Summary
Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Quiescence ince bir denge, kendini yenileme, ve farklılaşma hematopoetik kök hücre korumak için anahtar (HSC) havuzu ve tüm olgun kan hücrelerinin ömür boyu üretimini korumak. Son yıllarda hücresel metabolizma HSC fonksiyonu ve kaderinin önemli bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Daha önce mitokondriyal metabolizma modülasyonunun HSC kaderini etkilediğini göstermiştir. Özellikle, elektron taşıma zincirini kimyasal olarak ayırarak hsc işlevini normalde hızlı farklılaşmaya neden olan kültür koşullarında sürdürebildik. Ancak, HSC sayılarını sınırlamak genellikle HSC metabolizmasını ölçmek ve bu nedenle işlevlerini tahmin etmek için standart tahlillerin kullanılmasını engellemez. Burada, HSC'ler gibi kıt hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin ve mitokondriyal kitlenin güvenilir ölçümüne olanak tanıyan basit bir akış sitometri sitometrisi tayini sitoz raporu. HSC'lerin fare kemik iliğinden izolasyonu ve mitokondriyal kütle ve membran potansiyeli post ex vivo kültürünün ölçülmesi tartışılmaktadır. Örnek olarak, metabolik modülatör ile tedavi yoluyla HSC'lerde bu parametrelerin modülasyon göstermek. Ayrıca, insan periferik kan türetilmiş T hücreleri ve insan tümörü lenfositler (TILs) infiltrasyon, onların mitokondriyal profillerinde dramatik farklılıklar gösteren, muhtemelen farklı T hücre yansıtan bu metodolojinin uygulama genişletmek Işlevsel -liği. Bu töbyenin farklı bağlamlarda çeşitli hücre tiplerinde mitokondriyal metabolizmamodülatörlerini belirlemek için yapılan taramalarda işe yadabileceğine inanıyoruz.
Introduction
Hematopoetik kök hücreler (HSCs) bir organizmanın ömrü boyunca kan üretimi ve homeostaz sağlayan kemik iliğinde yaşayan hücrelerin küçük bir popülasyonvardır. HSC'ler bu süreci, hücre bölünmesi ve iyi düzenlenmiş farklılaşma adımları1ile ölümcül farklılaşmış olgun kan hücresi soyları üreten atalara yol açarak aracılık etmektedir. Daha da önemlisi, HSC'ler enerjilerini anaerobik glikoli yoluyla üretirler. Buna karşılık, daha kararlı ve aktif hematopoetik atalar mitokondriyal metabolizma doğru metabolizmageçiş2,3,4. Bu farklı metabolik durum aktif mitokondri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücresel hasara karşı HSC'leri korumak için inanılmaktadır, böylece in vivo fonksiyonuuzunvadeli korumak 5,6,7,8. HSC metabolik durumunun doğrudan ölçümü, sınırlı sayıdan dolayı zordur ve genellikle düşük iş üretimidir. Burada, tetrametilloidamin metil ester (TMRM) floresan kullanarak mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔM) sağlam ölçümü için akış sitometri sitometrisi esaslı bir test ve HSC'lerde yeşil floresan mitokondriyal leke (Mitotrackerrül) kullanılarak mitokondriyal kütleyi tanımlıyoruz. Daha önce düşük ΔSm son derece saflaştırılmış HSCs iyi niyetli fonksiyonel belirteç olduğunu göstermiştir9 ve metabolik modülatörler ΔSC fonksiyonu geliştirmekgeliştirmek 9,10. Burada, HSC'lerin uzun vadeli kan yeniden yapılanma potansiyelini geliştirebilen yeni molekülleri belirlemek için strateji olarak HSC'ler mitokondriyal profilleme yöntemimizi kullanmayı öneriyoruz.
Örnek olarak, b3 vitamini analog nikotinr riboside (NR) maruz kaldıktan sonra bu titreşinin HSC ΔSm'nin alçaltMasını güvenilir bir şekilde ölçtettiğini gösteriyoruz. Buna göre, yakın zamanda yayınlanan çalışmamızda NR'nin hem fare hem de insanlaştırılmış fare sistemlerinde kan kurtarma sonrası naklini doğrudan hematopoetik kök ve ata fonksiyonlarını geliştirerek güçlü bir şekilde iyileştirdiğini gösteriyoruz10. Bu tür metabolik modülatörlerin kapasitesi, nakledilen hastalarda %25'lik bir ölüm oranının kandaki gecikmeye ve immün iyileşmeye bağlı olduğu düşünülürse klinik değeri yüksektir11,12.
Ayrıca, bu metodolojinin insan T hücrelerinin metabolik profilinin ve fonksiyonunun karakterizasyonu için uygulanabildiği kanıtlarını saklı tmaktadır. Son yıllarda, otolog tümör infiltrasyon lenfositler (TILs) kullanarak benimseyen hücre tedavisi (ACT) gelişimi son derece olumsuz prognoz ile ileri kanser bazı türleri için en etkili yaklaşım haline gelmiştir (örneğin, metastatik melanom, nerede >50% hastaların tedaviye yanıt ve hastaların% 24 kadar tam regresyon var)13. Ancak, yeterli antitümör aktivitesi barındıran TILs oluşturmak zordur14. TILs ex vivo genişleme sırasında geçmesi geniş proliferasyon ve stimülasyon T hücre yorgunluğu ve önemli ölçüde T hücre antitümör yanıtı bozan senescence neden15. Daha da önemlisi, TILs 'antitümöral kapasitesi sıkıcametabolizma16bağlı,17 ve PI3K / Akt yolunun inhibisyonu ile metabolizma modüle amaçlayan yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar üretti18,19. Bu nedenle periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve hasta kaynaklı TIL'lerden elde edilen T hücrelerinin ΔMm'sini karşılaştırıyoruz ve daha az diferansiye PBMC türetilmiş T hücrelerinin ölümcül farklılaştırılmış TIL'lere kıyasla δM ve mitokondriyal kütleye sahip olduğunu gösteriyoruz.
Bu tözün, ΔDm modülasyonu ile HSC ve T hücre fonksiyonunu iyileştiren yeni metabolik modülatörleri tanımlamak için kullanılabileceğini öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El yazmasında açıklanan tüm deneyler kurumumuzun yönergelerine uyar ve İsviçre hayvan deneyleri (Yetki: VD3194) ve insan örneklerini içeren araştırmalar için İsviçre yasalarına uygun olarak yürütülmüştür (Protokol: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Hematopoetik Kök Hücre Ekstraksiyonu
- Yabani tip C57BL6/J fareler satın alın ve taşımayla ilgili stresi azaltmak için en az bir hafta hayvan evinde saklayın.
- Deney günü, CO2 boğulması kullanarak fareyi ötenazi edin.
- Kürk sterilize etmek için% 70 etanol ile fare sprey ve arka bacaklardan femur ve tibia kemikleri kesmek için, diseksiyon makas ve forceps gibi standart cerrahi araçlar kullanarak karın fare açık kesti.
- Femur, tibia ve pelvis'e bağlı kasları yumuşak bir kağıt havlu kullanarak çıkarın ve temizlenmiş kemikleri buz üzerinde 1 mM EDTA (tampon) içeren PBS içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Sprey bir harç ve havaneli ile 70% etanol ve bir hücre kültürü başlık yerleştirin. 30 dk. Post sterilizasyon etanol izlerini kaldırmak için tampon ile havan ve havaneli durulamak IÇIN UV ile sterilize.
- Havan içine bazı tampon (~ 10 mL) ile temiz kemikleri koyun ve yavaşça süspansiyon kemik iliği almak için onları ezmek. Şimdi, hücre süspansiyonu toplamak ve tek bir hücre süspansiyon almak için 50 mL tüp içine 70 μm hücreli süzgeç ile geçmek.
- Tüm kemik iliği çıkarılana ve kemik enkazı beyaza dönene kadar 1.6.
- Kemik iliği tek hücre süspansiyonu içeren 50 mL tüp(ler) bir santrifüj üzerine yerleştirin. Hücreleri peletlemek için 4 °C'de 10 dk için 300 x g'de santrifüj çalıştırın.
- Bu arada, otoklavlı distile suda 1x RBC lysis tampon 10 mL hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 m'lik bir filtreden filtreleyin.
- Santrifüjden örnek tüpü toplayın ve supernatant decant. Pipet hücre pelet üzerinde 1x RBC lysis tampon(Malzeme Tablosu). Peleti yerinden çıkarve birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak homojen bir çözelti hazırlayın. Tüpün RBC lysis'in insa edilmesi için 1-2 dk oda sıcaklığında olmasını bekleyin. Tüpü tamponla doldurarak lysis işlemini durdurun.
- Tüpü bir santrifüjüzerine yerleştirin ve 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de döndürün. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 10 mL tampon ekleyerek peleti yeniden askıya alın ve çözeltiyi 70 μm'lik bir süzgeç le yeni bir 50 mL tüpe filtreuygulayArak RBC lysis nedeniyle enkazı temizleyin.
- Tüpü 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 500 μL arabellekte peleti yeniden askıya alın.
- 100 μL aliquot çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüp te saklayın. Kalan 450 μL hücre süspansiyonuna progenitor zenginleştirme kitinden(Malzeme Tablosu)50 μL biotin soy tükenmesi antikor kokteyli ekleyin. 4 °C'de 15 dakika çalkalayıcı ile kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de 15 mL tampon ve santrifüj tüp ekleyin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 460 μL arabellekte peleti yeniden askıya alın. 10 μL aliquot çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüp te saklayın.
- Kalan 450°L hücre süspansiyonuna ata zenginleştirme kitinden(Malzeme Tablosu)50 μL streptavidin manyetik boncuk ekleyin. 4 °C'de 15 dakika çalkalayıcı ile kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de 15 mL tampon ve santrifüj tüp ekleyin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 5 mL tamponpe pelet resuspend ve 15 mL tüp için çözelti aktarın.
- Tüpü otomatik bir hücre ayırıcısına(Malzeme Tablosu) götürün. Durulama ve hücre ayırıcısının tüp astar için bir yıkama programı çalıştırın. Numuneyi ve iki toplama tüpünü tüp tutucuya yerleştirin. " Deplete " programını kullanarak ayırmagerçekleştirin. Çalışma sona erdikten sonra otomatik hücre ayırıcısından pozitif ve negatif kesirleri toplayın.
NOT: Otomatik hücre ayırıcısı yokluğunda kullanıcılar kullanım kılavuzuna göre manuel manyetik sütunları ve ilgili mıknatısları kullanabilirler. Kullanıcılar, el ile ayırma işleminin otomatik olandan daha yavaş olduğunu unutmamalıdır. Ayrıca, manuel sütunlar tıkanma ya da daha yatkındır. Bu nedenle, kullanıcıların numuneyi seyreltmeleri ve sütuna yavaşça yüklemeleri önerilir. - Pozitif kesir atın. Negatif kesir tüpünü tamponla doldurun. Tüpü 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
- Bu arada, tablo malzemeler ve Tablo 1'deaçıklandığı gibi, antikor karışımını 1 mL nihai hacim çözeltisi ve 200 μL nihai hacim çözeltisinde tek renkli kontroller halinde hazırlayın.
NOT: TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke kök hücre marker boyama ile kombine edilecekise, o zaman CD150-PE CD150-PEcy5 ve Streptavidin-Tx streptavidin-Pac Orange ile kırmızı değiştirin. - Santrifüjden örnek tüpü toplayın ve supernatant decant. 1 mL antikor karışımında peleti yeniden askıya alın. Tek renkli kontrol tüplerinin her birine (soy hariç) 10 μL hücre (adım 1.13'ten) ekleyin. Lineage tek renkli tüp 10 μL hücreleri (adım 1.14) ekleyin.
- Numuneyi ve tek renkli kontrol tüplerini 4 °C'de 45 dakika çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Tüm tüpleri tampon ve santrifüj ile 300 x g'da 4 °C'de 5 dk doldurun. Supernatant atın ve tampon 200 μL tampon 1 mL örnek resuspend.
- Numuneyi ve tek renkli kontrolleri 5 mL filtre üstü FACS tüplerine aktarın.
- Tüpleri ayırma makinesine götürün ve 400 μL kök hücre genişletme ortamı içeren 1,5 mL tüplerde HSC popülasyonu (Şekil 1A'dakigating stratejisi) sıralayın.
2. Hematopoetik Kök Hücrelerin Ex Vivo Kültürü
- Sıralanmış hücreler içeren tüpleri toplayın (hücre ekstraksiyonu için bölüm 1'e bakın). Tüpleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Peleti çıkarmadan süpernatantın çoğunu nazikçe çıkarın ve hücre peletinin üzerine 50-80°L bırakın. Bu hücre kaybını en aza indirir.
- Kök hücre genişletme ortamındaki hücre peletini test edilecek koşullara bağlı olarak son bir hacme geri alın (kuyu/kültür durumu başına 100 μL olarak say).
- Kök hücre genleşme ortamı, kök hücre faktörü (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) ve kalem-strep antibiyotikler (%1) içeren 2 x kültür ortamı hazırlayın (2x bazal orta; Malzeme Tablosu).
- 96 U-alt kuyu plakası(Malzeme Tablosu)tedavi steril doku kültürü alın ve hücrelerin kültürlenecek kuyuları tanımlayın (Şekil 1B'dekiplaka tasarımı).
NOT: Kullanıcılar marjinal kuyulardan uzak durmaları tavsiye edilir, çünkü buharlaşmaya daha yatkındırlar. - Bu kuyulara daha önce 2.3 adımda hazırlanmış 100 μL 2x bazal orta koyun. NR işaretli de 100x NR çözeltisi(Malzeme Tablosu)2 μL ekleyin. NR'yi her 24 saatte bir yeniler.
NOT: Stok yenileme NR'ye özgüdür. Diğer metabolik modülatörlerin ikmale ihtiyacı olabilir veya gerekmeyebilir. - 2x bazal orta içeren kuyuların üzerine 2.2 adımda hazırlanan hücrelerin 100 μL'sini tohum. Bu deneyde kuyu başına tohumlanan HSC sayısı 800-1.000 arasındaydı.
- 2x bazal orta içeren beş ekstra kuyu hazırlayın. Bunların her birinde 100.000 tam kemik iliği hücresi (adım 1.13)'den itibaren 100 μL'lik kök hücre genişletme ortamında yeniden askıya alınarak kültür sonrası akış sitometrisi analizi için boyama kontrolleri olarak kullanılır.
NOT: Kullanıcılar post kültür analizi için kök hücre belirteçleri ve mitokondriyal işaretleri birleştirmek istiyorsanız ayrıca ata popülasyonu (Ckit + hücreleri veya LKSCD150 hücreleri) sıralamak için tavsiye edilir. Post kültür akışı sitometri analizi için boyama kontrol kuyularında bu sıralanmış ataları tohum. Tek leke rengi başına bir iyi hazırlayın. - Hücreleri içeren kuyulardan buharlaşmayı azaltmak için çevredeki tüm kuyulara 200 μL otoklavlı su koyun. 37 °C ve %5 CO2'de bir kuluçka makinesinde plakayı rahatsız edilmeden kültür süresi boyunca (72 saat) bırakın. NR'yi her 24 saatte bir doldurmak için plakayı çıkarın ve kuvöze geri yerleştirin.
3. Mitokondriyal Kütle ve Membran Potansiyelinin Ölçülmesi
- Kültür döneminin sonunda kök hücre genleşme ortamında(Malzeme Tablosu)TMRM (20 μM) ve Mitotracker yeşili (10 μM) (yeşil floresan leke) 100 x'lik bir çözüm hazırlayın.
- Test kuyularının her birine 2 μL 100x TMRM çözeltisi ve 2 μL 100x yeşil floresan leke çözeltisi ekleyin. TMRM kontrolüne 2 μL 100x TMRM ekleyin. Mitotracker kontrol kuyusu 100x yeşil floresan leke 2 μL ekleyin. Plakayı 37 °C'de bir kuvöze yerleştirin ve 45 dk.
NOT: ABC pompa aracılı boya efflux test edilmesi gerekiyorsa Verapamil (ABC pompa inhibitörü) ile ek bir kontrol hazırlanabilir. Bunun için, TMRM ve yeşil floresan lekesi için boyama önce test kuyularından biri 1 saat 50 μM Verapamil ekleyin. - Plakayı kuvözden çıkarın ve 5 dk. Standart FACS tampon (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) 200 μL ekleyin, 5 dk için 300 x g plaka santrifüj. Bu yıkama adım 3x tekrarlayın. Kullanıcılar, doğrudan ışığa en az maruz kalma sağlamak için plakanın her zaman folyo ile kaplı olduğundan emin olmalıdır.
NOT: Eğer kullanıcıların mitokondriyal lekele kök hücre boyama ile birleştirmeleri gerekiyorsa, numunenin tüm kök hücre belirteçlerinin antikor karışımıyla kuluçkaya yatırılması ve tek renkli kontrollerin 4 °C'de 30-45 dakika boyunca ayrı ayrı antikorlarla boyanması gerekir.
NOT: Her adımda kullanıcılar plaka alüminyum folyo ile kaplı tutmak gerekir. Kullanıcılar bu ek boyama adımı ve sonraki yıkama adımları ek hücre kaybına neden olabilir dikkat etmelisiniz. - 200 μL'lik FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve FACS tüplere aktarın.
- Akış sitometresindeki örnekleri çalıştırın (bkz. Şekil 1). WBM içeren tek renkli tüpler şunlardır: (1) Lekesiz; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) yeşil floresan leke (FITC); (5) Tam leke (PE ve FITC).
- Önce makineyi kurmak için tek renkli denetimleri edinin. Telafiyi hesaplamak için makinede çalışan yazılımı kullanın. Tazminat uygulandıktan sonra, HSC örneğini edinin ve mümkün olduğunca çok olay kaydedin.
NOT: Kök hücre ve mitokondriyal belirteçler birleştirilirse, kullanıcıların TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) ve Sca-1 (APC) arasındaki tazminatkonusunda özellikle dikkatli olması gerekir. Ayrıca, örnekler hemen boyama sonrası çalıştırılmalıdır. - Facs dosyalarını sitometreden dışa aktarın ve bir analiz yazılımındaki(Malzeme Tablosu)verileri analiz edin.
- Analiz için, analiz yazılımı nın dosyasını açın. FSC-A ve SSC-A gating kullanarak hücre popülasyonu tanımlayın. DAPI negatif fraksiyonu (canlı hücreler) çizmeden önce sonraki kapılardaki singlet'leri tanımlayın. Canlı hücre kapısında, sırasıyla ΔDm ve kütleyi ölçmek için TMRM ve yeşil floresan leke kanalında bir kontur çizimi yapılır (Şekil 2A). Canlı hücre kapısında bu iki kanalın ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) dışa aktarın.
- TMRM alçak kapısı, TMRM kanalındaki omuz popülasyonuna göre ayarlanır. TMRM tek renkli kontrol, kapıyı ayarlamak için bu omuz popülasyonu tanımlamak için kullanılabilir. TMRM alçak kapısındaki hücrelerin canlı oranını kontrol ve çizim için test numuneleri olarak dışa aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de fare kemik iliğindeki hematopoetik kök hücrelerin izolasyonu ve eksvivo kültürleri için plakanın düzeni için gating stratejisini gösteriyoruz. Şekil 1A, SSC-A/FSC-A çizimindeki lenfosit fraksiyonunun tanımlanmasını gösterir. Doublets dapi sinyal yokluğu ile canlı hücrelerin belirlenmesi takip singlet kapıda kaldırıldı. Sca1+cKit+, soyu ile tanımlanan LKS popülasyonu tanımlanmıştır. Bu popülasyonun kök ve ata hücreleri içerdiği bilinmektedir. HSC'ler LKS popülasyonundaki hücrelerin yaklaşık %5-10'una sahiptir ve CD150+CD48- popülasyon için gating ile tanımlanmıştır. Şekil 1B, ex vivo kültürü için 96 kuyulu plakanın düzenini temsil eder. Sıralanmış HSC'ler farklı kültür koşullarında kaplandı:Bu durumda, kontrol ve NR destekli kültür koşulları. Tüm kemik iliği hücreleri de protokolde açıklandığı gibi tek renkli kontroller olarak kaplandı. Hücre içeren kuyulardan medyanın buharlaşmasını önlemek için çevredeki tüm kuyuları su yla doldurmak önemlidir. Ayrıca, daha önce de belirtildiği gibi, marjinal kuyular hücre kültürü için daha buharlaşma yatkın olduğu için kaçınılmalıdır.
Şekil 2, HSC'lerde mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔSm) ve kütle nin ölçülmesini göstermektedir. Şekil 2A, kontrol ve NR destekli koşullarda kültürlenmiş HSC'lerde TMRM düzeylerinin (üstte) ve yeşil floresan mitokondriyal lekenin (aşağıda) temsili çizimlerini gösterir. NR tedavisi TMRMdüşük popülasyonunda belirgin bir artış gösterdi. Şekil 2B üç bağımsız örnekten elde edilen niceliği gösterir. NR tedavisi TMRMdüşük kapıdaki hücrelerin oranını önemli ölçüde artırdı ve TMRM floresan yoğunluğunda önemli bir düşüş gösterdi. Mitokondriyal kitle (yeşil floresan yoğunluğu ile temsil edilir) NR takviyesi üzerine değişmedi. Ayrıca kök hücre belirteci boyama ile mitokondriyal boyama sonrası kültürü birleştirdik. Şekil 2C, soyundan gelen HSC'leri belirlemek için gating stratejisini gösterir ve LKS popülasyonları iki kültür koşulunda kültür sonrasıdır. Bu kapılı HSC'lerin TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke profili Şekil 2D'degörülmektedir. NR'ye maruz kalma% TMRMdüşük nüfus önemli bir artış ve kapılı HSCs TMRM floresan yoğunluğunda önemli bir azalma gösterdi. Yeşil floresan mitokondriyal leke yeşil sinyal iki koşulda değişmeden kaldı.
Şekil 3, hızlı genleşme protokolü (REP) sonrası mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔSm) ve farklı insan T hücrelerinde kütle ölçümünü göstermektedir: periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) CD4+ ve CD8+ T hücreleri, cd4+ ve CD8+ tümör infiltrasyon lenfositler (TILs) sonra. Şekil 3A, TMRM düzeylerinin (üstte) ve yeşil floresan mitokondriyal leke düzeylerinin (aşağıda) dolaşım (PBMC) ve tümör efiltrasyonu (TIL) CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin temsili çizimlerini gösterir. TILs TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke sinyali dolaşan T hücrelerine göre net bir artış gösterdi. Şekil 3B, TMRM'nin MFI niceliğini ve yeşil floresan mitokondriyal boyamayı göstermektedir. TILs PBMC türetilmiş T hücrelerine göre daha yüksek TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal boyama sinyalleri gösterdi. Bu veriler, TILs'in artmış ΔM ve mitokondriyal kitle ile ayırt edici bir metabolik profile sahip olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Hematopoetik kök hücrelerin izolasyonu ve kültürü. (A) Hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı hematopoetik kök hücrelerin (HSC) izolasyonu için gating stratejisi. HSC'ler soy olarak tanımlandı- Sca1+ cKit+ (LKS) CD150+CD48-. (B) Tasarım 96 kuyu plaka kültür koymak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HSC'lerin mitokondriyal profilleri. (A) FACS kontur çizimi, HSC'lerin bazal veya NR destekli koşullarda kültür sonrası kültürünü gösterir. TMRM (üstte) ve yeşil floresan mitokondriyal leke (Mitotracker) (aşağıda) profilleri gösterilmiştir. (B) TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke sinyalinin nicelleştirilmesi. NR takviyesi, yeşil floresan mitokondriyal leke sinyalini korurken TMRM profilinde azalmaya neden oldu. (C) Kontrol ve NR tamamlayıcı koşullar kültür sonrası HSC nüfusunun belirlenmesigösteren kontur arsalar. (D) Kontur çizimleri ve tmrm ve yeşil floresan mitokondriyal leke sinyali sayısallaştırma phenotipik HSCs sonrası kültür. NR takviyesi TMRM sinyalini azaltırken, yeşil floresan mitokondriyal leke sinyali HSC'lerde değişmeden kalmıştır. Öğrenci t testi ***p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05, önemli değil > 0.05, hata çubukları = SEM. Lütfen bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: İnsan PBMCs ve TILs Mitokondriyal profilleri: (A) FACS kontur çizim CD4 gösteren+ ve CD8+ taze PBMCs veya tümör kaynaklı CD4+ ve CD8+ sonrası REP (hızlı genişleme protokolü). TMRM (üstte) ve yeşil floresan mitokondriyal leke (Mitotracker) (aşağıda) profilleri gösterilmiştir. (B) TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke sinyalinin nicelleştirilmesi. TILs düşük mitokondriyal aktivite ve kitle görüntülendi. Öğrenci t-testi ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, önemli değil > 0.05, hata çubukları = SD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
| S.No | Antikor adı | Çalışma seyreltme |
| 1 | Streptavidin Tx kırmızı | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Sadece kök hücre ve mitokondriyal belirteçler biraraya getirildiğinde kullanılacak. | ||
| 6 | Streptavidin Pac turuncu | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tablo 1: Antikor seyreltmeleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HSC fonksiyonunun sıkı bir düzenleme bir organizmanın ömrü boyunca istikrarlı hematopoiesis korumak için önemlidir. Vücuttaki diğer çeşitli hücre tipleri gibi, HSC fonksiyonunun düzenlenmesine katkıda bulunan önemli bir bileşen hücre metabolizmasitir. Bizim laboratuvar9 ve diğerleri2öncekiçalışmalardamitokondri hscs ayrı bir metabolik devlet bakımında önemini ima var. İdris kemik iliği izole HSC'lerin son derece düşük sayıda nedeniyle, standart metabolik tahliller yoluyla bunları analiz etmek zordur (örneğin, SeaHorse ile oksijen tüketimi). Önceki çalışmamıza dayanarak, düşük sayıda hücrede (yani HSC'lerde) mitokondriyal kütle ve membran potansiyelini (dolaylı bir ölçüm) güvenilir bir şekilde ölçmek için basit bir akış sitometri sitometri sitometri testini standartlaştırdık. Bu tahlil, canlılıklarından ödün vermeden canlı hücreler üzerinde ölçüm yapılmasına olanak sağlar9,kullanıcıların gerçekleştirmek isteyebileceği herhangi bir alt akım fonksiyonel tahlilleri (CPU veya kemik iliği nakli gibi) için kullanılabilir hale. Bu talihin tarama deneylerinde kullanıldığını öngörüyoruz, farklı genetik geçmişlere veya nakavt modellerinden hsc'lerin mitokondriyal profili üzerinde hızlı bir okuma için izin. Daha da önemlisi, bizim tahlil CFSE boyama ile HSC proliferasyonu ve mitokondriyal profil9,10, HSC'ler bölen metabolik kaderanalizi sağlayan bir çift okuma için kombine edilebilir. Bunun zor bir boyama işlemi olduğu ve az sayıda hücre (HSC) ile çalıştığımız düşünülürse, santrifüj sonrası kullanıcıların hücre kaybını en aza indirmek için tüplerde her zaman 80-100 μL'lik bir çözelti bırakmaları önemlidir. Ayrıca, tüm boyama sonrası basamaklarda tüpler veya plakalar, folyo ile kaplayarak veya düşük ışıklı bir ortamda çalışarak ışıktan korunmalıdır. Kullanıcılar HSC lekesini mitokondriyal boyalarla birleştirmeye karar verirlerse, özellikle TMRM (PE), PeCy5 ve APC arasında, tazminatın doğru şekilde uygulanıp uygulanıp uygulanıp uygulanıp uygulanıp uygulanıp uygulanıp uygulanamayacaklarını kontrol etmelidirler.
Daha da önemlisi, yeni bir yayın, pompa efflux duyarlı olabilir, çünkü HSCs mitokondriyal boyaların kullanımı sorular. Bu çalışmalar, en ilkel hematopoetik bölmeleri kararlı ataları20ile karşılaştırıldığında mitokondri daha yüksek sayıda olduğunu rapor . Bizim deneyim, fare genetik modellerinin kullanımı (mito eGFP fareler21), mitokondri boya bağımsız boyama yöntemleri (TOM20 antikor), QPCR analizi en ilkel hematopoetik bölmeleri düşük mitokondriyal içeriğe sahip olduğu fikrini destekler10. Bu alandaki bu tutarsızlığı netleştirmek için daha fazla çalışma yapılması gerektiğine inanıyoruz.
Buna paralel olarak, insan TIL'lerinin metabolik uygunluğunu belirlemek ve tükenmiş T hücrelerinin işlevini geri getirmeyi amaçlayan metabolik stratejiler geliştirmek için mitokondriyal profilleme kullanımından yararlanılabileceğini göstermiş bulunuyoruz. Aslında, PBMCs izole T hücreleri düşük mitokondriyal aktivite görüntüler (TMRM) ve kitle (Mitotracker Yeşil), TILs gibi daha tükenmiş T hücreleri daha yüksek mitokondriyal aktivite ve kitle varken, yorgunluk sırasında meydana gelen olası bir metabolik yeniden programlama düşündüren. Buna göre, daha önce yayınlanan çalışmalarkök hücre benzeri bellek T hücrelerinin (TSCM), gelişmiş kalıcılığı olan ve uzun süreli geri çağırma yanıtı na sahip T hücrelerinin düşük ΔM'ye sahip olduğunu ve T hücre metabolizmasını hedefleyen tedavilerin işlevlerini kuvvetle etkileyebileceğini göstermiştir22,23.
Son olarak, yaklaşımımızın mitokondriyal uygunluklarını geri alarak işlevsiz HSC'leri (örneğin, yaşlanma veya hematolojik maligniteleri) onarabilecek yeni bileşiklerin belirlenmesi için değerli bir araç olabileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışmanın bazı unsurları Avrupa Patent Ofisi'ne P1828EP00 başvurusu olarak sunulmuştur.
Acknowledgments
ÖZELLIKLE Dr. Romain Bedel'e verdikleri destekten dolayı UNIL Flow Sitometri Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Kristian Gerhard Jebsen vakfının N.V ve O.N.'ye verdiği bağışla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
