Summary
Här beskriver vi en tillförlitlig metod för att mäta mitokondriell massa och membran potential i ex vivo odlade hematopoietiska stamceller och T-celler.
Abstract
En fin balans av quiescence, självförnyelse, och differentiering är nyckeln till att bevara den hematopoietiska stamcells (HSC) pool och upprätthålla livslångt produktion av alla mogna blodkroppar. Under de senaste åren cellulär metabolism har uppstått som en avgörande regulator av HSC funktion och öde. Vi har tidigare visat att modulering av mitokondriell metabolism påverkar HSC ödet. I synnerhet genom att kemiskt avkoppla elektrontransportkedjan kunde vi bibehålla HSC-funktionen i odlingsförhållanden som normalt inducerar en snabb differentiering. Men begränsar HSC-nummer ofta utesluter användning av standardanalyser för att mäta HSC metabolism och därför förutsäga deras funktion. Här rapporterar vi ett enkelt flödescytometri-test som möjliggör tillförlitlig mätning av mitokondriell membranpotential och mitokondriell massa i knappa celler som HSCs. Vi diskuterar isolering av HSCs från mus benmärg och mätning av mitokondriell massa och membran potentiell post ex vivo kultur. Som ett exempel visar vi moduleringen av dessa parametrar i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Dessutom utökar vi tillämpningen av denna metod på mänskliga perifera blod-härledda T-celler och mänsklig tumör infiltrerande lymfocyter (TILs), visar dramatiska skillnader i deras mitokondriella profiler, möjligen återspeglar olika T-cell Funktionalitet. Vi tror att denna analys kan användas i screening för att identifiera modulatorer av mitokondriell metabolism i olika celltyper i olika sammanhang.
Introduction
Hematopoietiska stamceller (HSCs) är en liten population av celler som är bosatta i benmärgen och säkerställer blod produktion och homeostas under hela organismens livstid. Hscs medla denna process genom att ge upphov till föregångare som i sin tur producerar obotligt differentierade mogna blodkroppar linjer via flera omgångar av celldelning och väl iscensätta differentiering steg1. Viktigare, HSCs producera sin energi via anaerob glykolys. Däremot, mer engagerade och aktiva hematopoietiska stamceller byta sin metabolism mot mitokondriell metabolism2,3,4. Denna distinkta metaboliska tillstånd tros skydda hscs från cellulära skador orsakade av reaktiva syreradikaler (ros) som produceras av aktiva mitokona, och därigenom bibehålla sin långsiktiga in vivo funktion5,6,7,8. Direkt mätning av HSC metaboliska tillstånd är utmanande och ofta låg genomströmning på grund av deras begränsade antal. Här beskriver vi ett flödescytometri-baserat test för robust mätning av mitokondriell membran potential (ΔΨm) med hjälp av tetrametylrodamin metyl Ester (tmrm) fluorescens, och mitokondriell massa med hjälp av en grön fluorescerande mitokondriell fläck (mitotracker grön) i hscs. Vi har tidigare visat att Low ΔΨm är en bona-fide funktionell markör för höggradigt renade hscs9 och metaboliska modulatorer som kan sänka ΔΨm förbättra hscs funktion9,10. Här föreslår vi användning av vår metod på HSCs mitokondriell profilering som strategi för att identifiera nya molekyler som kan förbättra HSCs långsiktiga blodrekonstituering potential.
Som ett exempel visar vi att denna analys på ett tillförlitligt sätt mäter sänkningen av HSC ΔΨm vid exponering för vitamin B3 analog nikotinamid riboside (NR). Följaktligen, i vår nyligen publicerade studie visar vi att nr starkt Ameliorates blod återhämtning transplantation i både mus och humaniserade mus system genom att direkt förbättra hematopoietiska Stem och progenitorfunktioner10. Kapaciteten hos sådana metaboliska modulatorer är av stort kliniskt värde med tanke på att en 25% döds frekvens är kopplad till försening i blod och immun återhämtning hos posttransplanterade patienter11,12.
Dessutom ger vi belägg för att denna metod kan användas för karakterisering av den metaboliska profilen och funktionen hos mänskliga T-celler. Under de senaste åren, utvecklingen av adoptiv cellterapi (ACT) använder autolog tumör infiltrerande lymfocyter (TILs) har blivit den mest effektiva metoden för vissa typer av avancerad cancer med extremt ogynnsamma prognos (t. ex., metastaserande melanom, där > 50% av patienterna svarar på behandling och upp till 24% av patienterna har fullständig regression)13. Men TILs hyser tillräcklig antitumöraktivitet är svåra att generera14. Den omfattande spridning och stimulering som TILs genomgår under ex vivo expansion orsak t cell utmattning och åldras som dramatiskt försämrar t-cell antitumörrespons15. Viktigt, TILs ' antitumöreffekt kapacitet är tätt kopplad till deras metabolism16,17 och metoder som syftar till att modulera metabolism genom hämning av PI3K/akt vägen har producerat uppmuntrande resultat18,19. Av denna anledning, vi jämför ΔΨm av T-celler som härrör från perifera blod mononukleära celler (pbmcs) och patient-derived tils, och visar att mindre differentierade PBMC-härledda T-celler har lägre ΔΨm och mitokondriell massa jämfört med obotligt differentierade TILs.
Vi föreställa att denna analys kan användas för att identifiera nya metaboliska modulatorer som förbättrar HSC och T-cells funktion via modulering av ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs i manuskriptet följer riktlinjerna från vår institution och genomfördes i enlighet med schweizisk lag för djurförsök (tillstånd: VD3194) och för forskning som inbegriper mänskliga prover (protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietisk stamcells utvinning
- Köp Wild Type C57BL6/J möss och förvara dem i djur huset i minst en vecka för att minska transportrelaterad stress.
- På dagen för experimentet, euthanize musen med hjälp av CO2 kvävning.
- Spraya musen med 70% etanol för att sterilisera pälsen och skär öppna musen på magen med hjälp av standard kirurgiska verktyg, såsom dissektion sax och tång, att skära lårbenet och Tibia ben från bakbenen.
- Ta bort musklerna knutna till lårbenet, Tibia, och bäckenet med hjälp av en mjuk pappershandduk och placera de rengjorda benen i en 50 mL tub innehållande PBS med 1 mM EDTA (buffert) på is.
- Spraya en murbruk och mortelstöt med 70% etanol och placera den i en cellkultur huva. Sterilisera den med UV i 30 min. efter sterilisering skölj mortel och mortelstöt med buffert för att avlägsna spår av etanol.
- Sätt rena ben med lite buffert (~ 10 mL) i murbruk och försiktigt krossa dem för att få benmärgen i suspensionen. Nu, samla in cellsuspensionen och passera den genom en 70 μm cell SIL i en 50 mL tub för att få en enda cellsuspension.
- Upprepa steg 1,6 tills all benmärg har extraherats och ben spillningen har blivit vit.
- Placera de 50 mL-rör som innehåller den enda cellsuspensionen i benmärgen på en centrifug. Kör centrifugen vid 300 x g i 10 min vid 4 ° c för att pelleten cellerna.
- Förbered samtidigt 10 mL 1x RBC-lysbuffert i autoklaverat destillerat vatten. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter.
- Samla provröret från centrifugen och dekanera supernatanten. Pipettera 1x RBC lysis buffert (tabell över material) på cellpelleten. Ta bort pelleten och Bered en homogen lösning genom att Pipettera upp och ner några gånger. Låt röret vara i rumstemperatur under 1 – 2 min för att RBC Lys ska inträffa. Stoppa Lys processen genom att fylla upp röret med bufferten.
- Placera röret på en centrifug och snurra på 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Samla röret från centrifugen och dekanera supernatanten. Omsuspendera pelleten genom att tillsätta 10 mL buffert och filtrera lösningen i ett nytt 50 mL-rör via en cell SIL med 70 μm för att ta bort skräpet på grund av RBC Lys.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Samla röret från centrifugen och dekanera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 500 μL buffert.
- Ta bort en 100 μL alikvot och förvara i en separat 1,5 mL tub. Tillsätt 50 μL av biotin Lineage utarmning antikropps cocktail från progenitorceller beriknings satsen (tabell över material) till resterande 450 μl cellsuspension. Inkubera vid 4 ° c i en shaker i 15 min.
- Tillsätt 15 mL buffert och centrifugera röret med 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Samla röret från centrifugen och dekanera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 460 μL buffert. Ta bort en 10 μL alikvot och förvara den i ett separat 1,5 mL-rör.
- Tillsätt 50 μl konjugerat magnetiska pärlor från progenitorceller beriknings satsen (tabell över material), till den återstående 450 μl cellsuspensionen. Inkubera vid 4 ° c i en shaker i 15 min.
- Tillsätt 15 mL buffert och centrifugera röret med 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Samla röret från centrifugen och dekanera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 5 mL buffert och överför lösningen till en 15 mL tub.
- Ta röret till en automatiserad cell separator (tabell över material). Kör ett tvättprogram för att skölja och Prime slangen av cell avskiljaren. Placera provet och två samlingsrör på rörhållaren. Utför separering med hjälp av "tömma"-programmet. Samla in de positiva och de negativa fraktionerna från den automatiserade cell avgränsaren när körningen har avslutats.
Anmärkning: I avsaknad av en automatisk cell separator kan användarna använda manuella magnetiska kolonner och motsvarande magneter, per användarhandboken. Användarna bör ha i åtanke att processen för manuell separation är långsammare än den automatiserade en. Dessutom är de manuella kolumnerna mer benägna att igensättning. Därför, användare rekommenderas att späda provet och belastningen på kolonnen långsamt. - Kassera den positiva fraktionen. Fyll det negativa fraktions röret med buffert. Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Bered samtidigt antikropps blandningen i 1 mL slutlig volym lösning och enfärgade kontroller i 200 μL av den slutliga volym lösningen enligt beskrivningen i tabell över material och tabell 1.
Anmärkning: Om TMRM och den gröna fluorescerande mitokondriefärgad ska kombineras med stamcells markör färgning, ersätt sedan CD150-PE med CD150-PEcy5 och Streptavidin-TX Red med Streptavidin-PAC orange. - Samla provröret från centrifugen och dekanera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 1 mL antikropps blandning. Tillsätt 10 μL celler (från steg 1,13) i var och en av de enfärgade kontroll rören (utom härstamning). Tillsätt 10 μL av celler (från steg 1,14) i Lineage enda färg röret.
- Inkubera provet och enfärgade kontroll rören vid 4 ° c i en shaker för 45 min. Täck isskopan med lock eller aluminiumfolie.
- Fyll alla rör med buffert och centrifugera på 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera provet i 1 mL buffert och enfärgade kontroller i 200 μL buffert.
- Överför provet och kontrollerna med en färg till 5 mL filtertop FACS-rör.
- Ta rören till sorterings maskinen och sortera HSC population (gating strategi i figur 1A) i 1,5 mL rör som innehåller 400 μl stamcells expansions medium.
2. ex vivo kultur av hematopoietiska stamceller
- Samla in rör som innehåller sorterade celler (se avsnitt 1 för cell extrahering). Centrifugera rören vid 300 x g i 5 min vid 4 ° c. Ta försiktigt bort de flesta av supernatanten utan att lossa pelleten och lämna 50 – 80 μL ovanpå cellpelleten. Detta minimerar cell förlusten.
- Omsuspendera cellpelleten i stamcells expansions medium till en slutlig volym beroende på antalet villkor som ska testas (antal för 100 μL per brunn/tillstånd för kultur).
- Förbered ett 2x odlingsmedium som innehåller stamcells expansions medium, stamcells faktor (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) och Pen-STREP-antibiotika (1%) (2x basal medium; Tabell över material).
- Ta en steril vävnadsodling behandlas 96 U-botten väl plattan (tabell över material) och identifiera brunnar där cellerna kommer att odlas (plåt design i figur 1B).
Anmärkning: Användare uppmanas att undvika marginella brunnar, eftersom de är mer mottagliga för avdunstning. - Sätt 100 μL 2x basmedium som tidigare förberetts i steg 2,3 i dessa brunnar. I NR märkt väl Tillsätt 2 μL av en 100x NR lösning (tabell över material). Fyll NR var 24 h.
Anmärkning: Påfyllnad är specifik för NR. Andra metaboliska modulatorer kan eller kanske inte behöver påfyllning. - Utsäde 100 μL av celler som bereds i steg 2,2 ovanpå brunnarna som innehåller 2x basala mediet. I detta experiment var antalet HSCs seedade per brunn mellan 800 – 1000 celler.
- Förbered fem extra brunnar som innehåller 2x basal medium. I var och en av dessa Tillsätt 100 000 hela benmärgsceller (från steg 1,13) återsuspenderade i 100 μL av stamceller expansions medium som ska användas som färgning kontroller för post kultur flöde flödescytometrianalys analys.
Anmärkning: Om användare vill kombinera stamcells markörer och mitokondriella markörer för post kulturanalys rekommenderas det att dessutom sortera stam populationen (antingen ckit + celler eller LKSCD150-celler). Utsäde dessa sorterade progenitorer i färgning kontroll brunnar för post kultur flödescytometri analys. Förbered en brunn per enskild fläck färg. - Sätt 200 μL autoklaverat vatten i alla omgivande brunnar för att minska avdunstning från brunnar som innehåller celler. Lämna plattan ostörd i en inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 under kultur periodens längd (72 h). Ta bort plattan för att fylla på NR varje 24 h och placera tillbaka den i inkubatorn.
3. mätning av mitokondriell massa och membran potential
- Vid slutet av kultur perioden förbereda en 100x lösning av TMRM (20 μM) och Mitotracker grön (10 μM) (grön fluorescerande fläck) i stamceller expansions medium (tabell över material).
- Tillsätt 2 μL 100x TMRM-lösning och 2 μL 100x grön fluorescerande fläck lösning i var och en av test brunnarna. Tillsätt 2 μL 100x TMRM i TMRM-kontrollen väl. Tillsätt 2 μL 100x grön fluorescerande fläck i Mitotracker-kontrollen väl. Placera plattan tillbaka i en inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 för 45 min. Täck toppen av plattan med aluminiumfolie.
Anmärkning: En ytterligare kontroll med verapamil (ABC pump inhibitor) kan förberedas om ABC pump medierad Dye efflux behöver testas. För detta, tillsätt 50 μM verapamil i en av test brunnarna 1 h före färgning för TMRM och grön fluorescerande fläck. - Ta bort plattan från inkubatorn och centrifugera den på 300 x g i 5 min. Vänd på plattan för att avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 μL standard FACS buffert (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), Centrifugera plattan på 300 x g i 5 min. ta bort supernatanten. Upprepa detta tvättsteg 3x. Användarna måste se till att plattan alltid är täckt med folie, för att ge minimal exponering för direkt ljus.
Anmärkning: Om användarna behöver kombinera mitokondriell färgning med stamcells färgning, måste provet inkuberas med en antikropps blandning av alla stamcells markörer och kontrollerna med en färg kommer att behöva färgas med individuella antikroppar separat vid 4 ° c i 30 – 45 minuter.
Anmärkning: I alla steg användare måste hålla plattan täckt med aluminiumfolie. Användare måste notera att denna ytterligare färgning steg och efterföljande tvättsteg kan resultera i ytterligare cellförlust. - Omsuspendera cellerna i 200 μL av FACS-bufferten och överför till FACS-rören.
- Kör proverna på flödescytometern (se figur 1). Enfärgade rör som innehåller WBM inkluderar: (1) ofärgade; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grön fluorescerande fläck (FITC); (5) full fläck (PE och FITC).
- Först förvärva kontroller med en färg för att ställa in maskinen. Använd programvaran som körs på maskinen för att beräkna ersättningen. När ersättningen har tillämpats, förvärva HSC provet och registrera så många händelser som möjligt.
Anmärkning: Om stamcellerna och mitokondriella markörer kombineras, måste användarna vara särskilt försiktig med kompensation mellan TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), och SCA-1 (APC). Dessutom bör proverna köras omedelbart efter färgning. - Exportera FACS-filer från flödescytometerns och analysera data på en analysprogramvara (tabell över material).
- För analysen, öppna filen på analysprogram varan. Använda FSC-A och SSC-en gating identifiera cellpopulationen. Identifiera undertröjor i nästa portar innan du plottar den negativa DAPI-fraktionen (Live-celler). I den levande cell grinden göra en kontur tomt i TMRM och grön fluorescerande fläcken kanal för att mäta ΔΨm och massa, respektive (figur 2a). Exportera medelfluorescensintensiteten (MFI) för dessa två kanaler i den levande cell porten.
- TMRM Low Gate är inställd baserat på axel populationen i TMRM-kanalen. Den TMRM enfärgad kontroll kan användas för att identifiera denna axel population att ställa in grinden. Exportera andelen levande celler i TMRM låg grind i din kontroll och prover prov för plottning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 visar vi den gating strategi för isolering av hematopoietiska stamceller från mus benmärgen och layouten på plattan för sin ex vivo kultur. Figur 1a visar identifieringen av lymfocytfraktionen i SSC-A/FSC-en komplott. Doublets togs bort i linne Gate följt av identifiering av levande celler av avsaknaden av DAPI signal. LKS-populationen, definierad av Lineage-Sca1+ckit+, identifierades. Denna population är känd för att innehålla stam och stamceller. HSCs bildar runt 5 – 10% av cellerna i LKS-populationen och identifierades genom gating för CD150+CD48- population. Figur 1B representerar layouten på 96-brunnen plattan för ex vivo kultur. Sorterat HSCs pläterades i olik kultur villkorar: i detta fall, kontrollera och NR kompletterade kultur villkorar. Hela benmärgsceller var också pläterade som enfärgade kontroller som beskrivs i protokollet. Det är viktigt att fylla alla omgivande brunnar med vatten för att undvika avdunstning av media från cell-innehållande brunnar. Dessutom, som tidigare nämnts, var marginella brunnar undvikas för cellkultur eftersom de är mer mottagliga för avdunstning.
Figur 2 visar mätning av mitokondriell membran potential (ΔΨm) och massa i hscs post kultur. Figur 2A visar representativa tomter av tmrm nivåer (ovan) och grön fluorescerande mitokondriell fläck (nedan) i hscs odlade i kontroll och nr kompletteras villkor. NR-behandling visade en tydlig ökning av denlåga populationen av TMRM. Figur 2B visar kvantifieringen från tre oberoende prover. NR behandling ökade signifikant andelen celler i TMRMlåg grind och visade en signifikant sänkning av tmrm fluorescens intensitet. Mitokondriell massa (representeras av grön-fluorescens intensitet) inte ändras vid NR tillskott. Dessutom kombinerade vi stamcells markör färgning med mitokondriell färgning post kultur. Figur 2C visar den gating strategi för att identifiera hscs från HÄRSTAMNING negativa och LKS populationer post kultur i de två odlingsförhållanden. Den TMRM och gröna fluorescerande mitokondriell fläck profil av dessa gated HSCs ses i figur 2D. Exponeringen för NR uppvisade en signifikant ökning av denlåga populationen av% tmrm och en signifikant minskning av intensiteten i tmrm-fluorescensen i gated hscs. Den gröna fluorescerande mitokondriell fläcken grön signal förblev oförändrad under de två förhållandena.
Figur 3 visar mätningen av mitokondriell membran potential (ΔΨm) och massa i olika mänskliga T-celler: perifert blod mononukleära celler (pbmcs) CD4+ och CD8+ T celler, samt CD4+ och CD8+ tumör INFILTRERANDE lymfocyter (TILs) efter Rapid expansion Protocol (rep). Figur 3A visar representativa tomter av tmrm-nivåerna (ovan) och grön-fluorescerande mitokondriella fläck nivåer (nedan) av cirkulerande (PBMC) och TUMÖRINFILTRERANDE (til) CD4+ och CD8+ T-celler. TILs visade en tydlig ökning av TMRM och grön fluorescerande mitokondriell fläck signal jämfört med cirkulerande T-celler. Figur 3B visar MFI-kvantifieringen av tmrm och grön fluorescerande mitokondriell färgning. TILs visade högre TMRM och gröna fluorescerande mitokondriella infärgnings signaler jämfört med PBMC-härledda T-celler. Dessa data indikerar att TILs har en framstående metabolisk profil med ökad ΔΨm och mitokondriell massa.
Figur 1: isolering och kultur av hematopoietiska stamceller. (a) gating strategi för isolering av hematopoietiska stamceller (hscs) baserat på cell ytan markörer. HSCs identifierades som Lineage-Sca1+ ckit+ (LKS) CD150+CD48-. (B) Design av 96 väl plattan sätta i kulturen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mitokondriella profiler av hscs. (a) FACS kon tur handlingsomvisar hscs post kultur i basal eller nr kompletterade förhållanden. TMRM (ovan) och grön fluorescerande mitokondriell fläck (Mitotracker) (nedan) profiler visas. Bkvantifiering av TMRM och grön fluorescerande mitokondriell fläck signal. NR tillskott resulterade i en minskning av TMRM profil samtidigt bibehålla den gröna fluorescerande mitokondriell fläck signal. Ckon tur områden som visar identifiering av HSC-populationen i kontroll-och nr kompletterade förhållanden efter kulturen. D) konturdiagram och kvantifiering av TMRM och grön fluorescerande mitokondriell fläck signal i fenotypisk hscs post kultur. NR tillskott reducerade TMRM signalen medan den gröna fluorescerande mitokondriell fläck signal förblev oförändrad i HSCs. student t test * * *p < 0,001, * * p < 0,01, * p < 0,05, inte betydande > 0,05, fel barer = SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mitokondriella profiler av humana Pbmcs och TILs: (a) FACS Contour Plot visar CD4+ och CD8+ nyligen isolerade från pbmcs eller tumör-derived CD4+ och CD8+ post rep (Rapid expansion Protocol). TMRM (ovan) och grön fluorescerande mitokondriell fläck (Mitotracker) (nedan) profiler visas. Bkvantifiering av TMRM och grön fluorescerande mitokondriell fläck signal. TILs visade lägre mitokondriell aktivitet och massa. Student t-test * * *p < 0,001, * *p < 0,01, *p < 0,05, inte betydande > 0,05, fel staplar = SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| S.No | Antikropps namn | Arbetsutspädning |
| 1 | Streptavidin TX röd | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Endast användas om stamcells-och mitokondriella markörer kombineras. | ||
| 6 | Streptavidin PAC apelsin | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabell 1: antikropps utspädningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stram reglering av HSC-funktion är viktigt att upprätthålla stabila hematopoies under en organism livstid. Liksom olika andra celltyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar till regleringen av HSC funktion är cellulär metabolism. Tidigare studier från vår Lab9 och andra2,3 har inblandad betydelsen av mitokonskerna att upprätthålla en distinkt metabolisk tillstånd i hscs. på grund av det extremt låga antalet hscs isolerade från murina benmärg, är det svårt att analysera dem via standardiserade metaboliska analyser (t. ex. syreförbrukning med Seahorse). Baserat på vårt tidigare arbete, standardiserade vi en enkel flödescytometri test för att tillförlitligt mäta mitokondriell massa och membran potential (en indirekt avläsning för aktivitet) i ett lågt antal celler (dvs., HSCs). Denna analys möjliggör mätning på levande celler utan att äventyra deras lönsamhet9, vilket gör dem tillgängliga för alla nedströms funktionella analyser (såsom cfus eller benmärgstransplantation) som användare kan önska att utföra. Vi förutser denna analys som används i screening experiment, möjliggör en snabb avläsning på mitokondriell profil HSCs från olika genetiska bakgrunder eller knockout modeller. Viktigt, vår analys kan kombineras med cfse färgning ha en dubbel avläsning på HSC proliferation och dess mitokondriell profil9,10, vilket gör det möjligt att analysera den metaboliska öde dividera hscs. med tanke på att det är en svår färgning förfarande och vi arbetar med ett lågt antal celler (hscs), är det viktigt att efter centrifugering användarna alltid lämna 80 – 100 μl lösning i rören för att minimera cellförlust. Dessutom, under alla inlägg färgning steg rören eller plattorna bör skyddas från ljus, antingen genom att täcka dem i folie eller arbeta i en svagt ljus miljö. Om användarna väljer att kombinera HSC fläck med mitokondriella färgämnen måste de kontrollera om ersättningen utförs korrekt, särskilt mellan TMRM (PE), PeCy5, och APC.
Viktigt är att en ny publikation ifrågasätter användningen av mitokondriella färgämnen i HSCs eftersom de kan vara mottagliga för pumpefflux. Dessa studier rapporterar att de flesta primitiva hematopoietiska fack har högre antal mitokonlikerna jämfört med deras engagerade progenitorer20. Enligt vår erfarenhet, användning av mus genetiska modeller (Mito egfp möss21), mitokondriella Dye-oberoende färgning metoder (TOM20 antikropp), qPCR analys stöder uppfattningen att de flesta primitiva hematopoietiska fack har lägre mitokondriell innehåll10. Vi anser att ytterligare studier måste göras för att klargöra denna avvikelse på fältet.
Parallellt visar vi att användningen av mitokondriell profilering kan utnyttjas för att bestämma den metaboliska konditionen av Human TILs och utveckla metaboliska strategier som syftar till att återställa funktionen hos uttömda T-celler. I själva verket, T-celler isolerade från PBMCs Visa lägre mitokondriell aktivitet (TMRM) och massa (Mitotracker grön), medan mer utmattad T-celler såsom TILs har högre mitokondriell aktivitet och massa, vilket tyder på en möjlig metabolisk omprogrammering inträffar under utmattning. Följaktligen, tidigare publicerade studier har visat att stamceller-liknande minne t-celler (TSCM), T-celler med ökad uthållighet och kan långvarig återkallande svar, har lägre ΔΨm och behandlingar som riktar sig t cell metabolism kan starkt påverka deras funktion22,23.
Slutligen anser vi att vår strategi kan vara ett värdefullt verktyg för identifiering av nya föreningar som kan reparera dysfunktionella HSCs (t. ex. åldrande eller hematologiska maligniteter) genom att återställa deras mitokondriell kondition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vissa delar av detta arbete har lämnats in som ansökan P1828EP00 till Europeiska patentverket.
Acknowledgments
Vi tackar UNIL Flow Cytometry Core facility för deras stöd särskilt Dr Romain Bedel. Detta arbete stöddes av Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant till N. V och O.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
