Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

Abstract

אנו מתארים שינוי של שיטה מבוססת לקביעת הדינמיקה המיקרוכדורית בתאי החיים. הפרוטוקול מבוסס על הביטוי של סמן מקודד גנטית עבור הקצוות החיוביים של microtubules (EB3 מתויג עם חלבון פלורסנט tdTomato) ו במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה, הדמיה של תא חי באמצעות מיקרוסקופ הדיסק מסתובב מיקרוסקופית. סנכרון התאים והצפיפות המוגברת של microtubules מתבצעים על ידי הפרדה מרבית בתאי הmitotic, וניתוח הצמיחה מבוצע באמצעות תוכנת U-Track של מקור פתוח. השימוש בחלבון פלורסנט בהיר ואדום הוזז, בשילוב עם כוח לייזר נמוך יותר וזמן חשיפה מופחת הנדרש עבור מיקרוסקופ דיסק מסתובב להפחית את הרעילות וההסתברות של חפצים המושרה באור. הדבר מאפשר הדמיה של מספר גדול יותר של תאים בהכנה זהה תוך שמירה על התאים במדיום גדילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים. מכיוון שהניתוח מבוצע באופן אוטומטי מפוקח, התוצאות הן עמידות סטטיסטית ומפוקחת.

Introduction

Microtubules (MTs) הם מבנים דינמיים מאוד למצוא כמעט כל התאים איקריוטית ובכמה חיידקים1. . הם מפסל את שלדהציטו2,3 תא החטיבה4, מולקולה הובלה5, מכות הדגל6, התחושה של הסביבה המקיפה דרך הסייום7, שמיעה (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, פלישה גרורות13,14, ואפילו היווצרות זיכרון15,16,17,18, ותהליכים רבים אחרים מסתמכים בעיקר על MTs. השתתפות MTs בכל האירועים הללו יהיה בלתי אפשרי ללא היכולת המדהימה שלהם לעבור במהירות בין הצמיחה (פלמור) והצטמקות (דפלוניזציה). מאפיין זה מתואר כאי-יציבות דינאמית19. הר הדינמיות משתנה בתנאים פתולוגיים רבים20,21,22. לפיכך, קביעת אופי הנכס יכול לעזור להבין את מנגנוני המחלות ולאחר מכן את הטיפול שלהם.

רשימה ארוכה של שיטות פותחו עבור ניתוח MT דינמיקה, שרובם מבוססים על טכניקות דימות23. בתחילה, מיקרוסקופים אור שדה רחב שימשו להתבוננות היווצרות פולימרים טובולין בתוך מבחנה24. הגילוי של מחייב הקצה (EB)-חלבונים שאוספים ב-MT פלוס-מסתיים ופיתוח של שיטות כדי לתייג חלבונים באנרגיה fluorescently אופן מאפשר לבחון את התנהגותו של MTs ישירות בתאים חיים עם שדה רחב ו-מיקרוסקופ מיקרוסקופים פלואורסצנטית25,26,27. EB-פרוטאין אחד הוא חלבון מחייב הקצה 3 (EB3)28; על ידי הבעת יתר ומעקב EB3 התמזגו חלבון פלורסנט, MT פלוס-end תעריפי ההרכבה ניתן לקבוע29,30.

לייזר confocal וקד סריקת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (CLSM) משמש לעתים קרובות כדי לעקוב MT הדינמיקה. עם זאת, טכניקת הדמיה זו מהווה סיכון גבוה לפוטורעילות ופוטוהלבנה, שני תהליכים לא רצויים עבור תא חי והדמיה לדוגמה עמומה31. כדי לקבל יחס טוב יותר של אות לרעש, את כוח הלייזר ואת משך החשיפה צריך להיות גבוה מספיק בעוד לא לפגוע בדגימות, וזה דורש הקרבת החלטה בתמורה למהירות. חלופה מתאימה ל-CLSM היא ספינינג32מיקרוסקופ דיסק. מודאליות זו מבוססת על השימוש של דיסק Nipkow33, אשר מורכב דיסק נע הנושאת מערך של חורים, ועובד אופן מיקרוסקופים CLS רבים הדמיה זהה בו34. לכן, האור מהלייזר יאיר מספר אזורים במדגם בו זמנית, אך ישמור על הטבע הטוב. הדיסק Nipkow, לכן, מאפשר קבלת תמונות דומות CLSM אבל מהיר יותר באמצעות כוח לייזר פחות. The Nipkow הדיסק היה שיפור נוסף על ידי Yokogawa אלקטריק, אשר הציג דיסק שני עם מערך של microlenses על זה כי בנפרד אור ישיר לתוך pinhole בהתאמה, הפחתת הרעילות הרבה יותר phototoxicity לבנת35. כך, מסתובב מיקרוסקופית דיסק סריקה לייזר הפכה לשיטה של בחירה עבור הדמיה תא חי, וזה מאפשר להשיג תמונות עם יחס אות לרעש גבוה במהירות גבוהה31,36, אשר חיוני לפתרון אותות כגון אלה מתוך הצמיחה המהירה MT.

הדינמיקה של MT שונה באופן זמני. לדוגמה, mitotic MTs הם דינמיים יותר מאשר האינטרפאזה37,38. באופן דומה, הבדלים בקצב הצמיחה הצטמקות נצפו גם בתוך שלב אותו מחזור התא, כגון מיטוזה39,40. לכן, כדי להימנע מאיסוף נתונים שווא, יש להגביל את המדידה של הדינמיקה של MT לחלון זמן צר במהלך מחזור התא. לדוגמה, מדידה של MT דינמיקה ב prometaphase ניתן להשיג על ידי טיפול בתאים עם dimethylenאסטרה (dme), אנלוגי monastrol המונע את המנוע קינזין Eg541 ומונע את היווצרות של הmitotic ציר דו-קוטבית42. עיכוב של תאים ב prometaphase עם Eg5 מעכבי dme ונגזרים monastrol אחרים לא משפיעים על MT דינמיקה43,44,45, מה שהופך dme כלי שימושי ללמוד mt דינמיקה הן בתאים קבועים וחיים44.

כאן אנו משלבים את השיטה של ניתוח הדינמיקה MT בתאים prometaphase שתוארו על ידי Ertych ואח '44 עם הדמיה דיסק מסתובב כפול. שיטה זו מאפשרת מדידה של הדינמיקה MT ב prometaphase תאים שנאספו ממישור מוקד אחד עם קצב הדמיה גבוה יותר, אך ללא הלבנת ומינימלית פוטורעילות. יתר על כן, כעיתונאי פלורסנט, אנו משתמשים בחלבון פלורסנט (tdTomato) הכולל בהירות ופוטויציבות לעומת חלבון פלורסנט ירוק (EGFP) והוא נרגש עם אור אנרגיה נמוכה46. לכן, tdTomato דורש פחות כוח לייזר עבור עירור והוא פחות פוטורעיל. בסך הכל, אנו משפרים עוד את השיטה על-ידי הפחתת הרעילות ושיפור הרזולוציה והטיפול בדואר הנדרש לניתוח הדינמיקה של MT. בנוסף, אנו יוצרים בסיס לשינויים עתידיים בשיטה על-ידי שילובם בשיטות סינכרון אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זריעת תאי הלה

  1. להכין 2 מ ל של 5 μg/mL fibronectin פתרון ב פוספט באגירה מלוחים (PBS) ולהוסיף 450 μL של אותו לתוך כל טוב של 4 שמיכות היטב הצ (#1 .5). מודיית את השקופית עבור 15 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  2. לשטוף באופן אסינכרוני בתאי הלה גדל עם מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) ו דגירה עם טריפסין-EDTA (0.05%: 0.02%; w:v) עבור 5 דקות ב 37 ° c. להפסיק את התגובה אנזימטית על ידי תוספת של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 10% החום מופעל סרום עגל העוברי (FCS) ב 3:1 (v:v) יחס של טריפסין הוסיף-EDTA.
    הערה: תאי הלה שמרו ב RPMI 1640 בינוני בתוספת של 10% חום מופעל FCS ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ו היו באופן שגרתי בעבר הגיעו 80-90% שליטה כמתואר לעיל.
  3. קבע את ריכוז התא. באמצעות תא נויבאואר מערבבים 50 μL ליטר של השעיית התא עם טריבן כחול ב 1:1 (v:v) יחס, השעיה מחדש, והעברה 10 μL של ההשעיה אל החדר. הרוזן רק את התאים הכחולים-שליליים בתוך ארבעת הריבועים הגדולים (לפרטים ראו פיילן47ואח '). גזור את ריכוז התא ממספר התא שנספר באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 1
  4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2 דקות. Resuspend שעיה עם חדש RPMI 1640 על מנת להשיג 1 x 106 תאים/mL.
  5. הסר את fibronectin מתוך שמיכות השינה, לשטוף את הבארות פעמיים עם DPBS, ואת הזרע 50,000 תאים לכל טוב.
  6. להחזיר את שמיכות השינה עם התאים לחממה ולגדול אותם 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

2. ביטוי של pEB3-tdTomato בתאי הלה

  1. . הכן שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ ל עבור כל צינור, לדלל 2 μg של pEB3-tdTomato48 עם מאגר החצייה (סינתטי מוצר בפתרון מימית) לנפח הסופי של 396 μl.
  2. הוסף 4 μL של מגיב (non-lipidic, המכיל פוליאתילן) לצינור הראשון, ומערבולת את התערובת מיד בדיוק 10 s.
  3. בקצרה לסובב את הצינור עם מיקרוצנטריפוגה ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.
  4. הסירו את תאי הלה מהאינקובטור. Dropwise, להוסיף 100 μL של תערובת החצייה לכל הבאר של 4 שמיכות היטב, ולהחזיר את התאים לחממה.
  5. לאחר 4 h של דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, מוסף את התאים עם בינוני גדילה טריים ו-דגירה לפחות 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
    הערה: יש צורך למטב את תנאי ההעברה עבור כל סוג תא. רמות הביטוי צריכות להיות נמוכות מספיק כדי לאפשר זיהוי של קצוות MT אחד גדל. לחילופין, קו תא המבטא באופן בלתי נשכח EB3-tdTomato ניתן להשתמש בניסויים; זה יפחית את השונות ברמות הביטוי של EB3-tdTomato בין ההכנות ובין תאים מאותה הכנה49.

3. סנכרון ולייב תא הדמיה של pEB3-tdTomato – ביטוי בתאי הלה

  1. הכנת פתרון μM 2.5 של dimethylenאסטרה (DME) ב-פנול-אדום חינם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DME) שיושלם עם 10% FCS ו 2 מ"מ L-גלוטמין או אספקת גלוטמין חלופית.
  2. החלף את מדיום הצמיחה ב coverslip שמיכות עם 500 μL של מדיום הצמיחה המכיל 2.5 μM DME ו-מארג התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  3. לאחר 3.5 h של דגירה עם DME, להעביר את התאים למיקרוסקופ, הר שמיכות לתוך חדר הסביבה עם פאנלים כהים עבור הדמיה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, ו מודטה נוספת עד הזמן הדגירה הכולל הוא 4 h.
    הערה: תחזוקת הטמפרטורה ב-37 ° צ' ללא תנודות היא חיונית לניסוי.
  4. לבצע את ההדמיה הזמן הדמיה על מיקרוסקופ הפוך מצויד 100x 1.49 N.A. שמן טבילה המטרה, מערכת מסתובב כפול הדיסק קונפוקלית, ואת מערכת האוטומטי אמין עבור תחזוקה רציפה של מטוס מוקד. הגדר את פרמטרי ההדמיה כדלקמן.
    הערה: אנו משתמשים מכשיר אלקטרוני הכפלת חיוב בשילוב מצלמה (EM-CCD).
    1. לעירור EB3-tdTomato, השתמש בקו לייזר של 561 ננומטר עם 200 ms זמן חשיפה. לאסוף את האור הנפלט באמצעות bandpass מרובעת (405, 488, 561, 640 nm) דיקרואיק מראה ומסנן פליטת nm 600/52.
      הערה: ניתן לכוונן את כוח הלייזר עבור כל תא הניתן לדימות כדי למנוע רוויית תמונה. בכל הזמנים הסרטים שניתנו כאן הכוח לייזר הוגדר 5.3 mW.
    2. למצוא תא ב prophase ולהתמקד Z-מישור המתאים למרכז של ציר הmitotic מונוסולאר. לרכוש תמונות כל 0.5 s על סך של 1 דקות ללא ביננינג ולא תאורה בין החשיפות.

4. ניתוח הדינמיקה של MT באמצעות U-Track v 2.2.0

  1. כדי לנתח את הדינמיקה MT נדרשת תוכנת סביבת מיחשוב נומרית (לדוגמה, MATLAB).
    הערה: הבנה בסיסית של התוכנה מספיקה לניתוח. חומר עזרה מקיף וערכות לימוד זמינים באתר האינטרנט של המפתחים (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. הורד (https://github.com/DanuserLab/u-track) והתקן את תוכנת הקוד הפתוח u-track v 2.2.0 בעקבות ההוראות המפורטות שניתנו בקובץ "Readme_u-track. pdf"50,51,52.
  3. הפעל את תוכנת ניתוח המספריים והוסף את תיקיית ה-U-Track v 2.2.0 עם תיקיות ממשנה לנתיב החיפוש של התוכנה.
  4. מתוך חלון הפקודה קוראים. " הדבר פותח חלון דיאלוג שממנו ניתן לייבא את הקבצים הגולמיים שהופקו על-ידי תוכנת רכישת התמונות במיקרוסקופ (איור משלים 1, איור 2, איור 3, איור 4).
    הערה: תוכנת ה-U-Track תואמת לתבניות אחרות של נתוני תמונה. היא משתמשת ביו-פורמטים, אשר מזהה חיים שונים מדעי הנתונים תבניות53.
  5. הגודל של כל תמונה נקרא מתוך המטא-נתונים באופן אוטומטי. הזן באופן ידני את הצמצם המספרי של המטרה (במקרה זה 1.49) ואת מרווח הזמן (0.5 s) המשמש לדימות (איור משלים 1B). בנוסף, מידע על אורך הגל, fluorophore ואת זמן החשיפה ניתן גם לספק, אבל הם לא קריטיים לניתוח נוסף.
  6. לאחר טעינת כל התמונות, שמור את סידרת הזמן שהוזנה כרשימת סרטים על-ידי בחירתרשימת הסרטים "שמור כסרט". בצד הימני של חלון הדיאלוג בחר באפשרות "U-Track" ולחץ על "המשך" (איור משלים 1c).
    הערה: הערכים ממוטבים לתאי הלה. אם מעבר לקו טלפון אחר, יש להגדיר שוב את הערכים. לחלופין, השתמש בהגדרות המומלצות על-ידי מפתחי התוכנה. ההסבר המפורט של כל אחד מהפרמטרים וכיצד יש להגדירה ניתן למצוא בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה, באמצעות מכשיר המעקב50.
  7. מהחלון המוקפץ, בחרבאפשרות"מסוף מיקרוטוכדורית" ולחץ על "אישור" (איור משלים 1c). חלון הדיאלוג החדש מאפשר לקבוע את הפרמטרים לשלושת השלבים של הניתוח (איור משלים 1D), שבהם מדובר בזיהוי, מעקב וניתוח מעקב.
  8. בשלב 1 בחר באפשרות "הגדרות" ומהתפריט הנפתח בחר "זיהוי שביט" כשיטת זיהוי (איור משלים 2 ב).
    1. מתוך חלון הדיאלוג החדש להגדיר את הפרמטרים עבור ההפרש של מסנן גאוסים ומפלח פרשת הזמן כדלקמן (איור משלים 2 ג): תהליך מסכה לשמש עבור הזיהוי = ללא; סטיית תקן של גאוסיאנית בעלת המעבר הנמוך = פיקסל אחד; סטיית תקן של גאוס-מעבר גבוהה = 3 פיקסלים; סף מינימלי = 3 סטיות סטנדרטיות; גודל השלב של הסף = 0.25 סטיות סטנדרטיות. בחר "החל הגדרות על כל הסרטים" ו "החל".
  9. בשלב 2, הפרמטרים לקישור, סגירת מרווח, מיזוג ופיצול, ופונקציות מסנן קלמן מוגדרות בשלושה שלבים המסומנים בצבע ורוד, ירוק וכחול, בהתאם (איור משלים 3 ב). עבור שלבים אלה, בחר באפשרות "דינמיקה מיקרוכדורית פלוס" ומהאפשרות "הגדרה", הגדר את הערכים כפי שמצוין באיור 3C – E, בהתאמה.
    1. לבעיות עם מנות מימדית, בחרו ' 2 ' מהתפריט הנפתח. השתמש במרווח מירבי כדי לסגור = 5 מסגרות; אורך מינימלי של מקטעי מסלול משלב ראשון = 3 מסגרות. כמו קודם, לבחור "להחיל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "להחיל".
  10. בשלב 3 של הניתוח, התגלו שירים MT מסווגים (איור משלים 4). כשיטה לניתוח מעקב, בחרו באפשרות 'סיווג מיקרוטורודינמיקה' והגדירו את הפרמטרים באמצעות הלחצן 'הגדרה' כפי שמצוין באיור 4 ב, ג. לאחר מכן, בחר את התיבה "החל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "החל".
  11. לאחר כל הפרמטרים מוגדרים, מתוך "לוח הבקרה-U-Track" חלון (איור משלים 1d) בחר את "החלת בדוק/בטל את כל הסרטים" ו "הפעל את כל הסרטים" ולחץ "לרוץ". פעולה זו תיזום את הניתוח MT של סדרת הקפיצה בזמן.
  12. לאחר השלמת עיבוד הסרט, מוצגת הודעה "הסרטים שלך עובדו בהצלחה". לחץ על "אישור", ואז "שמור".
  13. עכשיו בטוח לפרוש מתוכנת. הניתוח המספרי התוצאות מעיבוד הסרט מאוחסנות במבני תיקיות מסגרות כקבצי m בתיקייה שבה מאוחסנות הקבצים הגולמיים.

5. אנליזה סטטיסטית של MT דינמיקה

  1. יבא את קובצי ה-m לתוכנית של ניתוח סטטיסטי מועדף.
    הערה: במקרה שלנו, אנו מייבאים תחילה את הקבצים בגיליון אלקטרוני רגיל כדי להפוך אותם לקריאים. קובצי m מכילים מידע סטטיסטי (חציון, ממוצע וסטיית תקן) בפרמטרים שונים (לדוגמה, מהירות צמיחה, מאיץ הדינמיות של MT). הרשימה המפורטת של הפרמטרים מוענק בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה,ב50,52. קבצי m שנוצר יכול גם להיות מיובאים לתוך תוכנות עיבוד נתונים אחרים.
  2. בחר את "מהירות צמיחה ממוצע" הפרמטר ולייבא אותו לתוך שולחן לסטטיסטיקה ולהציג. הזן את המידע על פרמטרים אחרים, (לדוגמה, "דינמיות") בטבלה חדשה או בעמודה חדשה של אותה טבלה ומזימה מקובצת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול הנתון המתואר באיור 1A, ה-PEB3-tdTomato באופן מידי התבטא באופן מבוקר בתאי חלה הגדלים באופן אסינכרוני. התאים סונכרנו 48 h לאחר הprometaphase באמצעות טיפול DME (איור 1B). שלב זה הבטיח כי המדידה של MT דינמיקה נעשתה תמיד באותו שלב של מחזור התא. הסרטים בזמן הקפיצה היו מעובדים ונותחו באמצעות U-Track v 2.2.0 כפי שמתואר בתיעוד המשלים שלה50,51,52. למרות שהפרוטאינים של איגוד הפלוס מעקב רק על MT של שלבי הצמיחה, ה-U-Track v 2.2.0 מרחיב את המידע על האירועים הפסקה והצטמקות על-ידי קישור שלבי צמיחה רציפים ושחזור מסלולים מלאים26,50. האלגוריתם מבוסס על מסגרת המעקב הגלובלית הפיננסית והזמני שתוארה על ידי הג ואח '.51.

חשוב לציין שהרגישות והדיוק של הניתוח תלויות מאוד במספר פרמטרי ניתוח. לדוגמה, סרטי הזמן המותחים נותחו כמתואר בפרוטוקול (איור 1c, וידאו 1 "לפני", ו-Video 2 "אחרי" הניתוח), ומהירות הצמיחה המתקבלת והדינמיות (הזחה קולקטיבית של מסלולים המכילים רווחים על כל תקופת החיים שלהם) מותווים באיור 1E, F, בהתאמה (עיגולים ש לאחר מכן הפרמטרים שתוארו להשפיע מאוד על הניתוח50, כגון "אורך הפער המקסימלי" ו-"מקדם הצטמקות מקסימלית" שונו עבור אותה קבוצה של סרטים לפקיעה זמן (קטעי וידאו 3 ו-4, בהתאמה). הערכים המקבילים של מהירות הצמיחה והדינמיות ניתנים באיור 1E, F כריבועים אדומים ומשולשים כחולים, בהתאמה. מהירות הגדילה המתקבלת לא הושפעה עמוקות. עם זאת, הערכים שהתקבלו עבור הדינמיות היו שונים באופן משמעותי כאשר "אורך הפער המקסימלי" שונה, בעוד הוא נשאר ללא שינוי עם שינוי "פקטור התכווצות מקסימלית". כפי שמוצג באיור 1D, בכל שלושת המקרים, הזיהוי של פסי המשנה MT היה חזק באופן דומה. עם זאת, השחזור של מסלולי MT המלא הושפע בעיקר כאשר "אורך הפער המקסימלי" הוגדר 15 (איור 1D, תמונות הזחה). עוד, כדי להעריך אם תנאי הדימות הפריעו עם התנהגות MT, הראשון (מסגרות 1-61) ואת החצאים השני (61-121 מסגרות) של סדרת הזמן לשגות נותחו בנפרד את מהירות הצמיחה המקבילה ואת ערכי הדינמיות הושוו (איור 1G, H, בהתאמה). כצפוי, לא אותרו הבדלים משמעותיים בין שני החלקים של סדרת הקפיצה בזמן. בסרטי וידאו 1 – 8 תמונות הזמן פקיעה של תא mitotic מסונכרן prophase והבעת EB3-tdTomato ניתנת (משך = 1 דקות; מרווח = 0.5 s).

Figure 1
איור 1: ניתוח הדינמיקה של MT בתאי הלה מסונכרן ב-prometaphase. (א) חלוקה לרמות של שלבי הפרוטוקול. (ב) הייצוג הסכימטי של המנגנון של dme מתווכת היווצרות של ציר מונואולאר mitotic. (ג) מונטאז ' של 10 המסגרות הראשונות של סרט הפקיעה בזמן שעובדו עם תוכנת U-Track עם כל מסגרת שנייה המוצגת. מסלולים שאותרו של צמיחת MT מסומנים באדום. (ד) הקרנת סדרת הזמן של קובץ התמונה הגולמית ולאחר מעקב MT באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול ("אופטימלי"), ובשעת שינוי "אורך הפער המקסימלי" או "מקדם התכווצות מרבי" ניתנים. ניסות מייצגים את מסלולי MT מלא, אשר מורכב הצמיחה (אדום), הפסקה (כחול בהיר), הצטמקות (צהוב), fgap מסווג כצמיחה (ירוק) ו-bgap מסווג כמו הפסקה (כחול כהה) אירועים. מהירות הגדילה פירושה (E) והערכים הדינמיות (F) מוצגים, והתוצאות באמצעות אחד הקריטריונים האופטימליים המוצעים (עיגולים שחורים), אורך הפער המקסימלי מוגדר ל-15 (ריבועים אדומים), או שפקטור ההתכווצות המקסימלי שנקבע ל-1.0 (משולשים כחולים) מותווים (n = 45 תאים; ממוצע ± SEM; ניתוח ANOVA בכיוון אחד עם מבחן הצבה של tukey לצורך ה מהירות הצמיחה פירושה (G) והערכים הדינמיות (H) מוצגים עבור החצאים הראשון (מסגרות 1-61) והשני (61-121 מסגרות) של הסרטים בזמן הקפיצה (n = 45 תאים; מתכוון ± SEM; לא לזווג מבחן עם תיקון של וולש). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: תמונת זמן מייצגת תמונה גולמית של תא prometaphase לפני הניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 2: איתור ומעקב של MTs בתא ב-Video 1 באמצעות ההגדרות המוצעות עבור תוכנת U-Track. אותה תמונה בזמן הפקיעה בווידאו 1 מעובד עם תוכנת U-Track v 2.2.0 באמצעות ההגדרות המתוארות, ואת רצועות הצמיחה שזוהו מסומנים באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 3: איתור ומעקב של MTs בתא בווידאו 1 באמצעות ערך לא אופטימלי עבור "אורך הפער המקסימלי". אותה תמונה בזמן הפקיעה בווידאו 1 מעובד עם תוכנת U-Track v 2.2.0 באמצעות אותן הגדרות כמו קודם, אבל עם "אורך הפער המקסימלי" מוגדר על 15. שאר הפרמטרים לא השתנו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 4: איתור ומעקב של MTs בתא בווידאו 1 באמצעות ערך לא אופטימלי עבור "פקטור התכווצות מקסימלית". אותה תמונה בזמן הפקיעה בווידאו 1 מעובד עם תוכנת U-Track v 2.2.0 באמצעות אותן הגדרות כמו קודם, אבל עם "מקסימום התכווצות" הגדר 1. שאר הפרמטרים לא השתנו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 5: דוגמה של סדרה של מעידה בזמן של תא עם שאריות תאים. לאחר הניתוח, כמה פסולת תא זוהה גם על ידי התוכנה במהלך מעקב MT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 6: נתונים גולמיים המתאימים וידאו 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 7: דוגמה של סדרה הפקיעה זמן של תא עם ביטוי גבוה של EB3-tdTomato וכתוצאה מכך הגדרה ירודה של טיפים גוברת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

וידאו 8: נתונים גולמיים המתאימים וידאו 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Supplementary Figure 1
איור משלים 1: זרימת העבודה של הניתוח באמצעות תוכנת U-Track. (א) סכמטי של השלבים המועסקים על ידי התוכנה. (ב) צילום מסך של היבואן בפורמטים הביו מראה כיצד לייבא את הקבצים לשגות זמן. (ג) לאחר טעינת הקבצים, U-Track עם מודול MT פלוס-קצות נבחר. (ד) צילום מסך של לוח הבקרה של U-Track שבו ההגדרות עבור זיהוי שביט, מעקב וניתוח מעקב מוגדרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 2
איור משלים 2: תיאור השלב הראשון של הניתוח, זיהוי שביט. (א) מתאר את האירועים העיקריים שבוצעו על-ידי האלגוריתם. (ב, ג) צילומי מסך מהתוכנה מקבלים את הערכים האופטימליים המצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 3
איור משלים 3: תיאור השלב השני של הניתוח, שביט מעקב. (א) השלבים העיקריים שבוצעו על-ידי האלגוריתם מתוארים באופן מיתאר. (ב) צילום מסך של הלוח "מעקב" ניתן. ' סגירת המרווח המירבי ' מתאימה לאורך המרווח המירבי ומוגדרת כ-5. מעקב אחר שלושה שלבי משנה המסומנים במלבנים אדומים, ירוקים וכחולים. (C,D,E) הערכים המספריים הנחוצים עבור כל שלב משנה מוזנים כאן. פקטור ההתכווצות המרבי מוגדר ל-1.5 כפי שצוין ב (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 4
איור משלים 4: תיאור השלב האחרון של הניתוח, מעקב אחר ניתוח. (א) הסיווג הר דינמיקה וסיווג מסווג של המסלולים המורכבים מבוצע במהלך שלב זה. (ב, ג) צילומי מסך של ניתוח המסלול ואת ההגדרות המתאימות מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים שינוי של שיטה שהוקמה לראשונה על ידי ארפטיכון ואח '.44. יחד עם מספר שינויים אחרים, אנו משלבים את הטכניקה הזו של הניתוח MT דינמיקה עם הדמיה כפולה מסתובב הדיסק. השימוש בדיסק מסתובב כפול משפר את הרזולוציה של הגוברת MTs תוך הפחתת רעילות התמונה36. אנחנו עוד להקטין את התמונה הלבנה ונזק לייזר המושרה של התאים על ידי מעבר לכתב פלורסנט אורך גל ארוך יותר. חלבון פלורסנט tdTomato יש מקדם גבוה יותר של פוטויציבות ובהירות בהשוואה ל-EGFP46. לבסוף, מידת הדינמיקה של MT מוגבלת למישור Z אחד בלבד עקב מגבלות ניתוח המעקב עם U-Track. תוכנת ה-U-Track מיועדת לזהות את הטיפים של MT עם המסומנת באמצעות פלואורוסקופים ב-XYZ ציר50,51. לכן, לקיחת סדרת Z-מחסנית זמן לפקיעה ויצירת הקרנה מקסימלית זמן סדרת מעידה הוא נוטה לייצר תוצאות שווא. אותות שזוהו במטוסי Z שונים ולא השייכים MT גדל אותו הובאו יחד בהקרנה המקסימלית, ובכך ליצור מסלול שווא של צמיחה MT.

פרוטוקול הסנכרון המשמש כאן מעורר צפיפות גבוהה של MTs על ידי הגבלת הציר הmitotic למבנה מונוסולאר. Mitotic MTs הם מבנים דינמיים מאוד עם שלבים של צמיחה והצטמקות, עם הפסקה במעבר בין אותם19,54,55. בשל צפיפות גבוהה של MTs גוברת, זיהוי של אירועי הפסקה ואחריו הצטמקות או צמיחה נוטה לתוצאות שווא אם הפרמטרים מעקב מוגדרים בצורה שגויה. מודולי מעקב התוכנה של U-Track לזהות מסלולים משניים (פרקים של צמיחה רציפה) ולאחר מכן מסווג אותם כרצועות מורכבות עם אירועי הפסקה כינה "פערים". המלצה על שני פרמטרים קריטיים עבור מעקב ו subtrack קישור50. אלה הם "אורך הפער המקסימלי" ו-"גורם התכווצות מרבי". אם המעקב אחריו מופיע שוב בכיוון הגדל של MT בשלבי הזמן הבאים, אז הוא מסווג כפער קדמי. מצד שני, אם מסלול המשנה מופיע ממול לכיוון הגדילה, הוא יהיה מסווג כפער לאחור. ' אורך המרווח המירבי ' מגדיר את מספר המסגרות שיש לחפש בפערים הקדמיים והפוכים. כפי שהוזכר, הצפיפות הגבוהה והדינמיות הגבוהה של ה-mitotic MTs מגדירה את המגבלה, וערכים קטנים יותר צריכים להיות מוגדרים. כפי שמוצג באיור 1E , ההשפעה הדינמית מושפעת ביותר. הדינמיות מחושבת כעקירה קולקטיבית של כל מסלולים המכילים פערים על החיים הגלובליים שלהם. הפרמטר השני, מקדם ההתכווצות המרבי, אינו משפיע על מהירות הגדילה או הצמיחה (איור 1D, E).

באופן כללי, כאשר הלומדים מאפייני צמיחה MT, יש לשלם תשומת לב זהירה לתנאי הדימות. הראשון, MTs הם רגישים מאוד טמפרטורה והדסטריזציה כאשר הם חשופים הצמיחה קר בינוני56,57,58,59. לכן, כדי להימנע מאיסוף של תוצאות שווא, יש לשלוט על הטמפרטורה באופן מדויק בכל הניסוי כולו. שנית, ההרכב יונית של המדיום בשימוש במהלך הניסויים יכול להשפיע על MT צמיחה58,60. לדוגמה, חשיפה ליוני סידן משפיעה על MT דינמיקה בדרכים שונות61,62. מכאן, ההרכב של מדיום הצמיחה בשימוש בכל הניסויים צריך להיות זהה. באופן דומה, יש להגדיר את הפרמטרים של הניתוח פעם אחת ולשמור על קבוע עבור כל החזרות. בנוסף, הזמן פקיעה סרטים שנוצרו לאחר ניתוח צריך להיבדק באופן חזותי, וכל סרט עם רעש הרקע נותן העלייה חיוביים שווא (קטעי וידאו 5 ו 6) או עם ביטוי גבוה של tdTomato וכתוצאה מכך ברזולוציה ירודה של הטיפים הגוברת MT (קטעי וידאו 7 ו-8) יש להיות מנשלל ניתוח סטטיסטי נוסף.

לאחרונה, השילוב של המיקרוסקופיה של יריעות אור של הצירים mitotic במרווחי זמן משניים, יחד עם עיבוד תמונה מתוחכם מאפשר ניתוח של שיעורי הרכבה MT בשלושה ממדים63,64. זה יש יתרונות ברורים מעל clsm, אבל שיפורים נוספים יידרש לפני השיטה הופכת לשימוש כללי, כגון הרחבת האסטרטגיות המשמשות U-Track למימד השלישי26,50,63.

הפרוטוקול של גילוי הדינמיקה MT אנו מתארים כאן יכול להיות שיטה לבחירה עבור הקרנת תרופות. השיטה חזקה, והיא מסירה בהצלחה את ההטיה האנושית בהשוואה לניתוח שבוצע באופן ידני. האוטומציה של עיבוד הסרט מאפשרת ניתוח של אלפי רצועות MT בתוך כל תא, ובכך מגבירה את העוצמה הסטטיסטית של הניתוח. יתר על כן, ניתן לשנות את השיטה על ידי שינוי, למשל, פרוטוקול הסנכרון וקבלת תאים משלבים שונים של מחזור התא. זה יכול, למשל, להיות כלי שימושי עבור סינון MT המיקוד תרופות כימותרפיות כאשר ההשפעה על התאים הבינפאזיים וחילוק צריך להיות מכובד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מתקן המיקרוסקופיה, מכון מקס פלנק לרפואה ניסויית, לייעוץ ולתמיכה המומחים שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

ביולוגיה סוגיה 153 מיקרוכדורית צמיחה מיקרוכדורית מעקב מיקרוכדורית פלוס prometaphase הדמיה של תאים חיים מיקרוסקופ מסתובב בדיסק
מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter