiology. 49, (2), 169-177 (2019).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930 (2009).
  4. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome. Cerebral cortex. 25, (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).
  5. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, (1), 57-63 (2009).
  6. Kebschull, J. M., et al. High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA. bioRxiv. 054312 (2016).
  7. Mitulović, G., Mechtler, K. HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics. 5, (4), 249-260 (2006).
  8. Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC Research Notes. 4, 314 (2011).
  9. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. JoVE. (7), e269 (2007).
  10. Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457 (2018).
  11. Björk, K., et al. Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity. The FASEB Journal. 20, (11), 1826-1835 (2006).
  12. Jeong, H., et al. Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia. Frontiers in Systems Neuroscience. 12, (63), (2018).
  13. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics, Neuromethods. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).
  14. Palkovits, M. Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat. Brain Research. 59, 449-450 (1973).
  15. Palkovits, M. Methods in Enzymology. 103, Academic Press. 368-376 (1983).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. Academic Press. (2001).
  17. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. Academic Press. (1998).
  18. RNaseZap. Ambion. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf (2008).
  19. Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. Available from: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  20. Scheyer, A. F., et al. Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors. Biological Psychiatry. (2019).
  21. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, (1), 171-182 (1990).
  22. Guhaniyogi, J., Brewer, G. Regulation of mRNA stability in mammalian cells. Gene. 265, (1-2), 11-23 (2001).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PloS One. 8, (2), 56507 (2013).
  24. Yamagata, K., et al. Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging. Scientific Reports. 9, (1), 4050 (2019).
  25. Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. Available from: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (2011).
  26. Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. Available from: https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas (2008).
Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores
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Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).More

Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. J. Vis. Exp. (158), e60474, doi:10.3791/60474 (2020).

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