Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Fånga hjärtskada svar av riktade cellpopulationer via rensat hjärta tredimensionell imaging

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60482

Summary

Cardiomyocyte spridning efter skada är en dynamisk process som kräver en symfoni av extracellulära ledtrådar från icke-myocyte cellpopulationer. Med hjälp av härstamning spårning, passiv KLARHET, och tredimensionella helmonterade confocal mikroskopi tekniker, kan vi analysera påverkan av en mängd olika celltyper på hjärt reparation och förnyelse.

Abstract

Hjärt-kärlsjukdom överträffar alla andra dödsorsaker och är ansvarig för en svindlande 31% av dödligheten i världen. Denna sjukdom manifesterar sig i hjärtskada, främst i form av en akut hjärtinfarkt. Med lite motståndskraft efter skada, en gång frisk hjärtvävnad kommer att ersättas av fibrösa, icke-kontraktila ärrvävnad och ofta vara ett förspel till hjärtsvikt. För att identifiera nya behandlingsalternativ inom regenerativ medicin har forskningen fokuserat på ryggradsdjur med medfödd regenerativ förmåga. En sådan modell organism är neonatal musen, som svarar på hjärtskada med robust hjärtinfarkt förnyelse. För att framkalla en skada i neonatal musen som är kliniskt relevant, har vi utvecklat en operation för att ocklude den vänstra främre fallande artär (LAD), speglar en hjärtinfarkt utlöses av åderförkalkning i det mänskliga hjärtat. När matchas med tekniken för att spåra förändringar både inom kardiomyocyter och icke-myocyter populationer, ger denna modell oss en plattform för att identifiera de mekanismer som styr hjärtförnyelse. Få insikt i förändringar i hjärtcell populationer efter skada en gång förlitat sig starkt på metoder såsom vävnad snittning och histologisk undersökning, som är begränsade till tvådimensionell analys och ofta skada vävnaden i processen. Dessutom saknar dessa metoder förmågan att spåra förändringar i celllinjer, i stället ger bara en ögonblicksbild av skadesvaret. Här beskriver vi hur tekniskt avancerade metoder i härstamningsspårningsmodeller, hela organröjning och tredimensionell (3D) helmonterad mikroskopi kan användas för att belysa mekanismer för hjärtreparation. Med vårt protokoll för neonatal mus hjärtinfarkt kirurgi, vävnad clearing, och 3D hela organ imaging, de komplexa vägar som inducerar kardiomyocyt spridning kan redas ut, avslöjar nya terapeutiska mål för hjärt förnyelse.

Introduction

Hjärtat har länge ansetts vara ett postmitotiska organ, men de senaste bevisen visar att kardiomyocyte förnyelse sker i den vuxna mänskliga hjärtat på ca 1% per år1. Emellertid, dessa låga nivåer av kardiomyocyte omsättning är otillräckliga för att fylla på den massiva förlust av vävnad som uppstår efter skada. Ett hjärta som har drabbats av en hjärtinfarkt kommer att förlora cirka en miljard kardiomyocyter, ofta fungerar som ett förspel till hjärtsvikt och plötslig hjärtdöd2,3. Med över 26 miljoner människor som drabbats av hjärtsvikt över hela världen, det finns ett otillfredsställt behov av terapier som kan vända de skador som orsakats av hjärtsjukdom4.

För att överbrygga denna klyfta i therapeutics, forskare har börjat undersöka evolutionärt bevarade mekanismer som ligger bakom endogen ageneration efter skada. En modell för att studera däggdjur hjärt förnyelse är neonatal musen. Inom veckan efter födseln, neonatal möss har en robust regenerativ respons efter hjärtskador5. Vi har tidigare visat att neonatal möss kan regenerera sitt hjärta via kardiomyocyt spridning efter en apikal samband5. Även om denna teknik kan framkalla hjärtförnyelse hos nyfödda, saknar operationen klinisk relevans för mänskliga hjärtskador. För att efterlikna en mänsklig skada i neonatal mus modell, har vi utvecklat en teknik för att inducera en hjärtinfarkt genom en kranskärl ocklusion6. Denna teknik kräver kirurgisk ligation av den vänstra främre fallande artär (LAD), som ansvarar för att leverera 40%-50% av blodet till vänster Ventrikulärt hjärtmuskeln6,7. Således resulterar operationen i en infarct som påverkar en betydande del av den vänstra Ventrikulärt väggen. Denna skada på hjärtmuskeln kommer att stimulera kardiomyocyt spridning och hjärtförnyelse hos nyfödda5.

Den kranskärlocklusion kirurgi ger en mycket reproducerbar och direkt translationell metod för att avslöja det inre arbetet i hjärt förnyelse. Neonatal kirurgi paralleller kranskärlsförkalkning i det mänskliga hjärtat, där ansamling av plack inom de inre väggarna i artärerna kan orsaka en ocklusion och efterföljande hjärtinfarkt8. På grund av ett tomrum i terapeutiska behandlingar för hjärtsvikt patienter, en ocklusion i LAD är associerad med dödligheten når upp till 26% inom ett år efter skada9, och följaktligen har kallats "änka maker." Framsteg i therapeutics kräver en modell som exakt återspeglar de komplexa fysiologiska och patologiska effekterna av hjärtskada. Vårt kirurgiska protokoll för neonatal mus hjärtskada ger en plattform som gör det möjligt för forskare att undersöka molekylära och cellulära ledtrådar som signalerar däggdjur hjärtförnyelse efter skada.

Ny forskning belyser det dynamiska förhållandet mellan den extracellulära miljön och prolifererande kardiomyocyter. Till exempel kan det postnatala regenerativa fönstret förlängas genom att minska styvheten i den extracellulära matrisen som omger hjärtat10. Biomaterial från neonatal extracellulär matris kan också främja hjärtförnyelse i vuxna däggdjurshjärtan efter hjärtskada11. Också medföljande kardiomyocyte spridning är en angiogenic svar12,13; säkerheter artär bildning unik för regenererande hjärtat av neonatal musen visade sig vara avgörande för att stimulera hjärt förnyelse12. Dessutom har vårt labb visat att nervsignalering reglerar kardiomyocyte spridning och hjärtförnyelse via modulering av tillväxtfaktornivåer, samt den inflammatoriska svar efter skada14. Dessa resultat betonar behovet av att spåra icke-myocyte cellpopulationer som svar på hjärtskada. För att uppnå detta mål har vi utnyttjat Cre-lox rekombinationssystem i transgena möss linjer för att införliva konstituerande eller villkorligt uttryck för fluorescerande reporter proteiner för härstamning spårning. Dessutom kan vi använda avancerade metoder för att bestämma klonal expansion mönster med Rainbow muslinjen, som bygger på stokastiska uttryck för Cre-beroende, multi-color fluorescerande reportrar för att bestämma klonal expansion av riktade cellpopulationer15. Använda härstamning spårning med neonatal kranskärl ocklusion kirurgi är ett kraftfullt verktyg för att dissekera intrikata cellulära mekanismer för hjärt förnyelse.

Spåra härstamning av fluorescerande märkta celler med tredimensionella (3D) hela organ avbildning är svårt att uppnå med hjälp av traditionella snittning och återuppbyggnad teknik - särskilt när cellpopulationer är bräckliga, såsom nervfibrer eller blodkärl. Medan direkt helmonterad avbildning av organet genom optisk snittning kan fånga ytliga cellpopulationer, strukturer som bor djupt inne i vävnaden förblir otillgängliga. För att kringgå dessa hinder har vävnadsröjningstekniker utvecklats för att minska opaciteten hos hela organvävnader. Nyligen har betydande framsteg gjorts för att rensa Lipid-utbytte Akrylamid-hybridiserade Rigid Imaging kompatibla Vävnad hYdrogel (CLARITY)-baserade metoder, som rensar fast vävnad via lipidextraktion16. Åtgärder vidtas också för att homogenisera brytningsindexet och därefter minska ljusspridning medan bildbehandling17. En sådan metod är aktiv KLARHET, som påskyndar lipidnedbrytning med hjälp av elektrofores för att penetrera tvättmedlet i hela vävnaden18. Även effektiv, denna vävnad clearingmetod kräver dyr utrustning och kan orsaka vävnadsskador, vilket gör tillvägagångssättet oförenligt med bräckliga cellpopulationer såsom hjärt nerver19. Därför använder vi passiv CLARITY-metoden, som är beroende av värme för att försiktigt underlätta tvättmedelspenetration, och därför medhjälp till att behålla invecklade cellstrukturer20,,21.

Passiv klarhet anses vanligtvis vara mindre effektiv än aktiv CLARITY18, eftersom tekniken ofta åtföljs av två stora hinder: oförmågan att rensa hela organdjupet och den omfattande tid som krävs för att rensa vuxna vävnader. Vår passiva CLARITY strategi övervinner båda dessa hinder med en expeditated clearing process som kan helt rensa neonatal och vuxna hjärtvävnad. Vår passiva CLARITY vävnad clearing teknik har nått en effektivitet som tillåter visualisering av en mängd olika hjärtcell populationer, inklusive sällsynta populationer distribueras i hela det vuxna hjärtat. När det rensade hjärtat avbildars med konfokal mikroskopi kan arkitekturen för cellspecifik mönsterunder utveckling, sjukdom och regenerering belysas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med guiden för användning och vård av försöksdjur och i enlighet med kommittén för institutionsvård och användning vid School of Medicine and Public Health vid University of Wisconsin-Madison. Alla metoder utfördes på vild typ C57BL/6J (B6) och transgena muslinjer som erhållits från Jackson Laboratories.

1. Födans gatan ocklusion (hjärtinfarkt) inducerad via ligring av vänster främre fallande artär (LAD) i 1-dagars gamla neonatal möss6

  1. Separera de 1 dagar gamla neonatalvalparna från modern genom att placera dem i en ren bur tillsammans med några av de ursprungliga häckningsmaterialet.
  2. Placera hälften av buren på en värmedyna inställd på medelvärme. Valparna bör finnas kvar på den ouppvärmda sidan av buren, bara placeras på den uppvärmda sidan efter operationen.
  3. Skapa ett sterilt kirurgiskt område under ett fungerande mikroskop. Samla steriliserad kirurgisk utrustning (tabell 1).
  4. Anestesi pup via hypotermi: linda valpen i gasväv för att undvika direkt hudkontakt med is och begrava den i en isbädd i ca 3-4 min. Kontrollera hypotermi av mössen regelbundet genom att utföra en tå nypa. Nyfödda tolererar avstavning väl, men långvarig exponering för bindemedel kan resultera i köldskador och efterföljande dödlighet.
  5. När stasit, placera musen på det kirurgiska området i supine position, säkra armar och ben med tejp. Sterilisera det kirurgiska området i musen med en antiseptisk lösning.
  6. Lokalisera nedre bröstregionen och gör ett tvärgående snitt i huden med små dissekerande sax. För att vidga den kirurgiska synen på revbenen, separera huden från muskeln genom att lyfta huden försiktigt med ett par dressingpinps och försiktigt tryck mot interkostalmusklerna med små saxar i stängt läge.
  7. Lokalisera det fjärde interkostalutrymmet (figur 1A) och gör en liten, ytlig punktering med vassa pincett, var noga med att inte punktera några inre organ. Utför en trubbig dissekering genom att bredda området mellan intercostalmusklerna med dressingpinps. Korrekt anatomisk positionering av snittet är viktigt för lämplig tillgång till hjärtat.
  8. Styr försiktigt hjärtat ut ur brösthålan genom att placera ett finger och applicera ökande tryck på vänster sida av buken medan du håller interkostalutrymmet öppet med förbandpinps (figur 1B). När hjärtat är utanför bröstet, ta bort dressing pincett, lindra trycket, och låt hjärtat att vila på intercostal musklerna.
  9. Lokalisera LAD som det område i hjärtat som har mindre poolat blod och är i rätt anatomiskt läge (figur 1C). LAD kan bara ses under mikroskopet om hjärtat nås inom några minuter efter början kirurgi.
  10. Utför LAD ligation genom att suturera LAD med en 6-0 sutur(bild 1D). Knyt en fyrkantig knut två gånger för att framkalla hjärtinfarkt(figur 1E). Djupet av suturen i hjärtmuskeln kan variera, men korrekt anatomisk positionering av LAD ligering är avgörande för reproducerbarhet. När ligating LAD, bör suturen dras tätt men försiktigt för att inte bryta LAD. Blanchering i spetsen av hjärtat kommer att ses omedelbart(figur 1E)
  11. Låt hjärtat glida tillbaka in i brösthålan; denna process kan underlättas försiktigt med förbandpinpar. Suture revbenen tillsammans med en kirurg knut följt av en fyrkantig knut, med trubbiga pincett för att lyfta den övre uppsättningen revben samtidigt passerar en 6-0 sutur genom den övre och nedre uppsättningen revben.
  12. Ta bort tejpen som användes för att säkra bakbenen på valpen.
  13. Följ ihop huden genom att placera en liten mängd hudlim på övre delen av buken. Ta sedan tag i huden på nedre delen av buken med fina pincett och täck den exponerade bröstregionen. Begränsa mängden överskott lim som finns kvar på valparna, eftersom detta kan öka sannolikheten för avstötning och kannibalism av modern.
  14. Omedelbart underlätta återhämtningen från anestesi genom att placera valpen på en värmedyna inställd på medelvärme. Byt periodvis placeringen av nyfödda för att jämnt värma alla delar av kroppen.
  15. Låt den nyfödda stanna direkt på värmedynan i 10–15 min. Vanligtvis återfårs rörelsen inom 5 minuter efter att ha placerats på värme.
  16. Rengör restblodet och lim med en alkoholtorka.
  17. Täck utländska dofter på nyfödda genom att gnugga hela kroppen med sängkläder från den ursprungliga buren. Placera valpen i buren på den uppvärmda sidan medan andra operationer utförs.
  18. När alla operationer är klara och valpar är varma och mobila, överför kullen tillsammans med det ursprungliga häckningsmaterialet till moderns bur.
  19. Övervaka mössen i 30–60 min efter operationen och se upp för moderns acceptans av valparna genom att häcka och/eller grooming.
  20. Kolla mössen morgonen efter operationen. Om modern är bedrövad och inte har kapslat valparna, överväga en fostermor för valparna.

2. Rensa musen hjärta med passiv KLARHET21,22,23

  1. Sövar musen med isoflurane. Utför en tå nypa för att säkerställa att musen är helt sövd.
  2. Placera musen på ett rent, kirurgiskt område i supinläge, säkra armar och ben med tejp.
  3. Upprätthålla isoflurane sedering på musen med hjälp av en näskon tills hjärtat extraheras.
  4. Öppna den nedre bröstet genom att hålla pälsen strax under xiphoid processen med vävnad pincett och göra ett snitt som spänner över bredden på bröstkorgen med hjälp av den stora dissekerande sax.
  5. Skär tillsammans med de distala delarna av bröstkorgen med kirurgisk sax.
  6. Exponera membranmuskeln genom att förstå xiphoid processen med vävnad pincett. Lossa membranet med böjda pincett.
  7. Samtidigt som du upprätthåller ett grepp om xiphoid processen, dra vävnaden cranially tills det bultande hjärtat är tillgänglig.
  8. Ta tag i hjärtat vid basen med böjda pincett och dissekera hjärtat från brösthålan genom att skära aorta och överlägsen vena cava med iridectomy sax.
  9. Medan hjärtat fortfarande slår, placera hjärtat i en Petri maträtt fylld med PBS så att hjärtat pumpar ut blodet inuti som det håller slå. Hjärtinfarkt kan bekräftas genom att kontrollera att placeringen av suturen är i rätt anatomisk position för LAD ligering.
  10. Krama försiktigt hjärtat med pincett så att hjärtat kan utvisa det kvarvarande blodet.
  11. Överför mushjärtat till en engångsinjektion på 2,5 ml glasskal med 2 ml PBS. Tvätta bort kvarvarande blod genom att ruva hjärtat på en shaker i 10 min vid rumstemperatur (RT) flera gånger. Ändra PBS-lösningen varje gång tills PBS förblir klart.
  12. Kassera PBS och fyll flaskan med 2 ml kall 4% paraformaldehyd (PFA). Inkubera i 4 timmar på RT(bild 2A).
  13. Efter inkubation, kassera PFA och injektionsflaskan med 2 ml PBS. Tvätta hjärtat på en shaker i 10 min på RT. Upprepa tvättsteget två gånger, dränera och fylla flaskan med ny PBS varje gång för att helt tvätta bort överflödig PFA.
  14. Kassera PBS och fyll flaskan med 2 ml med 4% akrylamid och 0,5% VA-044 lösning. Inkubera över natten vid 4 °C.
  15. Nästa dag utför polymerisering genom att överföra injektionsflaskan till ett värmeblock som är 37 °C i 3 timmar.
  16. Överför hjärtat till en ny glasskalsinjektionsflaska och upprepa steg 2.12 (PBS-tvättcykeln).
  17. Kassera PBS och fyll flaskan med 2 ml Clearing Solution(tabell 2). Inkubera vid 37 °C tills hjärtat rensas. Byt ut lösningen och fyll på med färsk Clearing Solution var 2–3:e dag. Clearingprocessen kan ta upp till flera veckor(figur 2B-C).
    OBS: P1 hjärtan tar vanligtvis cirka 3-5 dagar, medan P21 hjärtan kan ta nästan en månad innan Clearing Solution inkubation är klar.
  18. Kassera PBS och fyll flaskan med 2 ml PBS och upprepa steg 2.12 (PBS tvättcykel). Fyll på injektionsflaskan med färsk PBS och inkubera över natten vid 37 °C.
  19. Om immunfärgning utförs, hoppa över steg 2.21–2.22 och fortsätt till avsnitt 3 för immunfärgning. Om du enbart förlitar sig på endogen fluorescens, fortsätt med steg 2.21–2.22 och hoppa över avsnitt 3.
  20. Kassera PBS och ändra lösningen till Refractive Index Matching Solution (RIMS)(tabell 3). Inkubera över natten vid 37 °C.
  21. Efter inkubation kan den rensade vävnaden lagras i RIMS-lösningen på RT. Vävnad kan verka vara vit och ogenomskinlig i mitten när den först överförs till RIMS. vävnaden ska bli transparent efter att ha inkuberats i RIMS vid rumstemperatur i flera veckor (figur 2D).

3. Valfritt: Immunohistochemistry Färgning av hela berget Mus Heart

  1. Ta bort det rensade hjärtat från RIMS-lösningen och placera i en ren 2,5 ml glasflaska med 2 ml PBST (PBS med 0,1% Triton-X 100)
  2. Tvätta hjärtat i PBST 3 gånger på en orbital rotator med 30 min inkuber på RT.
  3. Blockera icke-specifik antikroppsbindning genom att nedsänka hjärtat i 2 ml blockbuffert (utspädd i PBST) och inkubera med rotation i 3 timmar vid RT. Överför till 4 °C för att fläcka med rotation över natten.
    OBS: Blockeringsbufferten är tillverkad av normalt serum som matchar de arter där den sekundära antikroppen höjdes.
  4. Tvätta hjärtat i PBST 3 gånger med rotation i 5 min inkuber på RT.
  5. Sänk ner hjärtat i primär antikropp (utspädd i 2% blockerande buffert med PBST) och förhindra ljusexponering genom att linda glasflaskan i aluminiumfolie. Inkubera med rotation över natten på RT.
    OBS: Från denna punkt framåt bör aluminiumfolie kontinuerligt användas för att skydda sekundärt från omgivande ljusexponering.
  6. Inkubera i ytterligare 24 timmar med rotation vid 4 °C.
  7. Efter primär färgning, upprepa steg 3.2 (lång PBST tvättcykel) för att ta bort den obundna primära antikroppar från vävnaden. Förläng tvätten med en över natten inkubation med rotation på RT.
  8. Arbeta i ett område med begränsad belysning för att förhindra sekundär antikroppsljusexponering, sänk ner hjärtat i sekundär antikropp (utspädd i 2 % blockeringsbuffert med PBST) och inkubera med rotation i 3 timmar vid RT. Överför till 4 °C för att färga med rotation över natten.
  9. Nästa dag upprepar du steg 3.2 (lång PBST-tvättcykel) för att ta bort obunden sekundär antikropp.
  10. Byt ut lösningen mot 2% blockeringsbuffert (utspädd i PBST). Ta bort kvarvarande obundna antikroppar genom att tvätta över natten med rotation på RT.
  11. Nästa dag, kontrollera att överskott sekundär antikropp har tagits bort med hjälp av konfokal mikroskopi. Förläng tvätten efter behov och byt ut den 2% blockerande buffertlösningen dagligen. Fortsätt en gång liten eller ingen icke-specifik sekundär är närvarande.
  12. Förvara det immunfärgade hjärtat i PBS vid 4 °C.
  13. Direkt före helmonterad mikroskopi, inkubera hjärtat i RIMS-lösningen över natten vid 37 °C. Förläng inkubationen ytterligare 24 timmar om vävnaden fortfarande inte är helt rensad.
  14. Förvara det helt rensade och immunfärgade hjärtat i RIMS på RT.

4. Visualisera icke-myocyte populationer i 3D med single-photon Confocal Mikroskopi Imaging av rensas Mouse Heart

OBS: Om mushjärtan skördas embryonalt, fortsätt med avsnitt 4.1. För mus hjärtan skördas postnatally, fortsätt med avsnitt 4.2.

  1. Imaging den rensade embryonala Mus Heart
    1. Fyll mikroskopdepressionsbilden med PBS-lösningen.
    2. Plocka försiktigt upp det rensade hjärtat med böjda pincett och placera vävnaden på bilden.
    3. Montera bilden med ett glastäcke. Vävnaden kan nu avbildas under ett konfokalmikroskop.
  2. Imaging rensas Postnatal Mouse Heart
    1. Fyll hälften av depressionsbildens kammare med PBS-lösning. För att skapa en kammare stor nog att passa en vuxen mus hjärta, en 3D-tryckt polypropylen depression bild var skräddarsydd (Figur 4).
    2. Plocka försiktigt upp det rensade hjärtat med böjda pincett och placera vävnaden i kammaren. Fyll den återstående volymen av kammaren med PBS.
    3. Fyll kammaren med PBS så att vätskans yta bildar en kupol ovanför kammarens ovansida. Montera täckbilden. Vävnaden kan nu avvisas under ett upprätt konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ofta de två mest utmanande stegen är att styra hjärtat ur brösthålan och ligating LAD. För att felsöka dessa steg kan justeringar göras vid placeringen av den första punkteringen mellan de fjärde interkostnadsmusklerna; Om punkteringen och trubbigdissektionen är för nära i närheten av bröstbenet, kanske hjärtat inte kan lämna brösthålan (figur 1A).

Dessutom kan ökat tryck på vänster buk behövas för att underlätta denna process (figur 1B). Komplikationer kan också uppstå när man vilar hjärtat på intercostal musklerna. Vi fann att hjärtat kommer att förbli utanför kaviteten utan att dra sig tillbaka när den trubbiga dissekeringen hålls till en minimal storlek och utförs främst i horisontell riktning. Den här orienteringen möjliggör också tydlig visualisering och tillgänglighet till LAD(bild 1C).

När du placerar suturnålen bakom LAD, föreslås att tränga djupt in i främre väggen i den vänstra ventrikeln, som en ytlig ligering har mindre utrymme för justering i den slutliga sutur placeringen(figur 1D). Binda suuturen runt LAD bör utföras med kontrollerade, stadiga rörelser, eftersom LAD är bräcklig och bryta denna kranskärl och främre väggen kommer att orsaka dödlighet(figur 1E). Inom 5-10 minuter efter operationen är klar, bör den nyfödda vara livlig och andas normalt.

När man fortsätter till passiva CLARITY-protokollet bör hjärtan som skördats från en muslinje som innehåller en endogen fluorescerande reporter för cellhärstamningsspårning skyddas från ljus (figur 2), vilket kan åstadkommas genom att linda glasflaskan i aluminiumfolie. Under röjningssteget varierar tiden i Clearing Solution beroende på musens ålder när hjärtat skördades. Detta steg är klart när hela vävnaden är konsekvent ogenomskinlig, utan missfärgning i mitten (bild 2B-C). Hjärtana kommer att bli allt öppnare efter förvaring i RIMS-lösningen vid rumstemperatur i ett par dagar(figur 2D). Det bör noteras att vävnadsexpansion kan förekomma under clearingprocessen.

Vårt passiva CLARITY-protokoll möjliggör effektiv antikroppspenetration och är därför kompatibel med immunohistokemimetoder för att märka proteiner av intresse. Detta validerades i Actl6bCre; Rosa26tdT transgena möss, som etikett mogna nervceller med tdTomato (tdT) reporter protein. Hjärtnerverna är främst ytliga, med vissa populationer som bor i det episkalagret, därför använde vi denna cellpopulation som en proof-of-principal modell för reproducerbarhet endogen reporter signal(figur 3A),samt bevarande av reporter protein konformation före och efter KLARHET (figur 3B-C). Våra representanter från Actl6bCre; Rosa26tdT möss visar att den endogena tdT protein signal ses i nerver av en oklar P7 hjärta var troget rekapitulerade i nerver av både oklara och rensas tdT immunmärkt P7 hjärtan (Figur 3). Till immunolabel tdT-positiva nerver, en röd fluorescerande protein (RFP) primära antikroppar (kanin polyklonal; 1:200 utspädning; Rockland #600-401-379) användes tillsammans med en Alexa Fluor 488 sekundär antikropp (getpolyklonal; 1:1000 utspädning; Invitrogen #A-11008). För att visualisera det rensade hjärtat med ögat under immunfärgning och bildsteg kan en ultraviolett ficklampa kort användas för att belysa hjärtat.

Figure 1
Figur 1: Induktion av hjärtinfarkt i neonatal musen genom kranskärlocklusion av den vänstra främre fallande gatan (LAD). (A)Det fjärde interkostalutrymmet, indikerat med en enda asterisk (*), är lokaliserat och en trubbig dissekering utförs. (B)Tryck appliceras på vänster buk för att styra hjärtat ut ur brösthålan. C)LAD,som kännetecknas av en dubbel asterisk (**), identifieras som den dominerande artären och av anatomisk position. (D, E) En sutur skickas sedan bakom LAD och en fyrkantig knut är bunden runt LAD att inducera en kranskärl ocklusion och efterföljande infarct. (E)När den är klar kan blanchering ses under suturen, i hjärtats spets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Progression av metoden passiv KLARHET på ett P14 Mouse Heart. Hjärtan skördades från P14 möss,(A) fast, och (B-D) genomgick passiva CLARITY-protokollet. För hjärtan som tas vid en P14-tidspunkt är Clearing Solution inkubationssteg (B) ofullständig när missfärgning i mitten av hjärtat är uppenbar, sett efter 6 dagar, och(C)komplett när hjärtat verkar jämnt ogenomskinligt, sett efter 10 dagar. (D) När hjärtat har lagrats i RIMS är vävnaden helt rensad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Helmonterad 3D-avbildning av P7 Mouse Hearts med konfokal mikroskopi. Representativa helmonterade 3D-bilder från P7 Actl6bCre; Rosa26tdT transgena möss hjärtan visas som maximal intensitet prognoser z-staplade bilder. Hjärtan avbildades för att visa (A) endogena tdTomato (tdT) fluorescens direkt efter skörd (röd) (B) immunfärgning av tdT-positiva nerver i ett oklart hjärta (Alexa Fluor 488; grön) och (C) reproducerbar immunmärkning av tdT-positiva nerver i ett rensat hjärta (Alexa Fluor 488; grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: 3D Tryckt Polypropylen depression diabilder. För att avbilda postnatala hjärtprover, anpassade depression diabilder var 3D tryckt på polypropylen. Glidmåtten är 25 mm x 75 × 1 mm, med en gliddepression väl 13 mm i diameter och antingen(A) 6,5 mm eller(B)17 mm på djupet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Typ av utrustning Beskrivning Företag Katalognummer
Glasflaska 12 x 35mm injektionsflaskor med lock Fisherbrand (olika) 03-339-26A
6-0 Prolene Suturer Polypropylen suturer Etik 8889H (8889H)
Vassa pincett Fin spets, rak, 4,25 i Sigma-Adrich Z1687777
Dressing Pincett Dissekering, 4,5 i Fisherbrand (olika) 13-812-39
Nålhållare Mayo-Hegar, 6 år Fisherbrand (olika) 08-966
Liten dissekerande sax 30 mm Skäregg Walter Stern Inc 25870-002
Vävnad Pincett Medelvävnad, 1X2 tänder Excelta (excelta) 16050133
Stora dissekerande sax Rak, 6 i Fisherbrand (olika) 08-951-20
Iridectomy Sax 2 mm Skäregg Fine Science Verktyg 15000-03
Böjda pincett Halv böjd, serrated, 4 i Excelta (excelta) 16-050-146

Tabell 1: Kirurgisk utrustning.

Clearing lösning
Reagens Slutliga Belopp Anteckningar
Natriumdodecylsulfat (SDS) 8,0% w/v 40 g
Borsyra 1,25% w/v 6,25 g
1-thioglycerol 0,5% w/v 5 μL/ml Läggs till efter behov till lösning
Tillsätt 400 ml ultraren H20 till 1 L bägare. Blanda i SDS och Borsyra med magnetisk omrörning.
Justera pH till 8,5 med 6M NaOH. Bringa volym till 500 ml och Autoclave.
Förvara lösning i rumstemperatur.
Andra CLARITY-reagenser
Reagens Slutliga Lager Anteckningar
Pfa 4.0% 16% Utspädd i PBS
Akrylamid 4.0% 40% Utspädd i PBS
VA-044 0.5% 10% Läggs till efter behov till lösning

Tabell 2: Clearinglösning och andra CLARITY-reagenser.

Reagens Slutliga Belopp
Fosfatbuffert 0,02 M 90 ml
Histodenz (på väg att gå" 133,3% w/v 120 g
Natriumazid 0,05% w/v 45 mg
Tillsätt 90 ml 0,02 M fosfatbuffert till 250 ml glasmediaflaska insvept i aluminiumfolie.
Blanda i reagenser listade med magnetisk omrörning. Låt komponenterna lösas upp över natten.
Vortexlösning och filterret med filtreringssystem till en steril 250 ml glasmediaflaska.
Wrap flaska i aluminiumfolie och förvara lösning i rumstemperatur.

Tabell 3: Refractive Index Matching Solution (RIMS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cell-cell interaktioner mellan kardiomyocyter och icke-myocyte populationer är en avgörande faktor för om hjärtat kommer att genomgå fibros eller reparation efter skada. Upptäckter har gjorts visar att en mängd olika celltyper, inklusive nerver14, epicardial celler24, peritoneal makrofager25, arterioles12,13, och lymfatiska endotelceller26, alla spelar en viktig roll i medla hjärt reparation. Dessa cellhärstamningar och andra av intresse kan genetiskt spåras under utveckling, sjukdom och förnyelse genom att tillämpa Cre-lox och CRISPR-Cas9-teknik hos möss. I kombination med organröjning och avancerade mikroskopimetoder kan bidragen från icke-myocytepopulationer bedömas noggrant, vilket öppnar dörren för att belysa cellulära och molekylära mål för hjärtinfarkt efter skada.

Effektiviteten i protokollet är beroende av konsekvent och reproducerbar ligering av LAD under kranskärl ocklusion kirurgi. Neonatalmöss är känsliga för utökad exponering för hypotermi; Således måste operationen inte bara utföras med noggrannhet utan även inom några minuter. Från början till bör den hjärtinfarkt kirurgi ta mindre än 8 minuter. Vi rekommenderar att du först praktiserar på flera kullar med samma bakgrund som de experimentella mössen tills färdighet uppnås.

Progression av hjärtreparation kan bedömas med hjälp av ekokardiografi för att mäta hjärtfunktion (dvs. fraktionerad förkortning, utmatningsfraktion, systolisk och diastolisk volym) en gång inom 3 till 7 dagar efter operationen och igen strax före skörd av hjärtat , föreslås mellan 21- och 28-dagars efterskada. Hjärtan kan samlas in för clearing vid flera tidpunkter efter hjärtinfarkt kirurgi.

Röjningssteget (steg 2.17) är föremål för variation i varaktighet beroende på ålder och belastning på musen från vilken hjärtat skördades, vilket kan resultera i skillnader i hjärtstorlek. För en B6-bakgrundsmus beräknas röjningstiden baserat på ålder enligt följande: P1 (7-10 dagar), P7 (14-17 dagar), P14 (21-24 dagar), P21 (28-31 dagar), P28 (35-38 dagar). Även om det primära fokuset för vårt laboratorium är hjärtröjning, har vår passiva CLARITY-metod varit framgångsrik för att rensa mösslungor (opublicerade resultat) och vi förutser ingen gräns för att i stort sett tillämpa detta på andra organ. Sammantaget är vår påskyndade clearingprocess högt värderad för förmågan att rensa vävnader snabbt och effektivt.

Det bör noteras att komplikationer kan uppstå vid tillämpning av vävnadclearingtekniker i organ med endogena reportrar i sällsynta subpopulationer. Reporter signal i täta cellpopulationer (såsom myocyter23)verkar vara mer motståndskraftigmot clearingprocessen och därmed signalen vanligtvis kvar; men andra mer känsliga cellpopulationer (såsom hjärtnerver) är benägna att ha endogenfluorescerande proteinsignal släckt efter långvarig fixering eller clearing. Detta blev tydligt i Actl6bCre; Rosa26tdT reporter mus modell, där P7 hjärtan fast kort i 15 minuter visade stark TDT signal(Figur 3A),men detta fluorescerande signal släcktes efter fixering i 1 timme eller övernattning inkubation i Clearing Solution (data visas inte). I scenariot med förlorad reporter signal, antikroppar färgning inriktning reportern protein är kompatibel med vävnad clearing för att förstärka signalen (Figur 3). Tillsats av ett immunmärkningssteg kan vara fördelaktigt för vävnader som genomgår omfattande avbildning, eftersom konjugerade antikroppar är blekmedelsresistenta och producerar stabila, långsiktiga uttryck. Med förmågan att spåra proteiner endogenously och genom immunfärgning, vårt protokoll unikt möjliggör exakt lokalisering av sällsynta hjärtcell populationer som bor djupt inne i hjärtat.

Rensade hjärtan kan genomgå härstamning spårning eller fluorescerande protein uttryck analys med hela montera 3D confocal mikroskopi. Det konfokala mikroskopet är utrustat med laserlinjer optimerade för att excitera fluorescerande reportrar (eller konjugerade sekundära antikroppar), till exempel BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) och APC (Cy5, Alexa Fluor 647) på 405 nm, 488 nm, 561 nm respektive 683 nm. För hjärtprover som inte får plats i en depression bild - vanligt om hjärtat skördas postnatally - en anpassad depression bild kan göras genom 3D-utskrift på polypropylen. Anpassade diabilder följde dimensioner av ett mikroskop depression bild (25 mm x 75 mm x 1 mm), varierande brunnsdjup till antingen 6,5 mm eller 17 mm(bild 4).

För att visualisera reporterns cellinjer i 3D är confocal mikroskop inställd på att förvärva z-staplade bilder i hela hjärtat. När imaging större hjärtan, hela hjärtat kanske inte kan fångas i en enda z-staplade bild även med en låg förstoring mål. I det här fallet kan en serie av flera z-staplade bilder tagna i olika hjärtområden sys ihop med hjälp av en stor bildfunktion. Detta sker genom att kalibrera mikroskopet till lämplig objektiv och ange fältet för det stora bildskanningsområdet. Sedan genomgår z-staplade bilder 3D-rekonstruktion med hjälp av ett volymrenderingsprogram och maximal intensitetsprojektion (bild 3). De högupplösta bilder som förvärvats kan analyseras för att bestämma exakt 3D-rumsliga cellmönster för riktade cellpopulationer.

Tillsammans ger detta protokoll ett kraftfullt molekylärt verktyg för att förstå de dynamiska cellulära förändringar som sker under hjärtreparation och regenerering. Den här metoden beskriver stegen för att inducera en hjärtinfarkt, utföra hela organrensning, spåra cellspecifika populationer och analysera 3D-cellmönster. Tillsammans ger dessa tekniker tillgång till spårcellspopulationer som tidigare var otillgängliga på grund av deras glesa närvaro eller plats i vävnaden. Detta kommer att göra det möjligt att ytterligare undersöka frågor av största vikt för att främja terapeutiska metoder inom regenerativ medicin, särskilt de som syftar till att stimulera endogen hjärtförnyelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Finansiering för detta projekt tillhandahölls av UW School of Medicine and Public Health från Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), och en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures Ethicon 8889H Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps Excelta 16-050-146 Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps Fisherbrand 13-812-39 Dissecting, 4.5 in
Glass Vial Fisherbrand 03-339-26A 12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz Sigma-Aldrich Density gradient medium
Iridectomy Scissors Fine Science Tools 15000-03 2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors Fisherbrand 08-951-20 Straight, 6 in
Needle Holder Fisherbrand 08-966 Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps Sigma-Adrich Z168777 Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor Walter Stern Inc 25870-002 30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps Excelta 16050133 Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044 Wako Chemicals Water-soluble azo initiator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Tags

Utvecklingsbiologi hjärtinfarkt hjärtregenerering vävnadsröjning härstamningspårning 3D-avbildning neonatal mus
Fånga hjärtskada svar av riktade cellpopulationer via rensat hjärta tredimensionell imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud,More

Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60482, doi:10.3791/60482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter