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Biology

Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Hier stellen wir eine robuste und detaillierte Methode der Mikrotubuli-Dynamikanalyse in Zellen vor, die in der Prometaphase mit Live-Zell-Spinnscheibe konfokaler Mikroskopie und MATLAB-basierter Bildverarbeitung synchronisiert werden.

Abstract

Wir beschreiben eine Modifikation einer etablierten Methode zur Bestimmung der Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen. Das Protokoll basiert auf der Expression eines genetisch kodierten Markers für die positiven Enden von Mikrotubuli (EB3 mit tdTomato fluoreszierendem Protein) und hochgeschwindigkeits-, hochauflösender Live-Zell-Bildgebung mittels konokaler Spinnenvon-Mikroskopie. Die Zellzyklussynchronisierung und die erhöhte Dichte von Mikrotubuli werden durch Hemmung der zentrosomalen Trennung in mitotischen Zellen erreicht, und die Analyse des Wachstums wird mit Open-Source-U-Track-Software durchgeführt. Die Verwendung eines hellen und rot verschiebbaren fluoreszierenden Proteins in Kombination mit der geringeren Laserleistung und der reduzierten Belichtungszeit, die für die Spinnendere benötigt wird, reduziert die Phototoxizität und die Wahrscheinlichkeit lichtinduzierter Artefakte. Dies ermöglicht die Abbildung einer größeren Anzahl von Zellen in der gleichen Zubereitung unter Beibehaltung der Zellen in einem Wachstumsmedium unter Standardkulturbedingungen. Da die Analyse in einer überwachten automatischen Weise durchgeführt wird, sind die Ergebnisse statistisch robust und reproduzierbar.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) sind hochdynamische Strukturen, die in praktisch allen eukaryotischen Zellen und in einigen Bakterien gefunden werden1. Zusammen mit Aktin und Zwischenfilamenten formen sie das Zytoskelett2,3. Zellteilung4, Molekültransport5, Flagellar schlagen6, das Gefühl der Umgebung durch primärecilium7, Hören (Kinocilium)8,9, Embryogenese10,11,12, Invasion und Metastasierung13,14, und sogar Gedächtnisbildung15,16,17,18, und viele andere Prozesse verlassen sich in erster Linie auf MTs. Die Teilnahme von MTs an all diesen Ereignissen wäre ohne ihre bemerkenswerte Fähigkeit, schnell zwischen Wachstum (Polymerisation) und Schrumpfung (Depolymerisation) zu wechseln, nicht möglich. Diese Eigenschaft wird als dynamische Instabilität19beschrieben. MT-Dynamik wird unter vielen pathologischen Bedingungen verändert20,21,22. Daher kann die Bestimmung der Art dieser Eigenschaft helfen, Krankheitsmechanismen und anschließend ihre Behandlung zu verstehen.

Für die MT-Dynamikanalyse wurde eine lange Liste von Methoden entwickelt, von denen die meisten auf bildgebenden Verfahren basieren23. Ursprünglich wurden Weitfeldlichtmikroskope zur Beobachtung der Bildung von Tubulinpolymeren in vitro24eingesetzt. Die Entdeckung von Endbindungsproteinen (EB)-Proteinen, die sich an MT-Plus-Ends sammeln, und die Entwicklung von Methoden zur fluoreszierenden Kennzeichnung von Proteinen ermöglichten es, das Verhalten von MTs direkt in lebenden Zellen mit Weitfeld- und konfokalen Fluoreszenzmikroskopen25,26,27zu beobachten. Ein EB-Protein ist endbindendes Protein 3 (EB3)28; durch Überexpression und Verfolgung von EB3, das zu einem fluoreszierenden Protein verschmolzen wird, können MT-Plus-End-Montageraten bestimmt werden29,30.

Die konfokale Laserscanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) wird häufig verwendet, um der MT-Dynamik zu folgen. Diese bildgebende Technik stellt jedoch ein hohes Risiko für Phototoxizität und Photobleaching, zwei unerwünschte Prozesse für lebende Zellen und dim Probenbildgebung31. Um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, sollten die Laserleistung und die Belichtungsdauer hoch genug sein, ohne die Proben zu beschädigen, und dies erfordert eine Aufblätung der Auflösung im Austausch für Geschwindigkeit. Eine geeignete Alternative zu CLSM ist die Spinnscheibenmikroskopie32. Diese bildgebende Modalität basiert auf der Verwendung einer Nipkow-Scheibe33, die aus einer beweglichen Scheibe besteht, die eine Reihe von Lochlöchern trägt, und arbeitet äquivalent zu vielen CLS-Mikroskopen, die die gleiche Probe gleichzeitig darstellen34. Daher leuchtet das Licht des Lasers mehrere Bereiche in der Probe gleichzeitig, behält aber die konfokale Natur bei. Die Nipkow-Festplatte ermöglicht es daher, Bilder zu erhalten, die CLSM ähneln, aber schneller und mit weniger Laserleistung. Die Nipkow-Scheibe wurde von Yokogawa Electric weiter verbessert, die eine zweite Scheibe mit einer Reihe von Mikrolinsen auf sie einführte, die einzeln Licht in ein entsprechendes Loch leiten, wodurch Phototoxizität und Photobleichung weiter reduziert werden35. So wurde die Spinnscheiben-Laserscanmikroskopie zu einer Methode der Wahl für die Live-Zell-Bildgebung, und es ermöglicht, Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis bei einer hohen Geschwindigkeitvon 31,36zu erhalten, was für das Auflösen von Signalen wie denen von den schnell wachsenden MT-Enden entscheidend ist.

Mt-Dynamik unterscheidet sich vorübergehend. Beispielsweise sind die mitotischen MTs dynamischer als die Interphase-MTs37,38. In ähnlicher Weise wurden Unterschiede in der Wachstumsrate und Schrumpfung sogar innerhalb derselben Zellzyklusphase beobachtet, wie Mitose39,40. Um eine falsche Datenerfassung zu vermeiden, sollte die Messung der MT-Dynamik daher während des Zellzyklus auf ein enges Zeitfenster beschränkt werden. Zum Beispiel kann die Messung der MT-Dynamik in der Prometaphase durch die Behandlung der Zellen mit Dimethylenastron (DME) erreicht werden, einem monastrolen Analogon, das die Motorkinus eg541 hemmt und die Bildung der bipolaren Mitotischen Spindel42verhindert. Die Hemmung von Zellen in der Prometaphase mit Eg5-Hemmer DME und anderen monastrolen Derivaten hat keinen Einfluss auf die MT-Dynamik43,44,45, was DME zu einem nützlichen Werkzeug für die Untersuchung der MT-Dynamik sowohl in festen als auch in lebenden Zellen macht44.

Hier kombinieren wir die von Ertych etal. 44 beschriebene Methode der MT-Dynamikanalyse in Prometaphasenzellen mit dualspinnierender Scheibenbildgebung. Diese Methode ermöglicht die Messung der MT-Dynamik in Prometaphasenzellen, die von einer einzigen Fokalebene mit einer höheren Bildrate, jedoch ohne Photobleichung und minimale Phototoxizität gesammelt wurden. Darüber hinaus verwenden wir als fluoreszierender Reporter Tandem-Dimer Tomato fluorescent protein (tdTomato), das die Helligkeit und Photostabilität im Vergleich zum grünen Fluoreszenzprotein (EGFP) verbessert hat und mit weniger Energielicht46angeregt wird. Daher benötigt tdTomato weniger Laserleistung für die Anregung und ist weniger fototoxisch. Insgesamt verbessern wir die Methode weiter, indem wir die Phototoxizität reduzieren und die Auflösung und Nachbearbeitung verbessern, die für die MT-Dynamikanalyse erforderlich sind. Darüber hinaus schaffen wir eine Grundlage für zukünftige Änderungen der Methode, indem wir sie mit anderen Synchronisationstechniken kombinieren.

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Protocol

1. Aussaat von HeLa-Zellen

  1. Bereiten Sie 2 ml mit 5 g/ml Fibronectin-Lösung in Phosphatgepufferter Saline (PBS) vor und fügen Sie 450 l davon in jeden Brunnen eines 4 gut gekammerten Deckellips (#1.5) ein. Inkubieren Sie den Schlitten 15 min bei 37 °C und 5%CO2.
  2. Asynchron wachsende HeLa-Zellen mit Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) abspülen und mit Trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) 5 min bei 37 °C inkubieren. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch die Zugabe von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kalbsserum (FCS) bei 3:1 (v:v) Verhältnis von hinzugefügten Trypsin-EDTA.
    HINWEIS: HeLa-Zellen wurden in RPMI 1640 medium gehalten, ergänzt mit 10% wärmeinaktiviertem FCS bei 37 °C und 5%CO2 und wurden routinemäßig durchzogen, sobald sie wie oben beschrieben eine Konfluenz von 80–90% erreichten.
  3. Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einer Neubauer-Kammer. Mischen Sie ein 50 L Aliquot der Zellsuspension mit Trypan blau bei 1:1 (v:v) Verhältnis, resuspendieren, und übertragen Sie 10 l der Suspension in die Kammer. Zählen Sie nur die Trypan blau-negativen Zellen innerhalb der vier großen Quadrate (Details siehe Phelan et al.47). Leiten Sie die Zellkonzentration von der gezählten Zellzahl mit der folgenden Formel ab:
    Equation 1
  4. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 2 min. Resuspend mit frischem RPMI 1640, um 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
  5. Entfernen Sie das Fibronectin aus dem kammerierten Deckel, waschen Sie die Brunnen zweimal mit DPBS und säen Sie 50.000 Zellen pro Brunnen.
  6. Den kammerierten Deckelrutsch mit den Zellen in den Inkubator zurückgeben und 24 h bei 37 °C und 5%CO2anbauen.

2. Expression von pEB3-tdTomato in HeLa-Zellen

  1. Bereiten Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr vor. Für jedes Rohr 2 g pEB3-tdTomato48 mit Transfektionspuffer (synthetisches Produkt in wässriger Lösung) auf ein Endvolumen von 396 l verdünnen.
  2. Fügen Sie dem ersten Röhrchen 4 l Transfektionsreagenz (nicht-lipidisch, polyethylenimin enthaltend) hinzu und wirbeln Sie die Mischung sofort für genau 10 s aus.
  3. Drehen Sie das Rohr mit einer Mikrozentrifuge kurz herunter und brüten bei Raumtemperatur (RT) 10 min.
  4. Entfernen Sie die HeLa-Zellen aus dem Inkubator. Tropfend fügen Sie jedem Brunnen eines 4 gut kammerigen Deckels 100 l des Transfektionsgemisches hinzu und geben Sie die Zellen an den Inkubator zurück.
  5. Nach 4 h Inkubation bei 37 °C und 5%CO2die Zellen mit frischem Wachstumsmedium ergänzen und mindestens 24 h bei 37 °C und 5%CO2brüten.
    HINWEIS: Es ist notwendig, die Transfektionsbedingungen für jeden Zelltyp zu optimieren. Die Ausdrucksebenen müssen niedrig genug sein, um die Identifizierung einzelner MT-Wachstumsenden zu ermöglichen. Alternativ kann in den Experimenten eine Zelllinie verwendet werden, die EB3-tdTomato stabil ausdrückt; dies würde die Variabilität der Expressionsniveaus von EB3-tdTomato zwischen Präparaten und zwischen Zellen aus der gleichen Zubereitung verringern49.

3. Synchronisation und Live-Zell-Bildgebung von pEB3-tdTomato-expressing HeLa Cells

  1. Bereiten Sie eine 2,5-M-Lösung aus Dimethylenastron (DME) in phenolrot-freiem Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt durch 10% FCS und 2 mM L-Glutamin oder eine alternative Glutaminversorgung.
  2. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium im kammerierten Deckelschlupf durch 500 l des Wachstumsmediums, das 2,5 M DME enthält, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2.
  3. Nach 3,5 h Inkubation mit DME die Zellen auf das Mikroskop übertragen, den kammerierten Abdeckungsslip in eine Umweltkammer mit dunklen Paneelen für die Bildgebung bei 37 °C und 5%CO2montieren und weiter inkubieren, bis die gesamte Inkubationszeit 4 h beträgt.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der Temperatur bei 37 °C ohne Schwankungen ist für das Experiment entscheidend.
  4. Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung auf einem invertierten Mikroskop durch, das mit einem 100x 1,49 N.A. Öl-Tauchobjektiv, einem Konfokalsystem für Zweispinnscheiben und einem zuverlässigen Autofokussystem für die kontinuierliche Wartung der Brennebene ausgestattet ist. Definieren Sie die Bildparameter wie folgt.
    HINWEIS: Wir verwenden eine Elektronenmultiplizierende Charge-Coupled Device Kamera (EM-CCD).
    1. Für EB3-tdTomato Anregung, verwenden Sie eine 561 nm Laserlinie mit 200 ms Belichtungszeit. Sammeln Sie das emittierte Licht durch einen vierfachen Bandpass (405, 488, 561, 640 nm) dichroitischen Spiegel und einen 600/52 nm Emissionsfilter.
      HINWEIS: Die Laserleistung kann für jede abgebildete Zelle eingestellt werden, um eine Bildsättigung zu verhindern. In allen hier angegebenen Zeitrafferfilmen wurde die Laserleistung auf 5,3 mW eingestellt.
    2. Finden Sie eine Zelle in Prophase und Fokus in der Z-Ebene, die dem Zentrum der monopolaren mitotischen Spindel entspricht. Erfassen Sie Bilder alle 0,5 s über insgesamt 1 min ohne Binning und ohne Beleuchtung zwischen den Belichtungen.

4. Analyse der MT-Dynamik mit U-Track v2.2.0

  1. Zur Analyse der MT-Dynamik ist eine numerische Computerumgebungssoftware erforderlich (z.B. MATLAB).
    HINWEIS: Grundlegendes Verständnis der Software reicht für die Analyse aus. Umfassendes Hilfematerial und Tutorials finden Sie auf der Website des Entwicklers (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. Laden Sie (https://github.com/DanuserLab/u-track) herunter und installieren Sie die Open-Source-Software U-Track v2.2.0 gemäß den detaillierten Anweisungen in der Datei "Readme_u-track.pdf"50,51,52.
  3. Starten Sie die numerische Analysesoftware und fügen Sie dem Softwaresuchpfad den Ordner U-Track v2.2.0 mit Unterordnern hinzu.
  4. Rufen Sie im Befehlsfenster "movieSelectorGUI" auf. Dadurch wird ein Dialogfenster geöffnet, aus dem die von der Bildaufnahmesoftware am Mikroskop erzeugten Rohdateien importiert werden können (Zusatzabbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4).
    HINWEIS: Die U-Track Software ist mit anderen Bilddatenformaten kompatibel. Es verwendet Bio-Formate, die verschiedene Life Science Datenformate erkennen53.
  5. Die Größe jedes Bildes wird automatisch aus den Metadaten gelesen. Geben Sie manuell die numerische Blende des Objektivs (in diesem Fall 1,49) und des Zeitintervalls (0,5 s) ein, das für die Bildgebung verwendet wird (ergänzende Abbildung 1B). Zusätzlich können Informationen über die Anregungswellenlänge, das Fluorophor und die Belichtungszeit bereitgestellt werden, aber sie sind für die weitere Analyse nicht entscheidend.
  6. Sobald alle Bilder geladen sind, speichern Sie die eingegebene Zeitrafferserie als Filmliste, indem Sie die "Speichern als Filmliste "auswählen. Wählen Sie auf der rechten Seite des Dialogfensters die Option "U-Track" und drücken Sie "Continue" (Supplementary Figure 1C).
    HINWEIS: Die Werte sind für HeLa-Zellen optimiert. Wenn Sie zu einer anderen Zelllinie wechseln, sollten die Werte erneut definiert werden. Alternativ können Sie die von den Softwareentwicklern empfohlenen Einstellungen verwenden. Die detaillierte Erläuterung der einzelnen Parameter und deren Definition finden Sie im technischen Bericht mit der vorherigen Version der Software, plusTipTracker50.
  7. Wählen Sie im Pop-up-Fenster "Microtubule Plus-Ends" und drücken Sie "Ok" (Ergänzende Abbildung 1C). Das neue Dialogfenster ermöglicht die Bestimmung der Parameter für die drei Schritte der Analyse (Ergänzende Abbildung 1D), die Erkennung, Nachverfolgung und Spuranalyse sind.
  8. Wählen Sie in Schritt 1 "Einstellungen" und in einem Dropdown-Menü "Kometenerkennung" als Erkennungsmethode aus (Zusatzabbildung 2B).
    1. Aus dem neuen Dialogfenster definieren Sie die Parameter für die Differenz des Gaußer Filters und die Einzugsgebietsegmentierung wie folgt (Zusatzabbildung 2C): Maskenprozess für die Erkennung = Keine; Niedrigpass Gaußsche Standardabweichung = 1 Pixel; Hochpass Gaußsche Standardabweichung = 3 Pixel; Mindestschwelle = 3 Standardabweichungen; Schwellenwertschrittgröße = 0,25 Standardabweichungen. Wählen Sie "Einstellungen auf alle Filmeanwenden " und "Anwenden".
  9. In Schritt 2 werden die Parameter zum Verknüpfen, Schließen von Spalt, Zusammenführen und Aufteilen und Kalman-Filterfunktionen in drei Schritten definiert, wie in Rosa, Grün und Blau hervorgehoben , entsprechend(Ergänzende Abbildung 3B). Wählen Sie für diese Schritte die Option "Microtubule Plus-End Dynamics" aus, und definieren Sie aus der Option "Einstellen" die Werte, wie in der Zusatzabbildung 3C–Eangegeben.
    1. Bei Problemen mit der Dimensionalität wählen Sie "2" aus dem Dropdown-Menü. Verwenden Sie Maximale Lücke zum Schließen = 5 Frames; Minimale Länge der Spursegmente aus dem ersten Schritt = 3 Frames. Wählen Sie wie bisher "Einstellungen auf alle Filmeanwenden " und klicken Sie auf "Anwenden".
  10. In Schritt 3 der Analyse werden die erkannten MT-Spuren klassifiziert (Ergänzende Abbildung 4). Wählen Sie als Trackanalysemethode "Microtubule Dynamics Classification" und definieren Sie die Parameter über die Schaltfläche "Einstellen", wie in Der Ergänzenden Abbildung 4B,Cangegeben. Danach wählen Sie das Feld "Einstellungen auf alle Filme anwenden" und klicken Sie auf "Anwenden".
  11. Sobald alle Parameter definiert sind, wählen Sie im Fenster "Systemsteuerung –U-Track" (Ergänzende Abbildung 1D) die Felder "Check/Uncheck to All Moviesanwenden " und "Alle Filme ausführen" drücken und drücken Sie "Ausführen". Damit wird die MT-Analyse der Zeitrafferserie eingeleitet.
  12. Sobald die Filmverarbeitung abgeschlossen ist, wird die Meldung "Ihre Filme wurden erfolgreich verarbeitet" angezeigt. Drücken Sie "Ok", dann "Save".
  13. Jetzt ist es sicher, die numerische Analyse-Software zu beenden. Die Ergebnisse der Filmverarbeitung werden in Unterordnerstrukturen als m-Dateien in dem Ordner gespeichert, in dem die Rohdateien gespeichert sind.

5. Statistische Analyse der MT-Dynamik

  1. Importieren Sie die m-Dateien in ein bevorzugtes Statistikanalyseprogramm.
    HINWEIS: In unserem Fall importieren wir zuerst die Dateien in eine Standardtabelle, um sie lesbar zu machen. Die m-Dateien enthalten statistische Informationen (Median, Mittelwert und Standardabweichung) zu verschiedenen Parametern (z.B. Wachstumsgeschwindigkeit, MT-Dynamik). Die detaillierte Liste der Parameter ist im technischen Bericht mit der vorherigen Version der Software, plusTipTracker50,52angegeben. Die generierten m-Dateien können auch in andere Datenverarbeitungssoftware importiert werden.
  2. Wählen Sie den Parameter "Wachstumsgeschwindigkeit bedeutet" und importieren Sie ihn in eine Tabelle für Statistiken und Anzeige. Geben Sie die Informationen zu anderen Parametern (z. B. "Dynamik") entweder in einer neuen Tabelle oder in einer neuen Spalte derselben gruppierten Tabelle und demselben Diagramm ein.

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Representative Results

Nach dem in Abbildung 1Abeschriebenen Protokoll wurde das pEB3-tdTomato-Plasmid vorübergehend in asynchron wachsenden HeLa-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion bei Prometaphase durch DME-Behandlung synchronisiert (Abbildung 1B). Dieser Schritt sorgte dafür, dass die Messung der MT-Dynamik immer in der gleichen Phase des Zellzyklus durchgeführt wurde. Die Zeitrafferfilme wurden mit U-Track v2.2.0, wie in der Ergänzenden Dokumentation50,51,52beschrieben, weiterverarbeitet und analysiert. Obwohl die Plus-End-Bindungsproteine nur MT-Wachstumsphasen nachverfolgen, extrapoliert der U-Track v2.2.0 die Informationen über die Pausen- und Schrumpfungsereignisse, indem sequenzielle Wachstumsphasen verknüpft und die vollständigen Bahnen rekonstruiert werden26,50. Der Algorithmus basiert auf dem räumlich und zeitlich globalen Tracking-Framework, das von Jaqaman et al.51beschrieben wird.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse stark von mehreren Analyseparametern abhängt. Als Beispiel wurden die Zeitrafferfilme wie im Protokoll beschrieben analysiert(Abbildung 1C, Video 1 "Before" und Video 2 "Nach" der Analyse), und die resultierende Wachstumsgeschwindigkeit und Dynamik (kollektive Verschiebung lückenhafter Spuren über ihre gesamte Lebensdauer) werden in Abbildung 1E,Fbzw. (schwarze Kreise) dargestellt. Dann wurden die parameter beschrieben, um die Analyse stark beeinflussen50, wie "Maximum Gap Length" und "Maximum Shrinkage Factor" wurden für den gleichen Satz von Zeitrafferfilmen geändert (Videos 3 bzw. 4). Die entsprechenden Werte der Wachstumsgeschwindigkeit und Dynamik sind in Abbildung 1E,F als rote Quadrate bzw. blaue Dreiecke angegeben. Die daraus resultierende Wachstumsgeschwindigkeit wurde nicht tief beeinträchtigt. Die für die Dynamik ermittelten Werte unterschieden sich jedoch deutlich, als "Maximale Lückenlänge" geändert wurde, während sie bei der Änderung des "Maximum Shrinkage Factor" unverändert blieben. Wie in Abbildung 1Ddargestellt, war in allen drei Fällen die Erkennung der MT-Subtracks ähnlich robust. Die Rekonstruktion der gesamten MT-Trajektorien war jedoch vor allem betroffen, als "Maximum Gap Length" auf 15 eingestellt wurde(Abbildung 1D, Einsetbilder). Um zu beurteilen, ob die bildgebenden Bedingungen das MT-Verhalten beeinträchtigten, wurden die erste (1–61 Bilder) und die zweite (61–121 Frames) Hälfte der Zeitrafferreihe separat analysiert und die entsprechenden Wachstumsgeschwindigkeiten und Dynamikwerte verglichen(Abbildung 1G,Hbzw.). Wie erwartet wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Teilen der Zeitrafferreihe festgestellt. In Videos werden 1–8 Zeitrafferbilder einer mitotischen Zelle gegeben, die prophase synchronisiert ist und EB3-tdTomato ausdrückt (Dauer = 1 min; Intervall = 0,5 s).

Figure 1
Abbildung 1: Analyse der MT-Dynamik in HeLa-Zellen synchronisiert in Prometaphase. (A) Eine Übersicht der Schritte des Protokolls. (B) Die schematische Darstellung des Mechanismus der DME vermittelte Bildung einer monopolaren mitotischen Spindel. (C) Eine Montage der ersten 10 Frames des Zeitrafferfilms, der mit U-Track Software mit jedem zweiten gezeigten Frame verarbeitet wird. Die ermittelten Bahnen des MT-Wachstums sind rot markiert. (D) Die Zeitreihenprojektion der Rohbilddatei und nach MT-Tracking unter Verwendung der im Protokoll beschriebenen Einstellungen ("optimal") und beim Ändern von "Maximum Gap Length" oder "Maximum Shrinkage Factor" werden angegeben. Die Einläufe stellen die vollständigen MT-Trajektorien dar, die aus den Wachstumsereignissen (rot), Pause (hellblau), Schrumpfung (Gelb), als Wachstum (grün) und bgap reklassifiziertals Pause (dunkelblau) bestehen. Die Wachstumsgeschwindigkeit bedeutet (E) und die Dynamikwerte (F) werden angezeigt, und die Ergebnisse werden entweder unter Verwendung eines der vorgeschlagenen optimalen Kriterien (schwarze Kreise), der maximalen Spaltlänge auf 15 (rote Quadrate) oder des maximalen Schrumpffaktors auf 1,0 (blaue Dreiecke) dargestellt (n = 45 Zellen; Mittelwert - SEM; einwegige ANOVA-Analyse mit Tukey-Post-hoc-Test für den Mehrfachvergleich). Die Wachstumsgeschwindigkeit bedeutet (G) und die Dynamikwerte (H) werden für die erste (1–61 Bilder) und die zweite (61–121 Frames) Hälfte der Zeitrafferfilme (n = 45 Zellen; Mittelwert sem; ungepaarter t-Test mit Welchs Korrektur) angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Ein repräsentatives Zeitraffer-Rohbild einer Prometaphase-Zelle vor der Analyse. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 2: Erkennung und Verfolgung der MTs in einer Zelle in Video 1 unter Verwendung der vorgeschlagenen Einstellungen für U-Track-Software. Das gleiche Zeitrafferbild in Video 1, das mit der U-Track v2.2.0-Software unter Verwendung der beschriebenen Einstellungen verarbeitet wurde, und die erkannten Wachstumsspuren sind rot markiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 3: Erkennung und Verfolgung der MTs in einer Zelle in Video 1 unter Verwendung eines nicht optimalen Wertes für die "Maximale Lückenlänge". Das gleiche Zeitrafferbild in Video 1, das mit der U-Track v2.2.0-Software mit den gleichen Einstellungen wie zuvor verarbeitet wurde, jedoch mit der Einstellung "Maximale Lückenlänge" auf 15. Die übrigen Parameter wurden nicht geändert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 4: Erkennung und Verfolgung der MTs in einer Zelle in Video 1 unter Verwendung eines nicht optimalen Wertes für den "Maximum Shrinkage Factor". Das gleiche Zeitrafferbild in Video 1, das mit der U-Track v2.2.0-Software mit den gleichen Einstellungen wie zuvor verarbeitet wurde, jedoch mit dem "Maximum Shrinkage Factor" auf 1 gesetzt ist. Die übrigen Parameter wurden nicht geändert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 5: Ein Beispiel für eine Zeitrafferserie einer Zelle mit Zellablagerungen. Nach der Analyse wurden einige Zellablagerungen auch von der Software während der MT-Verfolgung entdeckt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 6: Rohdaten entsprechend Video 5. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 7: Ein Beispiel für eine Zeitrafferserie einer Zelle mit einem hohen Ausdruck von EB3-tdTomato, was zu einer schlechten Definition von Wachstumsspitzen führt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Video 8: Rohdaten entsprechend Video 7. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Der Workflow der Analyse mit U-Track-Software. (A) Ein Schema der von der Software verwendeten Schritte. (B) Ein Screenshot des Bio-Formats-Importeurs zeigt, wie man die Zeitrafferdateien importiert. (C) Nach dem Hochladen der Dateien wird U-Track mit dem MT Plus-Ends-Modul ausgewählt. (D) Ein Screenshot des Bedienfelds von U-Track, in dem die Einstellungen für Kometenerkennung, Verfolgung und Spurenanalyse definiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 2
Ergänzende Abbildung 2: Beschreibung des ersten Schritts der Analyse, der Kometenerkennung. (A) Eine Umrisse der wichtigsten Ereignisse, die vom Algorithmus ausgeführt werden. (B, C) Screenshots aus der Software werden mit den angegebenen optimalen Werten angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 3
Ergänzende Abbildung 3: Beschreibung des zweiten Schritts der Analyse, der Kometenverfolgung. (A) Die wichtigsten Schritte, die vom Algorithmus ausgeführt werden, sind umrissen. (B) Ein Screenshot des "Tracking"-Panels ist gegeben. Der maximale Lückenabschluss entspricht der maximalen Lückenlänge und ist auf 5 festgelegt. Die Verfolgung von drei Unterschritten, die mit roten, grünen und blauen Rechtecken hervorgehoben sind. (C,D,E) Hier werden die für jeden Unterschritt erforderlichen numerischen Werte eingegeben. Der maximale Schrumpfungsfaktor wird auf 1,5 gesetzt, wie in (D) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 4
Ergänzende Abbildung 4: Beschreibung des letzten Schritts der Analyse, Spuranalyse. (A) In diesem Schritt wird die MT-Dynamikklassifizierung und -neuklassifizierung der zusammengesetzten Spuren durchgeführt. (B,C) Screenshots der Track-Analyse und die entsprechenden Einstellungen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Hier beschreiben wir eine Modifikation einer Methode, die zuerst von Ertych et al.44etabliert wurde. Zusammen mit einigen anderen Modifikationen kombinieren wir diese Technik der MT-Dynamikanalyse mit der konfokalen Bildgebung der Doppelspinnscheibe. Die Verwendung der Doppelspinnscheibe verbessert die Auflösung wachsender MTs und reduziert gleichzeitig die Phototoxizität36. Wir reduzieren die Photobleaching- und Laserlichtschäden der Zellen weiter, indem wir zu einem fluoreszierenden Reporter mit längerer Wellenlänge wechseln. Das tdTomato fluoreszierende Protein hat einen höheren Photostabilitäts- und Helligkeitskoeffizienten im Vergleich zu einem EGFP46. Schließlich ist die Messung der MT-Dynamik aufgrund der Einschränkungen der Follow-up-Analyse mit U-Track auf nur eine Z-Ebene beschränkt. Die U-Track Software wurde entwickelt, um die fluoreszierend markierten MT-Spitzen in einer XYZ-Achse50,51zu erkennen. Daher ist die Einnahme einer Z-Stack-Zeitrafferserie und das Erstellen maximaler Projektionszeitrafferserien anfällig für falsche Ergebnisse. Signale, die in verschiedenen Z-Ebenen erkannt werden und nicht zum gleichen wachsenden MT gehören, werden in der maximalen Projektion zusammengeführt, wodurch eine falsche Flugbahn des MT-Wachstums entsteht.

Das hier verwendete Synchronisationsprotokoll induziert eine hohe Dichte an MTs, indem es die mitotische Spindel auf eine Monopolstruktur beschränkt. Die mitotischen MTs sind hochdynamische Strukturen mit Wachstums- und Schrumpfphasen, mit einer Pause am Übergang zwischen ihnen19,54,55. Aufgrund der hohen Dichte der wachsenden MTs ist die Erkennung der Pausenereignisse, gefolgt von Schrumpfung oder Wachstum, anfällig für falsche Ergebnisse, wenn die Tracking-Parameter falsch eingestellt sind. Die U-Track-Software-Tracking-Module erkennen sogenannte Subtracks (Episoden kontinuierlichen Wachstums) und stuft sie dann als zusammengesetzte Tracks mit Pausenereignissen als "Lücken" bezeichnet ein. Applegate et al. diskutieren zwei Parameter, die für die Tracking- und Subtrack-Verknüpfung50entscheidend sind. Dies sind "Maximum Gap Length" und "Maximum Shrinkage Factor". Wenn die nachfolgende Teilspur in den folgenden Zeitschritten wieder in wachsender Richtung des MT erscheint, wird sie als Vorwärtslücke klassifiziert. Auf der anderen Seite, wenn die Subspur wieder gegenüber der Wachstumsrichtung erscheint, wird sie als Rücklücke klassifiziert. Die maximale Lückenlänge definiert die Anzahl der Frames, die nach vorwärts- und rückwärts geforschten Lücken gesucht werden sollen. Wie bereits erwähnt, legt die hohe Dichte und die von Natur aus hohe Dynamik der mitotischen MTs die Begrenzung fest, und es sollten kleinere Werte definiert werden. Wie in Abbildung 1E dargestellt, wird die Dynamik am stärksten beeinflusst. Die Dynamik wird als kollektive Verschiebung aller lückenhaltenden Spuren über ihre globale Lebensdauer berechnet. Der zweite Parameter, der maximale Schrumpfungsfaktor, hat wenig bis gar keinen Einfluss auf die Dynamik oder die Wachstumsgeschwindigkeit (Abbildung 1D,E).

Im Allgemeinen, bei der Untersuchung MT Wachstumseigenschaften, sorgfältige Aufmerksamkeit auf die bildgebenden Bedingungen zu zahlen. Erstens sind die MTs sehr temperaturempfindlich und depolymerisieren, wenn sie dem kaltwachstumsmedium56,57,58,59ausgesetzt sind. Daher sollte die Temperatur während des gesamten Experiments streng kontrolliert werden, um die Erfassung falscher Ergebnisse zu vermeiden. Zweitens kann die ionische Zusammensetzung des während der Experimente verwendeten Mediums das MT-Wachstum58,60beeinflussen. Zum Beispiel wirkt sich die Exposition gegenüber Kalziumionen auf unterschiedliche Weise auf die MT-Dynamikaus 61,62. Daher sollte die Zusammensetzung des Wachstumsmediums, das in allen Experimenten verwendet wird, gleich sein. Ebenso sollten die Parameter der Analyse einmal definiert und für alle Wiederholungen konstant gehalten werden. Darüber hinaus sollten die nach der Analyse generierten Zeitrafferfilme visuell überprüft werden, und jeder Film mit Hintergrundrauschen, der zu falschen Positivmeldungen führt (Videos 5 und 6) oder mit hohem Ausdruck von tdTomato, was zu einer schlechten Auflösung der MT-Wachstumstipps führt (Videos 7 und 8), sollte von weiteren statistischen Analysen ausgeschlossen werden.

Kürzlich ermöglicht die Kombination der Gitterlichtbogenmikroskopie einer mitotischen Spindel in Subsekundenintervallen zusammen mit einer ausgeklügelten Bildverarbeitung die Analyse von MT-Montageraten in drei Dimensionen63,64. Dies hat offensichtliche Vorteile gegenüber CLSM, aber weitere Verbesserungen werden erforderlich sein, bevor die Methode allgemein genutzt wird, wie die Erweiterung der Strategien, die in U-Track verwendet werden, auf die dritte Dimension26,50,63.

Das Protokoll der MT-Dynamikerkennung, das wir hier beschreiben, kann eine Methode der Wahl für das Drogenscreening sein. Die Methode ist robust und beseitigt erfolgreich menschliche Verzerrungen im Vergleich zur manuell durchgeführten Analyse. Die Automatisierung der Filmverarbeitung ermöglicht die Analyse von Tausenden von MT-Spuren innerhalb jeder Zelle und erhöht so die statistische Leistungsfähigkeit der Analyse. Darüber hinaus kann die Methode geändert werden, indem z.B. das Synchronisationsprotokoll geändert und Zellen aus verschiedenen Phasen des Zellzyklus abruft. Dies kann beispielsweise ein nützliches Instrument für das Screening von MT-Targeting-Chemotherapeutika sein, wenn die Wirkung auf Interphase- und Trennzellen unterschieden werden sollte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken den Mitgliedern der Lichtmikroskopieanlage, dem Max-Planck-Institut für Experimentelle Medizin, für die fachkundige Beratung und Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

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Biologie Ausgabe 153 Mikrotubuli-Dynamik Mikrotubuli-Wachstum Plus-End-Mikrotubuli-Tracking Prometaphase Live-Zell-Bildgebung Konfokalmikroskopie
Messung der Mikrotubuli-Dynamik durch Spinnen der Disk-Mikroskopie in Monopolar-Mitotischen Spindeln
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Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

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