Summary
Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen übertreffen alle anderen Todesursachen und sind für unglaubliche 31 % der Todesfälle weltweit verantwortlich. Diese Krankheit manifestiert sich bei Herzverletzungen, in erster Linie in Form eines akuten Myokardinfarkts. Mit wenig Resilienz nach Verletzungen wird das einst gesunde Herzgewebe durch faseriges, nicht kontraktiles Narbengewebe ersetzt und ist oft ein Vorspiel zu Herzinsuffizienz. Um neue Behandlungsmöglichkeiten in der regenerativen Medizin zu identifizieren, konzentrierte sich die Forschung auf Wirbeltiere mit angeborenen regenerativen Fähigkeiten. Ein solcher Modellorganismus ist die Neonatalmaus, die auf Herzverletzungen mit robuster Myokardregeneration reagiert. Um eine Verletzung bei der neonatalen Maus zu induzieren, die klinisch relevant ist, haben wir eine Operation entwickelt, um die linke vordere absteigende Arterie (LAD) zu verdecken, die einen Myokardinfarkt widerspiegelt, der durch Arteriosklerose im menschlichen Herzen ausgelöst wird. In Verbindung mit der Technologie, um Veränderungen sowohl innerhalb von Kardiomyozyten als auch innerhalb von Nicht-Myozytenpopulationen zu verfolgen, bietet uns dieses Modell eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die die Herzregeneration leiten. Einblicke in Veränderungen der Herzzellpopulationen nach Verletzungen stützten sich einst stark auf Methoden wie Gewebeschnitt und histologische Untersuchung, die sich auf zweidimensionale Analysen beschränken und dabei oft das Gewebe schädigen. Darüber hinaus ist es diesen Methoden nicht in der Lage, Veränderungen in Zelllinien nachzuverfolgen, anstatt lediglich eine Momentaufnahme der Verletzungsreaktion bereitzustellen. Hier beschreiben wir, wie technologisch fortschrittliche Methoden in Linienverfolgungsmodellen, ganzer Organreinigung und dreidimensionaler (3D) Vollmontagemikroskopie eingesetzt werden können, um Mechanismen der Herzreparatur aufzuklären. Mit unserem Protokoll für die Operation an Myokardinfarktoperationen der Neonatalen Maus, die Gewebereinigung und die 3D-Gesamteorganbildgebung können die komplexen Wege, die die Kardiomyozytenproliferation induzieren, entwirrt werden, was neue therapeutische Ziele für die Herzregeneration enthüllt.
Introduction
Das Herz gilt seit langem als ein post-mitotisches Organ, aber neuere Beweise zeigen, dass Kardiomyozyten-Erneuerung tritt im erwachsenen menschlichen Herzen bei etwa 1% pro Jahr1. Jedoch, Diese niedrigen Raten der Kardiomyozyten Umsatz sind nicht ausreichend, um den massiven Verlust von Gewebe, die nach Verletzungen auftritt wieder aufzufüllen. Ein Herz, das einen Myokardinfarkt erlitten hat, wird etwa eine Milliarde Kardiomyozyten verlieren, die oft als Vorspiel zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dienen2,3. Mit über 26 Millionen Menschen, die weltweit von Herzinsuffizienz betroffen sind, besteht ein unerfüllter Bedarf an Therapeutika, die die durch Herzerkrankungen verursachten Schäden umkehren können4.
Um diese Lücke in der Therapeutik zu überbrücken, haben Wissenschaftler begonnen, evolutionär konservierte Mechanismen zu untersuchen, die der endogene Regeneration nach Verletzungen zugrunde liegen. Ein Modell zur Untersuchung der Herzregeneration von Säugetieren ist die Neonatalmaus. In der Woche nach der Geburt haben neonatale Mäuse eine robuste regenerative Reaktion nach Herzschäden5. Wir haben bereits gezeigt, dass neonatale Mäuse ihr Herz durch Kardiomyozytenproliferation nach einer apikalen Resektionregenerierenkönnen 5 . Obwohl diese Technik die Herzregeneration bei den Neonaten hervorrufen kann, fehlt es der Operation an klinischer Relevanz für menschliche Herzverletzungen. Um eine menschliche Verletzung im neonatalen Mausmodell nachzuahmen, haben wir eine Technik entwickelt, um einen Myokardinfarkt durch einen koronaren Arterienverschluss6zu induzieren. Diese Technik erfordert eine chirurgische Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), die für die Abgabe von 40%–50% des Blutes an das linksventrikuläre Myokard6,7verantwortlich ist. So führt die Operation zu einem Infarkt, der einen erheblichen Teil der linken ventrikulären Wand trifft. Diese Schädigung des Myokards stimuliert die Kardiomyozytenproliferation und Herzregeneration bei Neonaten5.
Die koronare Arterienverschlusschirurgie bietet eine hochreproduzierbare und direkt translationale Methode, um das Innenleben der Herzregeneration aufzudecken. Die neonatale Chirurgie parallel koronare Arterien-Atherosklerose im menschlichen Herzen, wo Ansammlung von Plaque in den inneren Wänden der Arterien kann eine Okklusion und nachfolgenden Myokardinfarktverursachen 8. Aufgrund einer Lücke in der therapeutischen Behandlung von Herzinsuffizienz-Patienten ist ein Okklusion im LAD mit Sterblichkeitsraten verbunden, die innerhalb eines Jahres nach der Verletzung9bis zu 26% erreichen, und wurde daher als "Witwenmacher" bezeichnet. Fortschritte in der Therapeutik erfordern ein Modell, das die komplexen physiologischen und pathologischen Auswirkungen von Herzverletzungen genau widerspiegelt. Unser chirurgisches Protokoll für neonatale Mausherzverletzungen bietet eine Plattform, die es Forschern ermöglicht, die molekularen und zellulären Hinweise zu untersuchen, die die Herzregeneration von Säugetieren nach einer Verletzung signalisieren.
Jüngste Forschungen zeigen die dynamische Beziehung zwischen der extrazellulären Umgebung und sich ausbreitenden Kardiomyozyten. Beispielsweise kann das postnatale regenerative Fenster erweitert werden, indem die Steifigkeit der extrazellulären Matrix um das Herz10verringert wird. Biomaterialien aus der neonatalen extrazellulären Matrix können auch die Herzregeneration in erwachsenen Säugetierherzen nach einer Herzverletzung fördern11. Auch die begleitende Proliferation von Kardiomyozyten ist eine angiogene Reaktion12,13; Kollateralarterienbildung, die nur für das regenerierende Herz der Neonatalmaus einzigartig ist, erwies sich als wesentlich für die Stimulierung der Herzregeneration12. Darüber hinaus hat unser Labor gezeigt, dass die Nervensignalisierung die Proliferation der Kardiomyozyten und die Herzregeneration durch Modulation der Wachstumsfaktorspiegel sowie die Entzündungsreaktion nach Derverletzung14reguliert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, nicht-Myozyten-Zellpopulationen als Reaktion auf Herzverletzungen zu verfolgen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir das Cre-lox-Rekombinationssystem in transgenen Mäuselinien genutzt, um die konstitutive oder bedingte Expression fluoreszierender Reporterproteine für die Linienverfolgung zu integrieren. Darüber hinaus können wir fortschrittliche Methoden verwenden, um die klonale Expansionsmusterung mit der Regenbogen-Mauslinie zu bestimmen, die auf der stochastischen Expression der cre-abhängigen, mehrfarbigen fluoreszierenden Reporter beruht, um die klonale Expansion von Zielzellpopulationen zu bestimmen15. Die Verwendung von Linienverfolgung enden mit der neonatalen koronaren Arterienverschlusschirurgie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplizierten zellulären Mechanismen der Herzregeneration zu sezieren.
Die Verfolgung der Abstammung fluoreszierend markierter Zellen mit dreidimensionaler (3D) Ganzkörperbildgebung ist mit der traditionellen Schnitt- und Rekonstruktionstechnik schwer zu erreichen – insbesondere dann, wenn Zellpopulationen zerbrechlich sind, wie Nervenfasern oder Blutgefäße. Während eine direkte Ganzkörperbildgebung des Organs durch optische Steilerstellung oberflächliche Zellpopulationen erfassen kann, bleiben Strukturen, die tief im Gewebe liegen, unzugänglich. Um diese Barrieren zu umgehen, wurden Geweberäumtechniken entwickelt, um die Opazität ganzer Organgewebe zu reduzieren. In jüngster Zeit wurden signifikante Fortschritte bei Clear Lipid-ausgetauschten Acrylamid-hybridisierten Rigid Imaging-kompatiblen Tissue hYdrogel (CLARITY)-basierten Methoden gemacht, die festes Gewebe über die Lipidextraktion16ablöschen. Es werden auch Schritte unternommen, um den Brechungsindex zu homogenisieren und anschließend die Lichtstreuung während der Bildgebung zu reduzieren17. Eine solche Methode ist die aktive CLARITY, die die Lipidzersetzung durch Elektrophorese beschleunigt, um das Waschmittel im gesamten Gewebe zu durchdringen18. Obwohl diese Geweberäummethode wirksam ist, erfordert sie teure Geräte und kann Gewebeschäden verursachen, wodurch der Ansatz mit empfindlichen Zellpopulationen wie den Herznerven 19 unvereinbarist. So verwenden wir den passiven CLARITY-Ansatz, der auf Wärme angewiesen ist, um das Eindringen von Reinigungsmitteln sanft zu erleichtern und so bei der Retention komplizierter Zellstrukturen zu helfen20,21.
Passive CLARITY wird in der Regel als weniger effizient als aktive CLARITY18, da die Technik wird oft von zwei Haupthindernissen begleitet: die Unfähigkeit, die gesamte Organtiefe zu löschen und die große Menge an Zeit benötigt, um erwachsene Gewebe zu löschen. Unser passiver CLARITY-Ansatz überwindet diese beiden Barrieren mit einem beschleunigten Clearing-Prozess, der in der Lage ist, neonatales und erwachsenes Herzgewebe vollständig zu beseitigen. Unsere passive CLARITY Gewebeclearing-Technik hat eine Effizienz erreicht, die die Visualisierung einer Vielzahl von Herzzellpopulationen ermöglicht, einschließlich seltener Populationen, die im erwachsenen Herzen verteilt sind. Wenn das gelöschte Herz mit konfokaler Mikroskopie abgebildet wird, kann die Architektur der zellspezifischen Musterung während der Entwicklung, Krankheit und Regeneration beleuchtet werden.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Use and Care of Laboratory Animals und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee in der School of Medicine and Public Health der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Alle Methoden wurden auf Wildtyp C57BL/6J (B6) und transgenen Mauslinien von Jackson Laboratories durchgeführt.
1. Koronare Arterienokklusion (Myokardinfarkt) Induziert durch Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) in 1-Tage-alten Neonatalen Mäusen6
- Trennen Sie die ein Tage alten neugeborenen Welpen von der Mutter, indem Sie sie zusammen mit einem Teil des ursprünglichen Nistmaterials in einen sauberen Käfig legen.
- Legen Sie die Hälfte des Käfigs auf ein Heizkissen, das auf mittlere Hitze eingestellt ist. Die Welpen sollten auf der unbeheizten Seite des Käfigs bleiben und erst nach der Operation auf die beheizte Seite gelegt werden.
- Erstellen Sie einen sterilen Operationsbereich unter einem Operationsmikroskop. Sammeln Sie sterilisierte chirurgische Geräte (Tabelle 1).
- Anästhetisieren Sie den Welpen über Unterkühlung: Wickeln Sie den Welpen in Gaze, um direkten Hautkontakt mit Eis zu vermeiden und begraben Sie ihn in einem Eisbett für ca. 3-4 min. Überprüfen Sie die Unterkühlung der Mäuse periodisch durch eine Zehenklemme. Neonate vertragen Hypothermie gut, jedoch kann eine längere Exposition gegenüber Unterkühlung zu Erfrierungen und anschließender Sterblichkeit führen.
- Nach der Beägung legen Sie die Maus in der Rückenlage auf den Operationsbereich und sichern Sie die Arme und Beine mit Klebeband. Sterilisieren Sie den operationsfolgenden Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
- Suchen Sie den unteren Brustbereich und machen Sie einen Querschnitt in der Haut mit einer kleinen Sezierenderin. Um die chirurgische Sicht auf die Rippen zu erweitern, trennen Sie die Haut vom Muskel, indem Sie die Haut sanft mit einem Paar Verbandszange heben und vorsichtig gegen die interkostalen Muskeln drücken, wobei die kleine Schere in geschlossener Position ist.
- Suchen Sie den vierten interkostalen Raum (Abbildung 1A) und machen Sie eine kleine, oberflächliche Punktion mit scharfen Zangen, wobei Sie darauf achten, keine inneren Organe zu durchstechen. Führen Sie eine stumpfe Sezierung durch Erweiterung des Bereichs zwischen den interkostalen Muskeln mit Verbandszangen. Die richtige anatomische Positionierung des Einschnitts ist für einen angemessenen Zugang zum Herzen unerlässlich.
- Führen Sie das Herz vorsichtig aus der Brusthöhle, indem Sie einen Finger setzen und zunehmenden Druck auf die linke Seite des Bauches ausüben, während Sie den interkostalen Raum mit Ankleidezangen offen halten (Abbildung 1B). Sobald das Herz außerhalb der Brust ist, entfernen Sie die Verbandszange, entlasten Druck, und lassen Sie das Herz auf den interkostalen Muskeln ruhen.
- Suchen Sie den LAD als den Bereich des Herzens, der weniger gepooltes Blut hat und sich in der richtigen anatomischen Position befindet (Abbildung 1C). Der LAD ist nur unter dem Mikroskop zu sehen, wenn das Herz innerhalb weniger Minuten nach Beginn der Operation zugänglich ist.
- Führen Sie LAD Ligation durch Nahn der LAD mit einer 6-0 Naht (Abbildung 1D). Binden Sie einen quadratischen Knoten zweimal, um Myokardinfarkt zu induzieren (Abbildung 1E). Die Tiefe der Naht in das Myokard kann variieren, jedoch ist die richtige anatomische Positionierung der LAD-Ligation entscheidend für die Reproduzierbarkeit. Beim Ligan der LAD sollte die Naht fest gezogen werden, aber sorgfältig, um den LAD nicht zu trennen. Blanchieren an der Spitze des Herzens wird sofort zu sehen sein (Abbildung 1E)
- Lassen Sie das Herz wieder in die Brusthöhle rutschen; dieser Prozess kann mit Abrichtzangen schonend erleichtert werden. Dicht die Rippen zusammen mit einem Chirurgenknoten gefolgt von einem quadratischen Knoten, mit stumpfer Zange, um den oberen Satz von Rippen zu heben, während eine 6-0 Naht durch den oberen und unteren Satz von Rippen passieren.
- Entfernen Sie das Band, das verwendet wurde, um die Hinterbeine des Welpen zu sichern.
- Die Haut zusammenhalten, indem Sie eine kleine Menge Hautkleber auf den Oberbauch legen. Dann greifen Sie die Haut des Unterbauchs mit feinen Zangen und bedecken Sie den exponierten Brustbereich. Begrenzen Sie die Menge an überschüssigem Kleber, der auf den Welpen verbleibt, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Ablehnung und Kannibalismus durch die Mutter erhöhen kann.
- Erleichtern Sie sofort die Erholung von der Anästhesie, indem Sie den Welpen auf ein Heizkissen auf mittlere Rhitze setzen. Wechseln Sie regelmäßig die Platzierung der Neonate, um alle Körperteile gleichmäßig zu erwärmen.
- Lassen Sie das Neugeborene 10–15 min direkt auf dem Heizkissen bleiben. Typischerweise wird die Bewegung innerhalb von 5 min wieder auf DieWärme gebracht.
- Reinigen Sie das Restblut und kleben Sie mit einem Alkoholtuch.
- Bedecken Sie fremde Düfte auf Neonaten, indem Sie den ganzen Körper mit Bettwäsche aus dem ursprünglichen Käfig reiben. Legen Sie den Welpen auf der beheizten Seite in den Käfig, während andere Operationen durchgeführt werden.
- Sobald alle Operationen abgeschlossen sind und Welpen warm und mobil sind, übertragen Sie den Wurf zusammen mit dem ursprünglichen Nistmaterial in den Käfig der Mutter.
- Überwachen Sie die Mäuse 30–60 min nach der Operation und achten Sie auf die Akzeptanz der Welpen durch Verschachtelung und/oder Pflege durch die Mutter.
- Überprüfen Sie die Mäuse am Morgen nach der Operation. Wenn die Mutter in Bedrängnis ist und die Welpen nicht verschachtelt hat, betrachten Sie eine Pflegemutter für die Welpen.
2. Löschen des Mausherzes mit Passive CLARITY21,22,23
- Anästhetisieren Sie die Maus mit Isofluran. Führen Sie eine Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig sediert ist.
- Legen Sie die Maus auf einen sauberen, chirurgischen Bereich in der Supine-Position, die Arme und Beine mit Klebeband zu sichern.
- Bewahren Sie isoflurane Sedierung auf der Maus mit einem Nasenkegel, bis das Herz extrahiert wird.
- Öffnen Sie die untere Brust, indem Sie das Fell knapp unterhalb des xiphoiden Prozesses mit Gewebezangen halten und einen Schnitt machen, der die Breite des Brustkorbs mit der großen Sezierschere überspannt.
- Schneiden Sie neben den distalen Teilen des Rippenkäfigs mit chirurgischer Schere.
- Setzen Sie den Membranmuskel aus, indem Sie den xiphoiden Prozess mit Gewebezangen erfassen. Lösen Sie die Membran mit gekrümmten Zangen.
- Unter Beibehaltung des Griffs des xiphoiden Prozesses ziehen Sie das Gewebe kranially, bis das schlagende Herz zugänglich ist.
- Greifen Sie das Herz an der Basis mit gekrümmten Zangen und sezieren Sie das Herz aus der Brusthöhle, indem Sie die Aorta und überlegene Vena cava mit einer Iridektomieschere schneiden.
- Während das Herz noch schlägt, legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS gefüllt, so dass das Herz pumpt das Blut im Inneren, wie es weiter schlägt. Myokardinfarkt kann durch die Überprüfung bestätigt werden, ob sich die Platzierung der Naht in der richtigen anatomischen Position für die LAD-Ligation befindet.
- Drücken Sie das Herz vorsichtig mit Einer Zange, damit das Herz das Restblut vertreiben kann.
- Übertragen Sie das Mausherz in eine Einweg-Glasschale mit 2 ml PBS. Waschen Sie Restblut weg, indem Sie das Herz auf einem Shaker für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mehrmals inkubieren. Ändern Sie die PBS-Lösung jedes Mal, bis PBS klar bleibt.
- Entsorgen Sie die PBS und füllen Sie die Durchstechflasche mit 2 ml kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA). 4 Stunden bei RT inkubieren (Abbildung 2A).
- Nach der Inkubation die PFA und die Durchstechflasche mit 2 ml PBS entsorgen. Waschen Sie das Herz auf einem Shaker für 10 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal, entleeren und füllen Sie die Durchstechflasche mit neuen PBS jedes Mal vollständig wegwaschen überschüssigePFA.
- PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml 4% Acrylamid und 0,5% VA-044 Lösung füllen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Führen Sie am nächsten Tag die Polymerisation durch, indem Sie die Durchstechflasche für 3 Stunden auf einen Beisekblock übertragen, der bei 37 °C eingestellt ist.
- Übertragen Sie das Herz in eine neue Glasschalendurchstechflasche und wiederholen Sie Schritt 2.12 (PBS Waschzyklus).
- PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml Clearing Solution füllen (Tabelle 2). Bei 37 °C inkubieren, bis das Herz gereinigt ist. Wechseln Sie die Lösung aus und füllen Sie sie alle 2–3 Tage mit einer frischen Clearing-Lösung auf. Der Clearingprozess kann mehrere Wochen dauern (Abbildung 2B-C).
HINWEIS: P1-Herzen dauern in der Regel etwa 3 bis 5 Tage, während P21-Herzen fast einen Monat dauern können, bevor die Inkubation der Clearing-Lösung abgeschlossen ist. - PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml PBS füllen und Schritt 2.12 (PBS-Waschzyklus) wiederholen. Die Durchstechflasche mit frischem PBS nachfüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Wenn eine Immunfärbung durchgeführt wird, überspringen Sie die Schritte 2.21–2.22 und fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Immunfärbung fort. Wenn Sie sich ausschließlich auf die endogene Fluoreszenz verlassen, fahren Sie mit den Schritten 2.21–2.22 fort und überspringen Sie Abschnitt 3.
- Verwerfen Sie PBS, und ändern Sie die Lösung in Rfractive Index Matching Solution (RIMS) (Tabelle 3). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Nach der Inkubation kann das gereinigte Gewebe in RIMS-Lösung bei RT gelagert werden. Gewebe kann in der Mitte weiß und undurchsichtig erscheinen, wenn es zuerst in RIMS übertragen wird; Gewebe sollte transparent werden, nachdem es mehrere Wochen lang in RIMS bei Raumtemperatur inkubiert wurde (Abbildung 2D).
3. Optional: Immunohistochemie Färbung des Ganz-Mount-Mausherzes
- Entfernen Sie das gereinigte Herz aus der RIMS-Lösung und legen Sie es in eine saubere 2,5 ml Glasdurchstechflasche mit 2 ml PBST (PBS mit 0,1% Triton-X 100)
- Waschen Sie das Herz in PBST 3 mal auf einem Orbitalrotator mit 30 min Inkubationen bei RT.
- Blockieren Sie die unspezifische Antikörperbindung, indem Sie das Herz in 2 ml 20% Sperrpuffer (in PBST verdünnt) eintauchen und mit Rotation für 3 Stunden bei RT inkubieren. Über4 °C übertragen, um über Nacht mit Rotation zu färben.
HINWEIS: Der Blockierpuffer besteht aus einem normalen Serum, das der Art entspricht, in der der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde. - Waschen Sie das Herz in PBST 3 mal mit Rotation für 5 min Inkubationen bei RT.
- Tauchen Sie das Herz in primärer Antikörper ein (in 2% Blockierpuffer mit PBST verdünnt) und verhindern Sie Lichteinwirkung, indem Sie die Glasflasche in Aluminiumfolie wickeln. Inkubieren Sie mit Rotation über Nacht bei RT.
HINWEIS: Von diesem Punkt an sollte Aluminiumfolie kontinuierlich verwendet werden, um die sekundäre vor Umgebungslichteinwirkung zu schützen. - Weitere 24 Stunden mit Drehung bei 4 °C inkubieren.
- Wiederholen Sie nach der primären Färbung Schritt 3.2 (langer PBST-Waschzyklus), um den ungebundenen Primärantikörper aus dem Gewebe zu entfernen. Verlängern Sie die Wäsche mit einer nächtlichen Inkubation mit Rotation bei RT.
- Arbeiten sie in einem Bereich mit begrenzter Beleuchtung, um eine Sekundärlichtexposition zu verhindern, tauchen Sie das Herz in sekundären Antikörper (verdünnt in 2% Sperrpuffer mit PBST) und inkubieren sie mit Rotation für 3 Stunden bei RT. Übertragen Sie auf 4 °C, um über Nacht mit Rotation zu färben.
- Wiederholen Sie am nächsten Tag Schritt 3.2 (langer PBST-Waschzyklus), um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
- Ersetzen Sie die Lösung durch 2% Sperrpuffer (in PBST verdünnt). Entfernen Sie den verbleibenden ungebundenen Antikörper, indem Sie über Nacht mit Rotation bei RT waschen.
- Überprüfen Sie am nächsten Tag, ob überschüssiger sekundärer Antikörper mit der konfokalen Mikroskopie entfernt wurde. Erweitern Sie die Wäsche nach Bedarf und ersetzen Sie täglich die 2%-Blockierpufferlösung. Gehen Sie einmal wenig bis keine unspezifische sekundäre vorhanden ist.
- Das immunbefleckte Herz in PBS bei 4 °C aufbewahren.
- Direkt vor der Vollmontagemikroskopie das Herz in RIMS-Lösung über Nacht bei 37 °C inkubieren. Verlängern Sie die Inkubation um weitere 24 Stunden, wenn das Gewebe noch nicht vollständig gereinigt ist.
- Bewahren Sie das vollständig gereinigte und immunbefleckte Herz in RIMS bei RT auf.
4. Visualisierung von Nicht-Myozytenpopulationen in 3D mit Single-Photon Confocal Microscopy Imaging des gelöschten Mausherzes
HINWEIS: Wenn Mausherzen embryonal geerntet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.1 fort. Für Mausherzen, die postnatal geerntet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.2 fort.
- Imaging des gelöschten embryonalen Mausherzes
- Füllen Sie den Mikroskop-Depressionsschlitten mit der PBS-Lösung.
- Nehmen Sie das gereinigte Herz vorsichtig mit gekrümmten Zangen auf und legen Sie das Gewebe auf die Rutsche.
- Montieren Sie die Rutsche mit einem Glasdeckel. Das Gewebe kann nun unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden.
- Imaging des gelöschten postnatalen Mausherzes
- Füllen Sie die Hälfte der Kammer der Depressionsrutsche mit PBS-Lösung. Um eine Kammer zu schaffen, die groß genug ist, um ein erwachsenes Mausherz zu passen, wurde ein 3D-gedrucktes Polypropylen-Vertiefungsschlitten nach Maß gefertigt (Abbildung 4).
- Nehmen Sie das gereinigte Herz vorsichtig mit gekrümmten Zangen auf und legen Sie das Gewebe in die Kammer. Füllen Sie das restliche Volumen der Kammer mit PBS.
- Füllen Sie die Kammer mit PBS, so dass die Oberfläche der Flüssigkeit eine Kuppel über der Oberseite der Kammer bildet. Montieren Sie die Abdeckungsrutsche. Das Gewebe kann nun unter einem aufrechten konfokalen Mikroskop abgebildet werden.
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Representative Results
Oft führen die beiden anspruchsvollsten Schritte das Herz aus der Brusthöhle und ligan den LAD. Um diese Schritte zu beheben, können Anpassungen bei der Platzierung der anfänglichen Punktion zwischen den vierten interkostalen Muskeln vorgenommen werden; Wenn die Punktion und die stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen (Abbildung 1A).
Zusätzlich kann ein erhöhter Druck auf den linken Bauch erforderlich sein, um diesen Prozess zu erleichtern (Abbildung 1B). Komplikationen können auch auftreten, wenn das Herz auf den interkostalen Muskeln ruht. Wir fanden heraus, dass das Herz außerhalb des Hohlraums bleiben wird, ohne sich zurückzuziehen, wenn die stumpfe Sezieren auf eine minimale Größe gehalten und hauptsächlich in horizontaler Richtung durchgeführt wird. Diese Ausrichtung ermöglicht auch eine klare Visualisierung und Zugänglichkeit des LAD (Abbildung 1C).
Beim Platzieren der Nahtnadel hinter dem LAD wird vorgeschlagen, tief in die vordere Wand des linken Ventrikels einzudringen, da eine oberflächliche Ligation in der endgültigen Nahtplatzierung weniger Anpassungsspielraum hat (Abbildung 1D). Das Binden der Naht um den LAD sollte mit kontrollierten, stetigen Bewegungen durchgeführt werden, da der LAD zerbrechlich ist und diese Herzkranzgefäße abtrennen und die vordere Wand die Sterblichkeit verursacht (Abbildung 1E). Innerhalb von 5-10 Minuten nach Abschluss der Operation sollte das Neugeborene lebendig sein und normal atmen.
Wenn Sie mit dem passiven CLARITY-Protokoll fortfahren, sollten Herzen, die von einer Mauslinie geerntet werden, die einen endogenen fluoreszierenden Reporter für die Zelllinienverfolgung enthält, vor Licht geschützt werden (Abbildung 2), was durch Einwickeln der Glasflasche in Aluminiumfolie erreicht werden kann. Während des Clearing-Schritts ist die Zeitinkubation in Clearing Solution variabel, abhängig vom Alter der Maus, als das Herz geerntet wurde. Dieser Schritt ist abgeschlossen, wenn das gesamte Gewebe konsistent undurchsichtig ist, ohne Verfärbung in der Mitte (Abbildung 2B-C). Die Herzen werden nach der Lagerung in RIMS-Lösung bei Raumtemperatur für ein paar Tage immer transparenter (Abbildung 2D). Es sollte beachtet werden, dass Gewebeausdehnung während des Clearing-Prozesses auftreten kann.
Unser passives CLARITY-Protokoll ermöglicht eine effektive Antikörperpenetration und ist somit mit immunhistochemischen Methoden zur Kennzeichnung von Proteinen von Interesse kompatibel. Dies wurde in Actl6bCrevalidiert; Rosa26tdT transgene Mäuse, die reife Neuronen mit dem tdTomato (tdT) Reporterprotein kennzeichnen. Die Herznerven sind hauptsächlich oberflächlich, wobei einige Populationen in der Epikardialschicht leben, daher haben wir diese Zellpopulation als Proof-of-Prinzip-Modell für die Reproduzierbarkeit des endogenen Reportersignals (Abbildung 3A) sowie für die Erhaltung der Reporterproteinkonformation vor und nach CLARITY verwendet (Abbildung 3B-C). Unser Vertreter ergibt sich aus Actl6bCre; Rosa26tdT-Mäuse zeigen, dass das endogene tdT-Proteinsignal, das in Nerven eines ungeklärten P7-Herzens zu sehen ist, in Nerven sowohl von ungeklärten als auch von gelöschten tdT-immunomarkierten P7-Herzen originalgetreu rekapituliert wurde (Abbildung 3). Um tdT-positive Nerven immunlabel, ein Rotikfluoreszenzprotein (RFP) Primärantikörper (Kaninchen polyklonal; 1:200 Verdünnung; Rockland #600-401-379) wurde zusammen mit einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (Ziegenpolyklonal; 1:1000 Verdünnung; Invitrogen #A-11008). Um das gereinigte Herz durch Auge während der Immunfärbung und Bildgebungsschritte zu visualisieren, kann eine ultraviolette Taschenlampe kurz verwendet werden, um das Herz zu beleuchten.
Abbildung 1: Induktion des Myokardinfarkts in der Neonatalen Maus durch koronare Arterienokklusion der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD). (A) Der vierte interkostale Raum, der durch ein einzelnes Sternchen (*) gekennzeichnet ist, wird lokalisiert und eine stumpfe Sezierung durchgeführt. (B) Druck wird auf den linken Bauch ausgeübt, um das Herz aus der Brusthöhle zu führen. (C) Der LAD, gekennzeichnet durch ein doppeltes Sternchen (**), wird als die vorherrschende Arterie und durch anatomische Position identifiziert. (D, E) Eine Naht wird dann hinter dem LAD übergeben und ein quadratischer Knoten wird um den LAD gebunden, um einen koronaren Arterienverschluss und anschließenden Infarkt zu induzieren. (E) Nach der Fertigstellung ist das Blanchieren unter der Naht an der Spitze des Herzens zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verlauf der passiven CLARITY-Methode auf einem P14-Mausherz. Die Herzen wurden von P14-Mäusen geerntet, (A) fixiert, und (B-D) unterzog sich dem passiven CLARITY-Protokoll. Für Herzen, die zu einem P14-Zeitpunkt eingenommen werden, ist der Inkubationsschritt der Clearing-Lösung (B) unvollständig, wenn eine Verfärbung in der Mitte des Herzens offensichtlich ist, die nach 6 Tagen gesehen wird, und (C) abgeschlossen ist, wenn das Herz gleichmäßig undurchsichtig erscheint, gesehen nach 10 Tagen. (D) Nachdem das Herz in RIMS gespeichert wurde, wird das Gewebe vollständig gerodet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ganzmount-3D-Bildgebung von P7-Mausherzen mit konfokaler Mikroskopie. Repräsentative 3D-Bilder aus der ganzen Halterung von P7 Actl6bCre; Rosa26tdT transgene Mäuseherzen werden als maximale Intensitätsprojektionen von z-gestapelten Bildern dargestellt. Die Herzen wurden abgebildet, um (A) endogene tdTomato (tdT) Fluoreszenz direkt nach der Ernte (rot) (B) Immunostainierung von tdT-positiven Nerven in einem ungeklärten Herzen (Alexa Fluor 488; grün) und (C) reproduzierbare Immunlabelierung von tdT-positiven Nerven in einem gereinigten Herzen (Alexa Fluor 488; grün) zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: 3D gedruckte Polypropylen-Depressionsfolien. Um die postnatalen Herzproben abzubilden, wurden benutzerdefinierte Depressionsdias in 3D auf Polypropylen gedruckt. Die Gleitmaße sind 25 mm x 75 mm x 1 mm, mit einer Schiebevertiefung gut 13 mm im Durchmesser und entweder (A) 6,5 mm oder (B) 17 mm in der Tiefe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gerätetyp | Beschreibung | Unternehmen | Katalognummer |
| Glas-Vial | 12 x 35mm Fläschper mit Kappe | Fisherbrand | 03-339-26A |
| 6-0 Prolene Nähte | Polypropylen-Nähte | Ethicon | 8889H |
| Scharfe Zange | Feine Spitze, gerade, 4.25 in | Sigma-Adrich | Z168777 |
| Dressing Forceps | Sezieren, 4.5 in | Fisherbrand | 13-812-39 |
| Nadelhalter | Mayo-Hegar, 6 in | Fisherbrand | 08-966 |
| Kleine Sezierende Schere | 30 mm Schneide | Walter Stern Inc. | 25870-002 |
| Gewebezange | Mittleres Gewebe, 1X2 Zähne | Excelta | 16050133 |
| Große Sezierende Schere | Gerade, 6 in | Fisherbrand | 08-951-20 |
| Iridectomy Schere | 2 mm Schneide | Fine Science Tools | 15000-03 |
| Gebogene Zange | Halb gebogen, Serrated, 4 in | Excelta | 16-050-146 |
Tabelle 1: Chirurgische Geräte.
| Clearing-Lösung | |||
| Reagenz | Finale | Menge | Notizen |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 8,0% w/v | 40 g | |
| Borsäure | 1,25% w/v | 6,25 g | |
| 1-Thioglycerol | 0,5% w/v | 5 l/ml | Nach Bedarf zur Lösung hinzugefügt |
| 400 ml Reinst-H20 auf 1 L Becher geben. SDS und Borsäure mit magnetischem Rühren mischen. | |||
| Stellen Sie den pH-Wert mit 6M NaOH auf 8,5 ein. Volumen auf 500 ml und Autoklavbringen. | |||
| Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. | |||
| Andere CLARITY Reagenzien | |||
| Reagenz | Finale | Lager | Notizen |
| Pfa | 4.0% | 16% | Verdünnt in PBS |
| Acrylamid | 4.0% | 40% | Verdünnt in PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Nach Bedarf zur Lösung hinzugefügt |
Tabelle 2: Clearing-Lösung und andere CLARITY-Reagenzien.
| Reagenz | Finale | Menge |
| Phosphatpuffer | 0,02 M | 90 ml |
| Histodenz | 133,3% w/v | 120 g |
| Natriumazid | 0,05% w/v | 45 mg |
| Fügen Sie 90 ml 0,02 M Phosphatpuffer zu 250 ml Glasmedienflasche in Aluminiumfolie eingewickelt. | ||
| Mit magnetischem Rühren in Reagenzien mischen. Lassen Sie Komponenten über Nacht auflösen. | ||
| Vortex-Lösung und Filter reinigen mit Filtersystem in eine sterile 250 ml Glasmedienflasche. | ||
| Flasche in Aluminiumfolie wickeln und Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. | ||
Tabelle 3: Refractive Index Matching Solution (RIMS).
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Discussion
Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Myozytenpopulationen sind ein entscheidender Faktor dafür, ob das Herz nach verletzungen fibrosis oder repariert wird. Es wurden Entdeckungen gemacht, die zeigen, dass eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Nerven14, Epikardialzellen24, Peritonealmakrophagen25, Arteriole12,13und lymphatische Endothelzellen26, alle eine wesentliche Rolle bei der Vermittlung von Herzreparatur spielen. Diese Zelllinien und andere von Interesse können genetisch während der Entwicklung, Krankheit und Regeneration durch die Anwendung von Cre-lox und CRISPR-Cas9-Technologien bei Mäusen zurückverfolgt werden. In Verbindung mit Organclearing und fortschrittlichen Mikroskopiemethoden können die Beiträge von Nicht-Myozytenpopulationen genau bewertet werden, was die Tür öffnet, um zelluläre und molekulare Ziele der Myokardregeneration nach Verletzungen aufzuklären.
Die Effizienz des Protokolls hängt von einer konsistenten und reproduzierbaren Ligation des LAD während der koronaren Arterienverschlusschirurgie ab. Neonatale Mäuse reagieren empfindlich auf eine längere Exposition gegenüber Unterkühlung; Daher muss die Operation nicht nur mit Genauigkeit, sondern auch innerhalb von Minuten durchgeführt werden. Von Anfang bis Ende sollte die Myokardinfarktoperation weniger als 8 Minuten dauern. Wir empfehlen, zuerst an mehreren Würfen mit dem gleichen Hintergrund wie die Versuchsmäuse zu üben, bis die Befähigung erreicht ist.
Progression der Herzreparatur kann mit Hilfe der Echokardiographie zur Messung der Herzfunktion (d. h. Bruchverkürzung, Auswurffraktion, systolisches und diastolisches Volumen) einmal innerhalb von 3 bis 7 Tagen nach der Operation und wieder kurz vor der Entnahme des Herzens beurteilt werden. , zwischen 21- und 28-Tage nach der Verletzung vorgeschlagen. Herzen können nach einer Myokardinfarktoperation an mehreren Zeitpunkten gesammelt werden.
Der Clearingschritt (Schritt 2.17) unterliegt je nach Alter und Belastung der Maus, von der das Herz geerntet wurde, unterschiedlichen Dauer, was zu Unterschieden in der Herzgröße führen kann. Bei einer B6-Hintergrundmaus wird die Clearingdauer basierend auf dem Alter wie folgt geschätzt: P1 (7-10 Tage), P7 (14-17 Tage), P14 (21-24 Tage), P21 (28-31 Tage), P28 (35-38 Tage). Obwohl der Hauptfokus unseres Labors auf der Herzreinigung liegt, war unsere passive CLARITY-Methode erfolgreich bei der Reinigung der Lungen von Mäusen (unveröffentlichte Ergebnisse) und wir sehen keine Begrenzung für die breite Anwendung auf andere Organe. Insgesamt wird unser beschleunigter Clearingprozess für die Fähigkeit, Gewebe schnell und effektiv zu löschen, hoch geschätzt.
Es sollte beachtet werden, dass Komplikationen bei der Anwendung von Gewebeclearing-Techniken in Organen mit endogenen Reportern in seltenen Subpopulationen auftreten können. Reportersignal in dichten Zellpopulationen (wie Myozyten23) scheinen resistenter gegen den Clearing-Prozess zu sein und daher wird das Signal in der Regel beibehalten; andere empfindlichere Zellpopulationen (z. B. Herznerven) neigen jedoch dazu, dass das endogene fluoreszierende Proteinsignal nach längerer Fixierung oder Clearing gelöscht wird. Dies wurde im Actl6bCredeutlich; Rosa26tdT Reporter Maus modell, wo P7-Herzen kurz für 15 Minuten fixiert zeigte starkes tdT-Signal (Abbildung 3A), aber dieses fluoreszierende Signal wurde nach Fixierung für 1 Stunde oder über Nacht Inkubation in der Clearing-Lösung (Daten nicht gezeigt) gelöscht. Im Szenario des verlorenen Reportersignals ist die Antikörperfärbung, die auf das Reporterprotein abzielt, mit der Gewebeklärung kompatibel, um das Signal zu verstärken (Abbildung 3). Die Zugabe eines Immunlabeling-Schritts kann für Gewebe, die einer umfangreichen Bildgebung unterzogen werden, von Vorteil sein, da konjugierte Antikörper bleichresistent sind und eine stabile Langzeitexpression erzeugen. Mit der Fähigkeit, Proteine endogen und durch Immunfärbung zu verfolgen, ermöglicht unser Protokoll eine präzise Lokalisierung seltener Herzzellpopulationen, die tief im Herzen leben.
Gelöschte Herzen können einer Linienverfolgung oder einer fluoreszierenden Proteinexpressionsanalyse mittels ganzer 3D-Konfokalmikroskopie unterzogen werden. Das konfokale Mikroskop ist mit Laserlinien ausgestattet, die optimiert sind, um floreszierende Reporter (oder konjugierte Sekundärantikörper) zu begeistern, z. B. B. B. B. B. BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) und APC (Cy5, Alexa Fluor 647) bei 405 nm, 488 nm, 561 nm bzw. 683 nm. Für Herzproben, die nicht in eine Depressionsrutsche passen – häufig, wenn das Herz postnatal geerntet wird – kann ein benutzerdefinierter Depressionsschlitten durch 3D-Druck auf Polypropylen hergestellt werden. Benutzerdefinierte Dias folgten den Abmessungen eines Mikroskop-Vertiefungsschlittens (25 mm x 75 mm x 1 mm), wobei die Brunnentiefe entweder auf 6,5 mm oder 17 mm variierte(Abbildung 4).
Um die Reporterzelllinien in 3D zu visualisieren, wird das konfokale Mikroskop so eingestellt, dass es z-gestapelte Bilder im ganzen Herzen erfasst. Bei der Abbildung größerer Herzen kann das gesamte Herz möglicherweise nicht in einem einzigen z-gestapelten Bild erfasst werden, selbst bei einem objektiven niedrigen Vergrößerungsziel. In diesem Szenario kann eine Reihe von mehreren z-gestapelten Bildern, die an verschiedenen Herzbereichen aufgenommen wurden, mit einer großen Bildfunktion zusammengenäht werden. Dies wird erreicht, indem das Mikroskop auf die entsprechende Objektivlinse kalibriert und das Feld für den großen Bildscanbereich angegeben wird. Anschließend werden z-gestapelte Bilder mit einem Lautstärke-Rendering-Programm und einer maximalen Intensitätsprojektion(Abbildung 3)in 3D-Rekonstruktion unterzogen. Die aufgenommenen hochauflösenden Bilder können analysiert werden, um die genaue 3D-Raumzellmusterung von Zielzellpopulationen zu bestimmen.
Zusammen stellt dieses Protokoll ein leistungsfähiges molekulares Werkzeug bereit, um die dynamischen zellulären Veränderungen zu verstehen, die während der Herzreparatur und -regeneration auftreten. Diese Methode beschreibt die Schritte, um einen Myokardinfarkt zu induzieren, das gesamte Organclearing durchzuführen, zellspezifische Populationen zu verfolgen und die 3D-Zellmusterung zu analysieren. Zusammen bieten diese Techniken Zugang zu Spurenzellenpopulationen, die zuvor aufgrund ihrer geringen Präsenz oder Position im Gewebe nicht zugänglich waren. Dies wird eine weitere Untersuchung von Fragen ermöglichen, die für die Weiterentwicklung therapeutischer Ansätze in der regenerativen Medizin von größter Bedeutung sind, insbesondere solche, die auf die Stimulierung der endogenen Herzregeneration abzielen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der UW School of Medicine and Public Health aus dem Wisconsin Partnership Program (A.I.M.) und einem American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.) bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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