Summary
ينتج تضيق الحنجرة من ترسب الندبة الباثولوجي الذي يضيق بشكل خطير مجري القصبات الهوائية ويفتقر إلى العلاجات الطبية الفعالة. باستخدام PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) الدعامات كنظام تسليم المخدرات المحلية ، يمكن دراسة العلاجات المحتملة التي تهدف إلى خفض انتشار ندبه في القصبة الهوائية.
Abstract
تضيق الحنجرة (لتر) هو تضييق باثولوجي للتهاب الرغامي والقصبة الهوائية مما يؤدي إلى انسداد خارج المضيق وضيق كبير في التنفس. ينتج هذا المرض عن أصابه الغشاء المخاطي من جسم غريب في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تلف الانسجه والاستجابة التهابيه المحلية التي تذهب بشكل منحرف ، مما يؤدي إلى ترسب الانسجه المصابة بندبات مرضيه. العلاج لل ه هو الجراحية بسبب عدم وجود العلاجات الطبية الفعالة. والغرض من هذا الأسلوب هو بناء الدعامات المتوافقة مع الحيوية التي يمكن تصغيرها لوضعها في الفئران مع لتر. أظهرنا ان PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) بناء كان الأمثل نشاط القوه ، كانت متوافقة بيولوجيا ، عمليا في وضع الدعامات في الجسم الحيوي ، وقادره علي التملص من المخدرات. يوفر هذا الأسلوب نظام تسليم المخدرات لاختبار العوامل المناعية المختلفة لمنع التهاب محليا والحد من تليف مجري التنفس. تصنيع الدعامات ياخذ 28 − 30 ح ويمكن استنساخها بسهوله ، مما يسمح للتجارب مع الأفواج الكبيرة. هنا أدرجنا راباميسين المخدرات داخل الدعامة لاختبار فعاليتها في الحد من التليف وترسب الكولاجين. وكشفت النتائج ان الخيام plla-PCL أظهرت الإفراج عن راباميسين موثوق بها ، وكانت مستقره ميكانيكيا في الظروف الفسيولوجية ، وكانت متوافقة بيولوجيا ، مما يحفز استجابه التهابيه قليلا في القصبة الهوائية. وعلاوة علي ذلك ، فان الدعامات PLLA-PCL التي تقلل من الندبات في القصبة الهوائية في الجسم المجري.
Introduction
تضيق القصبة الهوائية هو تضييق باثولوجي للرغامي في معظم الأحيان بسبب الاصابه بعد التنبيب الضموري. الجمع بين الاستعمار البكتيري ، استجابه الجسم الاجنبيه لفغر الرغامي أو أنبوب الرغامي ، والعوامل الخاصة بالمريض تؤدي إلى استجابه التهابيه شاذة. يؤدي هذا الاستجابة المناعية غير المتكيفة إلى ترسب الكولاجين في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تضييق القصبة الهوائية والتضيق اللاحق1،2. ونظرا لان العلاج الحالي لهذا المرض هو في المقام الأول الجراحية ، وتطوير بديل العلاج الطبي القائم علي نموذج استهداف مسارات التهابيه والخبيثة المنحرفة التي تؤدي إلى ترسب الكولاجين المفرط قد درست. راتاميسين ، الذي يمنع مركب الإشارات mTOR ، وقد ثبت ان لها تاثيرات المناعة ، فضلا عن تاثير مضاد لليفي قوي. ومع ذلك, عندما يتم أداره راباميسين بالمنهجية, الآثار الجانبية الشائعة (علي سبيل المثال, فرط الدهون, فقر الدم, نقص الصفيحات) يمكن ان تكون واضحة3. والغرض من منهجيتنا هو تطوير وسيله لإيصال المخدرات المحلية عمليا لاستخدامها في مجري التنفس من شانها ان تقلل من هذه الآثار الجهازية. تركز تقييماتنا علي التحقيق في الاستجابة المناعية المحلية لبناء تسليم المخدرات ، فضلا عن قدرتها علي كبح وظيفة الخلايا الليفية وتغيير البيئة المناعية المحلية. وتشمل النتائج الخاصة بالمرض في اختبار الجسم الذي يقيم علامات التليف.
وقد استخدمت الدعامات القابلة للتحلل من المخدرات في النماذج الحيوانية من الامراض في أنظمه الأعضاء المتعددة ، بما في ذلك مجري التنفس4. لأداره تضيق المسالك الهوائية أو الانهيار ، وقد استخدمت التحقيقات السابقة المخدرات المغلفة السيليكون والدعامات القائمة علي النيكل5. تم اختيار بناء PLLA-PCL لهذا الأسلوب بالذات بسبب الشخصية الخاصة به الإدمان المخدرات والقوه الميكانيكية في الظروف الفسيولوجية علي مدي فتره من 3 أسابيع, وقد ثبت في الدراسات المنشورة السابقة6. PLLA-PCL هو أيضا ماده متوافقة بيولوجيا وقابله للتحلل بالفعل وافقت عليها FDA4. وقد درست الدعامات المتوافقة مع الحيوية سيسبلاتين و MMC في نماذج الحيوانية الكبيرة مثل الأرانب والقطط. ومع ذلك ، في هذه النماذج الحيوانية ، لم توضع الدعامات في نموذج حيواني من المرض وزرعت transcervically. توفر هذه الدراسة طريقه فريدة لتقييم الدعامات المتوافقة مع الادويه الحيوية التي توضع عبر الفم في نموذج الماوس لإصابات المسالك الهوائية وتضيق الحنجرة. والدعامة الحيوية التي تفلت من المخدرات المناعية محليا ويمكن تصغيرها للدراسة في نموذج murine هي قيمه للبحوث السريرية المسبقة الانتقالية. المحاولات السابقة في استخدام الدعامات مع المواد الأخرى بنيات ولدت استجابات قويه الجسم الغريبة تفاقم التهاب الكامن الذي يميز الجهاز7. هذه المنهجية ، علي حد علمنا ، هي الاولي من نوعها لدراسة الآثار المناعية والمضادة لليفي لنظام توصيل الادويه المرتكزة علي الدعامات في نموذج murine من لتر. نموذج murine نفسه يوفر العديد من المزايا لدراسة اثار المخدرات المناعية علي القصبة الهوائية. ويمكن دراسة الفئران المعدلة وراثيا والأفواج التجريبية من الفئران الصحية والمريضة ، والتي يمكن ان تؤدي إلى استنساخ التجريبية وتحسين فعاليه التكلفة. وعلاوة علي ذلك ، فان تسليم الدعامة transorally في القصبة الهوائية الماوس يحاكي التسليم السريري لهذه الدعامة في البشر ، والتي تسلط الضوء كذلك علي ميزه متعديه من هذه الطريقة. وأخيرا ، السهولة النسبية التي يمكن ان تنتج الدعامة PLLA-PCL مع المخدرات يسمح للتعديلات لتقديم العلاجات الدوائية البديلة التي تهدف إلى الحد من تشكيل ندبه في القصبة الهوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام التابعة لجامعه جونز هوبكنز (MO12M354).
1. اعداد راباميسين في plla-PCL
- اعداد قارورة زجاجيه اثنين (مع قبعات) من 70:30 البوليمر PLLA-PCL الحلول (اللزوجة المتاصله 1.3 − 1.8 DL/G ؛ جدول المواد) الحلول ، مع قارورة واحده تحتوي علي 1.0 ٪ راباميسين والاخر دون راباميسين.
- جعل 1.0 ٪ راباميسين التي تحتوي علي محلول البوليمر عن طريق أضافه 6 ملغ من راباميسين إلى 600 ملغ من 70:30 plla-PCL في قارورة زجاجيه.
- لمحلول البوليمر دون راباميسين (السيطرة) ، أضافه فقط 600 ملغ من 70:30 plla-PCL إلى قارورة زجاجيه.
- تحت غطاء الدخان ، أضافه 6 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى كل قارورة زجاجيه.
تحذير: ثنائي كلورو ميثان هي ماده مسببه للتاكل ويجب استخدام الماصات الزجاجية فقط. وتشمل احتياطات السلامة المناسبة حماية العين الشخصية والقفازات. - أضافه 120 μL من الجلسرين لكل قارورة زجاجيه (لحل 2 ٪ الجلسرين).
ملاحظه: أضافه الجلسرين يسمح لزيادة المرونة وانخفاض صلابة في بناء الدعامات. - تلخيص قوارير الزجاج والسماح 70:30 plla-PCL مع وبدون راباميسين لحل والتجانس ل 6 − 12 ح.
ملاحظه: يمكن أيضا وضع قوارير زجاجيه علي منصة تهتز الدورية لحل أسرع.
2. اختبار التملص من rapamycin
- ماصه 1 مل من 70:30 حل PLLA-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين في صحن بيتري الزجاج.
ملاحظه: هذا الحجم من 70:30 الحل plla-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين سوف تحتوي علي 120 ميكروغرام من راباميسين ويمثل المبلغ الإجمالي من راباميسين في كل بناء. ويمكن استخدام احجام وتركيزات بديله. - السماح 70:30 PLLA-PCL مع 1 ٪ راتاميسين تتصلب إلى قرص مسطح في صحن بيتري الزجاج.
- مره واحده تصلب ، ووضع القرص في 2 مل من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني ، pH 7.4) واحتضان في 37 درجه مئوية الغرفة.
- جمع واستبدال تلفزيوني (2 مل) كل 24 ح واستخدام المجمعة التي جمعت لتحليل اللوني السائل عاليه الأداء (hplc) من محتوي راباميسين.
- استخدام التلقائية والعمود C18 4.6 cm x 250 mm hplc لتشغيل عينات من خلال حاقن التلقائي مع التخفيفات التسلسلية من راباميسين لإنشاء منحني قياسي معايره. تشغيل كل عينه في ثلاث نسخ.
ملاحظه: التخفيفات التسلسلية من راباميسين ليتم اختبارها تشمل 10 ٪ ، 1 ٪ ، 0.1 ٪ ، و 0.01 ٪. - استخدام مرحله المحمول من المياه الصف hplc و اسيتلونيتريل مع حجم 10/90/حجم مع معدل تدفق 2.0 mL/min. تعيين الامتصاص خلال hplc ل راباميسين إلى 280 nm.
ملاحظه: يظهر الشكل 1 التملص من راباميسين علي مدي 14 يوما.
3-إنشاء الدعامات الهوائية لممرات المجاري
ملاحظه: نفذ الخطوات 3-2-3-9 باستخدام مواد معقمه وتقنيه معقمه لتجنب التلوث الذي من شانه ان يؤثر في التطبيقات المجرية والانبوبيه.
- اعداد حلول plla-PCL التي تحتوي علي راباميسين كما هو موضح في القسم 1.
- باستخدام ماصه الزجاج باستور مع بالون مطاطي ، وتطبيق 1 مل من محلول PLLA-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين علي الاوعيه الوريدية من 22 جرام الإيثيلين بروبيلين القائمة علي أساس البروبيلين (جدول المواد). عقد الاوعيه الدموية في يد واحده واستخدام ماصه الزجاج لإسقاط حل PLLA-PCL علي مقياس الاوعيه. ببطء تدوير الاوعيه الدموية لضمان تغطيه متجانسة من الاوعيه الدموية مع حل PLLA-PCL.
ملاحظه: في البداية ، سيكون الحل PLLA-PCL رقيقه ، ولكن كما يتبخر ثنائي كلورو ميثان اثناء التطبيق علي الاوعيه الدموية ، فان الحل تصبح أكثر لزجه إلى العفن علي الاوعيه الدموية. تحويل الاوعيه الدموية بشكل مستمر اثناء التطبيق مفيد. يجب ان يتم هذه الخطوة ببطء وبدقه لضمان سماكه متسقة من الدعامة. - دعم الاوعيه الدموية مصبوب مع غيض من الاوعيه الدموية التي تواجه الهبوط والتي علي حافه صحن بيتري الزجاج لتجفيف.
- تسمح الدعامات لتجف لمده 24 ساعة في غطاء المحرك الفراغي في درجه حرارة الغرفة (الشكل 2ا).
- أزاله بناء الدعامات من الاوعيه الاساسيه من خلال التواء بلطف القسطرة الاساسيه الحرة والانزلاق بها من الدعامة مصبوب (الشكل 2ب).
- تحقق من الدعامة بحذر لأي عيوب قد تكون قد نتجت اثناء عمليه الصب. في حاله وجود عيب في الدعامة المحملة ، تخلص منه.
- تقليم كل نهاية من الدعامة المحملة مع مقص مستقيم غرامه بحيث حواف محوريه.
- باستخدام مقص مستقيم غرامه ، وقطع 3 أجزاء محوريه مم من الدعامة المدلي بها لاستخدامها في نموذج الماوس من لتر (الشكل 2ج).
ملاحظه: حوالي 8 الدعامات يمكن ان تكون مصنوعة من الاوعيه الدموية المسبوكة واحد ، مع كل الدعامات 3 ملم تحتوي علي 120 ميكروغرام من rapamycin. - تحميل الدعامات 3 ملم علي القسطرة الوريدية 22 جديده لاستخدامها في نموذج الماوس من لتر (الشكل 1).
4. التحريض تضيق الحنجرة في الفئران
- قبل اجراء في دراسات الماوس المجرية الحصول علي موافقه من لجنه رعاية الحيوانية والاستخدام.
- تخدير الذكر البالغ من العمر 9 أسابيع C57BL/6 عن طريق إعطاء حقنه داخل الصفاق من الكيتامين (80 − 100 مغ/كغ) و اكسيليازين (5 − 10 مغ/كغ).
ملاحظه: سلالات أخرى من الفئران يمكن استبدالها ، ولكن من المستحسن ان يكون وزن الفئران بين 20 − 27 غرام. - عشوائي الفئران في مجموعه تجريبية (أصابه تشيموميتشانيكال مع وضع 1 ٪ rapamycin التي تحتوي علي الدعامة PLLA-PCL) واثنين من مجموعات التحكم: 1) تشيموميتشانيكال أصابه مع وضع دعامة PLLA-PCL ، 2) تشيموميتشانيكال أصابه دون وضع الدعامات.
- وضع الماوس علي منصة الجراحية في موقف ضعيف. استخدام حلقه صغيره من الموضوع الملصقة علي الجانب العلوي من منصة لتوسيع العمود الفقري العنقي عن طريق حلقات حول القواطع المركزية.
- Affix اليدين والساقيين من الماوس إلى الجدول باستخدام قطعه 2 بوصه من الشريط. قرصه مخلب الماوس للتاكد من انه قد كان التخدير الكافي.
- ثم يجهز الموقع الجراحي. يجب أزاله الفراء الفوقي ويجب تنظيف الجلد (بالتناوب اليود أو فرك الكلوركسيدين مع الكحول أو مطهر الجلد المخفف) ثلاث مرات. يجب ان تكون المنطقة مغطاه بالقفازات المعقمة. وينبغي وضع الاداات المعقمة علي سطح معقم عندما لا تكون في الاستخدام.
- جعل 1.5 سم الخط الأوسط شق عمودي في عنق الماوس باستخدام غرامه مقص قزحية المنحني. يقسم الغدة الصعتريه الفوقية والفصين الناتجين لتصور القصبة الهوائية. تقسيم العضلات الفوقية المفرطة والدرقية (الحزام) في المرفق المتفوق ثنائيا.
ملاحظه: يجب ان يكون مجمع الحنجرة بأكمله مكشوفا تماما بعد هذا. - مرر 22 جرام من الشعيرات عبر الحنجرة في القصبة الهوائية. استخدام ملقط صغير لتطبيق الضغط علي الحنجرة الاماميه للماوس للمساعدة في وضع الصحيح للاوعيه الدموية. تصور الاوعيه الدموية البيضاء من خلال القصبة الهوائية لضمان الوضع الصحيح (غير المريء).
ملاحظه: القصبة الهوائية الماوس رقيقه للغاية سيتم تصور الاوعيه الدموية البيضاء من خلال القصبة الهوائية الشفافة. - مرر فرشاه السلك المغلفة بالجفن من خلال مقياس الشعيرات المدرج.
- ببطء سحب الاوعيه الدموية بحيث لا تبقي سوي فرشاه سلك في القصبة الهوائية.
- تطبيق الضغط المضاد باستخدام ملقط غرامه علي القصبة الهوائية لتعطيل التجويف الرغامي ميكانيكيا مع فرشاه الأسلاك.
- أعد تركيب الاوعيه الدموية في القصبة الهوائية فوق الفرشاة السلكية.
- أزاله فرشاه الأسلاك وأعاده تطبيق bleomycin.
- كرر الخطوات 4.8 − 4.12 ما مجموعه 5x. تطبيق بليوميسين علي الفرشاة بين كل تطبيق.
ملاحظه: يمكن العثور علي التحقق من صحة ووصف هذا النموذج في هليل وآخرون8. - أزاله مقياس الاوعيه الدموية من القصبة الهوائية الماوس.
ملاحظه: إذا لم يتم وضع الدعامات ، يمكن إغلاق الشق باستخدام غراء الانسجه.
5. وضع الدعامات PLLA-PCL عبر الفم في الفئران
- حمل دعامة واحده بحجم 3 مم علي مقياس وعائي 22 غ فارغ (الشكل 3ا).
ملاحظه: يجب ان تبقي الدعامة 5 مم من طرف الاوعيه الدموية. - رسم خط عمودي اسود رقيقه علي الدعامات المحملة 3 مم.
ملاحظه: هذا الخط يسمح لتحسين التصور للدعامة في القصبة الهوائية. - عبر التنبيب الماوس مع الاوعيه الدموية التي تم تحميلها مسبقا مع الدعامة.
- تصور الدعامة علي مقياس الاوعيه في القصبة الهوائية من خلال شق عبر عنق الرحم (الشكل 3ب).
ملاحظه: القصبة الهوائية رقيقه جدا ، مما يسمح لصبغه سوداء علي الدعامة ليتم تصورها من خلال القصبة الهوائية. استخدم هذا لتاكيد موضع التعقب الصحيح. - امسك الدعامة في مكانها بالإمساك بالقصبة الهوائية من خلال شق عنق الرحم بملقط ناعم.
- أزاله الاوعيه الدموية عبر الفم مع الحفاظ علي قبضه علي الدعامة مع ملقط غرامه.
ملاحظه: من المهم للغاية عدم تطبيق الكثير من القوه علي الدعامة لعدم سحق التجويف عند أزاله الاوعيه الدموية. ومع ذلك ، مطلوب قوه كافيه لضمان عدم أزاله الدعامة مع الاوعيه الدموية. ويمكن استخدام سياليندوسكوبي mm 0.8 لتصور موقع ووضع الدعامة في القصبة الهوائية. - إغلاق شق عبر عنق الرحم مع الغراء الانسجه.
- السماح لكل الماوس لاستعاده مستوي نشاطها الأصلي قبل وضعه مره أخرى في قفصه.
6. اعداد النسيجية من العينات
- تخدير الفئران مع الفئران المخدرة المستنشقة والتضحية مع خلع عنق الرحم لكل بروتوكول الحيوانية بعد 7 ، 14 ، أو 21 يوما.
ملاحظه: استنادا إلى فتره الدراسة ، يمكن استخدام فترات زمنيه مختلفه (علي سبيل المثال ، 28 ، 30 يوما ، الخ). - ضع الماوس علي المنصة الجراحية كما هو موضح في الخطوات 4.4 و 4.5.
- أعاده فتح شق الرقبة علي الماوس باستخدام غرامه مقص قزحية المنحني.
- فضح القصبة الهوائية في الخطوة 4.6.
- تقسيم القصبة الهوائية البعيدة تحت مستوي الدعامة باستخدام مقص قزحية منحنيه غرامه.
- تقسيم القصبة الهوائية القريبة تحت الحنجرة وفوق الدعامة باستخدام مقص القزحية المنحنية غرامه.
ملاحظه: من المهم تقسيم القصبة الهوائية البعيدة أولا لمنع القصبة الهوائية من التراجع في الصدر. - افصل القصبة الهوائية المنقسمة عن المريء وأزل القصبة الهوائية من الفاره.
ملاحظه: سيتم الاحتفاظ الدعامات لا يزال داخل القصبة الهوائية الماوس. - أزاله الدعامات من القصبة الهوائية وإصلاح في 10 ٪ فورالين ل 24 ساعة.
- تضمين formalin-ثابت الفئران القصبة الهوائية العينات في البارافين مع نهاية البعيدة المنحى سوبريورلي بحيث يمكن اجراء التخفيضات المحورية من القصبة الهوائية في الخطوة التالية.
- قطع 5 ميكرون المقاطع من القصبة الهوائية الماوس جزءا لا يتجزا من البارافين باستخدام ميكروتومي.
ملاحظه: يجب قطع العينات بالمحاور بدءا من القصبة الهوائية البعيدة. - الحصول علي 5 ميكرون القسم التمثيلي كل 250 μm علي طول العينة.
- كامل H & E وصمه عار علي كل قسم تمثيلي.
- المغادرين الشرائح عن طريق وضع في الزيلين 2x لكل شريحة لمده 3 دقائق.
- ضع الشرائح في 100 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه ، 95 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه ، و 70 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه لترطيب.
- اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده 2 دقيقه.
- وصمه عار الشرائح في الهيلوكسيلين لمده 3 − 5 دقيقه.
- اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده 5 دقائق.
- وضع الشرائح في 1 ٪ حمض الكحول لمده 1 دقيقه.
- اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده دقيقه واحده.
- شطف في 0.2 ٪ ماء الأمونيا لمده 30 ثانيه.
- شطف الشرائح في ماء الصنبور تشغيل لمده 5 دقائق. تراجع في 95 ٪ الايثانول 10x.
- ايوسين وصمه عار من خلال وضع الشريحة في يوزين phloxine ل 30 s.
- ديهيدرات الشرائح عن طريق وضع في 95 ٪ الايثانول لمده 5 دقائق ، تليها الايثانول المطلق 2x لمده 5 دقائق.
- مكان في اكسيلين 2x لمده 5 دقائق.
- جبل الشرائح مع المتوسطة القائمة علي التثبيت اكسيلين.
- قياس سماكه بروبينا لأمينا كما هو موضح في هليل وآخرون8.
7. التوافق الحيوي الدعامات في الجسم المجري
- اعداد أقسام الانسجه كما في الخطوات 6.1 − 6.4. لا تقم بازاله الدعامات من هذه الأقسام الرغامية من أجل تصور التغيرات في التهاب بالنسبة لموقع الدعامة داخل تجويف القصبة الهوائية.
- لتحديد استجابه الجسم الغريبة الحاده إلى الدعامة ، ومراقبه الضامة والنشاط خليه T باستخدام CD3 و F4/80 علامات.
ملاحظه: يمكن أيضا استخدام علامات أخرى لتحديد رد الفعل التهابي الحاد علي الدعامة. - الحصول علي قطع 5 ميكرومتر من القصبة الهوائية المضمنة البارافين علي الشرائح المائية المتاحة تجاريا بالاضافه إلى (جدول المواد). ضع قسمين علي كل شريحة.
ملاحظه: يجب ان تكون هذه المقاطع من منطقه القصبة الهوائية حيث وضعت الدعامة PLLA-PCL.
- لتحديد استجابه الجسم الغريبة الحاده إلى الدعامة ، ومراقبه الضامة والنشاط خليه T باستخدام CD3 و F4/80 علامات.
- ضع الشرائح في الزيلين 2x لمده 5 دقائق لكل منهما.
- ضع الشرائح في 100 ٪ الايثانول 2x لمده 3 دقائق لكل منهما.
- ضع الشرائح في 95 ٪ الايثانول لمده 1 دقيقه.
- وضع الشرائح في رف تلطيخ الانسجه بحيث يتم مغمورة في المخزن المؤقت استرداد مستضد (جدول المواد) ومن ثم وضع في باخرة الخضار مع الماء المغلي لمده 20 دقيقه.
- أزاله الرفوف تلطيخ من الباخرة وتجاهل المخزن المؤقت استرداد antigen.
- استبدال المخزن المؤقت مع 1 مل من تلفزيوني.
- وضع الشرائح في مربع تلطيخ الرطب لمده دقيقه واحده.
- تجاهل العروض التلفزيونية واحتضان الشرائح مع النسر المعدل دولبيكو المتوسطة (DMEM) مع 10 ٪ لمده 30 دقيقه.
- تجاهل DMEM وأضافه خليط من اثنين من الأجسام المضادة الاساسيه التي أثيرت في الأنواع المختلفة. تغطيه الشرائح مع فيلم البارافين واحتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في غرفه مظلمة.
ملاحظه: في هذا البروتوكول الأرنب المضادة لCD3 والفئران المضادة F4/80 (جدول المواد) واستخدمت. - اغسل الشرائح في 3x تلفزيوني لمده 5 دقائق.
- احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بأنواع الأجسام المضادة الاساسيه (جدول المواد) المخففة في dmem بنسبه 10% لمده 0.5 − 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
- اغسل الشرائح في 3x التلفزيونية لمده 5 دقائق في الظلام.
- جبل الشرائح علي الشفتين مع قطره من المتوسطة المتصاعدة مع 4 ' 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI). خزن الشرائح في الظلام عند 20 درجه مئوية أو 4 درجات مئوية.
- راقب الشرائح الملونة علي المجهر البؤري الضوئي بالليزر والصورة.
- تحديد العدد الإجمالي للخلايا الملوثة مع DAPI والأجسام المضادة ذات الفائدة للمقارنة مع القصبة الهوائية غير المصابة.
8. الماوس القصبة الهوائية تحليل التعبير الجيني الكمي
- جمع القصبة الهوائية الماوس كما هو موضح في الخطوات 6.1 − 6.7 وأزاله الدعامات.
ملاحظه: يمكن تخزين الرغامي الفار المقطوع في 80 درجه مئوية الفريزر لمده تصل إلى 2 سنوات. - المجففة الانسجه الرغامي حصادها في الخطوة 8.1 باستخدام مقص غرامه ومزيد من التجانس باستخدام حبه الخالط مطحنه مع 1.4 مم الخرز السيراميك (جدول المواد) كجزء من المتاحة تجاريا المستندة إلى العمود الريبي استخراج مجموعه (جدول المواد).
ملاحظه: إعدادات الخالط مطحنه حبه = 1 40 s دوره في 6 م/ث. - استخراج الحمض الريبي النيبالي من محلله الرغامي باستخدام العمود القائم علي استخراج وتنقيه عده (جدول المواد) بعد تعليمات الشركة المصنعة.
- تحديد كميه الحمض الريبي النيبالي من كل عينه باستخدام مقياس طيفي (جدول المواد).
ملاحظه: يتم تقييم نقاء الحمض الريبي النيبالي باستخدام نسبه 260/230 نانومتر مع عينه الحمض الريبي النيبالي النقي القراءة 2.0. - إنشاء DNA التكميلية من الحمض النووي الريبي المستخرجة باستخدام النسخ العكسي (جدول المواد) وثيرموسيكلير مع الإعدادات التالية: 5 دقيقه عند 25 درجه مئوية (فتيله) ، 46 درجه مئوية لمده 30 دقيقه (عكس النسخ) ، ثم 95 درجه مئوية لمده 1 دقيقه (تعطيل النسخ العكسي).
- تمييع عينات الحمض النووي التكميلية مع المياه الحرة RNase إلى تركيز من 10 − 25 نانوغرام/مل لاستخدامها في الوقت الحقيقي الكمي PCR.
- مزيج 1 μL من الحمض النووي التكميلي (10 − 25 نانوغرام/مل) مع 10 μL من المزيج PCR (جدول المواد) ، 8 Μl من ddh2O و 0.5 Μl من 10 μM إلى الامام والإشعال العكسي لجين الفائدة في بئر واحده من لوحه PCR 96 (جدول المواد).
ملاحظه: يجب ان يكون إجمالي وحده التخزين في كل بئر 20 μL. وينبغي لكل بئر علي لوحه 96 جيدا تحتوي علي عينه واحده فقط وجين واحد من الفائدة. - كرر الخطوات 8.1 – 8.7 لجميع الجينات المثيرة للاهتمام وتشغيل كل عينه لكل جين في ثلاث نسخ.
ملاحظه: تستخدم عاده الإشعال الامامي والعكسي الخاص بالجينات (جدول المواد) للكولاجين 1 ، والكولاجين 3 ، والجينات المرجعية β-actin للتحقيق في علامات التليف. - وضع لوحه جيدا 96 علي اله PCR الكمية في الوقت الحقيقي والبدء في البروتوكول التالي: تفسد في 95 درجه مئوية ل 15 ثانيه واننيل وتمتد في 60 درجه مئوية ل 60 s لدورات 40.
- تطبيع قيمه عتبه الدورة (CT) للكشف عن المنتجات الجينية لكل جين من الفائدة (غوى) إلى القيمة المقطعية للجينات المرجعية β-actin لجميع العينات للحصول علي ΔCT لكل غوى. ثم ، قارن قيم ΔCT لكل غوى للعينات المعالجة وغير المعالجة لتوليد ΔΔCT.
ملاحظه: عتبه الدورة هي النقطة علي منحني التضخيم عند وجود كميه محدده سلفا من المنتج الجيني (ΔRn). يجب تحديد قيمه ΔRn لكل رد فعل لكل جين الفائدة ويجب ان تقع علي الجزء الخطي من منحني التضخيم.
ملاحظه: ΔCT = CT (غوى) – CT (الجينات المرجعية); ΔΔCT = ΔCT (معالجه) – ΔCT (غير المعالجة). - حساب التغير النسبي في التعبير الجيني بين العينات المعالجة وغير المعالجة كتعبير عن تغيير الطية عن طريق حساب 2δδCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان بناء الدعامات plla-PCL القابلة للتحلل التي تم تحميلها مع راباميسين المستخدمة في هذه الدراسة قادره علي التملص راباميسين بطريقه متسقة ويمكن التنبؤ بها في الظروف الفسيولوجية (الشكل 1). يبين الشكل 2 الدعامة PLLA-PCL التي تم وضعها حول مقياس الشعيرات 22 جرام لاستخدامها في نموذج murine. لتحديد ما إذا كانت اثار التملص من راباميسين في القصبة الهوائية فعاله في التخفيف من التليف ، يمكن تقييم التغيرات المقيسة في التعبير الجيني المرتبط بالتليف وعلامات التهاب الحاد من خلال تحليل التعبير الجيني ، وقياس التدفق الخلوي ، والمناعي ، و ELISA. تم التدليل علي الوضع الناجح لدعامة مصغره في القصبة الهوائية للماوس باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه. ويرد في الشكل 3 رسمتخطيطي للأسلوب. يظهر الشكل 4 الدعامة المتوافقة بيولوجيا المصغرة في الموقع في القصبة الهوائية كما هو مبين في العلامة السوداء علي الدعامة ، والتي يتم تصورها من خلال القصبة الهوائية الشفافة للماوس. في التجارب الاوليه ، وذلك باستخدام سياليندوسكوبي مم 0.8 لتاكيد وضع الدعامة في القصبة الهوائية كان مفيدا. بعد 21 يوما ، للتاكد من ان وضع الدعامة عبر الفم كان فعالا ولم تهاجر الدعامة من وضعها الأصلي ، أعيد فتح شق الرقبة لتحديد موضع الدعامة. وكما هو مبين في الشكل 4ب، أظهرت علامة الصبغة السوداء للدعامة ان الدعامة حافظت علي مكانتها في القصبة الهوائية. ويظهر استئصال القصبة الهوائية بعد 21 يوما من العلاج مع الدعامة في الشكل 4ج.
تظهر الصور التمثيلية لاختبار التوافق الحيوي باستخدام تلطيخ النيون المناعي لعلامات التهاب الحاد والمزمن في الشكل 5. وهذا يدل علي ان بناء الدعامات PLLA-PCL (بدون راتاميسين) لم يكن مناعيا كما هو محدد من قبل العدد الأدنى من الخلايا المناعية الموجودة بعد التنسيب. ومن المهم ان نلاحظ انه في هذه الطريقة ، تم استخدام القصبات الهوائية العادية غير المصابة ووضع دعامة plla-PCL دون راباميسين لتحديد الاستجابة التهابيه للبناء نفسه.
بعد ذلك ، لتحديد ما إذا كان rapamycin-التملص PLLA-PCL الدعامة كانت فعاله في التخفيف من الندوب ، ونحن أظهرت في السابق تغييرات التعبير الجيني في علامات التهاب الحاد والتليف6. علي وجه التحديد ، هناك انخفاض 90.3 اضعاف (SEM ± 26.0 ؛ n = 4; p < 0.01) تخفيض في col1a1 في اليوم 4 ، فضلا عن علامات التهابيه حاده γ ، CD11b ، Arg-1 ، و IL-1b6. علي الرغم من ان الاختلافات في تغيير اضعاف لبعض الجينات لم تكن كبيره ، فمن الممكن انه مع مجموعه أكبر من الفئران ، ويمكن تحقيق اهميه. لتحديد ما إذا كانت هناك تغييرات علي القصبة الهوائية بسبب الإدمان المخدرات تشريحيا ، أو ما إذا كانت هناك تغييرات في القصبة الهوائية بسبب الجهد القوي شعاعي من قبل الدعامة ، وأظهرنا ان هناك انخفاضا في عرض بروبرونا صفيحه في تلك القصبات المعالجة مع الدعامات rapamycin
الشكل 1: راتاميسين PLLA-PCL التملص. وقد اظهر بناء plla-PCL الذي يحتوي علي 1 ٪ من راتاميسين إطلاق ثابت ويمكن التنبؤ به من راباميسين علي مدي فتره 14 يوما. تمثل نقاط البيانات متوسط ± SEM من الشطف عينات (ن = 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صب الدعامات. (ا) تم السماح لمحلول plla-PCL بالتجفيف حول مقياس وعائي 22 جرام. (ب) ثم تمت أزاله المدليبهامن الاوعيه الدموية. (ج) تم قطع الدعامات إلى أطوال 3 مم لاستخدامها في نموذج الماوس6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وضع الدعامات عبر الفم في الفئران. (ا) تم تحميل الدعامة علي مقياس وعائي فارغ ووضعت عبر الفم في القصبة الهوائية. (ب) يمكن رؤية الصبغة السوداء علي الدعامة من خلال شق عبر عنق الرحم لتاكيد وضعها في القصبة الهوائية بالماوس. (ج) رسم تمثيلي للدعامة في الموقع في القصبة الهوائية المريضة6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور الدعامات في الموقع. (ا-ب) ويمكن رؤية الدعامة مع علامات صبغ سوداء في الموقع في القصبة الهوائية murine. (ج) صوره للدعامة ومجمع الحنجرة الرغامي بعد الحصاد في 21 يوما6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: توافق الدعامات الحيوي. كشفت تلطيخ المناعية ل F4/80 (الضامة ، الكروكوفيري الأحمر) و CD3 (الكروم الأخضر ، اللمفاويات التائية) في اليوم 4 الحد الأدنى من الخلايا التهابيه في (ا) القصبة الهوائية غير المصابة و (ب) القصبة الهوائية مع دعامة plla-PCL. وهذا يتناقض مع (ج) القصبة الهوائية المصابة ، مع بروبروا لأمينا سميكه ووجود العديد من الخلايا مع الايجابيه F4/80 و CD3 تلطيخ6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر اهميه لبناء بنجاح واستخدام الدعامات المخدرات التملص في الجسم الحيوي هي 1) تحديد نسبه PLLA-PCL الأمثل لمعدل الإدمان المخدرات مرغوب فيه ، 2) تحديد التركيز المناسب من المخدرات ليكون التملص ، 3) صب الدعامات حول الاوعيه الدموية لاستخدامها في الجسم الفيفو ، و 4) نقل الدعامات عبر الفم إلى الفئران بعد الحث الكهربائي الهوائي دون التسبب في انسداد مجري التنفس المميت.
في حين ان هناك عده طرق لتسليم المخدرات باستخدام الدعامات في النماذج الحيوانية من امراض المسالك الهوائية ، وتطوير دعامة حيوية قادره علي تسليم المخدرات في نموذج murine المريضة هي الاولي. وفي تطوير هذه الطريقة لتسليم المخدرات ، أدخلت عده تعديلات علي الأسلوب. كان من المهم تحديد تركيب PLLA-PCL المناسب لصنع الدعامات التي كانت جامده ميكانيكيا بما فيه الكفاية لوضعها في القصبة الهوائية والبقاء في القصبة الهوائية علي الرغم من الإفرازات الفسيولوجية. وقد تقرر تكوين 70:30 من plla-PCL بناء علي الدعامات مع صب الاوعيه الدموية لأنه يمكن بنجاح الوت راباميسين في طبيعة القابلة للتنبؤ ، توضع في الأزياء أمنه وموثوق بها في نموذج الماوس لدينا ، ولا تتحلل في الفسيولوجية الظروف. وهناك جزء صعبه ويحتمل ان تعتمد علي الشركة المصنعة من هذا الأسلوب هو صب الدعامة حول الاوعيه الدموية. في البداية ، في بناء الدعامات المجرية ، وضعت 22 غ من الاوعيه الدموية داخل غيض من ماصه الزجاج وسكب محلول البوليمر في الفضاء بين الاوعيه الدموية وماصه الزجاج ، وتشكيل المدلي بها من الفضاء بين. ومع ذلك ، كان جدار الدعامات الناتجة عن هذه الطريقة في كثير من الأحيان رقيقه جدا ولم تكن قادره علي وضعها بشكل موثوق في القصبة الهوائية. الحد من الطريقة الحالية لصب الدعامات علي الاوعيه الدموية هو الاعتماد علي الشركة المصنعة للاتساق ، والحاجة إلى اهتمام دقيق بالتفاصيل لضمان التجانس في إنتاج الدعامات. ومن الضروري معالجه احتمالات التباين في السماكة بين الدعامات المحملة في الدراسات المقبلة. مع مزيد من الدراسات ، ونحن نامل في تصميم قالب ل 22 G angiocatheter محاطه بزجاج آخر أو مواد غير قابله للتاكل من هذا القبيل ان الفضاء بين الاوعيه الدموية والزجاج الغلاف هو 50 μm ، ونحن عازمون علي ان يكون سمك الجدار كافيه من الدعامة لسهوله الوضع في القصبة الهوائية.
هناك العديد من الفوائد لاستخدام دعامة حيوية لدراسة توصيل المخدرات إلى القصبة الهوائية المتضررة. عموما ، وقد ثبت الدعامات التي تتالف من المعدن أو السيليكون التي تم المغلفة مع البوليمر التي تحتوي علي المخدرات لإنتاج الانسجه الحبيبية والاستجابة التهابيه لجزء من القصبة الهوائية بالفعل ندوب. هذا الأسلوب ، الذي يستجوب استخدام الدعامات المصنوعة بالبالكامل من الجزيئات الحيوية التي هي متوافقة بيولوجيا وأيضا تطلق المخدرات المناعية بطريقه موثوق بها هو مفيد. كما يظهر الدعامة PLLA-PCL لتكون متوافقة بيولوجيا في نموذج murine ولا تثير استجابه التهابيه حاده. في دراسة الادويه التي يمكن ان تكافح التليف ، وذلك باستخدام الدعامات التي تتالف تماما من المواد المتوافقة بيولوجيا مثل PLLA-PCL كما هو موضح في هذا الأسلوب هو مفيد.
ميزه وسهوله استخدام هذه الطريقة لبناء الدعامات القابلة للاستخدام هو ان تكوين PLLA-PCL يمكن ان تكون متنوعة ، مما يسمح للاختلافات في التشكيلات الجانبية الإفراج عن المخدرات مختلطة في تكوين. الدراسات السابقة من المواد PLLA-PCL تظهر ان الاختلاف في يمزج PLLA-PCL يمكن ان يؤدي إلى تدهور أكبر من المواد ، مما يسمح لأسرع المخدرات الإفراج9. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام هذه الطريقة لبناء الدعامات التي يمكن وضعها في الفئران هو مفيد ، كما تم القيام بمعظم دراسات الدعامات لامراض المسالك الهوائية في الماشية أكبر10،11،12. استخدام نموذج الماوس التي يمكن تعديلها لنماذج الامراض المختلفة والسماح للاختبار الدعامات المخدرات التملص في حاله المريضة مثاليه. اختبار الدعامة المخدرة التملص في حاله المريضة والقدرة علي مقارنه فعاليتها لتلك الموجودة في الحيوانية دون مرض يسمح لمزيد من الصرامة التجريبية. هذا الأسلوب يظهر أيضا كيف يمكن وضع دعامة المخدرات التملص لمجري التنفس عبر الفم ، بدلا من الدراسات السابقة حيث تم زرع الدعامات جراحيا.
توضح هذه الدراسة منصة قابله للاستخدام للغاية لتطوير الدعامات والاختبار في نموذج حيواني صغير. ومع ذلك ، يجب النظر في عوامل أخرى لاستخدامها في المواد البشرية. ونظرا للطبيعة الثابتة والجامدة للدعامات ، فمن المرجح انه لا يمكن وضعها من خلال منظار القصبات المرن الذي يتم توجيهه ، ولكن يجب وضعها عبر الفم مع تنظير الحنجرة المباشر ومنظار القصبات الجامد. ومن الناحية المثالية ، سيتم وضع الدعامة بعد توسيع البالون من مجري التنفس للمساعدة في تخفيف الجفاف. من المحتملين لسلامه المرضي ، واحتمال الدعامة للهجرة هو مصدر قلق كبير لأنه يمكن ان يؤدي إلى الحياة التي تهدد المعيشة التسوية. وبشكل ثانوي ، لا بد أيضا من النظر في احتمال انسداد الدعامات بالنسبة لتراكم المخاط أو الدم. وهناك حاجه إلى مزيد من الاختبار والتطوير للتقليل من هذه المخاطر.
يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لاختبار الادويه المختلفة في مزيج PLLA-PCL لفهم المزيد عن كيفيه العلاجات المثبطة للمناعة المختلفة يمكن ان تخفف من تشكيل ندبه في القصبة الهوائية. لان مثل هذه الدعامات يمكن وضعها في الفئران ، وذلك باستخدام مجموعه أكبر من الفئران أو الفئران مع التعديلات الجينية لجينات تشكيل ندبه يمكن أيضا ان تختبر. يمكن ان تشمل التجارب المستقبلية أيضا فهم التغييرات في القصبة الهوائية التي يمكن ان تحدث بعد الزرع المزمن للدعامة (3 – 6 أشهر) والتغيرات في تجويف القصبة الهوائية وكذلك ملامح التعبير الجيني للعلامات التهابيه والتليف علامات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصال في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1K23DC014082 و 1K23DC014082 (الكسندر هليل). وقد دعمت هذه الدراسة أيضا ماليا من قبل الجمعية الثلاثية والكلية الامريكيه للجراحين (الكسندر هليل) ، ومؤسسه الجمعية الطبية الامريكيه ، شيكاغو ، IL (Madhavi Duvvuri) ومنحه T32 NIDCD التدريب (كيفن Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
