Summary
Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.
Abstract
Un bel équilibre de quiescence, d'auto-renouvellement et de différenciation est essentiel pour préserver le bassin de cellules souches hématopoïétiques (HSC) et maintenir la production à vie de toutes les cellules sanguines matures. Ces dernières années, le métabolisme cellulaire a émergé comme un régulateur crucial de la fonction HSC et le destin. Nous avons précédemment démontré que la modulation du métabolisme mitochondrial influence le destin de HSC. Plus précisément, en découplant chimiquement la chaîne de transport d'électrons, nous avons pu maintenir la fonction HSC dans des conditions de culture qui induisent normalement une différenciation rapide. Cependant, la limitation des nombres de HSC empêche souvent l'utilisation des essais standard pour mesurer le métabolisme de HSC et donc prévoir leur fonction. Ici, nous rapportons un essai simple de cytométrie de flux qui permet la mesure fiable du potentiel de membrane mitochondrique et de la masse mitochondrique dans les cellules rares telles que HSCs. Nous discutons l'isolement des HSCde de la moelle osseuse de souris et la mesure de la masse mitochondriale et de la culture post ex vivo potentielle de membrane. Par exemple, nous montrons la modulation de ces paramètres dans les HSC par le traitement avec un modulateur métabolique. En outre, nous étendons l'application de cette méthodologie sur les lymphocytes T périphériques humains dérivés du sang et les lymphocytes infiltrants de tumeur humaine (TILs), montrant des différences dramatiques dans leurs profils mitochondriaux, reflétant probablement différentes cellules T Fonctionnalité. Nous croyons que cet analyse peut être employé dans les criblages pour identifier des modulateurs du métabolisme mitochondrique dans différents types de cellules dans différents contextes.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont une petite population de cellules résidant dans la moelle osseuse assurant la production sanguine et l'homéostasie tout au long de la vie d'un organisme. Les HSC font la médiation de ce processus en donnant naissance à des progéniteurs qui, à leur tour, produisent des lignées de cellules sanguines matures différenciées en phase terminale par plusieurs cycles de division cellulaire et des étapes de différenciation bien orchestrées1. Fait important, les HSC produisent leur énergie par glycolyse anaérobie. En revanche, les progéniteurs hématopoïétiques plus engagés et actifs commutent leur métabolisme vers le métabolisme mitochondrial2,3,4. Cet état métabolique distinct est censé protéger les HSC contre les dommages cellulaires infligés par les espèces réactives d'oxygène (ROS) produites par les mitochondries actives, maintenant ainsi leur fonction in vivo à long terme5,6,7,8. La mesure directe de l'état métabolique de HSC est provocante et souvent faible débit en raison de leur nombre limité. Ici, nous décrivons un essai basé sur la cytométrie d'écoulement pour la mesure robuste du potentiel de membrane mitochondriale (M) utilisant la fluorescence de méthyle de méthylàure de térameramethylrhodamine (TMRM), et la masse mitochondrique utilisant une tache mitochondriale fluorescente verte (Mitotracker Vert) dans HSCs. Nous avons déjà démontré que le bas -m est un marqueur fonctionnel de bonne foi des HSC fortement purifiés9 et des modulateurs métaboliques capables d'abaisser la fonction d'amélioration de HSCs9,10. Ici nous proposons l'utilisation de notre méthode sur le profilage mitochondrial de HSCs comme stratégie pour identifier de nouvelles molécules capables d'améliorer le potentiel à long terme de reconstitution de sang des HSC.
À titre d'exemple, nous démontrons que cet analyse mesure de façon fiable l'abaissement de HSC'm lors de l'exposition à la vitamine B3 analog nicotinamide riboside (NR). En conséquence, dans notre étude récemment éditée nous démontrons que NR améliore fortement la posttransplantation de récupération de sang dans les systèmes de souris et humanisés de souris en améliorant directement les fonctions hématopoïétiques de tige et d'ancêtre10. La capacité de ces modulateurs métaboliques est d'une grande valeur clinique considérant qu'un taux de mortalité de 25% est lié au retard dans le sang et à la récupération immunisée dans les patients posttransplantés11,12.
En outre, nous fournissons la preuve que cette méthodologie peut être appliquée pour la caractérisation du profil métabolique et de la fonction des lymphocytes T humains. Ces dernières années, le développement de la thérapie cellulaire adoptive (ACT) utilisant des lymphocytes infiltrants de tumeur autologue (TILs) est devenu l'approche la plus efficace pour certains types de cancer avancé avec le pronostic extrêmement défavorable (par exemple, mélanome métastatique, où 'gt;50% de patients répondent au traitement et jusqu'à 24% de patients ont la régression complète)13. Cependant, les TILs hébergeant une activité antitumorale suffisante sont difficiles à générer14. La prolifération et la stimulation étendues que les TILs subissent pendant l'expansion ex vivo causent l'épuisement et la sénescence de cellules T qui altèrent considérablement la réponse antitumorale de cellule T15. Fait important, la capacité antitumorale des TIL est étroitement liée à leur métabolisme16,17 et les approches visant à moduler le métabolisme par l'inhibition de la voie PI3K/Akt ont produit des résultats encourageants18,19. Pour cette raison, nous comparons les cellules T dérivées de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et de TIL dérivées du patient, et montrons que les lymphocytes T moins différenciés dérivés de PBMC ont une masse inférieure et mitochondriale par rapport aux TIL différenciés en phase terminale.
Nous envisageons que cet analyse peut être utilisé pour identifier de nouveaux modulateurs métaboliques qui améliorent la fonction HSC et les lymphocytes T par la modulation de l'amon.
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Protocol
Toutes les expériences décrites dans le manuscrit suivent les directives de notre institution et ont été réalisées conformément au droit suisse pour l'expérimentation animale (Autorisation: VD3194) et pour la recherche portant sur des échantillons humains (Protocole: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Extraction hématopoïétique des cellules souches
- Achetez des souris sauvages de type C57BL6/J et gardez-les dans la maison des animaux pendant au moins une semaine pour réduire le stress associé au transport.
- Le jour de l'expérience, euthanasiez la souris à l'aide de l'asphyxie au CO2.
- Vaporiser la souris avec 70% d'éthanol pour stériliser la fourrure et ouvrir la souris au ventre en utilisant des outils chirurgicaux standard, tels que les ciseaux de dissection et les forceps, pour couper le fémur et les os du tibia des pattes postérieures.
- Retirez les muscles attachés au fémur, au tibia et au bassin à l'aide d'une serviette en papier souple et placez les os nettoyés dans un tube de 50 ml contenant du PBS avec 1 mM EDTA (tampon) sur la glace.
- Vaporiser un mortier et un pilon avec 70 % d'éthanol et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Stérilisez-le avec des UV pendant 30 min. Après la stérilisation, rincez le mortier et pilons avec tampon pour éliminer les traces d'éthanol.
- Mettre les os propres avec un tampon (10 ml) dans le mortier et les écraser délicatement pour sortir la moelle osseuse en suspension. Maintenant, collectez la suspension cellulaire et passez-la à travers une passoire à cellules de 70 m dans un tube de 50 ml pour obtenir une suspension à cellule unique.
- Répétez l'étape 1.6 jusqu'à ce que toute la moelle osseuse ait été extraite et que les débris osseux soient devenus blancs.
- Placez le tube (s) de 50 ml contenant la suspension à cellule unique de moelle osseuse sur une centrifugeuse. Faire fonctionner la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les cellules.
- Pendant ce temps, préparer 10 ml de tampon de lyse RBC 1x dans de l'eau distillée autoclaved. Filtrer la solution à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m.
- Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Pipette le tampon de lyse 1x RBC (Table des Matériaux) sur la pastille cellulaire. Déloger la pastille et préparer une solution homogène en faisant monter et descendre à quelques reprises. Laisser le tube être à température ambiante pendant 1 h 2 pour que la lyse RBC se produise. Arrêtez le processus de lyse en remplissant le tube avec le tampon.
- Placer le tube sur une centrifugeuse et faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre le granule en ajoutant 10 ml de tampon et filtrer la solution dans un nouveau tube de 50 ml via une passoire à cellules de 70 m pour enlever les débris en raison de la lyse RBC.
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 500 l'un de tampon.
- Retirer un aliquot de 100 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml. Ajoutez 50 L de cocktail d'anticorps d'épuisement de la lignée de biotine du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials) aux 450 l'autre de suspension cellulaire. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.
- Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 460 l'un de tampon. Retirer un aliquot de 10 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml.
- Ajouter 50 l de perles magnétiques streptavidin es du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials), à la suspension cellulaire restante de 450 l. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.
- Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 5 ml de tampon et transférer la solution dans un tube de 15 ml.
- Prendre le tube à un séparateur cellulaire automatisé (Table des matériaux). Exécuter un programme de lavage pour rincer et amorcer le tube du séparateur cellulaire. Placez l'échantillon et deux tubes de collecte sur le support du tube. Effectuer la séparation à l'aide du programme «Deplete». Recueillir les fractions positives et négatives du séparateur cellulaire automatisé une fois la course terminée.
REMARQUE: En l'absence d'un séparateur cellulaire automatique, les utilisateurs peuvent utiliser des colonnes magnétiques manuelles et des aimants correspondants, selon le manuel de l'utilisateur. Les utilisateurs doivent garder à l'esprit que le processus de séparation manuelle est plus lent que celui automatisé. En outre, les colonnes manuelles sont plus sujettes à l'engorgement. Par conséquent, il est conseillé aux utilisateurs de diluer l'échantillon et de charger lentement sur la colonne. - Jeter la fraction positive. Remplissez le tube de fraction négative avec un tampon. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Pendant ce temps, préparer le mélange d'anticorps dans 1 ml de solution de volume final et les commandes d'une seule couleur dans 200 L de solution de volume final comme décrit dans tableau des matériaux et tableau 1.
REMARQUE: Si le TMRM et la tache mitochondriale fluorescente verte doivent être combinés avec la coloration de marqueur de cellules souches, puis remplacez CD150-PE avec CD150-PEcy5 et Streptavidin-Tx rouge avec Streptavidin-Pac Orange. - Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de mélange d'anticorps. Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.13) dans chacun des tubes de contrôle d'une seule couleur (à l'exception de la lignée). Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.14) dans le tube de couleur unique de la lignée.
- Incuber l'échantillon et les tubes de commande d'une seule couleur à 4 oC sur un shaker pendant 45 min. Couvrir le seau à glace d'un couvercle ou d'une feuille d'aluminium.
- Remplir tous les tubes de tampon et de centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et suspendez l'échantillon dans 1 ml de tampon et de commandes d'une seule couleur dans 200 l'un de tampon.
- Transférer l'échantillon et les commandes unicolores sur des tubes FACS de 5 ml.
- Acqu'on trouve les tubes jusqu'à la machine de tri et triez la population de HSC (stratégie de gating dans la figure 1A)dans des tubes de 1,5 ml contenant 400 l de milieu d'expansion des cellules souches.
2. Ex Vivo Culture of Hematopoietic Stem Cells
- Recueillir des tubes contenant des cellules triées (voir la section 1 pour l'extraction cellulaire). Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez délicatement la majeure partie du supernatant sans déloger la pastille et laissez 50 à 80 l sur le dessus de la pastille cellulaire. Cela minimise la perte cellulaire.
- Resuspendre le granule cellulaire dans le milieu d'expansion des cellules souches à un volume final dépendant du nombre de conditions à tester (compte zettant pour 100 L par puits/condition de culture).
- Préparer un milieu de culture 2x contenant un milieu d'expansion des cellules souches, un facteur de cellules souches (200 ng/mL), un ligand FLT3 (4 ng/mL) et des antibiotiques pen-strep (1 %) (2x milieu basal; Tableau des matériaux).
- Prenez une culture stérile de tissu traitée 96 U-bottom plaque de puits (Tableau des matériaux) et d'identifier les puits où les cellules seront cultivées (conception de plaque dans la figure 1B).
REMARQUE: Il est conseillé aux utilisateurs d'éviter les puits marginaux, car ils sont plus sensibles à l'évaporation. - Mettre 100 ll de milieu basal 2x préalablement préparé à l'étape 2.3 dans ces puits. Dans le NR marqué bien ajouter 2 'L d'une solution NR 100x (Tableau des Matériaux). Réapprovisionnez NR toutes les 24 h.
REMARQUE: Le réapprovisionnement est spécifique à NR. D'autres modulateurs métaboliques peuvent ou ne peuvent pas avoir besoin de reconstitution. - Graines 100 l de cellules préparées à l'étape 2.2 sur les puits contenant 2x milieu basal. Dans cette expérience, le nombre de HSC ensedus par puits se trouvaient entre 800 et 1 000 cellules.
- Préparer cinq puits supplémentaires contenant 2x milieu basal. Dans chacune de ces cellules ajouter 100.000 cellules entières de moelle (à partir de l'étape 1.13) resuspendues dans 100 'L de milieu d'expansion de cellules souches pour être utilisé comme contrôles de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture.
REMARQUE: Si les utilisateurs veulent combiner des marqueurs de cellules souches et des marqueurs mitochondriaux pour l'analyse post-culture, il est recommandé de trier en outre la population progénitrice (cellules CkitMD ou LKSCD150- cellules). Ensemencez ces progéniteurs triés dans les puits de contrôle de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture. Préparer un puits par couleur de tache unique. - Mettre 200 ll d'eau autoclaved dans tous les puits environnants pour réduire l'évaporation des puits contenant des cellules. Laisser la plaque intacte dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pendant toute la durée de la période de culture (72 h). Retirez la plaque pour reconstituer NR toutes les 24 h et placez-la de nouveau dans l'incubateur.
3. Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire
- À la fin de la période de culture, préparez une solution 100x de TMRM (20 M) et de vert Mitotracker (10 M) (tache fluorescente verte) dans le milieu d'expansion des cellules souches(Tableau des matériaux).
- Ajouter 2 ll de la solution TMRM 100x et 2 l de solution de tache fluorescente verte de 100x dans chacun des puits d'essai. Ajouter 2 L de 100x TMRM dans le puits de commande TMRM. Ajouter 2 ll de tache fluorescente verte de 100x dans le puits de commande Mitotracker. Remettre la plaque dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 45 min. Couvrir le dessus de la plaque de papier d'aluminium.
REMARQUE: Un contrôle supplémentaire avec Verapamil (inhibiteur de pompe ABC) peut être préparé si l'efflux de colorant médié par la pompe ABC doit être testé. Pour cela, ajouter 50 M Verapamil dans l'un des puits d'essai 1 h avant de coloration pour TMRM et tache fluorescente verte. - Retirer la plaque de l'incubateur et la centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Inverser la plaque pour enlever le supernatant. Ajouter 200 oL de tampon FACS standard (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min. Retirez le supernatant. Répétez cette étape de lavage 3x. Les utilisateurs doivent s'assurer que la plaque est toujours recouverte de papier d'aluminium, afin d'offrir une exposition minimale à la lumière directe.
REMARQUE: Si les utilisateurs ont besoin de combiner la coloration mitochondriale avec la coloration des cellules souches, l'échantillon devra être incubé avec un mélange d'anticorps de tous les marqueurs de cellules souches et les contrôles d'une seule couleur devront être tachés avec des anticorps individuels séparément à 4 oC pendant 30 à 45 min.
REMARQUE: À toutes les étapes, les utilisateurs doivent garder la plaque recouverte de papier d'aluminium. Les utilisateurs doivent noter que cette étape de coloration supplémentaire et les étapes de lavage ultérieures peuvent entraîner une perte cellulaire supplémentaire. - Resuspendre les cellules dans 200 l de tampon FACS et transférer dans les tubes FACS.
- Exécuter les échantillons sur le cytomètre d'écoulement (voir Figure 1). Les tubes de couleur unique contenant WBM comprennent : (1) Non taché; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) tache fluorescente verte (FITC); (5) Tache complète (PE et FITC).
- D'abord acquérir les commandes unicolores pour configurer la machine. Utilisez le logiciel en cours d'exécution sur la machine pour calculer la compensation. Une fois la compensation appliquée, acquérez l'échantillon de HSC et enregistrez autant d'événements que possible.
REMARQUE: Si les marqueurs de cellules souches et mitochondriales sont combinés, les utilisateurs doivent être particulièrement prudents avec la compensation entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), et Sca-1 (APC). En outre, les échantillons doivent être exécutés immédiatement après coloration. - Exporter les fichiers FACS à partir du cytomètre et analyser les données sur un logiciel d'analyse (Tableau des Matériaux).
- Pour l'analyse, ouvrez le fichier sur le logiciel d'analyse. L'utilisation de FSC-A et sSC-A pour identifier la population cellulaire. Identifiez les singlets dans les portes suivantes avant de tracer la fraction négative DAPI (cellules vivantes). Dans la porte des cellules vivantes faire une parcelle de contour dans le TMRM et vert canal de taches fluorescentes pour mesurer la masse et la masse, respectivement (Figure 2A). Exporter l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de ces deux canaux dans la porte des cellules vivantes.
- La porte basse TMRM est fixée en fonction de la population d'épaules dans le canal TMRM. Le contrôle tMRM d'une seule couleur peut être utilisé pour identifier cette population d'épaules pour définir la porte. Exportez la proportion de cellules vivantes dans la porte basse de TMRM dans votre contrôle et testez des échantillons pour tracer.
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Representative Results
Dans la figure 1, nous montrons la stratégie de gating pour l'isolement des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de la souris et la disposition de la plaque pour leur culture ex vivo. La figure 1A montre l'identification de la fraction de lymphocyte dans la parcelle SSC-A/FSC-A. Les doublets ont été enlevés dans la porte de singlet suivie par l'identification des cellules vivantes par l'absence du signal de DAPI. La population de LKS, définie par la lignée- Sca1etcKit,a été identifiée. Cette population est connue pour contenir des cellules souches et progénitrices. Les HSC forment environ 5 à 10 % des cellules de la population de LKS et ont été identifiés par gating pour lapopulation cD150etCD48. La figure 1B représente la disposition de la plaque de 96 puits pour la culture ex vivo. Les HSC triés ont été plaqués dans différentes conditions de culture : Dans ce cas, le contrôle et les conditions de culture complétées de NR. Des cellules entières de moelle ont été également plaquées comme contrôles d'une seule couleur comme décrit dans le protocole. Il est important de remplir tous les puits environnants d'eau pour éviter l'évaporation des médias des puits contenant des cellules. En outre, comme mentionné précédemment, les puits marginaux ont été évités pour la culture cellulaire parce qu'ils sont plus sensibles à l'évaporation.
La figure 2 montre la mesure du potentiel de la membrane mitochondriale et de la masse dans la post-culture des HSC. La figure 2A montre des parcelles représentatives des niveaux de TMRM (ci-dessus) et de la tache mitochondriale fluorescente verte (ci-dessous) dans les HSC cultivés dans des conditions de contrôle et de NR complétées. Le traitement de NR a montré une augmentation claire de lafaible population de TMRM. La figure 2B montre la quantification à partir de trois échantillons indépendants. Le traitement de NR a sensiblement augmenté la proportion de cellules dans laporte basse de TMRM et a montré une baisse significative de l'intensité de fluorescence de TMRM. La masse mitochondriale (représentée par l'intensité verte-fluorescence) n'a pas changé sur la supplémentation de NR. En outre, nous avons combiné la coloration de marqueur de cellules souches avec la coloration mitochondriale post culture. La figure 2C montre la stratégie de gating pour identifier les HSC à partir de la lignée négative et les populations LKS post culture dans les deux conditions de culture. Le profil de tMRM et de tache mitochondriale fluorescente verte de ces HSC fermés est vu dans la figure 2D. L'exposition à la RN a montré une augmentation significative de lafaible population de MGRT et une diminution significative de l'intensité de la fluorescence du MGRT chez les HSC fermés. Le signal vert fluorescent de tache mitochondriale verte est resté inchangé dans les deux conditions.
La figure 3 montre la mesure du potentiel de la membrane mitochondriale et de la masse dans différentes lymphocytes T humains : cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) CD4 et CD8- lymphocytes T, ainsi que CD4et CD8- tumeur infiltrant les lymphocytes (TILs) après le protocole d'expansion rapide (REP). La figure 3A montre des parcelles représentatives des niveaux de TMRM (ci-dessus) et des niveaux de taches mitochondriales vert-fluorescent (ci-dessous) des cellules circulantes (PBMC) et infiltrantes de tumeurs (TIL) CD4 et CD8et T. Les TIL ont montré une augmentation claire de TMRM et du signal fluorescent vert de tache mitochondriale comparé aux cellules T circulantes. La figure 3B montre la quantification de l'IMF de TMRM et de la coloration mitochondriale fluorescente verte. Les TIL s'exposaient à des signaux de coloration mitochondriales fluorescents plus élevés et à des lymphocytes T dérivés de PBMC. Ces données indiquent que les TIL ont un profil métabolique distingué avec une masse accrue de 'm et de mitochondrial.
Figure 1: Isolement et culture des cellules souches hématopoïétiques. (A) Stratégie de gating pour l'isolement des cellules souches hématopoïétiques (HSC) basées sur des marqueurs de surface cellulaire. Les HSC ont été identifiés comme étant la lignée- Sca1et cKit (LKS) CD150etCD48-. (B) Conception de 96 plaques de puits mises en culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Profils mitochondriaux des HSC. (A) Diagramme de contour de FACS montrant HSCs post culture dans des conditions basales ou NR complétées. TMRM (ci-dessus) et les profils fluorescents verts de tache mitochondriale (Mitotracker) (ci-dessous). (B) Quantification du TMRM et du signal fluorescent vert de tache mitochondriale. La supplémentation de NR a eu comme conséquence une diminution du profil de TMRM tout en maintenant le signal fluorescent vert de tache mitochondriale. (C) Les parcelles de contour montrant l'identification de la population de HSC dans le contrôle et nr ont complété des conditions post culture. (D) Les parcelles de contour et la quantification de TMRM et le signal fluorescent vert de tache mitochondriale dans les HSC phénotypiques post culture. La supplémentation de NR a réduit le signal de TMRM tandis que le signal fluorescent vert de tache mitochondriale est resté inchangé dans HSCs. Étudiant t essai p'lt ; 0.001, 'p 'lt ; 0.01, 'p 'lt ; 0.05, pas significatif 'gt; 0.05, barres d'erreur 'lt. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Profils mitochondriaux de PBMC et de TILs humains : (A) diagramme de contour DES FACS montrant cD4et CD8- fraîchement isolés des PBMC ou des CD4 dérivés de tumeurset CD8et post REP (protocole d'expansion rapide). TMRM (ci-dessus) et les profils fluorescents verts de tache mitochondriale (Mitotracker) (ci-dessous). (B) Quantification du TMRM et du signal fluorescent vert de tache mitochondriale. Les TILs ont montré l'activité et la masse mitochondriques inférieures. Étudiant t-test p'lt; 0.001,'p 'lt; 0.01,'p 'lt; 0.05, pas significatif 'gt; 0.05, barres d'erreur 'SD. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| S.No | Nom d'anticorps | Dilution de travail |
| 1 | Streptavidin Tx rouge | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| À utiliser uniquement si les cellules souches et les marqueurs mitochondriaux combinés. | ||
| 6 | Streptavidin Pac orange | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tableau 1 : Dilutions d'anticorps.
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Discussion
Une régulation serrée de la fonction HSC est importante pour maintenir l'hématopoiesis stable pendant la vie d'un organisme. Comme divers autres types de cellules dans le corps, un composant clé qui contribue à la régulation de la fonction HSC est le métabolisme cellulaire. Des études antérieures de notre laboratoire9 et d'autres2,3 ont impliqué l'importance des mitochondries dans le maintien d'un état métabolique distinct dans les HSC. En raison du nombre extrêmement faible de HSCisolés de la moelle osseuse, il est difficile de les analyser par l'intermédiaire d'essais métaboliques standard (par exemple, la consommation d'oxygène avec SeaHorse). Sur la base de nos travaux antérieurs, nous avons normalisé un simple essai de cytométrie de débit pour mesurer de façon fiable la masse mitochondriale et le potentiel membranaire (une lecture indirecte de l'activité) dans un faible nombre de cellules (c.-à-d. les HSC). Cet analyse permet de mesurer sur les cellules vivantes sans compromettre leur viabilité9, les rendant disponibles pour tous les essais fonctionnels en aval (tels que les UFC ou les greffes de moelle osseuse) que les utilisateurs peuvent souhaiter effectuer. Nous prévoyons que cet analyse sera utilisé dans des expériences de dépistage, ce qui permettra une lecture rapide sur le profil mitochondrial des HSC de différents milieux génétiques ou des modèles knock-out. Fait important, notre analyse peut être combinée avec la coloration CFSE d'avoir une double lecture sur la prolifération HSC et son profil mitochondrial9,10, permettant l'analyse du sort métabolique de diviser HSCs. Considérant qu'il s'agit d'une procédure de coloration difficile et nous travaillons avec un faible nombre de cellules (HSCs), il est important que post centrifation ugug les utilisateurs laissent toujours 80 à 100 L de solution dans la perte de tubes. En outre, pendant toutes les étapes de coloration après les tubes ou les plaques doivent être protégés de la lumière, soit en les recouvrant dans du papier d'aluminium ou en travaillant dans un environnement de faible luminosité. Si les utilisateurs décident de combiner la tache HSC avec des colorants mitochondriaux, ils doivent vérifier si la compensation est effectuée correctement, en particulier entre TMRM (PE), PeCy5, et APC.
Fait important, une publication récente remet en question l'utilisation de colorants mitochondriaux dans les HSC parce qu'ils pourraient être sensibles à l'efflux de pompe. Ces études rapportent que la plupart des compartiments hématopoïétiques primitifs ont un plus grand nombre de mitochondries par rapport à leurs progéniteurs engagés20. Dans notre expérience, l'utilisation de modèles génétiques de souris (souris mito eGFP21),mitochondries colorants indépendants méthodes de coloration (anticorps TOM20), qPCR analyse soutient l'idée que la plupart des compartiments hématopoïétiques primitifs ont un contenu mitochondrial inférieur10. Nous pensons que d'autres études doivent être réalisées afin de clarifier cet écart sur le terrain.
En parallèle, nous démontrons que l'utilisation du profilage mitochondrial pourrait être exploitée pour déterminer la forme métabolique des TIL humains et développer des stratégies métaboliques visant à restaurer la fonction des lymphocytes T épuisés. En fait, les lymphocytes T isolés des PBMC présentent une activité mitochondriale plus faible (TMRM) et une masse (Mitotracker Green), tandis que les lymphocytes T plus épuisés tels que les TIL ont une activité et une masse mitochondriales plus élevées, suggérant une reprogrammation métabolique possible se produisant pendant l'épuisement. En conséquence, des études publiées antérieures ont démontré que les lymphocytes T de mémoire de cellules souches (TSCM), les cellules T avec la persistance accrue et capable de la réponse à long terme de rappel, ont plus bas et les traitements ciblant le métabolisme de cellules T peuvent fortement influencer leur fonction22,23.
Enfin, nous croyons que notre approche pourrait être un outil précieux pour l'identification de nouveaux composés qui peuvent réparer les HSC dysfonctionnels (par exemple, le vieillissement ou les malignités hématologiques) en rétablissant leur condition physique mitochondriale.
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Disclosures
Certains éléments de ce travail ont été soumis à la demande P1828EP00 à l'Office européen des brevets.
Acknowledgments
Nous remercions l'UNIL Flow Cytometry Core Facility pour son soutien, en particulier le Dr Romain Bedel. Ce travail a été soutenu par la subvention de la fondation Kristian Gerhard Jebsen à N.V et O.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
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