Summary
Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.
Abstract
We beschrijven een modificatie van een gevestigde methode om de dynamiek van microtubulus in levende cellen te bepalen. Het protocol is gebaseerd op de uitdrukking van een genetisch gecodeerde marker voor de positieve uiteinden van microtubuli (EB3 gelabeld met Tdtomaat fluorescerende eiwitten) en hoge-snelheid, hoge-resolutie, Live-celbeeldvorming met behulp van draaiende schijf confocale microscopie. Celcyclus synchronisatie en verhoogde dichtheid van microtubuli worden bereikt door remming van de centrosomale scheiding in mitotische cellen, en analyse van de groei wordt uitgevoerd met behulp van open-source U-track software. Het gebruik van een helder en rood verschoven fluorescerende eiwit, in combinatie met het lagere Laser vermogen en de gereduceerde blootstellingstijd die nodig is voor het spinnen van schijf microscopie verminderen fototoxiciteit en de waarschijnlijkheid van lichtgeïnduceerde artefacten. Dit maakt een groter aantal cellen in dezelfde bereiding mogelijk, terwijl de cellen in een groeimedium onder standaardcultuur omstandigheden worden gehandhaafd. Omdat de analyse wordt uitgevoerd in een automatische gecontroleerde mode, zijn de resultaten statistisch robuust en reproduceerbaar.
Introduction
Microtubuli (MTs) zijn zeer dynamische structuren gevonden in vrijwel alle eukaryote cellen en in sommige bacteriën1. Samen met actine en tussenliggende filamenten, ze beeldhouwen het cytoskelet2,3. Cell Division4, molecuul transport5, flagellar verslaan6, de sensatie van de omgeving door primaire tril haar cilium7, hoorzitting (kinocilium)8,9, embryo Genesis10,11,12, invasie en metastase13,14, en zelfs Geheugenvorming15,16,17,18, en veel andere processen vertrouwen voornamelijk op MTs. deelname van MTs in al deze gebeurtenissen zou onmogelijk zijn zonder hun opmerkelijke vermogen om snel te schakelen tussen groei (polymerisatie) en krimp (depolymerisatie). Deze eigenschap wordt beschreven als dynamische instabiliteit19. MT dynamiciteit is veranderd in vele pathologische condities20,21,22. Vandaar, het bepalen van de aard van deze eigenschap kan helpen om te begrijpen van de ziekte mechanismen en vervolgens hun behandeling.
Er is een lange lijst met methoden ontwikkeld voor de analyse van MT Dynamics, waarvan de meeste gebaseerd zijn op beeldvormingstechnieken23. Aanvankelijk werden brede veld licht microscopen gebruikt om de vorming van tubuline-polymeren in vitro24te observeren. De ontdekking van end-binding (EB)-eiwitten die verzamelen bij mt plus-ends en de ontwikkeling van methoden tot fluorescently label eiwitten maakten het mogelijk om het gedrag van MTs direct in levende cellen met breed veld en confocale fluorescentie microscopen25,26,27te observeren. Eén EB-eiwit is eind bindende proteïne 3 (EB3)28; door het overdrukken en volgen van EB3 gesmolten tot een fluorescerende proteïne, kunnen MT plus-end assemblage percentages worden bepaald op29,30.
Confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie (CLSM) wordt vaak gebruikt om de MT-dynamiek te volgen. Deze beeldvormings techniek vormt echter een hoog risico op fototoxiciteit en fotobleaching, twee ongewenste processen voor de beeldvorming van levende cellen en Dim-voorbeelden31. Om een betere signaal-ruis verhouding te verkrijgen, moeten de laser kracht en de blootstellingsduur hoog genoeg zijn, terwijl ze de monsters niet beschadigen, en dit vereist een opoffering van de resolutie in ruil voor snelheid. Een geschikt alternatief voor CLSM is het spinnen schijf microscopie32. Deze Imaging modaliteit is gebaseerd op het gebruik van een Nipkowschijf33, die bestaat uit een bewegende schijf met een array van pinholes, en werkt op equivalente wijze aan veel CLS microscopen die hetzelfde monster gelijktijdig34. Daarom zal het licht van de laser verschillende gebieden in het monster tegelijkertijd verlichten, maar het confocale karakter behouden. De Nipkowschijf maakt het daarom mogelijk om beelden te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met CLSM, maar sneller en minder Laser vermogen gebruiken. De Nipkow-schijf werd verder verbeterd door Yokogawa Electric, die een tweede schijf introduceerde met een reeks micro lenzen erop die individueel direct licht in een respectieve pinhole, verdere vermindering van fototoxiciteit en photobleaching35. Dus, Spinning Disk laser scanning microscopie werd een methode van keuze voor Live Cell Imaging, en het maakt het mogelijk om beelden met een hoge signaal-ruis verhouding te verkrijgen op een hoge snelheid31,36, wat cruciaal is voor het oplossen van signalen zoals die van de snelgroeiende MT-ends.
MT Dynamics verschillen tijdelijk. Bijvoorbeeld, de mitotische MTs zijn dynamischer dan de interfase Ones37,38. Evenzo, verschillen in de groeisnelheid en krimp zijn waargenomen zelfs binnen dezelfde cel cyclus fase, zoals mitose39,40. Daarom, om valse gegevensverzameling te voorkomen, moet de meting van MT Dynamics worden beperkt tot een smal tijdvenster tijdens de celcyclus. Meting van de MT-dynamiek in tijdens kan bijvoorbeeld worden bereikt door de cellen te behandelen met dimethylenastron (DME), een monastrol-analoog dat de motor kinesin Eg541 remt en de vorming van de bipolaire mitotische spindel42verhindert. Remming van cellen bij tijdens met Eg5 remmer DME en andere monastrol derivaten heeft geen invloed op de MT Dynamics43,44,45, waardoor DME een nuttig instrument voor het bestuderen van MT Dynamics zowel in vaste en levende cellen44.
Hier combineren we de methode van MT Dynamics analyse in tijdens cellen, beschreven door ertych et al.44 met Dual Spinning Disk Imaging. Deze methode maakt meting van de MT-dynamiek in prometafase cellen verzameld uit een enkel focal vlak met een hogere Imaging rate, maar zonder photobleaching en minimale fototoxiciteit. Bovendien gebruiken we als fluorescerende reporter tandem dimeer tomaten fluorescerende eiwitten (tdTomato) die de helderheid en foto stabiliteit in vergelijking met het groene fluorescerende eiwit (EGFP) heeft verbeterd en is opgewonden met lager energie licht46. Daarom vereist tdTomato minder Laser vermogen voor excitatie en is het minder fototoxisch. In totaal verbeteren we de methode verder door de fototoxiciteit te verminderen en de resolutie en nabewerking te verbeteren die nodig zijn voor de MT Dynamics-analyse. Bovendien maken we een basis voor toekomstige wijzigingen van de methode door deze te combineren met andere synchronisatie technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. zaaien van HeLa-cellen
- Bereid 2 mL van 5 μg/mL fibronectine oplossing in fosfaatgebufferde Saline (PBS) en voeg hieraan 450 μL toe in elke put van een 4 well Chambered dekslip (#1.5). Incuberen de glijbaan gedurende 15 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Spoel asynchroon groeiende HeLa-cellen af met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en inincuberen met trypsine-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) gedurende 5 minuten bij 37 °C. Stop de enzymatische reactie door de toevoeging van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum (FCS) bij 3:1 (v:v) verhouding van toegevoegde trypsine-EDTA.
Opmerking: HeLa-cellen werden gehandhaafd in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FCS bij 37 ° c en 5% CO2 en werden routinematig doorgangen zodra ze 80 – 90% confluentie bereikten zoals hierboven beschreven. - Bepaal de celconcentratie met behulp van een Neubauer kamer. Meng een aliquot van 50 μL van de celsuspensie met trypan Blue bij een ratio van 1:1 (v:v), recombinatie en breng 10 μL van de suspensie over in de kamer. Tel alleen de trypaanse blauw-negatieve cellen in de vier grote vierkantjes (voor details zie Phelan et al.47). Afleiden van de celconcentratie van het getelde celnummer met behulp van de volgende formule:
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 2 min. respendeer met verse rpmi 1640 om 1 x 106 cellen/ml te verkrijgen.
- Verwijder de fibronectin uit de Chambered coverslip, was de putjes tweemaal met DPBS en zaai 50.000 cellen per putje.
- Retourneer de Chambered afdek met de cellen naar de incubator en kweek ze voor 24 uur bij 37 °c en 5% Co2.
2. expressie van pEB3-tdTomato in HeLa-cellen
- Maak een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Verdun voor elke buis 2 μg pEB3-tdTomato48 met transfectie buffer (synthetisch product in waterige oplossing) tot een eindvolume van 396 μL.
- Voeg 4 μL transfectie reagens (niet-lipiden, met polyethylenimine) toe aan de eerste buis en Vortex het mengsel onmiddellijk voor precies 10 s.
- Draai de buis kort met een micro centrifuge en inincuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten.
- Verwijder de HeLa-cellen uit de incubator. Dropwise, voeg 100 μL van het transfectie mengsel toe aan elk goed van een 4 goed Chambered dekslip, en retourneer de cellen naar de incubator.
- Na 4 uur incubatie bij 37 °C en 5% CO2, vullen de cellen aan met een vers groeimedium en incuberen ze gedurende ten minste 24 uur bij 37 °c en 5% Co2.
Opmerking: Het is noodzakelijk om te optimaliseren van de transfectie voorwaarden voor elk celtype. De uitdrukkings niveaus moeten laag genoeg zijn om de identificatie van enkele MT-groei uiteinden mogelijk te maken. Als alternatief kan een cellijn met een stabiel uitdrukken van EB3-tdTomato worden gebruikt in de experimenten; Dit zou de variabiliteit in uitdrukkings niveaus van EB3-tdTomato verminderen tussen preparaten en tussen cellen uit hetzelfde preparaat49.
3. synchronisatie en live-celbeeldvorming van pEB3-tdTomato – HeLa-cellen uitdrukken
- Bereid een 2,5 μM oplossing van dimethyleenastron (DME) in fenol-rood gratis Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% FCS en 2 mM L-glutamine of een alternatieve glutamine toevoer.
- Vervang het groeimedium in de Afdeklijst van de Chambered met 500 μL van het groeimedium met 2,5 μM DME en inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
- Na 3,5 h van incubatie met DME, de cellen overbrengen naar de Microscoop, Monteer de Chambered afdek in een milieu kamer met donkere panelen voorbeeld vorming bij 37 ° c en 5% Co2, en verder inbroed tot de totale incubatietijd 4 h.
Opmerking: Het onderhoud van de temperatuur bij 37 °C zonder schommeling is cruciaal voor het experiment. - Voer de time-lapse Imaging uit op een omgekeerde Microscoop uitgerust met een 100x 1,49 N.A. olie immersie doelstelling, een Dual Spinning Disk confocale systeem en een betrouwbaar autofocus systeem voor continu onderhoud van het brandvlak. Definieer de imaging-parameters als volgt.
Opmerking: We gebruiken een elektron vermenigvuldigings camera (EM-CCD) met oplaadapparaat.- Gebruik voor EB3-tdTomato excitatie een 561 nm Laser lijn met 200 MS belichtingstijd. Vang het uitgezonden licht op via een viervoudige band pass (405, 488, 561, 640 nm) dichroïde spiegel en een 600/52 nm emissie filter.
Opmerking: Laser vermogen kan worden aangepast voor elke afbeelding gemaakt cel om de beeld verzadiging te voorkomen. In alle time-lapse films die hier worden gegeven, was de laser kracht ingesteld op 5,3 mW. - Zoek een cel in profase en focus in het Z-vlak dat overeenkomt met het midden van de monopolaire mitotische spil. Verwerven van beelden elke 0,5 s over een totaal van 1 min zonder binning en geen belichting tussen de belichtingen.
- Gebruik voor EB3-tdTomato excitatie een 561 nm Laser lijn met 200 MS belichtingstijd. Vang het uitgezonden licht op via een viervoudige band pass (405, 488, 561, 640 nm) dichroïde spiegel en een 600/52 nm emissie filter.
4. analyse van de MT-dynamiek met U-track v 2.2.0
- Voor het analyseren van de MT-dynamiek is een numerieke computeromgeving software vereist (bijvoorbeeld MATLAB).
Opmerking: Basiskennis van de software is voldoende voor de analyse. Uitgebreid Help materiaal en tutorials zijn beschikbaar op de website van de ontwikkelaar (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html). - Download (https://github.com/DanuserLab/u-track) en installeer de open-source u-track v 2.2.0-software volgens de gedetailleerde instructies in het bestand ' Readme_u-track. PDF '50,51,52.
- Start de numerieke analyse software en voeg U-track v 2.2.0 map met submappen in de software zoekpad.
- Vanuit het commando venster oproep "Movieselectorgui". Hiermee opent u een dialoogvenster van waaruit de RAW-bestanden die worden gegenereerd door de beeldverwervings software op de Microscoop kunnen worden geïmporteerd (aanvullend figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4).
Opmerking: De U-track software is compatibel met andere beeldgegevens formaten. Het maakt gebruik van bio-formaten, die verschillende Life Science data formaten herkent53. - De grootte van elke afbeelding wordt automatisch uit de metagegevens gelezen. Voer handmatig het numerieke diafragma in van de doelstelling (in dit geval 1,49) en het tijdsinterval (0,5 s) dat wordt gebruikt voorbeeld vorming (aanvullende figuur 1b). Daarnaast kan ook informatie over de excitatie golflengte, de fluorophore en de blootstellingstijd worden verstrekt, maar ze zijn niet kritisch voor verdere analyse.
- Zodra alle afbeeldingen zijn geladen, slaat u de ingevoerde timelapse-reeks op als een film lijst door de "Opslaan als film lijst" te selecteren. Aan de rechterkant van het dialoogvenster selecteert u de optie "U-track" en drukt u op "Doorgaan" (aanvullende figuur 1c).
Opmerking: De waarden zijn geoptimaliseerd voor HeLa-cellen. Als u overschakelt naar een andere cellijn, moeten de waarden opnieuw worden gedefinieerd. U ook de instellingen gebruiken die door de softwareontwikkelaars worden aanbevolen. De gedetailleerde uitleg van elk van de parameters en hoe deze moeten worden gedefinieerd, vindt u in het technische rapport dat is meegeleverd met de vorige versie van de software, Plustip tracker50. - Selecteer in het pop-upvenster "Microtubule plus-ends" en druk op "OK" (aanvullende afbeelding 1c). Het nieuwe dialoogvenster maakt het mogelijk om de parameters te bepalen voor de drie stappen van de analyse (aanvullende figuur 1d), die detectie, tracering en spoor analyse zijn.
- Kies in stap 1 "instellingen" en selecteer in een vervolgkeuzemenu "Comet Detection" als detectiemethode (aanvullende figuur 2b).
- Definieer in het nieuwe dialoogvenster de parameters voor het verschil van het Gaussianen filter en de segmentatie van de waterscheiding als volgt (aanvullende figuur 2c): masker proces dat moet worden gebruikt voor de detectie = geen; Low-Pass Gaussiaanse standaarddeviatie = 1 pixel; High-Pass Gaussiaanse standaarddeviatie = 3 pixels; Minimum drempel = 3 standaarddeviaties; Drempel grootte van stap = 0,25 standaarddeviaties. Selecteer "instellingen toepassen op alle films" en "toepassen".
- In stap 2 worden de parameters voor koppelen, kloof dichten, samenvoegen en splitsen en Kalman-filterfuncties in drie stappen gedefinieerd, zoals aangegeven in roze, groen en blauw, dienovereenkomstig (aanvullende Figuur 3b). Voor deze stappen selecteert u de "Microtubule plus-end Dynamics" en uit de optie "setting" definieert u de waarden zoals aangegeven in aanvullende figuur 3c – E, respectievelijk.
- Voor problemen met dimensionaliteit kiest u "2" in het vervolgkeuzemenu. Gebruik de maximale kloof te sluiten = 5 frames; Minimale lengte van spoor segmenten vanaf de eerste stap = 3 frames. Zoals eerder, selecteer "instellingen toepassen op alle films" en klik op "toepassen".
- In stap 3 van de analyse worden de gedetecteerde MT-tracks geclassificeerd (aanvullend figuur 4). Als een track analysemethode, kies "Microtubule Dynamics Classification" en definieer de parameters via de "setting" knop zoals aangegeven in aanvullende figuur 4b, C. Kies daarna het vak "instellingen toepassen op alle films" en klik op "toepassen".
- Zodra alle parameters zijn gedefinieerd, selecteert U in het venster "Configuratiescherm – U-spoor" (aanvullende figuur 1d) de vakken "Controleer/Verwijder het vinkje bij alle films" en "alle films uitvoeren" en druk op "uitvoeren". Dit zal de MT-analyse van de time-lapse-serie initiëren.
- Zodra de verwerking van de film is voltooid, wordt een bericht "uw film (s) zijn verwerkt" weergegeven. Druk op "OK" en vervolgens op "Save".
- Nu is het veilig om te stoppen met de numerieke analyse software. De resultaten van de film verwerking worden opgeslagen in submapstructuren als m-bestanden in de map waar de RAW-bestanden worden opgeslagen.
5. statistische analyse van de MT Dynamics
- Importeer de m-bestanden in een voorkeurs statistiek-analyseprogramma.
Opmerking: In ons geval importeren we eerst de bestanden in een standaard spreadsheet om ze leesbaar te maken. De m-bestanden bevatten statistische informatie (mediaan, gemiddelde en standaarddeviatie) op verschillende parameters (bijv. groeisnelheid, MT dynamiciteit). De gedetailleerde lijst van de parameters wordt gegeven in het technisch rapport dat is meegeleverd met de vorige versie van de software, plustip tracker50,52. De gegenereerde m-bestanden kunnen ook worden geïmporteerd in andere software voor gegevensverwerking. - Kies de parameter ' groeisnelheid mean ' en importeer deze in een tabel voor statistieken en weergave. Voer de informatie in over andere parameters (bijvoorbeeld ' dynamiciteit ') in een nieuwe tabel of in een nieuwe kolom van dezelfde gegroepeerde tabel en plot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het gegeven protocol in Figuur 1awerd de PEB3-tdTomato plasmide transitief uitgedrukt in asynchroon groeiende HeLa-cellen. De cellen werden gesynchroniseerd 48 h na de transfectie bij tijdens door DME behandeling (Figuur 1b). Deze stap zorgde ervoor dat de meting van de MT-dynamiek altijd in dezelfde fase van de celcyclus werd uitgevoerd. De timelapse-films werden verder verwerkt en geanalyseerd met U-track v 2.2.0, zoals beschreven in de aanvullende documentatie50,51,52. Hoewel de plus-end bindende eiwitten alleen de groeifases van de MT traceren, extrapoleert de U-track v 2.2.0 de informatie over de pauze-en krimp gebeurtenissen door sequentiële groeifases te koppelen en de volledige trajecten26,50te reconstrueren. Het algoritme is gebaseerd op de ruimtelijke en temporale Global tracking Framework beschreven door Jaqaman et al.51.
Het is belangrijk op te merken dat de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de analyse sterk afhankelijk zijn van verschillende analyseparameters. Als voorbeeld werden de timelapse-films geanalyseerd zoals beschreven in het Protocol (afbeelding 1c, video 1 "before" en video 2 "na" de analyse), en de resulterende groeisnelheid en dynamiciteit (collectieve verplaatsing van kloof-bevattende tracks gedurende hun gehele levensduur) worden uitgezet in Figuur 1E, F, respectievelijk (zwarte cirkels). Vervolgens zijn de parameters beschreven die sterk van invloed zijn op de analyse50, zoals "maximale lengte van tussenruimte" en "maximale krimp factor" voor dezelfde reeks time-lapse-films (respectievelijk Video's 3 en 4). De overeenkomstige waarden van de groeisnelheid en de dynamiciteit worden gegeven in Figuur 1E, F als rode vierkantjes en blauwe driehoeken, respectievelijk. De resulterende groeisnelheid werd niet diep aangetast. De voor dynamiciteit verkregen waarden waren echter significant verschillend wanneer "maximale lengte van tussenruimte" werd gewijzigd, terwijl het onveranderd bleef bij het wijzigen van de "maximale krimp factor". Zoals weergegeven in figuur 1d, was de detectie van de MT-startte in alle drie de gevallen eveneens robuust. Toch werd de reconstructie van de volledige MT-trajecten meestal beïnvloed wanneer "maximale tussenruimte" werd ingesteld op 15 (afbeelding 1d, inzet beelden). Om te kunnen beoordelen of de beeldvormings omstandigheden het MT-gedrag verstoorden, werden de eerste (1 – 61 frames) en de tweede (61 – 121 frames) helften van de time-lapse-serie afzonderlijk geanalyseerd en werden de corresponderende groeisnelheid en de dynamiciteitswaarden vergeleken (Figuur 1G, H, respectievelijk). Zoals verwacht werden er geen significante verschillen gedetecteerd tussen de twee delen van de time-lapse-serie. In Video's 1 – 8 time-lapse beelden van een mitotische cel gesynchroniseerd in profase en uitdrukken EB3-tdtomato worden gegeven (duur = 1 min; interval = 0,5 s).
Figuur 1: analyse van de MT-dynamiek in HeLa-cellen gesynchroniseerd in tijdens. A) een overzicht van de stappen van het protocol. B) de schematische weergave van het mechanisme van gemedieerde vorming van een monopolaire mitotische spil. C) een montage van de eerste 10 frames van de timelapse-film die met U-track software wordt verwerkt met elk tweede frame. De gedetecteerde trajecten van de MT-groei zijn gemarkeerd met rood. (D) de time series-projectie van het RAW-afbeeldingsbestand en na MT-tracking met behulp van de instellingen die worden beschreven in het Protocol ("optimaal"), en bij het wijzigen van "maximale lengte van tussenruimte" of "maximum krimp factor" worden gegeven. De inzetstukken vertegenwoordigen de volledige MT-trajecten, die bestaan uit de groei (rood), pauze (licht blauw), krimp (geel), fgap geherclassificeerd als groei (groen) en bgap geherclassificeerd als pauze (donkerblauw) gebeurtenissen. De groeisnelheid betekent (E) en de waarden van de dynamiciteit (F) worden weergegeven, en de resultaten met behulp van een van de voorgestelde optimale criteria (zwarte cirkels), maximale gap lengte ingesteld op 15 (rode vierkantjes), of de maximale krimp factor ingesteld op 1,0 (blauwe driehoeken) worden uitgezet (n = 45 cellen; gemiddelde ± SEM; one-way ANOVA-analyse met Tukey post hoc test voor meervoudige vergelijking). De groeisnelheid betekent (G) en de dynamiciteitswaarden (H) worden weergegeven voor de eerste (1 – 61 frames) en de tweede (61 – 121 frames) helften van de time-lapse-films (n = 45 cellen; gemiddelde ± SEM; ongepaarde t-toets met de correctie van Welch). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: een representatieve time-lapse RAW-afbeelding van een prometafase-cel vóór de analyse. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 2: detectie en tracering van de MTs in een cel in video 1 met behulp van de voorgestelde instellingen voor U-track software. Dezelfde time-lapse-afbeelding in video 1 verwerkt met U-track v 2.2.0-software met behulp van de beschreven instellingen, en de gedetecteerde groei tracks zijn gemarkeerd in het rood. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 3: detectie en tracering van de MTs in een cel in video 1 met behulp van een niet-optimale waarde voor de "maximale lengte van tussenruimte". Dezelfde timelapse-afbeelding in video 1 verwerkt met U-track v 2.2.0-software met dezelfde instellingen als voorheen, maar met de "maximale spleet lengte" ingesteld op 15. De rest van de parameters werden niet gewijzigd. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 4: detectie en tracering van de MTs in een cel in video 1 met behulp van een niet-optimale waarde voor de "maximale krimp factor". Dezelfde timelapse-afbeelding in video 1 verwerkt met U-track v 2.2.0-software met dezelfde instellingen als voorheen, maar met de "maximale krimp factor" ingesteld op 1. De rest van de parameters werden niet gewijzigd. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 5: een voorbeeld van een time-lapse-reeks van een cel met celpuin. Na de analyse, sommige celpuin werd ook gedetecteerd door de software tijdens MT tracking. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 6: onbewerkte gegevens die corresponderen met video 5. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 7: een voorbeeld van een time-lapse-reeks van een cel met een hoge expressie van EB3-tdTomato, wat resulteert in een slechte definitie van groei tips. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Video 8: onbewerkte gegevens die corresponderen met video 7. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullend figuur 1: de workflow van de analyse met behulp van U-track software. A) eenschematische voorstelling van de door de software toegepaste stappen. (B) een schermafbeelding van de importeur van bio-formaten die laat zien hoe de timelapse-bestanden worden geïmporteerd. (C) na het uploaden van de bestanden, U-track met de MT plus-ends module is geselecteerd. (D) een screenshot van het bedieningspaneel van U-track waar de instellingen voor Comet detectie, tracering en spoor analyse zijn gedefinieerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: beschrijving van de eerste stap van de analyse, de komeet detectie. (A) een overzicht van de belangrijkste gebeurtenissen die door het algoritme worden uitgevoerd. (B, C) Screenshots van de software worden gegeven met de optimale waarden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: beschrijving van de tweede stap van de analyse, de Comet tracking. (A) de belangrijkste stappen die door het algoritme worden uitgevoerd, worden beschreven. (B) een screenshot van het "tracking"-paneel wordt gegeven. De maximale tussenruimte sluit komt overeen met de maximale lengte van de tussenruimte en is ingesteld op 5. Het volgen van drie substappen die zijn gemarkeerd met rode, groene en blauwe rechthoeken. (C,D,E) De numerieke waarden die nodig zijn voor elke substap worden hier ingevoerd. De maximale krimp factor is ingesteld op 1,5 zoals aangegeven onderD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4: beschrijving van de laatste stap van de analyse, spoor analyse. A) de MT Dynamics-classificatie en herindeling van de samengestelde sporen wordt tijdens deze stap uitgevoerd. (B, C) Screenshots van de track analyse en de bijbehorende instellingen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een wijziging van een methode die voor het eerst werd vastgesteld door Ertych et al.44. Samen met een aantal andere modificaties, combineren we deze techniek van MT Dynamics analyse met Dual Spinning Disk confocale Imaging. Het gebruik van de Dual Spinning Disk verbetert de resolutie van de groeiende MTs en vermindert fototoxiciteit36. We verminderen verder de fotobleaching en laserlicht veroorzaakte schade van de cellen door over te schakelen naar een langere golflengte fluorescerende Reporter. Het tdTomato fluorescerende eiwit heeft een hogere coëfficiënt van foto stabiliteit en helderheid in vergelijking met een EGFP46. Tot slot is de meting van de MT-dynamiek beperkt tot slechts één Z-vlak vanwege de beperkingen van de follow-upanalyse met U-track. De U-track software is ontworpen om de fluorescently gelabelde MT-uiteinden op te sporen in een xyz-as50,51. Daarom is het nemen van een Z-stack time-lapse serie en het creëren van maximale projectie time-lapse serie gevoelig voor het genereren van valse resultaten. Signalen die in verschillende Z-vlakken zijn gedetecteerd en die niet tot dezelfde groeiende MT behoren, worden samengebracht in de maximale projectie, waardoor een vals traject van MT-groei ontstaat.
Het synchronisatie protocol dat hier wordt gebruikt induceert een hoge dichtheid van MTs door de mitotische spil te beperken tot een monopolaire structuur. De mitotische MTs zijn zeer dynamische structuren met fasen van groei en krimp, met een pauze bij de overgang tussen hen19,54,55. Vanwege de hoge dichtheid van de groeiende MTs, is detectie van de pauze gebeurtenissen, gevolgd door krimp of groei, gevoelig voor valse resultaten als de tracking parameters onjuist zijn ingesteld. De U-track software tracking modules detecteren zogenaamde startte (episodes van continue groei) en classificeert ze vervolgens als samengestelde tracks met pauze gebeurtenissen genaamd "gaps". Applegate et al. Bespreek twee parameters die essentieel zijn voor de tracking en subtrack Linking50. Dit zijn "maximale spleet lengte" en "maximale krimp factor". Als de vervolg track die gevolgd wordt opnieuw verschijnt in de stijgende richting van de MT in de daaropvolgende tijd stappen, dan wordt deze geclassificeerd als een voorwaartse kloof. Aan de andere kant, als het subspoor opnieuw tegenover de groei richting verschijnt, zal het worden geclassificeerd als een achterwaartse kloof. De maximale lengte van de tussenruimte definieert het aantal frames dat moet worden doorzocht op de voorwaartse en achterwaartse hiaten. Zoals gezegd, de hoge dichtheid en door de natuur hoge dynamiciteit van de mitotische MTs stelt de beperking, en kleinere waarden moeten worden gedefinieerd. Zoals weergegeven in Figuur 1e , wordt de dynamiciteit het meest beïnvloed. De dynamiciteit wordt berekend als collectieve verplaatsing van alle gap-bevattende tracks over hun wereldwijde levensduur. De tweede parameter, de maximale krimp factor, heeft weinig tot geen effect op dynamiciteit of groeisnelheid (Figuur 1D, E).
In het algemeen, bij het bestuderen van MT-groei-eigenschappen, moet zorgvuldige aandacht worden besteed aan de imaging voorwaarden. Ten eerste, de MTs zijn zeer gevoelig voor temperatuur en cellulose wanneer blootgesteld aan koude groeimedium56,57,58,59. Daarom, om het verzamelen van valse resultaten te voorkomen, moet de temperatuur strikt worden gecontroleerd gedurende het hele experiment. Ten tweede kan de Ionische samenstelling van het medium dat tijdens de experimenten wordt gebruikt invloed hebben op de MT-groei58,60. Blootstelling aan calciumionen beïnvloedt bijvoorbeeld de MT-dynamiek op verschillende manieren61,62. Vandaar dat de samenstelling van het groeimedium dat in alle experimenten wordt gebruikt, hetzelfde moet zijn. Evenzo moeten de parameters van de analyse eenmaal worden gedefinieerd en constant worden gehouden voor alle herhalingen. Bovendien moeten de time-lapse-films die na de analyse worden gegenereerd, visueel worden geïnspecteerd, en elke film met achtergrondruis die aanleiding geeft tot valse positieven (Video's 5 en 6) of met een hoge expressie van tdTomato, resulterend in een slechte resolutie van de MT-kweektips (Video's 7 en 8), moet worden uitgesloten van verdere statistische analyse.
Onlangs, de combinatie van rooster licht blad microscopie van een mitotische spindels op subsecond intervallen, samen met geavanceerde beeldverwerking de analyse van MT assemblage tarieven in drie dimensies63,64. Dit heeft duidelijke voordelen ten opzichte van CLSM, maar verdere verbeteringen zullen nodig zijn voordat de methode algemeen wordt gebruikt, zoals de uitbreiding van strategieën die worden gebruikt in U-track naar de derde dimensie26,50,63.
Het Protocol van MT Dynamics Detection dat we hier beschrijven, kan een methode zijn voor de keuze van drugs screening. De methode is robuust, en het met succes verwijdert menselijke bias in vergelijking met de analyse handmatig uitgevoerd. De automatisering van de film verwerking maakt het mogelijk om duizenden MT-tracks binnen elke cel te analyseren, waardoor het statistische vermogen van de analyse toeneemt. Bovendien kan de methode worden gewijzigd door bijvoorbeeld het synchronisatie protocol te wijzigen en cellen uit verschillende fasen van de celcyclus te verkrijgen. Dit kan bijvoorbeeld een nuttig instrument zijn voor het screenen van MT gericht op chemotherapeutische geneesmiddelen wanneer het effect op de interfase en het verdelen van cellen moet worden onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de lichte microscopie faciliteit, Max-Planck Instituut voor experimentele geneeskunde, voor hun deskundig advies en ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylenastron | Merck | 324622 | |
| DMEM w/o phenol red | Gibco | 31053-28 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0415 | |
| Fibronectin Bovine Plasma | Merck | F4759 | Sterile powder |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | Stable glutamine substitutive |
| jetPRIME | Polyplus | 114-15 | |
| EB3-TdTomato | Addgene | plasmid #50708 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Trypan Blue | Merck | T8154-20ML | |
| Trypsin/EDTA solution | Biochrom | L2143 | 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium |
| µ-slide | Ibidi | 80426 | 4-well slide with #1.5 coverslip |
| Eclipse Ti Inverted microscope | Nikon | NA | |
| Objective | Nikon | MRD01991 | CFI Apo TIRF 100xC Oil |
| ACAL Laser Excahnger | Nikon | Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm | |
| Spinning disk module | Andor | CSU-W | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| Environmental Chamber | Okolab | Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier | |
| HeLa Cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIS Elements v4 | Nikon | Spinning disk microscope. Acquisition Software | |
| MATLAB | Mathworks | Computing environment | |
| Prism 8 | GraphPad | Statistical analysis and display software |
References
- Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
- Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
- Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
- Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
- Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
- Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
- Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
- Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
- Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
- Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
- Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
- Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
- Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
- Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
- Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
- Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
- Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
- Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
- Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
- Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
- Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
- Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
- Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
- Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
- Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
- Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
- Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
- Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
- Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
- Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
- Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
- Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
- Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
- Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
- Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
- Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
- Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
- Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
- Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
- Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
- Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
- Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
- Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
- Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
