Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение динамики микротрубок с помощью вращающейся микроскопии диска в монополярных митотическом спинное

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Здесь мы представляем надежный и подробный метод анализа микротрубной динамики в клетках, синхронизированных в прометафазе с помощью живой клетки вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и обработки изображений на основе MATLAB.

Abstract

Мы описываем модификацию установленного метода определения динамики микротрубв в живых клетках. Протокол основан на экспрессии генетически закодированного маркера для положительных концов микротрубок (EB3, маркированных флуоресцентным белком tdTomato) и высокоскоростной, с высоким разрешением, живоклеточной визуализации с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Синхронизация клеточного цикла и увеличение плотности микротрубок достигается путем ингибирования центросомального разделения в митотических клетках, а анализ роста проводится с помощью программного обеспечения U-Track с открытым исходным кодом. Использование яркого и красного сдвига флуоресцентного белка в сочетании с более низкой мощностью лазера и сокращением времени экспозиции, необходимого для вращающейся дисковой микроскопии, снижает фототоксичность и вероятность световых артефактов. Это позволяет для визуализации большего количества клеток в том же препарате при сохранении клеток в среде роста в стандартных условиях культуры. Поскольку анализ выполняется контролируемым автоматическим способом, результаты являются статистически надежными и воспроизводимыми.

Introduction

Микротрубочки (МТ) являются высокодинамическими структурами, встречаемыми практически во всех эукариотических клетках и в некоторых бактериях1. Вместе с актином и промежуточными нитями они лепят цитоскелет2,3. Ячейка разделение4, молекула транспорт5, flagellar избиение6, ощущение окружающей среды через первичный цилиум7, слух (киноцилиум)8,9, эмбриогенез10,11,12, вторжение и метастазы13,14, и даже формирование памяти15,16,17,18, и многие другие процессы в первую очередь опираются на МТ. Участие МТ во всех этих событиях было бы невозможно без их замечательной способности быстро переключаться между ростом (полимеризация) и усадки (деполимеризация). Это свойство описывается как динамическая нестабильность19. Mt динамика изменяется во многих патологических условиях20,21,22. Таким образом, определение характера этого свойства может помочь понять механизмы болезни, а затем их лечение.

Для анализа динамики МТ был разработан длинный список методов, большинство из которых основаны на методах визуализации23. Первоначально для наблюдения за образованием полимеров тубулина в пробирке24использовались широкоугольные световые микроскопы. Открытие конечных связывания (EB)-белки, которые собирают на МТ плюс-концы и развитие методов флуоресцентно этикетки белков позволило наблюдать за поведением MTs непосредственно в живых клетках с широким полем и конфокальные флуоресценции микроскопов25,26,27. Один EB-белок является конечным связывающим белком 3 (EB3)28; путем переэкспрессинга и отслеживания EB3, слитого в флуоресцентный белок, MT плюс конец сборки ставки могут быть определены29,30.

Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия (CLSM) часто используется для наблюдения за динамикой МТ. Тем не менее, этот метод визуализации представляет высокий риск фототоксичности и фотоотбеления, два нежелательных процессов для живых клеток и тусклый образец изображения31. Для того, чтобы получить лучшее соотношение сигнала к шуму, мощность лазера и продолжительность экспозиции должны быть достаточно высокими, не повреждая образцы, и это требует ущерба разрешением в обмен на скорость. Подходящей альтернативой CLSM является спиннинг дискмикроскопия32. Эта модальность изображения основана на использовании диска Nipkow33, который состоит из движущегося диска, несущего массив пинхолов, и работает эквивалентно многим микроскопам CLS, изображая тот же образец одновременно34. Таким образом, свет от лазера будет освещать несколько областей в образце одновременно, но сохранить конфокальный характер. Таким образом, диск Nipkow позволяет получать изображения, похожие на CLSM, но быстрее и используя меньше лазерной энергии. Диск Nipkow был дополнительно улучшен Yokogawa Electric, который представил второй диск с массивом микролинз на нем, что индивидуально направлять свет в соответствующую пинхол, дальнейшее снижение фототоксичности и photobleaching35. Таким образом, вращающийся диск лазерное сканирование микроскопии стал методом выбора для живой визуализации клеток, и это позволяет получать изображения с высоким соотношением сигнала к шуму на высокой скорости31,36, что имеет решающее значение для решения сигналов, таких как от быстрорастущих концов МТ.

Динамика МТ временно отличается. Например, митотические МТ более динамичны, чем межфазные37,38. Аналогичным образом, различия в темпах роста и усадке наблюдались даже в пределах одной и той же фазы клеточного цикла, например, митоза39,40. Поэтому, чтобы избежать ложного сбора данных, измерение динамики МТ должно ограничиваться узким временем во время клеточного цикла. Например, измерение динамики МТ в прометафазе может быть достигнуто путем лечения клеток с диметиленастроном (DME), монострольным аналогом, который подавляет моторный кинезин Eg541 и предотвращает образование биполярного митоtic шпинделя42. Ингибирование клеток на прометафазе с ингибитором Eg5 DME и другими производными монастрола не влияет на динамику МТ43,44,45, что делает DME полезным инструментом для изучения динамики МТ как в стационарных, так и в живых клетках44.

Здесь мы объединяем метод анализа динамики МТ в прометафазных клетках, описанных Ertych et al.44, с двойной вращающейся визуализацией диска. Этот метод позволяет измерять динамику МТ в прометафазных клетках, собранных из одного фокусного плана с более высокой частотой изображений, но без фотоотбелевания и минимальной фототоксичности. Кроме того, как флуоресцентный репортер, мы используем тандем димер томатный флуоресцентный белок (tdTomato), который улучшил яркость и фотостабильность по сравнению с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) и возбуждается с более низким энергетическим светом46. Таким образом, tdTomato требует меньше лазерной энергии для возбуждения и менее фототоксичным. В целом, мы дополнительно улучшаем метод за счет снижения фототоксичности и улучшения разрешения и постобработки, необходимых для анализа динамики Mt. Кроме того, мы создаем основу для будущих модификаций метода, объединив его с другими методами синхронизации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Посев клеток HeLa

  1. Приготовьте 2 мл 5 мл/мл фибронектина раствор афериста (PBS) и добавьте 450 л его в каждую скважину 4 хорошо камерного покрытия (#1,5). Инкубировать слайд в течение 15 мин при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
  2. Промыть асинхронно растущие клетки HeLa с фосфатным солей Dulbecco (DPBS) и инкубировать с трипсин-EDTA (0.05%: 0.02%; w:v) в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Остановить ферментативную реакцию добавлением Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 средних дополнен 10% тепло-инактивированной сыворотки плода теленка (FCS) на 3:1 (v:v) соотношение добавил трипсин-EDTA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HeLa были сохранены в среде RPMI 1640, дополненной 10% теплоинактивированной FCS при температуре 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 и регулярно проходились, как только они достигли 80-90% непредвиденных обстоятельств, как описано выше.
  3. Определить концентрацию клеток с помощью камеры Нойбауэра. Смешайте 50 qL aliquot клеточной подвески с трипан овым итога в соотношении 1:1 (v:v), resuspend, и перенесите 10 зл. Подсчитайте только трипан сине-отрицательных клеток внутри четырех больших квадратов (для деталей см. Фелан и др.47). Извлеките концентрацию клетки из подсчитанного числа клеток с помощью следующей формулы:
    Equation 1
  4. Пеллети теки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин. Отдохните свежим RPMI 1640 для того, чтобы получить 1 х 106 клеток/мл.
  5. Удалите фибронектин из камерной крышкой, мыть колодцы дважды с DPBS, и семена 50000 клеток на хорошо.
  6. Вернуть камерный покрывало с клетками в инкубатор и выращивать их в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

2. Выражение pEB3-tdTomato в клетках HeLa

  1. Подготовьте микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Для каждой трубки разбавьте 2 мкг pEB3-tdTomato48 с трансфекционным буфером (синтетический продукт в водином растворе) до конечного объема 396 qL.
  2. Добавьте в первую трубку 4 л трансфекционного реагента (нелипидного, содержащего полиэтиленина), и сразу же на 10 с.
  3. Кратко вращать трубку с микроцентрифугой и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
  4. Удалите клетки HeLa из инкубатора. Dropwise, добавить 100 л трансфекционной смеси к каждому колодцу 4 хорошо камерной крышкой, и вернуть клетки в инкубатор.
  5. После 4 ч инкубации при 37 и 5% CO2, дополнить клетки со свежим средством роста среды и инкубировать, по крайней мере 24 ч при 37 КС и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо оптимизировать условия трансфекции для каждого типа клеток. Уровни выражения должны быть достаточно низкими, чтобы определить одиночные концы роста МТ. Кроме того, в экспериментах может быть использована клеточная линия, четко выражающая EB3-tdTomato; это уменьшит изменчивость в уровнях экспрессии EB3-tdTomato между препаратами и между клетками из одного и того же препарата49.

3. Синхронизация и live-cell Imaging pEB3-tdTomato-выражение клеток HeLa

  1. Подготовьте раствор диметиленастрона (DME) в феноло-красном безварном орел-медиуме (DMEM) дополненном 10% FCS и 2 ММ L-глутамина или альтернативным запасом глутамина.
  2. Замените среду роста в камерном coverslip с 500 qL среды роста, содержащей 2,5 ММ DME и инкубировать клетки на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  3. После 3,5 ч инкубации с DME, передача клеток в микроскоп, смонтировать камерный покрывало в экологическую камеру с темными панелями для визуализации при 37 КС и 5% CO2, и далее инкубировать до тех пор, пока общее время инкубации составляет 4 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры при температуре 37 градусов без колебаний имеет решающее значение для эксперимента.
  4. Выполните замедленное изображение на перевернутом микроскопе, оснащенном целью погружения масла 100x 1.49 N.A., двойной вращающейся дисковой конфокальной системой и надежной системой автофокусировки для непрерывного обслуживания фокусной плоскости. Определите параметры изображения следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем камеру Electron Multiplying Charge-Coupled Device (EM-CCD).
    1. Для EB3-tdTomato возбуждение, используйте 561 нм лазерной линии с 200 мс время экспозиции. Соберите излучаемый свет через четырехместный диапазон (405, 488, 561, 640 нм) дихроическое зеркало и фильтр для выбросов 600/52 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная мощность может быть скорректирована для каждой изображенной ячейки, чтобы предотвратить насыщение изображения. Во всех фильмах замедленного пребывания здесь лазерная мощность была установлена на 5,3 мВт.
    2. Найти клетку в профазе и сосредоточиться в плоскости, соответствующей центру монополярного митотического шпинделя. Приобретайте изображения каждые 0,5 с в общей сложности 1 мин без связывания и без освещения между экспозициями.

4. Анализ динамики MT с использованием U-Track v2.2.0

  1. Для анализа динамики MT требуется программное обеспечение для расчетной среды (например, MATLAB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Базового понимания программного обеспечения достаточно для анализа. Всеобъемлющий справочный материал и учебные материалы доступны на веб-сайте разработчика (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. Скачать (https://github.com/DanuserLab/u-track) и установить с открытым исходным кодом U-Track v2.2.0 программное обеспечение после подробных инструкций, приведенных в "Readme_u-track.pdf" файл50,51,52.
  3. Запустите программное обеспечение для количественного анализа и добавьте папку U-Track v2.2.0 с субфолиорами в путь поиска программного обеспечения.
  4. Из окна команды звоните "movieSelectorGUI". Это открывает окно диалога, из которого сырые файлы, генерируемые программным обеспечением приобретения изображения в микроскоп, могут быть импортированы(Дополнительная диаграмма 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение U-Track совместимо с другими форматами данных изображений. Он использует Bio-Formats, который распознает различные форматы данных науки о жизни53.
  5. Размер каждого изображения считывается из метаданных автоматически. Вручную введите численное отверстие цели (в данном случае 1,49) и временной интервал (0,5 с), используемый для визуализации(Дополнительная диаграмма 1B). Кроме того, информация о длине волн возбуждения, фторфоре и времени воздействия также может быть предоставлена, но они не являются критическими для дальнейшего анализа.
  6. После загрузки всех изображений сохраните вводимые временные промежутки в качестве списка фильмов, выбрав «Сохранить как список фильмов». На правой стороне окна диалога выберите вариант"U-Track"инажмите" Продолжить "(Дополнительная рисунок 1С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения оптимизированы для клеток HeLa. При переключении на другую клеточную линию значения следует определить еще раз. Кроме того, используйте параметры, рекомендованные разработчиками программного обеспечения. Подробное объяснение каждого из параметров и того, как они должны быть определены, можно найти в техническом отчете, представленном предыдущей версией программного обеспечения, plusTipTracker50.
  7. Из всплывающее окно выберите "Microtubule Plus-Ends" и нажмите "Ok"(Дополнительная рисунок 1С). Новое окно диалога позволяет определить параметры для трех этапов анализа(Дополнительная цифра 1D), которые являются обнаружение, отслеживание и отслеживание анализа.
  8. В шаге 1 выберите "Настройки" и из выпадающего меню выберите "Обнаружение кометы" в качестве метода обнаружения(Дополнительная диаграмма 2B).
    1. Из нового окна диалога определяются параметры разницы гауссийского фильтра и сегментации водораздела следующим образом(Дополнительная диаграмма 2C):Процесс маски, который будет использоваться для обнаружения и нет; Низкопроходивное стандартное отклонение Гауссиана - 1 пиксель; Высокопроходивное гауссское стандартное отклонение - 3 пикселя; Минимальный порог - 3 стандартных отклонения; Пороговый размер шага - 0,25 стандартных отклонений. Выберите "Применить настройки для всех фильмов" и "Применить".
  9. В шаге 2, параметры для соединения, закрытия зазора, слияния и расщепления, и Калман фильтр функции определяются в три этапа, как выделено в розовый, зеленый и синий, соответственно(Дополнительный рисунок 3B). Для этих шагов выберите "Microtubule Plus-end Dynamics" и из опции "Установка" определить значения, указанные в дополнительном рисунке 3C-E, соответственно.
    1. Для проблем с размерностью выберите "2" из выпадающего меню. Используйте максимальный разрыв, чтобы закрыть 5 кадров; Минимальная длина трековых сегментов от первого шага - 3 кадра. Как и прежде, выберите "Применить настройки для всех фильмов" и нажмите на "Применить".
  10. В шаге 3 анализа, обнаруженные треки МТ классифицируются(Дополнительный рисунок 4). В качестве метода анализа треков выберите «Классификацию динамики микротрубок»и определите параметры через кнопку«Установка»,указанную на дополнительной диаграмме 4B,C. После этого выберите поле«Применить настройки ко всем фильмам»и нажмите накнопку «Применить».
  11. После того, как все параметры определены, из окна "Control Panel-U-Track"(Дополнительная цифра 1D) выберите "Применить Check/Uncheck для всех фильмов" и "Запустите все фильмы" коробки и нажмите "Run". Это инициирует MT анализ замедленной серии.
  12. После завершения обработки фильма отображается сообщение "Ваш фильм (ы) успешно обработаны". Пресса"Ок",затем "Сохранить".
  13. Теперь можно смело выйти из программного обеспечения для количественного анализа. Результаты обработки фильмов хранятся в подфайлных структурах в виде m-файлов в папке, где хранятся необработанные файлы.

5. Статистический анализ динамики МТ

  1. Импортm-файлов в предпочтительную программу статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае мы сначала импортируем файлы в стандартной электронной таблице, чтобы сделать их читаемыми. M-файлы содержат статистическую информацию (средний, средний и стандартный отклонение) по различным параметрам (например, скорость роста, mt-динамика). Подробный перечень параметров приведен в техническом отчете, представленном предыдущей версией программного обеспечения, plusTipTracker50,52. Генерируемые m-файлы также могут быть импортированы в другое программное обеспечение для обработки данных.
  2. Выберите параметр "средняя скорость роста" и импортируйте его в таблицу для статистики и отображения. Введите информацию о других параметрах (например, "динамическость") либо в новой таблице, либо в новой колонке той же сгруппированной таблицы и сюжета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя данному протоколу, изложенному на рисунке 1A,плазмида pEB3-tdTomato была транслеэффектно выражена в асинхронно растущих клетках HeLa. Клетки были синхронизированы 48 ч после трансфекции на прометафазе через лечение DME(рисунок 1B). Этот шаг обеспечил, чтобы измерение динамики МТ всегда проводилось на одной и той же стадии клеточного цикла. Замедленное кино было дополнительно обработано и проанализировано с U-Track v2.2.0, как описано в его дополнительной документации50,51,52. Хотя плюс-конец связывающих белков прослеживать только mt фазы роста, U-Track v2.2.0 экстраполирует информацию о паузе и усадки событий, связывая последовательные фазы роста и реконструкции полных траекторий26,50. Алгоритм основан на пространственно и временно глобальной структуре отслеживания, описанной Jaqaman et al.51.

Важно отметить, что чувствительность и точность анализа сильно зависят от нескольких параметров анализа. Например, замедленное кино было проанализировано, как описано в протоколе(рисунок 1С,Видео 1 "До" и видео 2 "После" анализа), а в результате скорость роста и динамика (коллективное смещение пробелов, содержащих треки на протяжении всего срока их существования) построены на рисунке 1E,F, соответственно (черные круги). Затем параметры, описанные в значительной степени влияют на анализ50, такие как "Максимальная длина разрыва" и "Максимальный фактор сжатия" были изменены для того же набора фильмов замедленного времени (Видео 3 и 4, соответственно). Соответствующие значения скорости и динамики роста приведены на рисунке 1E, F как красные квадраты, так и синие треугольники соответственно. В результате скорость роста не была глубоко затронута. Однако значения, полученные для динамики, существенно отличались при изменении "Максимальной длины разрыва", в то время как при изменении "коэффициента максимального сжатия" он оставался неизменным. Как показано на рисунке 1D, во всех трех случаях обнаружение мТ-подстроек было столь же надежным. Тем не менее, реконструкция полной траектории МТ в основном пострадали, когда "Максимальная длина разрыва" был установлен на 15(Рисунок 1D, вставка изображения). Кроме того, для того, чтобы оценить, мешали ли условия визуализации поведению МТ, были проанализированы первая (1-61 кадры) и вторая (61-121 кадры) половинки серии тайм-лап, а также соответствующие значения скорости роста и динамики(рисунок 1G, H, соответственно). Как и ожидалось, никаких существенных различий между двумя частями серии замедленного времени обнаружено не было. В видео дается 1-8 покадровые изображения митотической клетки, синхронизированной в профазе и выражающей EB3-tdTomato (длительность 1 мин; интервал 0,5 с).

Figure 1
Рисунок 1: Анализ динамики МТ в клетках HeLa синхронизирован в прометафазе. (A) Набросок шагов протокола. (B) Схематическое представление механизма Опосредованного образования монополярного митотического шпинделя. (C) Монтаж первых 10 кадров замедленного фильма обрабатываются с U-Track программного обеспечения с каждым вторым кадром показано. Обнаруженные траектории роста МТ отмечены красным цветом. (D) Проекция временных рядов необработанного файла изображения и после отслеживания MT с использованием параметров, описанных в протоколе ("оптимальный"), и при изменении либо "Максимальная длина разрыва" или "Максимальный фактор сжатия" даются. Вставки представляют собой полные траектории MT, которые состоят из роста (красный), пауза (светло-голубой), усадки (желтый), fgap реклассифицированы как рост (зеленый) и bgap реклассифицированы как пауза (темно-синий) событий. Скорость роста означает (E) и динамические значения (F) показаны, и результаты, использующие любой из предложенных оптимальных критериев (черные круги), максимальная длина разрыва, установленная до 15 (красные квадраты), или максимальный коэффициент усадки, установленный до 1,0 (синие треугольники) нарисованы (n q 45 ячеек; означает SEM; односторонний анализ ANOVA с Tukey post hoc тест для многократного сравнения). Скорость роста означает(G) и динамические значения (H) показаны для первого (1-61 кадров) и второй (61-121 кадров) половинки замедленного фильмов (n no 45 ячеек; означает SEM; непарный t-test с коррекцией Welch). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Видео 1: Репрезентативное замедленное необработанное изображение прометафазной ячейки перед анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 2: Обнаружение и отслеживание MT в ячейке в Видео 1 с использованием предлагаемых настроек для программного обеспечения U-Track. То же изображение повремени в Video 1 обрабатывается с помощью программного обеспечения U-Track v2.2.0 с использованием описанных настроек, а обнаруженные треки роста отмечены красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 3: Обнаружение и отслеживание MT в ячейке в видео 1 с использованием неоптимального значения для "Максимальная длина разрыва". То же время промежуток изображения в видео 1 обрабатываются с U-Track v2.2.0 программного обеспечения с использованием тех же настроек, как и раньше, но с "Максимальная длина разрыва" установлен на 15. Остальные параметры не были изменены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 4: Обнаружение и отслеживание МТ в ячейке в видео 1 с использованием неоптимального значения для "Максимального фактора сжатия". То же изображение повремени в Video 1 обрабатывается с U-Track v2.2.0 программного обеспечения с использованием тех же настроек, как и раньше, но с "Максимальный фактор сжатия" установлен на 1. Остальные параметры не были изменены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 5: Пример замедленной серии клеток с клеточным мусором. После анализа, некоторые обломки клеток были также обнаружены программным обеспечением во время отслеживания МТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 6: Сырые данные, соответствующие видео 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 7: Пример замедленной серии клеток с высоким выражением EB3-tdTomato в результате плохого определения растущих советов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Видео 8: Сырые данные, соответствующие видео 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Supplementary Figure 1
Дополнительная диаграмма 1: Рабочий процесс анализа с использованием программного обеспечения U-Track. (A) Схема шагов, используемых программным обеспечением. (B) Скриншот импортера Bio-Formats, показывающий, как импортировать файлы замедленного времени. (C) После загрузки файлов, U-Track с МТ плюс-концы модуль выбран. (D) Скриншот панели управления U-Track, где определяются параметры обнаружения кометы, отслеживания и анализа треков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 2
Дополнительная диаграмма 2: Описание первого шага анализа, обнаружение кометы. (A) Наброски основных событий, выполняемых алгоритмом. (B, C) Скриншоты из программного обеспечения даются с оптимальными значениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 3
Дополнительная рисунок 3: Описание второго шага анализа, отслеживание кометы. (A) Основные шаги, выполняемые алгоритмом, изложены. (B) Приведен скриншот панели "Tracking". Максимальное закрытие разрыва соответствует максимальной длине разрыва и устанавливается до 5. Отслеживание трех подступен, выделенных красными, зелеными и синими прямоугольниками. (C,D,E) Здесь вводятся численные значения, необходимые для каждого подшага. Максимальный коэффициент сжатия установлен на 1,5, как указано в (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 4
Дополнительная цифра 4: Описание последнего шага анализа, анализ треков. (A) Классификация динамики MT и реклассификация составных треков выполняется в течение этого шага. (B, C) Отображаются скриншоты анализа трека и соответствующие настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем модификацию метода, впервые установленного Ertych et al.44. Наряду с несколькими другими модификациями, мы сочетаем эту технику анализа динамики МТ с двойной вращающейся дискковой конфокальной визуализации. Использование двойного вращающегося диска улучшает разрешение растущих МТ при одновременном снижении фототоксичности36. Мы также уменьшаем фотоотбеление и лазерное свето-индуцированное повреждение клеток путем переключения на более длинную волну флуоресцентного репортера. TdTomato флуоресцентный белок имеет более высокий коэффициент фотостабильности и яркости по сравнению с EGFP46. Наконец, измерение динамики МТ ограничивается только одним самолетом из-за ограничений последующего анализа с U-Track. Программное обеспечение U-Track предназначено для обнаружения флуоресцентно обозначенных наконечников MT в осиXY'-50,51. Таким образом, принятие серии замедленного промежутки с теги и создание максимальной серии проецирования повремени склонны генерировать ложные результаты. Сигналы, обнаруженные в разных плоскостях и не принадлежащие к одному и тому же растущему МТ, объединяются в максимную проекцию, создавая тем самым ложную траекторию роста МТ.

Используемый здесь протокол синхронизации вызывает высокую плотность МТ, ограничивая митотический шпиндель монополярной структурой. Митотические МТ являются высокодинамическими структурами с фазами роста и усадки, с паузой при переходе между ними19,54,55. Из-за высокой плотности растущих МТ, обнаружение событий паузы, за которыми следует либо усадка, либо рост, склонно к ложным результатам, если параметры отслеживания установлены неправильно. Модули отслеживания программного обеспечения U-Track обнаруживают так называемые подрубы (эпизоды непрерывного роста), а затем классифицируют их как сложные треки с событиями паузы, называемыми «пробелами». Applegate et al. обсуждают два параметра, критически важных для отслеживания и субтрека, связывающего50. Это "Максимальная длина разрыва" и "Максимальный фактор сжатия". Если следят за подпутьем, вновь появляется в растущем направлении МТ в последующих временных шагах, то он классифицируется как передний разрыв. С другой стороны, если подследок появляется в противоположном направлении роста, он будет классифицирован как обратный разрыв. Максимальная длина разрыва определяет количество кадров, которые необходимо искать для передних и обратных пробелов. Как уже упоминалось, высокая плотность и по своей природе высокая динамика митотических МТ устанавливает ограничение, и меньшие значения должны быть определены. Как показано на рисунке 1E, больше всего влияет на динамику. Динамика рассчитывается как коллективное перемещение всех пробелов, содержащих треки на протяжении их глобальной жизни. Второй параметр, максимальный коэффициент сжатия, практически не влияет ни на динамику, ни на скорость роста(рисунок 1D,E).

В целом, при изучении свойств роста МТ следует уделять пристальное внимание условиям визуализации. Во-первых, МТ очень чувствительны к температуре и деполимеризации при воздействии холода среднего роста56,57,58,59. Поэтому, чтобы избежать сбора ложных результатов, температура должна строго контролироваться на протяжении всего эксперимента. Во-вторых, ионный состав среды, используемой в ходе экспериментов, может повлиять на рост МТ58,60. Например, воздействие ионов кальция влияет на динамику МТ различными способами61,62. Следовательно, состав среды роста, используемой во всех экспериментах, должен быть одинаковым. Аналогичным образом, параметры анализа должны быть определены один раз и поддерживать сятворные для всех повторений. Кроме того, замедленное количество фильмов, созданных после анализа, должно быть визуально проверено, и любой фильм с фоновым шумом, приводящим к ложным срабатываниям (Видео 5 и 6) или с высоким выражением tdTomato, что приводит к плохому разрешению mt растущих советов (Видео 7 и 8), должен быть исключен из дальнейшего статистического анализа.

В последнее время сочетание решетки светлистной микроскопии митотических шпинделей с субсекундными интервалами, вместе со сложной обработкой изображений позволяет анализировать скорость сборки МТ в трех измерениях63,64. Это имеет очевидные преимущества перед CLSM, но дальнейшие улучшения потребуются, прежде чем метод станет общего использования, таких как расширение стратегий, используемых в U-Track в третьем измерении26,50,63.

Протокол обнаружения динамики МТ, который мы описываем здесь, может быть методом выбора для скрининга на наркотики. Метод является надежным, и он успешно устраняет человеческие предубеждения по сравнению с анализом, выполняемым вручную. Автоматизация обработки фильмов позволяет анализовать тысячи треков Mt внутри каждой ячейки, тем самым увеличивая статистическую мощность анализа. Кроме того, метод может быть изменен путем изменения, например, протокола синхронизации и получения ячеек из разных фаз клеточного цикла. Это может, например, быть полезным инструментом для скрининга МТ ориентации химиотерапевтических препаратов, когда влияние на межфазные и деления клеток следует различать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим членов Фонда световой микроскопии, Института экспериментальной медицины Макса-Планка, за их экспертные советы и поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Биология Выпуск 153 динамика микротрубок рост микротрубок слежение за микротрубами плюс конец прометафа живая клеточная визуализация вращающаяся дисковая конфокальная микроскопия
Измерение динамики микротрубок с помощью вращающейся микроскопии диска в монополярных митотическом спинное
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter