Summary
התפשטות הקרדיוציט לאחר הפציעה היא תהליך דינאמי הדורש סימפוניה של רמזים בלתי-מיכיים מאוכלוסיות תאים שאינן מיוציט. ניצול מעקב אחר השושלת, בהירות פסיבית, ושלושה מימדים שלמים של מיקרוסקופ ההרכבה טכניקות, אנחנו יכולים לנתח את ההשפעה של מגוון סוגי תאים על תיקון לב והתחדשות.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הבטן כל סיבות אחרות של המוות והוא אחראי על 31% מדהים של מורטליקצבאות ברחבי העולם. מחלה זו מתבטאת בפגיעה בלב, בעיקר בצורה של אוטם שריר הלב חריפה. עם מעט חוסן לאחר הפציעה, רקמת לב בריאה פעם יוחלפו על ידי סיבי, לא הקונקטילה צלקת רקמה ולעתים קרובות להיות הקדמה אי ספיקת לב. כדי לזהות אפשרויות טיפול הרומן ברפואה רגנרטיבית, המחקר התמקד בחוליות עם יכולות משובי מולדת. אחד כזה אורגניזם מודל הוא עכבר ה, אשר מגיב לפציעה לב עם התחדשות חזקה שריר הלב. כדי לגרום לפציעה בעכבר ה, כי הוא רלוונטי קלינית, פיתחנו ניתוח כדי לסגר את העורק הקדמי שמאל בירידה (LAD), שיקוף אוטם שריר הלב המופעל על ידי טרשת עורקים בלב האנושי. מודל זה מספק לנו פלטפורמה לזיהוי המנגנונים המנחים את התחדשות הלב באמצעות הטכנולוגיה למעקב אחר שינויים בתוך האוכלוסיות האנטי-מיוציטים והלא-מיציט. קבלת תובנה על שינויים באוכלוסיות של תאי לב לאחר הפציעה הסתמך פעם בכבדות על שיטות כגון הבחנה רקמות הבדיקה היסטולוגית, אשר מוגבלים ניתוח דו מימדי ולעיתים קרובות נזק הרקמה בתהליך. יתר על כן, שיטות אלה חסרות את היכולת לעקוב אחר שינויים בתאי התאים, במקום זאת מספקת רק תמונה של תגובת הפציעה. כאן, אנו מתארים כיצד שיטות מתקדמות מבחינה טכנולוגית במודלים לאיתור השושלת, ניקוי איברים שלם ותלת מימדי (3D) המיקרוסקופיה מלאה יכול לשמש כדי להבהיר מנגנונים של תיקון לב. עם הפרוטוקול שלנו לניתוח אוטם שריר הלב של העכבר, ניקוי רקמות, 3D איברים שלמים הדמיה, מסלולים מורכבים לגרום להתפשטות הקרדיוציט יכול להיות מורכב, חשיפת מטרות טיפוליות הרומן להתחדשות הלב.
Introduction
הלב כבר זמן רב נחשב להיות עוגב פוסט-mitotic, אך הראיות האחרונות מראות כי התחדשות הקרדיוציט מתרחשת בלב האנושי המבוגר בערך 1% לשנה1. עם זאת, אלה שיעורי נמוך של מחזור קרדיומיקוציט אינם מספיקים כדי לחדש את אובדן מסיבי של רקמות המתרחשת לאחר הפציעה. לב שסבל אוטם שריר הלב יאבדו סביב 1,000,000,000 קרדיוציטים, לעתים קרובות משמש כהקדמה לכישלון הלב ומוות לב פתאומי2,3. עם מעל 26,000,000 אנשים מושפעים אי ספיקת לב ברחבי העולם, יש צורך בלתי מתקיים עבור therapeutics שיכול להפוך את הנזקים שנגרמו על ידי מחלת לב4.
על מנת לגשר על פער זה בtherapeutics, החלו מדענים לחקור מנגנונים שאינם מנוצלים ושמרו על התחדשות האנדודוגני בעקבות הפציעה. מודל אחד ללימוד התחדשות לב היונקים הוא עכבר ה, הנמצא בתנועה. בתוך שבוע לאחר הלידה, עכברים בעלי הילודה יש תגובה משובי חזקה בעקבות נזק לב5. בעבר הדגמנו כי עכברים בעלי שם מסוגלים לחדש את הלב באמצעות התפשטות הקרדיוציט בעקבות כריתת הקודקוד5. למרות שטכניקה זו יכולה לעורר התחדשות לב בneonates, הניתוח חסר רלוונטיות קלינית לפציעות לב אנוש. כדי לחקות פציעה אנושית במודל העכבר של התינוק, פיתחנו טכניקה כדי לגרום אוטם שריר הלב דרך עורק כלילי הסגר6. טכניקה זו דורשת הארכה כירורגית של העורק האחורי השמאלי הקדמי (בחור), אשר אחראי על אספקת 40%-50% של הדם אל שריר הלב השמאלי בשריר המוח6,7. כך, הניתוח מביא לסיכונים ההשפעות על חלק ניכר מהחומה השמאלית החדרית. הנזק הזה לשריר הלב יעורר את התפשטות הקרדיוציט ואת התחדשות הלב בneonates5.
בעורק העורק הכלילי מספק שיטה מאוד מיועלת וישירה לחשוף את פעולתו הפנימית של התחדשות הלב. הניתוח המנותח מקבילה טרשת עורקים עורק כלילי בלב האדם, שבו הצטברות של הפלאק בתוך הקירות הפנימיים של העורקים יכול לגרום לחסימה ואת אוטם שריר הלב הבאים8. בשל חוסר בטיפולים טיפוליים לחולי אי ספיקת לב, חסימה בנער קשורה לשיעורי התמותה המגיעים עד 26% בתוך שנה לאחר פציעה9, וכתוצאה מכך נקרא "האלמנה maker". פיתוחים בtherapeutics דורשים מודל המשקף במדויק את ההשפעות הפיסיולוגיים והפתולוגיים המורכבים של פגיעה בליבו. הפרוטוקול הכירורגי שלנו לפגיעה בליבם של העכברים מספק פלטפורמה המאפשרת לחוקרים לחקור את הרמזים המולקולריים והסלולריים המספקים התחדשות לב היונקים לאחר הפציעה.
מחקר שנערך לאחרונה מדגיש את הקשר הדינמי בין סביבת החילוץ לבין הקרדיוומיציטים מתרבים. לדוגמה, חלון התחדשות לידה ניתן להאריך על ידי הפחתת הנוקשות של מטריצה החילוץ סביב הלב10. ביואטיריאלס מהמטריקס המגמיותיים יכולים גם לקדם התחדשות לב בלבבות יונקים למבוגרים לאחר פגיעה בלב11. גם ליווי התפשטות הקרדיוציט היא תגובה לאנגיוגנטית12,13; היווצרות עורק הסביבתי ייחודי ליבה מתחדשות של עכבר ה, היתה הכרחית לעירור התחדשות הלב12. יתר על כן, המעבדה שלנו הוכיחה כי מווסת את הפצת הקרדיוציט ואת התחדשות הלב באמצעות אפנון של רמות גורם הצמיחה, כמו גם את התגובה הדלקתית בעקבות פציעה14. ממצאים אלה מדגישים את הצורך לעקוב אחר אוכלוסיות תאים שאינן מיציט בתגובה לפציעה בלב. כדי להשיג מטרה זו, אנו יש לנו לנצל את המערכת שילוב מחדש של היצור-לקס בשורות עכברים טרנסגניים לשלב הביטוי הקונסטיטוטיבי או מותנה של כתבת הפלורסנט חלבונים עבור מעקב השושלת. יתר על כן, אנו יכולים להשתמש בשיטות מתקדמות כדי לקבוע התרחבות התפשטות שבטים עם קו העכבר קשת, אשר מסתמך על ביטוי סטוכסטי של כתבים תלויי-צבע התלויים, רב צבעים כדי לקבוע את התפשטות המשובטים של אוכלוסיות ממוקדות תאים15. העסקת מעקב אחר השושלת עם הניתוח הכלילי של הדום העורקים הוא כלי רב עוצמה לנתח את המנגנונים הסלולריים המורכבות של התחדשות הלב.
מעקב אחר שושלת היוחסין של תאים בעלי תווית של שלושה מימדים (3D) הדמיה של איבר שלם קשה להשיג באמצעות הציבור המסורתי וטכניקת שחזור – במיוחד כאשר אוכלוסיות תאים הם שבירים, כגון סיבי עצב או כלי דם. בעוד הדמיה מלאה הדמיית העוגב על ידי הדגשות אופטיות יכולות ללכוד אוכלוסיות תאים שטחיות, מבנים השוכנים עמוק בתוך הרקמה נותרים בלתי נגישים. כדי לעקוף מחסומים אלה, טכניקות ניקוי רקמות פותחו כדי להפחית את האטימות של רקמות איברים שלם. לאחרונה, מקדמות משמעותיות נעשו לנקות השומנים-החליפו אקרילאמיד-הוכלא קשיח הדמיה תואם רקמות הידרוג'ל (בהירות)-שיטות מבוססות, אשר רקמה קבועה ברורה באמצעות הפקת ליפיד16. צעדים נלקחים גם כדי המגון את המדד השבירה ולאחר מכן להפחית פיזור אור בזמן הדמיה17. שיטה אחת כזאת היא בהירות פעילה, אשר מזירוז פירוק השומנים באמצעות אלקטרופורזה לחדור את אבקת הניקוי לאורך הרקמה18. למרות יעיל, זה ניקוי רקמות שיטה דורשת ציוד יקר יכול לגרום נזק לרקמות, מה שהופך את הגישה לא תואם אוכלוסיות תאים שברירי כגון עצבי הלב19. לפיכך, אנו מעסיקים את הגישה בהירות פסיבית, אשר נשענת על חום כדי להקל בעדינות על חדירת חומרי ניקוי, ולכן לסייע בשמירה של מבני תאים מסובכים20,21.
בהירות פסיבית היא בדרך כלל נחשב פחות יעיל מאשר בהירות פעילה18, כמו הטכניקה מלווה לעתים קרובות על ידי שני מכשולים עיקריים: חוסר היכולת לנקות את עומק האיבר כולו ואת כמות נרחבת של זמן הנדרש כדי לנקות רקמות מבוגרים. הגישה הפסיבית שלנו בהירות גוברת על שני המחסומים הללו עם תהליך ניקוי מהיר שמסוגל לנקות במלואו את החול ואת רקמת הלב מבוגרים. טכניקת הניקוי הפסיבי של רקמת הבהירות הגיעה ליעילות המאפשרת הדמיה של מגוון אוכלוסיות של תאי לב, כולל אוכלוסיות נדירות המופצות ברחבי הלב המבוגר. כאשר הלב הנקי הוא התמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי, את הארכיטקטורה של המבנה הספציפי לתא במהלך פיתוח, מחלה, והתחדשות יכול להיות מואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לשימוש ולטיפול בבעלי חיים מעבדתיים ובציות לועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית הספר לרפואה ובריאות הציבור באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. כל השיטות נערכו על סוג פראי C57BL/6J (B6) וקווי העכבר הטרנסגניים שהתקבלו ממעבדות ג'קסון.
1. סגר עורק כלילי (אוטם שריר הלב) הנגרמת באמצעות הארכה של העורק הקדמי שמאלי (LAD) ב-1-יום עכברים של המלך הישן6
- הפרד את גורי התינוק בן היום מהאמא על ידי הצבת אותם לכלוב נקי יחד עם החומר הקינון המקורי.
- מניחים חצי כלוב על כרית חימום שנקבעה לחום בינוני. הגורים צריכים להישאר בצד הבלתי מחומם של הכלוב, רק להיות ממוקם על הצד המחומם לאחר הניתוח.
- צור אזור כירורגי סטרילי תחת מיקרוסקופ הפעלה. איסוף ציוד כירורגי מעוקר (שולחן 1).
- הגור הכלבלב באמצעות היפותרמיה: לעטוף את הגור בגזה כדי למנוע מגע ישיר בעור עם קרח ולקבור אותו במיטת קרח בערך 3 – 4 דקות. בדוק היפותרמיה של העכברים מדי פעם על ידי ביצוע צביטה בבוהן. Neonates לסבול היפותרמיה היטב, עם זאת, חשיפה ממושכת להיפותרמיה עלולה לגרום לכוויות קור ולתמותה שלאחר מכן.
- פעם מורדם, למקם את העכבר על האזור כירורגי במצב פרקדן, אבטחת הזרועות והרגליים עם קלטת. לחטא את האזור הכירורגי של העכבר עם פתרון אנטיספטי.
- לאתר את אזור החזה התחתון ולעשות חתך רוחבי בעור עם המספריים מבתר קטן. כדי להרחיב את ההשקפה כירורגית של הצלעות, להפריד את העור מן השריר על ידי הרמת העור בעדינות עם זוג מלקחיים ההלבשה ולחץ בעדינות על השרירים הבינקוסטל עם מספריים קטנים במצב סגור.
- אתר את החלל הבינקוסטל הרביעי (איור 1א) והפוך לנקב קטן ושטחי בעזרת מלקחיים חדים, והיזהר שלא לנקב איברים פנימיים. בצע ניתוח קהה על ידי הרחבת האזור בין השרירים הבינקורבית עם מלקחיים ההלבשה. המיקום האנטומי הנכון של החתך חיוני לגישה המתאימה ללב.
- בעדינות להנחות את הלב מתוך חלל החזה על ידי הצבת אצבע והפעלת לחץ הולך וגובר בצד שמאל של הבטן תוך החזקת החלל האינטרקוסטל פתוח עם מלקחיים ההלבשה (איור 1B). לאחר הלב הוא מחוץ לחזה, להסיר את מלקחיים ההלבשה, להקל על הלחץ, ולאפשר ללב לנוח על השרירים הבינקוסטל.
- אתר את הנער כאזור הלב כי יש פחות דם במאגר והוא בתנוחה האנטומית הנכונה (איור 1ג). הנער ניתן לראות רק מתחת למיקרוסקופ אם הגישה ללב בתוך כמה דקות של התחלת הניתוח.
- ביצוע הקשר lad על ידי תפירה הנער עם תפר 6-0 (איור 1D). לקשור קשר מרובע פעמיים כדי לגרום אוטם שריר הלב (איור 1E). העומק של תפר לתוך שריר הלב עשוי להשתנות, עם זאת, מיקום אנטומי נאות של ליטל בחור הוא חיוני לצורך התוכסות. כאשר ליגפת הנער, יש למשוך את התפר בחוזקה אך בזהירות כדי לא לנתק את הנער. החולצ'ינג בקודקוד הלב יראו מיד (איור 1E)
- הניחו ללב להחליק בחזרה לחלל החזה; תהליך זה ניתן להקל בעדינות עם מלקחיים ההלבשה. תפר את הצלעות יחד עם הקשר של מנתח ואחריו קשר מרובע, באמצעות מלקחיים קהה להרים את הסט העליון של צלעות תוך העברת תפר 6-0 דרך החלק העליון והתחתון של צלעות.
- הסר את הקלטת ששימש לאבטחת הרגליים האחוריות של הכלבלב.
- לדבוק את העור יחד על ידי הצבת כמות קטנה של דבק העור על הבטן העליונה. ואז, לתפוס את העור של הבטן התחתונה עם מלקחיים עדינים לכסות את אזור החזה חשוף. הגבל את כמות הדבק העודף שנשאר על הגורים, משום שזה יכול להגביר את הסבירות לדחייה ולקניבליזם על ידי האם.
- מיד להקל על ההתאוששות מן ההרדמה על ידי הצבת הגור על כרית חימום להגדיר חום בינוני. מדי פעם מחליפים את מיקום הneonates כדי לחמם את כל חלקי הגוף באופן שווה.
- אפשר neonate להישאר ישירות על משטח החימום עבור 10 – 15 דקות. בדרך כלל, התנועה היא חזרה בתוך 5 דקות של להיות ממוקם על החום.
- נקו את שרידי הדם והדבק בעזרת מחיקת אלכוהול.
- כיסו ריחות זרים על neonates על ידי לשפשף את כל הגוף עם מצעים מהכלוב המקורי. מניחים את הגור לתוך הכלוב בצד המחומם בעוד ניתוחים אחרים מתבצעים.
- לאחר כל הניתוחים הושלמו, גורי הם חמים וניידים, להעביר את הפסולת יחד עם החומר הקינון המקורי לכלוב של האם.
- לעקוב אחר העכברים עבור 30-60 דקות לאחר הניתוח ולצפות הקבלה של האם של הגורים על ידי קינון ו/או לטפח.
- בדקו את העכברים. בבוקר שאחרי הניתוח אם אמא במצוקה ולא מקוננת גורים, שקול אם מאמצת לגורים.
2. ניקוי לב העכבר עם בהירות פסיבית21,22,23
- . לדבר עם העכבר בעזרת מלגלית לבצע צביטה הבוהן כדי להבטיח את העכבר הוא הרגעה לחלוטין.
- מניחים את העכבר על האזור נקי, כירורגי במצב פרקדן, אבטחת הזרועות והרגליים עם קלטת.
- לשמור על הרגעה על העכבר באמצעות חרוט האף עד שהלב מופק.
- פתח את החזה התחתון על ידי החזקת הפרווה ממש מתחת לתהליך xiphoid עם מלקחיים רקמות ולעשות חתך מבעד לרוחב של הצלעות באמצעות מספריים לבתר גדול.
- חותכים לצד החלק המרוחק של. כלוב הצלעות עם מספריים כירורגיים
- לחשוף את שריר הסרעפת על ידי האוחז התהליך xiphoid עם מלקחיים רקמות. ניתוק הסרעפת באמצעות מלקחיים מעוקלים.
- תוך שמירה על התפיסה של תהליך xiphoid, למשוך את גולגולת הרקמה עד הלב הפועם נגיש.
- לתפוס את הלב בבסיס עם מלקחיים מעוקל ולנתח את הלב מחלל החזה על ידי חיתוך העורקים והבנה העליון מעולה עם מספריים iridectomy.
- בעוד הלב עדיין פועם, הניחו את הלב לתוך צלחת פטרי מלאה בערוץ ה-PBS כך שהלב מונע את הדם בפנים כפי שהוא ממשיך לפעום. אוטם שריר הלב יכול להיות מאושר על ידי בדיקה כי המיקום של תפר הוא בתנוחה האנטומית הנכונה עבור ליטל בחור.
- לסחוט בעדינות את הלב עם מלקחיים כדי לאפשר ללב לגרש את שרידי הדם.
- העבר את לב העכבר לתוך בקבוקון חד פעמי 2.5 מ"ל זכוכית עם 2 מ ל של PBS. לשטוף את הדם שיורית על ידי הדגירה של הלב על שייקר עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) מספר פעמים. שינוי פתרון ה-PBS בכל פעם. עד שערוץ הpbs יישאר נקי
- להיפטר PBS ולמלא את המבחנה עם 2 מ ל קר 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית). דגירה 4 שעות ב RT (איור 2א).
- לאחר הדגירה, למחוק את התחתית ואת המבחנה עם 2 מ ל של PBS. לשטוף את הלב על שייקר במשך 10 דקות ב RT. חזור על צעד הכביסה פעמיים, ניקוז ומילוי המבחנה עם PBS חדש בכל פעם כדי לשטוף לחלוטין את החצי השני של החצי השני.
- להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל של 4% אקרילide ו 0.5% VA-044 פתרון. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
- למחרת, לבצע פולימוניזציה על ידי העברת המבחנה לבלוק חום להגדיר ב 37 ° c עבור 3 שעות.
- להעביר את הלב לתוך בקבוקון מעטפת זכוכית חדשה וחזור על שלב 2.12 (מחזור כביסה PBS).
- להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל ניקוי פתרון (שולחן 2). מודטה ב 37 ° c עד שהלב נקי. לשנות את הפתרון ומילוי מחדש עם פתרון ניקוי טרי מדי 2 – 3 ימים. תהליך הסליקה יכול להימשך עד מספר שבועות (איור 2ב-ג).
הערה: לבבות P1 בדרך כלל לקחת סביב 3 – 5 ימים, בעוד P21 לבבות יכולים לקחת כמעט חודש לפני סליקה הדגירה הפתרון הושלמה. - להיפטר PBS ולמלא את הבקבוקון עם 2 מ ל של PBS ולחזור על שלב 2.12 (מחזור כביסה PBS). למלא את המבחנה עם PBS טרי ו הדגירה לילה ב 37 ° c.
- אם יבוצע כתמים, דלג על שלבים 2.21 – 2.22 והמשך לסעיף 3 עבור כתמים חיסוני. אם להסתמך אך ורק על הזריחה אנדודוגני, להמשיך עם צעדים 2.21 – 2.22 ולדלג על סעיף 3.
- להיפטר PBS ולשנות את הפתרון להתאמה התאמת אינדקס פתרון (החישוקים) (שולחן 3). המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
- לאחר הדגירה, הרקמה הנקיה ניתן לאחסן בתמיסה המכון ב RT. הרקמה עשויה להיראות לבן ואטום במרכז כאשר הועברו לראשונה לתוך החישוקים; רקמות צריך להיות שקוף לאחר הדגירה ב החישוקים בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות (איור 2ד).
3. אופציונלי: מכתים אימונוהיסטוכימיה של הלב המלא של הר העכבר
- הסר את הלב הנקי מהפתרון המכון והמקום לתוך בקבוקון זכוכית נקי 2.5 mL עם 2 מ ל של PBST (PBS עם 0.1% טריטון-X 100)
- לשטוף את הלב ב PBST 3 פעמים על מסובבי מסלולית עם 30 דקות incubations ב RT.
- בלוק כריכת נוגדנים לא ספציפית על ידי העברת הלב ב 2 מ ל של 20% חסימת מאגר (מדולל ב-PBST) ו דגירה עם סיבוב עבור 3 שעות ב RT. העברה עד 4 ° צ' כדי לכתם עם סיבוב לילה.
הערה: חסימת המאגר עשויה מנסיוב רגיל התואם את המינים בהם הועלה הנוגדן המשני. - לשטוף את הלב ב PBST 3 פעמים עם סיבוב עבור 5 דקות incubations ב RT.
- לטבול את הלב של הנוגדן העיקרי (מדולל ב 2% חסימת מאגר עם PBST) ולמנוע חשיפה באור על ידי גלישת בקבוקון זכוכית רדיד אלומיניום. דגירה עם סיבוב לילה ב RT.
הערה: מנקודה זו קדימה, רדיד אלומיניום צריך להיות משמש ללא הרף כדי להגן על המשני מפני חשיפה לאור סביבתי. - המשך 24 שעות נוספות עם סיבוב ב-4 ° c.
- בעקבות כתמים ראשוניים, חזור על שלב 3.2 (מחזור לשטוף PBST ארוך) כדי להסיר את הנוגדן העיקרי מפני הרקמה. להאריך את השטיפה עם הדגירה לילה עם סיבוב ב RT.
- עבודה באזור עם תאורה מוגבלת כדי למנוע חשיפה משנית האור, לטבול את הלב בנוגדן משני (מדולל ב 2% חסימת מאגר עם PBST) ו דגירה עם סיבוב עבור 3 שעות ב RT. העברה עד 4 ° צ' כדי לכתם עם סיבוב לילה.
- ביום למחרת, חזור על שלב 3.2 (מחזור PBST לשטוף הארוך) כדי להסיר נוגדן משני לא מאוגד.
- החלף את הפתרון עם מאגר חסימה של 2% (מדולל ב-PBST). להסיר נוגדנים מאוגד שיורית על ידי שטיפת לילה עם סיבוב ב RT.
- ביום שלמחרת, בדוק כי הנוגדן המשני העודף הוסר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית. הארך את הכביסה בהתאם לצורך, והחליף את פתרון המאגר של 2% מדי יום. המשך פעם קטנה ללא משנית שאינה מסוימת קיימת.
- יש לאחסן את הלב החיסוני ב-PBS ב-4 ° c.
- ישירות לפני המיקרוסקופיה מלאה, מודיית את הלב בפתרון המכון ללילה ב 37 ° c. להאריך את הדגירה 24 שעות נוספות אם הרקמה עדיין לא מנוקה לחלוטין.
- אחסן את הניקוי המלא ואת לב חיסוני ב החישוקים ב RT.
4. המחשה של אוכלוסיות שאינן מיציט ב-3D עם הדמיה חד-פוטון Confocal יקרוסקופית מיקרוסקופיה של לב העכבר הנקי
הערה: אם לבבות העכבר הם קצרו embryonically, להמשיך עם סעיף 4.1. עבור לבבות עכבר שנקטפו postnatally, להמשיך עם סעיף 4.2.
- הדמיה הלב עובריים מנוקה העכבר
- מלא את השקע המיקרוסקופ באמצעות פתרון ה-PBS.
- בזהירות להרים את הלב נקי עם מלקחיים מעוקל ולמקם את הרקמה על השקופית.
- הר את השקופית עם שמיכות זכוכית. הרקמה יכולה להיות מיועלת כעת. תחת מיקרוסקופ קונמוקד
- הדמיה של לב העכבר פוסטנטאל מנוקה
- מלא את מחצית החדר של שקופית הדיכאון עם פתרון PBS. על מנת ליצור חדר גדול מספיק כדי להתאים לב עכבר למבוגרים, שקופית דיכאון מודפס 3D-פוליפרופילן היה מותאם אישית (איור 4).
- בזהירות להרים את הלב נקי עם מלקחיים מעוקל ולמקם את הרקמה לתוך החדר. מלא את הנפח הנותר של התא עם PBS.
- מלאו את החדר עם PBS כך שהמשטח של הנוזל מהווה כיפה מעל החלק העליון של החדר. הבהר את שקופית הכיסוי. הרקמה יכולה להיות מיועלת כעת. תחת מיקרוסקופ ממוקד זקוף
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לעתים קרובות שני הצעדים המאתגרים ביותר מנחה את הלב מתוך חלל החזה ליגגאת LAD. כדי לפתור את הפעולות הבאות, ניתן לבצע התאמות במיקום הניקוב הראשוני בין השרירים הבין-מפרידים הרביעית; אם הניקוב והניתוח הקהה קרובים מדי בסמיכות לעצם החזה, ייתכן שהלב לא יוכל לצאת מחלל החזה (איור 1א).
בנוסף, ייתכן שיהיה צורך בלחץ מוגבר על הבטן השמאלית כדי להקל על תהליך זה (איור 1ב). סיבוכים עלולים להתרחש גם כאשר מנוחה הלב על השרירים הבינקוסטל. מצאנו את הלב יישאר מחוץ לחלל מבלי לסגת כאשר הניתוח הקהה יישמר בגודל מינימלי ויבוצע בעיקר בכיוון האופקי. התמצאות זו מאפשרת גם הדמיה ברורה ונגישות לנער (איור 1ג).
כאשר ממקמים את המחט תפר מאחורי הנער, הוא הציע לחדור עמוק לתוך הקיר הקדמי של החדר השמאלי, כמו הארכה שטחית יש פחות מקום להתאמה במיקום תפר הסופי (איור 1ד). יש לבצע את התפר סביב הנער בתנועות מבוקרות ויציבות, שכן הנער הוא שברירי וניתוק עורק כלילי זה והקיר הקדמי יגרום לתמותה (איור 1E). בתוך 5 – 10 דקות לאחר הניתוח הושלמה, neonate צריך להיות תוסס ונושם כרגיל.
כאשר ממשיכים לפרוטוקול בהירות פסיבית, לבבות שנקטפו מקו העכבר המשלב כתבת פלורסנט אנדוגניים למעקב השושלת של התא צריך להיות מוגן מפני אור (איור 2), אשר יכול להתבצע על ידי גלישת בקבוקון זכוכית רדיד אלומיניום. במהלך הניקוי, הזמן הדגירה של פתרון סליקה הוא משתנה בהתאם לגיל העכבר כאשר הלב נקצרו. שלב זה מושלם כאשר הרקמה כולה אטומה בעקביות, ללא שינוי צבע במרכז (איור 2ב-C). הלבבות יהפכו לשקופים יותר ויותר לאחר האחסון בתמיסה של המכון בטמפרטורת החדר במשך כמה ימים (איור 2ד). יצוין כי הרחבת רקמות עלולה להתרחש במהלך תהליך הניקוי.
פרוטוקול בהירות פסיבית שלנו מאפשרת חדירת נוגדן יעיל ולכן תואם עם שיטות אימונוהיסטוכימיה לתייג חלבון (ים) של עניין. זה היה מאומת ב Actl6bהיצורים; Rosa26Tdt העכברים הטרנסגניים, אשר מתייג נוירונים בוגרים עם חלבון העיתונאי Tdעגבניה (tdt). עצבי הלב הם בעיקר שטחיים, עם כמה אוכלוסיות המתגוררים בשכבת האפילדיאל, ולכן השתמשנו באוכלוסיית תאים זו כמודל הוכחה של העיקרי של אות כתבת אנדוגני (איור 3א), כמו גם שימור של היווצרות חלבון הכתב לפני ואחרי בהירות (איור 3B-C). הנציג שלנו נובעמActl6b. עכברים Rosa26tdt להראות כי האותות האנדוגניים tdt החלבון לראות את העצבים של לב P7 לא מנוקה היה בנאמנות לאחר לכידה בעצבים של שניהם בלתי מנוקה ונוקו tdt immunolabeled P7 לבבות (איור 3). כדי immunolabel tdT-חיוביים, חלבון פלורסנט אדום (RFP) הנוגדן הראשוני (הארנב polyclonal בטים; 1:200 דילול; ב#600 רוקלנד-401-379) נעשה שימוש יחד עם מיכל הנוגדנים המשני של 488 אלכסה (שבטים עזים; 1:1000 דילול; #A המוזמן-11008). כדי להמחיש את הלב הנקי על ידי עין במהלך הצביעת ושלבי ההדמיה, פנס אולטרה סגול ניתן להשתמש לזמן קצר כדי להאיר את הלב.
איור 1: אינדוקציה של אוטם שריר הלב בעכבר הכלילי באמצעות אוטם עורק כלילית של העורק הקדמי שמאלי (LAD). (א) המרחב הבין-דתי הרביעי, המצוין על-ידי כוכבית אחת (*), ממוקם ומבוצע ניתוח קהה. (ב) לחץ מוחל על הבטן השמאלית כדי להנחות את הלב מתוך חלל החזה. (ג) הנער, מסומן על ידי כוכבית כפולה (* *), מזוהה כעורק השולט על ידי מיקום אנטומי. (ד, ה) תפר מועבר ואז מאחורי הנער וקשר מרובע קשורה סביב הנער כדי לגרום לחסימה עורק כלילי והבאים סיכונים. (E) פעם הושלמה, החולצ'ינג ניתן לראות מתחת תפר, בקודקוד הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההתקדמות של שיטת בהירות פסיבית על לב עכבר P14. לבבות נקצרו מעכברים P14, (א) קבועים, ו (ב-ד) עברו את פרוטוקול הבהירות הפסיבית. עבור לבבות שנלקחו בP14 timepoint, ניקוי הפתרון הדגירה הוא (ב) לא הושלמה כאשר שינוי צבע במרכז הלב הוא לעין, ראה לאחר 6 ימים, ו (ג) להשלים כאשר הלב מופיע שווה אטום, ראה לאחר 10 ימים. (ד) לאחר שהלב מאוחסן בחישוקים, הרקמה מנוקה לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שלמות הר הדמיה 3D של לבבות P7 העכבר עם מיקרוסקופ Confocal וקד. נציג שלמות-הר תמונות 3D מ P7 Actl6bהיצורים; Rosa26Tdt לבבות טרנסגניים מוצגים כתחזיות אינטנסיביות מקסימלית של תמונות מוערמות z. לבבות היו מאותמים כדי להראות (A) אנדוגני tdTomato (tdt) פלואורסצנטית ישירות לאחר קציר (אדום) (ב) חיסוני של tdt-חיוביים עצבים בליבו לא נקי (אלקסה fluor 488; ירוק) ו (ג) הנוזקות החיסונית של העצבים Tdt-חיוביים בלב נקי (אלקסה fluor 488; ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4:3D מודפס שקופיות הדיכאון פוליפרופילן. לתמונה דגימות לב פוסט לידה, דיכאון מותאם אישית שקופיות היו 3D הודפס על פוליפרופילן. מידות השקופית הם 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ, עם דיכאון השקופית היטב 13 מ"מ קוטר ו (a) 6.5 mm או (ב) 17 מ"מ לעומק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סוג ציוד | תיאור/ | חברה | מספר קטלוגי |
| בקבוקון זכוכית | 12 x בקבוקון 35 מ מ עם כובע | דייג | 03-339-26A |
| 6-0 פרולן תפרים | תפר פוליפרופילן | אתקון | 8889H |
| שארפ מלקחיים | עצה טובה, ישר, 4.25 ב | סיגמא-אדריץ ' | Z168777 |
| מלקחיים להלבשה | מבתר, 4.5 ב | דייג | 13-812-39 |
| מחט מחזיק | מאיו-חגאר, בן 6 ב | דייג | 08-966 |
| מספריים קטנים | 50 מ"מ מקצה חיתוך | וולטר שטרן בע מ | 25870-002 |
| מלקחיים רקמה | רקמה בינונית, שיניים של 1X2 | מיכל בלטה | 16050133 |
| מספריים גדולים | ישר, 6 ב | דייג | 08-951-20 |
| Iridectomy מספריים | מקצה חיתוך 2 מ"מ | פיין מדעי כלים | 15000-03 |
| מלקחיים מעוקלים | חצי מעוקל, משונן, 4 ב | מיכל בלטה | 16-050-146 |
שולחן 1: ציוד כירורגי.
| פינוי פתרונות | |||
| ריאגנט | סופי | כמות | ערות |
| נתרן Dodecyl סולפט (SDS) | 8.0% w/v | 40 גרם | |
| חומצה בורית | 1.25% w/v | 6.25 גרם | |
| 1-תייוגלינול | 0.5% w/v | 5 μL/mL | נוסף לפי הצורך בפתרון |
| הוסף 400 מ ל של אלקטרופורזה H20 לגביע L 1. מערבבים ב SDS ו חומצה Boric עם ערבוב מגנטי. | |||
| התאם את ה-pH ל 8.5 באמצעות 6M NaOH. הביאו נפח ל 500 מ"ל ו-האוטוקלב. | |||
| . הפתרון לחנות בטמפרטורת החדר | |||
| ריאגנטים בהירות אחרים | |||
| ריאגנט | סופי | לאי | ערות |
| כדורגלן | 4.0% | 16 | מדולל ב-PBS |
| אקרילאמיד | 4.0% | 40% | מדולל ב-PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10 | נוסף לפי הצורך בפתרון |
שולחן 2: ניקוי הפתרון וריאגנטים בהירות אחרים.
| ריאגנט | סופי | כמות |
| מאגר פוספט | 0.02 מ ' | 90 מ ל |
| היסטדזי | 133.3% w/v | 120 גרם |
| נתרן עזידה | 0.05% w/v | 45 מ ג |
| הוסף 90 mL של 0.02 M פוספט מאגר ל 250 mL מדיה זכוכית בקבוק עטוף רדיד אלומיניום. | ||
| מערבבים ריאגנטים המפורטים עם ערבוב מגנטי. אפשר לרכיבים להתמוסס בין לילה. | ||
| מערבולת פתרון ומסננים לטהר עם מערכת סינון לתוך סטרילי 250 mL מדיה זכוכית בקבוק. | ||
| לעטוף את הבקבוק ברדיד אלומיניום ולאחסן פתרון בטמפרטורת החדר. | ||
שולחן 3: התאמת המדד התאמה פתרון (החישוקים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינטראקציות תא תא בין האוכלוסייה הקרדיוציטים לבין אוכלוסיות שאינן מיוציט הן גורם הקובע אם הלב יעבור פיברוזיס או יתקן לאחר הפציעה. תגליות נעשו להפגין כי מגוון של סוגי תאים, כולל עצבים14, תאים אפירחיוג24, מקרופאגים הצפק25, העורקי העורקים12,13, ותאים אנדותל הלימפה26, כל לשחק תפקיד חיוני בתיקון לב תיווך. לתאי תאים אלה ואחרים של עניין ניתן לעקוב גנטית במהלך פיתוח, מחלה, והתחדשות על ידי החלת היצור-לקס ו CRISPR-Cas9 טכנולוגיות בעכברים. בשילוב עם ניקוי איברים ושיטות מיקרוסקופ מתקדמות, התרומות של אוכלוסיות לא-מיציט יכולות להיות מוערך באופן מדויק, פתיחת הדלת כדי להבהיר מטרות סלולריות ומולקולריות של התחדשות שריר הלב לאחר הפציעה.
היעילות של הפרוטוקול תלויה בהארכה עקבית ושלילית של הנער במהלך ניתוח הסגר עורק כלילי. עכברים בעלי התקררות רגישים לחשיפה מורחבת להיפותרמיה; לכן, אין לבצע את הניתוח רק בדיוק, אלא גם בתוך דקות ספורות. מההתחלה ועד הסוף, ניתוח אוטם שריר הלב צריך להימשך פחות מ 8 דקות. אנו ממליצים להתאמן על מספר מטרים של אותו רקע כמו העכברים הניסיוניים עד להשגת מיומנות.
התקדמות של תיקון לב יכול להיות מוערך באמצעות הד כדי למדוד את תפקוד הלב (כלומר קיצור השבר, שבר הפליטה, הסיסטולי ונפח הדיאסטולי) פעם בתוך 3 עד 7 ימים לאחר הניתוח ושוב זמן קצר לפני איסוף הלב , הציע בין 21 ו 28-ימים פציעה הפוסט. לבבות ניתן לאסוף לניקוי בנקודות זמן מרובות בעקבות ניתוח אוטם שריר הלב.
הצעד המסלקה (שלב 2.17) כפוף לווריאציה במשך הזמן, בהתאם לגיל ולזן של העכבר שממנו נקצרו הלב, דבר שעלול לגרום להבדלים בגודל הלב. עבור העכבר ברקע B6, ניקוי משך המבוסס על גיל מוערך כדלקמן: P1 (7-10 ימים), P7 (14-17 ימים), P14 (21-24 ימים), P21 (28-31 ימים), P28 (35-38 ימים). למרות המיקוד העיקרי של המעבדה שלנו הוא ניקוי הלב, שיטת בהירות פסיבית שלנו הצליחה לטהר את הריאות עכברים (תוצאות שלא פורסמו) ואנו לא צופה מגבלה על החלת בהרחבה זה לאיברים אחרים. בסך הכל, תהליך סליקה מזורז שלנו הוא מוערך מאוד עבור היכולת לנקות רקמות במהירות וביעילות.
יצוין כי סיבוכים יכולים להיווצר בעת החלת ניקוי רקמות טכניקות באיברים עם כתבים אנדוגני באוכלוסיות משנה נדירים. אות כתבת באוכלוסיות תאים צפופות (כגון תאי23) נראה עמיד יותר לתהליך סליקה ולכן האות נשמר בדרך כלל; עם זאת, אוכלוסיות תאים אחרות רגישות יותר (כגון עצבי לב) נוטים להיות בעל אות חלבון פלורסנט אנסוגני מוארכים לאחר קיבעון ממושך או ניקוי. זה התברר בActl6bהיצורים; Rosa26tdt כתב מודל העכבר, שבו P7 לבבות קבוע לזמן קצר במשך 15 דקות הראה האות tdt חזק (איור 3A), אולם זה אות פלורסנט היה מאוסס לאחר קיבעון עבור 1 שעה או לילה הדגירה בפתרון סליקה (נתונים לא מוצגים). בתרחיש של אות הכתב האבוד, מכתים נוגדנים מיקוד הכתב חלבון תואם לניקוי רקמות כדי להגביר את האות (איור 3). התוספת של צעד אימונויניום יכול להיות יתרון עבור רקמות שעברו הדמיה נרחבת, כמו נוגדנים מצופנים הם עמידים בפני אקונומיקה ולייצר יציב, לטווח ארוך הביטוי. עם היכולת לעקוב אחר חלבונים באופן מובהק ובאמצעות כתמים חיסוני, הפרוטוקול שלנו מאפשר לוקליזציה מדויקת של אוכלוסיות נדירות תאי לב השוכנים עמוק בתוך הלב.
לבבות נקי יכול לעבור מעקב השושלת או ביטוי חלבון הניאון ניתוח באמצעות שלמות-הר מיקרוסקופ 3d קונפוקלית. המיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד קווי לייזר ממוטב כדי להלהיב כתבים (או נוגדנים משני מצוקדים), לדוגמה: bfp (dapi, אלקסה fluor 405), egfp (fitc, אלקסה פלואור 488), dsred (tritc, אלקסה fluor 546/555), ו APC (Cy5, אלקסה fluor 647) ב 405 nm, 488 nm, 561 nm, ו-683 nm, בהתאמה. עבור דגימות לב לא מסוגל להתאים את שקופית דיכאון – נפוץ אם הלב הקצרו postnatally – שקופית דיכאון מותאם אישית יכול להתבצע על ידי הדפסה 3D על פוליפרופילן. מותאם אישית שקופיות אחרי ממדים של מיקרוסקופ דיכאון שקופית (25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ), שינוי עומק היטב ל-6.5 מ"מ או 17 מ"מ (איור 4).
כדי להמחיש את קווי התא העיתונאי ב-3d, המיקרוסקופ קונפוקלית וקד מוגדר לרכוש z-מוערמים תמונות ברחבי הלב. כאשר הדמיה לבבות גדולים יותר, הלב כולו לא יוכל להילכד בתמונה אחת מוערמים z אפילו עם יעד הגדלה נמוכה. בתרחיש זה, סדרה של מספר תמונות z מוערמים שצולמו באזורי לב שונים ניתן לתפור יחד באמצעות פונקציה תמונה גדולה. הדבר מתבצע על ידי כיול המיקרוסקופ לעדשת המטרה המתאימה וציון השדה עבור אזור הסריקה הגדול של התמונה. לאחר מכן, תמונות בערימה z עוברות שחזור תלת-ממד באמצעות תוכנית עיבוד אמצעי אחסון והקרנת עוצמה מרבית (איור 3). תמונות ברזולוציה גבוהה שנרכשו ניתן לנתח כדי לקבוע מדויק של תא מרחבית תלת-ממדי של אוכלוסיית תאים ממוקדת.
באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מספק כלי מולקולרי רב עוצמה כדי להבין את השינויים הסלולריים הדינמיים המתרחשים במהלך תיקון לב והתחדשות. שיטה זו מתארת את השלבים כדי לגרום לאוטם שריר הלב, לבצע ניקוי איברים שלם, מעקב אחר אוכלוסיות ספציפיות, ולנתח מפענח תא תלת-ממדי. ביחד, טכניקות אלה מספקות גישה מעקב אוכלוסיות תאים שהיו נגישים בעבר עקב הנוכחות הדלילה שלהם או המיקום בתוך הרקמה. זה יאפשר חקירה נוספת של שאלות בעלת חשיבות עליונה לקידום גישות טיפוליות ברפואה רגנרטיבית, במיוחד אלה המיועדים התחדשות לב אנדוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המימון לפרויקט זה סופק על ידי בית הספר UW לרפואה ובריאות הציבור מתוכנית שותפות ויסקונסין (A.I.M.), ו האמריקנית לפיתוח קריירה האגודה פרס הברית 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
