Summary
La sténose laryngotratrale résulte d'un dépôt pathologique de cicatrices qui rétrécit de façon critique les voies respiratoires trachéales et manque de thérapies médicales efficaces. À l'aide d'un stent PLLA-PCL (70% poly-L-lactiure et 30% de polycaprolactone) comme système local d'administration de médicaments, des thérapies potentielles visant à diminuer la prolifération des cicatrices dans la trachée peuvent être étudiées.
Abstract
La sténose laryngotratrachéle (LTS) est un rétrécissement pathologique du subglottis et de la trachée menant à l'obstruction extrathoracique et à l'essoufflement significatif. LTS résulte de dommages muqueux d'un corps étranger dans la trachée, menant aux dommages de tissu et à une réponse inflammatoire locale qui va mal, menant au dépôt du tissu pathologique de cicatrice. Le traitement du SLR est chirurgical en raison de l'absence de thérapies médicales efficaces. Le but de cette méthode est de construire un stent biocompatible qui peut être miniaturisé pour placer dans les souris avec LTS. Nous avons démontré qu'une construction de PLLA-PCL (70% poly-L-lactide et 30% de polycaprolactone) avait la force biomécanique optimale, était biocompatible, réalisable pour un stent de placement in vivo, et capable d'élusiper le médicament. Cette méthode fournit un système d'administration de médicaments pour tester divers agents immunomodulatoires afin d'inhiber localement l'inflammation et de réduire la fibrose des voies respiratoires. La fabrication des endoprothèses prend de 28 à 30 h et peut être reproduite facilement, ce qui permet d'expérimenter avec de grandes cohortes. Ici, nous avons incorporé la rapamycine médicament dans l'endoprothèse pour tester son efficacité dans la réduction de la fibrose et le dépôt de collagène. Les résultats ont indiqué que les tentes de PLLA-PCL ont montré la libération fiable de rapamycine, étaient mécaniquement stables dans des conditions physiologiques, et étaient biocompatibles, induisant peu de réponse inflammatoire dans la trachée. En outre, les endoprothèses PLLA-PCL de rapamycine-eluting ont réduit la formation de cicatrice dans la trachée in vivo.
Introduction
La sténose laryngotratrachéale (LTS) est un rétrécissement pathologique de la trachée le plus souvent dû aux dommages iatrogènes de post-intubation. La combinaison de la colonisation bactérienne, de la réponse de corps étranger à un tube trachéochéatif ou endotrachéal, et des facteurs patient-spécifiques mènent à une réponse inflammatoire anormale. Cette réponse immunitaire inadaptée conduit au dépôt de collagène dans la trachée, ayant pour résultat le rétrécissement luminal de la trachée et la sténose suivante1,2. Comme le traitement actuel pour cette maladie est principalement chirurgical, le développement d'un paradigme de traitement médicalement basé alternative ciblant les voies inflammatoires et profibrotiques aberrantes qui mènent au dépôt excessif de collagène a été étudié. La rapamycine, qui inhibe le complexe de signalisation mTOR, a été montrée pour avoir des effets immunosuppresseurs aussi bien qu'un effet antifibroblaste robuste. Cependant, lorsque la rapamycine est administrée de façon systémique, les effets secondaires courants (p. ex. hyperlipidémie, anémie, thrombocytopenie) peuvent être prononcés3. Le but de notre méthodologie est de développer un véhicule pour l'administration locale de médicaments praticable pour une utilisation dans les voies respiratoires qui réduirait ces effets systémiques. Nos évaluations se concentrent sur l'étude de la réponse immunitaire locale à la construction de l'administration de médicaments ainsi que sa capacité à inhiber la fonction du fibroblaste et à modifier le microenvironnement immunitaire local. Les résultats spécifiques à la maladie comprennent des tests in vivo qui évaluent les marqueurs de la fibrose.
Des endoprothèses biodégradables ont été utilisées dans les modèles animaux de la maladie dans plusieurs systèmes d'organes, y compris les voies respiratoires4. Pour la gestion de la sténose ou de l'effondrement des voies respiratoires, des enquêtes antérieures ont utilisé du silicone enduit de drogue et des endoprothèses à base de nickel5. Une construction de PLLA-PCL a été choisie pour cette méthode particulière en raison de son profil d'élution de drogue et de la force mécanique dans des conditions physiologiques sur une période de 3 semaines, qui a été démontrée dans les études éditées précédentes6. PLLA-PCL est également un matériau biocompatible et biodégradable déjà approuvé par la FDA4. Les endoprothèses biocompatibles en cequissant le cisplatine et le MMC ont été étudiées dans de grands modèles animaux tels que les lapins et les chiens. Cependant, dans ces modèles animaux, les endoprothèses n'ont pas été placées dans un modèle animal de la maladie et ont été implantées transcervicalement. Cette étude fournit une méthode unique pour évaluer un stent biocompatible de drogue-élutage placé transorally dans un modèle de souris des dommages de voie aérienne et de la sténose laryngotraheal. Un stent biocompatible qui élude un médicament immunomodulateur localement et peut être miniaturisé pour l'étude dans un modèle murine est valable pour la recherche préclinique translationnelle. Les tentatives précédentes à l'utilisation d'endoprothèse avec d'autres constructions matérielles ont généré des réponses robustes de corps étranger aggravant l'inflammation fondamentale qui distingue LTS7. Cette méthodologie, à notre connaissance, est la première de son genre à étudier les effets immunomodulatoires et antifibrotiques d'un système d'administration de drogue à base d'endoprothèse dans un modèle murine de LTS. Le modèle murine lui-même offre plusieurs avantages pour étudier les effets d'un médicament immunomodulateur sur la trachée. Des souris génétiquement modifiées et des cohortes expérimentales de souris saines et malades peuvent être étudiées, ce qui peut mener à une reproductibilité expérimentale et améliorer la rentabilité. En outre, la livraison de l'endoprothèse transoralement dans la trachée de souris imite la livraison clinique d'un tel stent chez l'homme, qui accentue davantage l'avantage translationnel de cette méthode. Enfin, la facilité relative avec laquelle l'endoprothèse PLLA-PCL avec le médicament peut être produite permet des modifications pour fournir d'autres thérapies médicamenteuses visant à réduire la formation de cicatrices dans la trachée.
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Protocol
REMARQUE : Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins (MO12M354).
1. Préparation de la rapamycine en PLLA-PCL
- Préparer deux flacons en verre (avec bouchons) de 70:30 solutions de polymère PLLA-PCL (viscosité inhérente 1,3 à 1,8 DL/G; Tableau des matériaux) solutions, avec une fiole contenant 1,0% de rapamycine et l'autre sans rapamycine.
- Faire une solution de 1,0% de rapamycine contenant des polymères en ajoutant 6 mg de rapamycine à 600 mg de 70:30 PLLA-PCL dans un flacon de verre.
- Pour la solution de polymère sans rapamycine (contrôle), ajoutez seulement 600 mg de 70:30 PLLA-PCL au flacon de verre.
- Sous une hotte de fumée, ajouter 6 ml de dichlorométhane à chaque flacon de verre.
CAUTION: Le dichlorométhane est un matériau corrosif et seules les pipettes en verre doivent être utilisées. Les précautions de sécurité appropriées comprennent la protection oculaire personnelle et des gants. - Ajouter 120 l de glycérol à chaque flacon de verre (pour 2 % de solution de glycérol).
REMARQUE : L'ajout de glycérol permet une plus grande flexibilité et une diminution de la rigidité dans la construction de l'endoprothèse. - Récapitulez les flacons de verre et laissez 70:30 PLLA-PCL avec et sans rapamycine de se dissoudre et d'homogénéiser pendant 6 à 12 h.
REMARQUE : Les flacons en verre peuvent également être placés sur une plate-forme tournante de secousse pour une dissolution plus rapide.
2. Test d'élution de Rapamycin
- Pipette 1 mL de 70:30 PLLA-PCL solution contenant 1% rapamycine dans un plat en verre Petri.
REMARQUE : Ce volume de 70:30 PLLA-PCL solution contenant 1% de rapamycine contiendra 120 g de rapamycine et représente la quantité totale de rapamycine dans chaque construction. D'autres volumes et concentrations peuvent être utilisés. - Laisser 70:30 PLLA-PCL avec 1% de rapamycine pour durcir dans un disque plat dans le plat en verre Petri.
- Une fois durci, placez le disque dans 2 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) et incubez-le dans une chambre à 37 oC.
- Recueillir et remplacer PBS (2 mL) tous les 24 h et utiliser le PBS collecté pour l'analyse de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) de la teneur en rapamycine.
- Utilisez un autosampler et une colonne C18 4,6 cm x 250 mm HPLC pour faire passer des échantillons à travers l'injecteur d'autosampler ainsi que des dilutions en série de rapamycine pour créer une courbe standard calibrée. Exécuter chaque échantillon en triple.
REMARQUE : Les dilutions en série de la rapamycine à tester comprennent 10 %, 1 %, 0,1 % et 0,01 %. - Utilisez une phase mobile d'eau et d'acétonitrile de qualité HPLC avec un volume/volume de 10/90 avec un débit de 2,0 ml/min. Régler l'absorption pendant le HPLC pour la rapamycine à 280 nm.
REMARQUE : La figure 1 montre l'élution de la rapamycine sur une période de 14 jours.
3. Création d'endoprothèses de voies respiratoires murinep PLLA-PCL de rapamycine
REMARQUE : Effectuer des étapes 3.2-3.9 en utilisant des matériaux stériles et une technique stérile pour éviter la contamination qui influencerait les applications in vivo et in vitro.
- Préparer des solutions PLLA-PCL contenant de la rapamycine telles que décrites à la section 1.
- À l'aide d'une pipette Pasteur en verre avec un ballon en caoutchouc, appliquer 1 mL de solution PLLA-PCL contenant 1 % de rapamycine sur la canule veineuse d'un angiocatheter à base d'éthylène fluoré de 22 G(Tableau des matériaux). Tenez l'angiocatheter dans une main et utilisez la pipette en verre pour déposer la solution PLLA-PCL sur l'angiocatheter. Faites pivoter lentement l'angiocatheter pour assurer une couverture homogène de l'angiocatheter avec la solution PLLA-PCL.
REMARQUE : Dans un premier temps, la solution PLLA-PCL sera mince, mais comme le dichlorométhane s'évapore pendant l'application sur l'angiocatheter, la solution deviendra plus visqueuse pour mouler sur l'angiocatheter. Il est bénéfique de tourner continuellement l'angiocatheter pendant l'application. Cette étape doit être faite lentement et méticuleusement pour assurer l'épaisseur cohérente de l'endoprothèse. - Propulsez l'angiocatheter moulé avec la pointe de l'angiocatheter vers le bas et la pochoir sur le bord d'un plat Petri en verre pour le séchage.
- Laisser sécher les endoprothèses pendant 24 h dans un capot sous vide à température ambiante (figure 2A).
- Retirez la construction de l'endoprothèse de l'angiocatheter sous-jacent en tordant doucement le cathéter sous-jacent et en le faisant glisser hors de l'endoprothèse moulée (Figure 2B).
- Vérifiez l'endoprothèse circonscérientiellement pour tous les défauts qui peuvent avoir résulté pendant le processus de coulée. Si un défaut dans l'endoprothèse moulée est présent, jetez-le.
- Couper chaque extrémité de l'endoprothèse moulée avec de fines ciseaux droites de sorte que les bords sont axiaux.
- À l'aide de ciseaux fins et droits, couper des segments axiaux de 3 mm de l'endoprothèse moulée pour être utilisé dans un modèle de souris de LTS (Figure 2C).
REMARQUE : Environ 8 endoprothèses peuvent être fabriquées à partir d'un angiocathéter moulé, chaque stent de 3 mm contenant 120 g de rapamycine. - Chargez l'endoprothèse de 3 mm sur un nouveau cathéter veineux de 22 pour une utilisation dans un modèle de souris de LTS (Figure 1).
4. Induction de sténose laryngotratratrique chez la souris
- Avant de mener des études in vivo sur les souris, le Comité des soins et de l'utilisation des animaux a obtenu l'approbation.
- Anesthésiez un C57BL/6 mâle de 9 semaines en injectant de la kétamine (80 à 100 mg/kg) et de la xylazine (5 à 10 mg/kg).
REMARQUE: D'autres souches de souris peuvent être substituées, mais il est recommandé que le poids des souris soit entre 20 et 27 g. - Randomiser les souris dans un groupe expérimental (blessure chimiomécanique avec un placement d'un stent PLLA-PCL contenant de la rapamycine de 1 %) et deux groupes témoins : 1) lésions chimiomécaniques avec le placement d'un stent PLLA-PCL, 2) des lésions chimiomécaniques sans le placement d'un stent.
- Placez une souris sur une plate-forme chirurgicale en position de supine. Utilisez une petite boucle de fil apposée sur le dessus de la plate-forme pour étendre la colonne cervicale en la boucle autour des incisifs centraux.
- Affix les mains et les jambes de la souris à la table en utilisant des morceaux de ruban adhésif de 2 pouces. Pincez la patte de souris pour s'assurer qu'elle a eu une anesthésie adéquate.
- Le site chirurgical est ensuite préparé. La fourrure sus-jacente doit être enlevée et la peau doit être nettoyée (alternant gommage à l'iode ou chlorhexidine avec de l'alcool ou un désinfectant dilué pour la peau) trois fois. La zone doit être drapée et des gants stériles être portés. Les instruments stérilisés doivent être posés sur une surface stérile lorsqu'ils ne sont pas utilisés.
- Faire une incision verticale de 1,5 cm dans le cou de la souris à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins. Diviser le thymus sus-sus et latéraliser les deux lobes résultants pour visualiser la trachée. Divisez les muscles sternohyoid et sternothyroid (strap) sus-sus-sus-susaires à l'attachement supérieur bilatéralement.
REMARQUE : Le complexe laryngotracheal entier devrait être complètement exposé après ceci. - Passer un angiocatheter 22 G transorally à travers le larynx dans la trachée. Utilisez de petits forceps pour appliquer une pression sur le larynx antérieur de la souris pour aider à la bonne position de l'angiocatheter. Visualisez l'angiocatheter blanc à travers la trachée pour assurer un placement correct (non-oesophagine).
REMARQUE : La trachée de souris est extrêmement mince et l'angiocatheter blanc sera visualisé par la trachée translucide. - Passer une brosse en fil de bléomycine à travers l'angiocatheter inséré.
- Retirez lentement l'angiocatheter de sorte que seule la brosse métallique reste dans la trachée.
- Appliquer la contre-pression à l'aide de fines forceps sur la trachée pour perturber mécaniquement le lumen trachéal avec la brosse métallique.
- Réinsérer l'angiocatheter dans la trachée au-dessus de la brosse de fil.
- Retirez la brosse métallique et réappliquez la bleomycine.
- Répétez les étapes 4.8-4.12 un total de 5x. Appliquer de la bléomycine sur le pinceau entre chaque application.
REMARQUE : La validation et la description de ce modèle se trouvent dans Hillel et coll.8. - Retirer l'angiocathéter de la trachée de la souris.
REMARQUE : Si aucun endoprothèse ne doit être placé, l'incision peut être fermée avec de la colle de tissu.
5. Placement transoral d'endoprothèse De PLLA-PCL chez les souris
- Chargez un stent moulé de 3 mm sur un angiocatheter vide de 22 G (Figure 3A).
REMARQUE : L'endoprothèse doit reposer à 5 mm de la pointe de l'angiocatheter. - Dessinez une fine ligne verticale noire sur l'endoprothèse moulée de 3 mm.
REMARQUE: Cette ligne permet une meilleure visualisation de l'endoprothèse dans la trachée. - Intuber transoralement la souris avec l'angiocatheter qui a été préchargé avec l'endoprothèse.
- Visualisez l'endoprothèse sur l'angiocatheter dans la trachée par l'incision transcervicale (Figure 3B).
REMARQUE: La trachée est très mince, permettant au colorant noir sur l'endoprothèse d'être visualisé à travers la trachée. Utilisez-le pour confirmer le placement trachéal correct. - Maintenez l'endoprothèse en place en saisissant la trachée à travers l'incision transcervicale avec de fines forceps.
- Retirez l'angiocatheter transorally tout en maintenant une poignée sur l'endoprothèse avec les forceps fins.
REMARQUE : Il est extrêmement important de ne pas appliquer trop de force sur l'endoprothèse pour ne pas écraser le lumen lorsque l'angiocatheter est enlevé. Cependant, une force suffisante est nécessaire pour s'assurer que l'endoprothèse n'est pas enlevée avec l'angiocatheter. Un sialendoscope de 0,8 mm peut être utilisé pour visualiser l'emplacement et le placement de l'endoprothèse dans la trachée. - Fermer l'incision transcervicale avec de la colle de tissu.
- Permettre à chaque souris de retrouver son niveau d'activité d'origine avant de la remettre dans sa cage.
6. Préparation histologique des échantillons
- Anesthésiez les souris atteintes d'anesthésique inhalé et sacrifiez les souris avec une luxation cervicale par protocole animal après 7, 14 ou 21 jours.
REMARQUE : Selon la chronicité de l'étude, différents intervalles de temps peuvent être utilisés (p. ex., 28, 30 jours, etc.). - Placez une souris sur la plate-forme chirurgicale comme décrit dans les étapes 4.4 et 4.5.
- Rouvrir l'incision du cou sur la souris à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
- Exposer la trachée par étape 4.6.
- Divisez la trachée distale sous le niveau de l'endoprothèse à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
- Divisez la trachée proximale sous le larynx et au-dessus de l'endoprothèse à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
REMARQUE : Il est important de diviser la trachée distale d'abord pour empêcher la trachée de se rétracter dans le thorax. - Séparez la trachée divisée de l'œsophage postérieurement et retirez la trachée de la souris.
REMARQUE : Les endoprothèses seront toujours conservées dans la trachée de la souris. - Retirer l'endoprothèse de la trachée et fixer dans 10% de formaline pendant 24 h.
- Intégrez des spécimens de trachée de souris fixés par formaline dans la paraffine avec l'extrémité distale orientée de façon supérieure de sorte que les coupes axiales de la trachée puissent être faites dans l'étape suivante.
- Couper des sections de 5 m de la trachée de souris incorporée à la paraffine à l'aide d'un microtome.
REMARQUE : Les spécimens doivent être coupés axialement à partir de la trachée distale. - Obtenir une section représentative de 5 m tous les 250 m le long de la longueur du spécimen.
- Affichez-vous complètement sur chaque section représentative.
- Déparaffiniser les diapositives en plaçant dans le xylène 2x par diapositive pendant 3 min.
- Placez les lames dans 100 % d'éthanol pendant 2 min, 95 % d'éthanol pendant 2 min et 70 % d'éthanol pendant 2 min pour se réhydrater.
- Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 2 min.
- Tainer les lames dans l'hématoxylin pendant 3 à 5 min.
- Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 5 min.
- Placer les lames dans 1% d'alcool acide pendant 1 min.
- Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 1 min.
- Rincer à 0,2 % d'eau d'ammoniac pendant 30 s.
- Rincer les glissières dans l'eau courante du robinet pendant 5 min. Trempez dans 95 % d'éthanol 10x.
- Tache d'éosine en plaçant la glissière dans la phloxine d'éosine pendant 30 s.
- Déshydrater les lames en plaçant dans 95% d'éthanol pendant 5 min, suivi de l'éthanol absolu 2x pour 5 min.
- Placer en xylène 2x pendant 5 min.
- Montez les diapositives avec un support de montage à base de xylène.
- Mesurer l'épaisseur de la lamina propria telle que décrite dans Hillel et al.8.
7. Biocompatibilité stent in vivo
- Préparer les sections de tissus comme dans les étapes 6.1-6.4. Ne retirez pas l'endoprothèse de ces sections trachéales afin de visualiser les changements de l'inflammation par rapport à l'emplacement de l'endoprothèse dans le lumen de la trachée.
- Pour déterminer la réponse aigue du corps étranger à l'endoprothèse, observez l'activité des macrophages et des lymphocytes T à l'aide de marqueurs CD3 et F4/80.
REMARQUE : D'autres marqueurs peuvent également être utilisés pour déterminer la réaction inflammatoire aigue à l'endoprothèse. - Obtenir des sections coupées de 5 m de la trachée incorporée à la paraffine sur des glissières hydrophiles et des glissières disponibles dans le commerce(tableau des matériaux). Placez deux sections sur chaque toboggan.
REMARQUE : Ces sections devraient être d'une zone de la trachée où l'endoprothèse DePL-PCL a été placée.
- Pour déterminer la réponse aigue du corps étranger à l'endoprothèse, observez l'activité des macrophages et des lymphocytes T à l'aide de marqueurs CD3 et F4/80.
- Placer les lames en xylène 2x pendant 5 min chacune.
- Placer les glissières dans 100% d'éthanol 2x pendant 3 min chacune.
- Placer les lames dans 95 % d'éthanol pendant 1 min.
- Placez les diapositives dans une grille de coloration histologique afin qu'elles soient immergées dans un tampon de récupération d'antigène(Tableau des matériaux)et placez-les dans un vapeur de légumes avec de l'eau bouillante pendant 20 min.
- Retirez les grilles de coloration du vapeur et jetez le tampon de récupération d'antigène.
- Remplacer le tampon par 1 ml de PBS.
- Placer les diapositives dans une boîte à coloration humide pendant 1 min.
- Jetez le PBS et incubez les diapositives avec le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pendant 30 min.
- Jeter le DMEM et ajouter un mélange de deux anticorps primaires élevés chez différentes espèces. Couvrir les diapositives de film de paraffine et couver toute la nuit à 4 oC dans une pièce sombre.
REMARQUE: Dans ce protocole lapin anti-CD3 et rat anti-F4/80 (Tableau des matériaux) ont été utilisés. - Laver les diapositives en PBS 3x pendant 5 min.
- Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires spécifiques aux espèces d'anticorps primaires (Tableau des matériaux) dilués dans le DMEM avec 10% de FBS pour 0,5 à 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver les diapositives en PBS 3x pendant 5 min dans l'obscurité.
- Montez les toboggans sur des couvertures avec une goutte de support de montage avec 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Conserver les lames dans l'obscurité à 20 oC ou 4 oC.
- Observez les diapositives tachées sur un microscope confocal de balayage laser et photographiez.
- Quantifier le nombre total de cellules tachées de DAPI et d'anticorps d'intérêt pour la comparaison avec la trachée non blessée.
8. Analyse quantitative de l'expression des gènes de la trachée de souris
- Recueillir la trachée de souris comme décrit dans les étapes 6.1-6.7 et enlever l'endoprothèse.
REMARQUE : Les trachées de souris récoltées peuvent être conservées dans un congélateur de -80 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 2 ans. - Desïculez le tissu trachéal récolté à l'étape 8.1 à l'aide de ciseaux fins et homogénéisez davantage à l'aide d'un homogénéisateur de moulin à perles avec des perles en céramique de 1,4 mm (Tableau des matériaux) dans le cadre d'un kit d'extraction d'ARN à base de colonnes disponible dans le commerce (Tableau des matériaux).
REMARQUE : Réglages d'homogénéisateur de moulin à perles , un cycle de 40 s à 6 m/s. - Extraire l'ARN du lysate trachéal à l'aide d'un kit d'extraction et de purification à base de colonnes (Tableau des matériaux) suivant les instructions du fabricant.
- Quantifier l'ARN de chaque échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre (Tableau des matériaux).
REMARQUE : La pureté de l'ARN est évaluée à l'aide du rapport de 260/230 nm avec un échantillon d'ARN pur lisant 2.0. - Créer de l'ADN complémentaire à partir d'ARN extrait à l'aide de transcriptase inversée(tableau des matériaux)et d'un thermocycler avec les réglages suivants : 5 min à 25 oC (amorçage), 46 oC pour 30 min (transcription inversée), puis 95 oC pour 1 min (inactivation de la transcriptase inverse).
- Diluer les échantillons d'ADN complémentaires avec de l'eau libre de RNase à une concentration de 10 à 25 ng/mL pour une utilisation dans le PCR quantitatif en temps réel.
- Mélanger 1 l de l'ADN complémentaire (10 à 25 ng/mL) avec 10 oL d'un mastermix PCR (Tableau des matériaux), 8 l de ddH2O et 0,5 L de 10 apprêts avant et inversés pour le gène d'intérêt dans un puits d'une plaque PCR de 96 puits ( Tableaudes matériaux).
REMARQUE : Le volume total dans chaque puits doit être de 20 l. Chaque puits de la plaque de puits 96 ne doit contenir qu'un seul échantillon et un gène d'intérêt. - Répétez les étapes 8.1-8.7 pour tous les gènes d'intérêt et exécutez chaque échantillon pour chaque gène dans triplicate.
REMARQUE : Les amorces avant et inversées spécifiques aux gènes(Tableau des matériaux) pour le collagène 1, le collagène 3 et le gène de référence, l'actine, sont couramment utilisés pour étudier les marqueurs de la fibrose. - Placez la plaque de puits 96 sur la machine quantitative DE PCR en temps réel et lancez le protocole suivant : dénatureà95 oC pour 15 s et anneale et étendez-la à 60 oC pour 60 s pendant 40 cycles.
- Normaliser la valeur seuil de cycle (CT) pour la détection des produits géniques de chaque gène d'intérêt (GOI) à la valeur de CT pour le gène de référence - actine pour tous les échantillons afin d'obtenir un TCC pour chaque GOI. Ensuite, comparez les valeurs de l'ITC pour chaque GOI pour les échantillons traités et non traités afin de générer un TCC.
REMARQUE : Le seuil de cycle est le point sur la courbe d'amplification lorsqu'une quantité prédéterminée de produit génique est présente ( 'Rn). La valeur de chaque réaction doit être déterminée pour chaque gène d'intérêt et devrait tomber sur la partie linéaire de la courbe d'amplification.
REMARQUE : TCT et CT (GOI) - CT (gène de référence); CT 'CT 'CT (traité) 'CT 'CT (non traité). - Calculer le changement relatif dans l'expression des gènes entre les échantillons traités et non traités comme une expression de changement de pli en calculant 2CT.
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Representative Results
La construction d'endoprothèse stent Biodégradable PLLA-PCL chargée de rapamycine utilisée dans cette étude était capable d'éluder la rapamycine d'une manière cohérente et prévisible dans des conditions physiologiques (figure 1). La figure 2 montre l'endoprothèse PLLA-PCL projetée autour d'un angiocatheter de 22 G pour une utilisation dans un modèle murine de LTS. Pour déterminer si les effets de l'élution de rapamycine dans la trachée sont efficaces en atténuant la fibrose, les changements mesurés dans l'expression génique liée à la fibrose et les marqueurs de l'inflammation aigue peuvent être évalués par l'analyse d'expression génique, la cytométrie de flux, l'immunofluorescence, et ELISA. Le placement réussi d'un stent miniaturized dans la trachée de la souris utilisant la méthode décrite ci-dessus a été démontré. Un schéma de la méthode est indiqué dans la figure 3. La figure 4 montre l'endoprothèse biocompatible miniaturisée in situ dans la trachée comme indiqué par le marqueur noir sur l'endoprothèse, qui est visualisé à travers la trachée translucide de souris. Dans les premières expériences, l'utilisation d'un sialendoscope de 0,8 mm pour confirmer le placement de l'endoprothèse dans la trachée a été utile. Après 21 jours, pour confirmer que le placement transoral de l'endoprothèse était efficace et que l'endoprothèse n'avait pas migré de sa position initialement placée, l'incision du cou a été rouverte pour déterminer le placement de l'endoprothèse. Comme le montre la figure 4B, le marqueur de teinture noire de l'endoprothèse a montré que l'endoprothèse maintenait sa position dans la trachée. La résection de la trachée après 21 jours de traitement avec l'endoprothèse est indiquée dans la figure 4C.
Des images représentatives des tests de biocompatibilité utilisant la coloration immunofluorescente pour les marqueurs de l'inflammation aigue et chronique sont montrées dans la figure 5. Ceci a démontré que la construction d'endoprothèse de PLLA-PCL (sans rapamycine) n'était pas immunoréactive comme déterminé par le nombre minimal de cellules immunitaires présentes après placement. Il est important de noter que dans cette méthode, des trachées normales non blessées ont été employées et un stent de PLLA-PCL sans rapamycine a été placé pour déterminer la réponse inflammatoire à la construction elle-même.
Ensuite, pour déterminer si l'endoprothèse PLLA-PCL de rapamycine-eluting était efficace en atténuant des cicatrices, nous avons précédemment démontré des changements d'expression de gène dans des marqueurs de l'inflammation aigue et de la fibrose6. Plus précisément, il y a une réduction de 90,3 plis (SEM 26,0; n ' 4; p 'lt; 0.01) réduction de col1a1 au jour 4, aussi bien que les marqueurs inflammatoires aigus INF-, CD11b, Arg-1, et IL-1B6. Bien que les différences dans le changement de pli pour certains gènes n'étaient pas significatives, il est possible qu'avec une plus grande cohorte de souris, l'importance pourrait être atteinte. Pour déterminer s'il y avait des changements à la trachée due à l'élution de drogue histologiquement, ou s'il y avait des changements à la trachée dueàà à l'effort radial de force par l'endoprothèse, nous avons démontré qu'il y avait une diminution de la largeur de la propria de lamina dans ces trachées traitées avec des stents rapamycin-eluting comparés à ceux sans stents rapamycin-eluting6.
Figure 1 : L'élution de Rapamycin PLLA-PCL. La construction de PLLA-PCL contenant 1% de rapamycine a démontré une libération cohérente et prévisible de rapamycine sur une période de 14 jours. Les points de données représentent la moyenne de l'élution échantillonnée (n ' 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Casting de stent. (A) La solution PLLA-PCL a été autorisée à sécher autour d'un angiocatheter de 22 G. (B) Le plâtre a ensuite été retiré de l'angiocatheter. (C) Les endoprothèses ont été coupées à 3 mm de longueur pour une utilisation dans le modèle de souris6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Placement transoral de l'endoprothèse chez la souris. (A) L'endoprothèse a été chargée sur un angiocatheter vide et placée transorally dans la trachée. (B) Le marquage de colorant noir sur l'endoprothèse peut être vu par une incision transcervicale pour confirmer sa position dans la trachée de souris. (C) Dessin représentatif de l'endoprothèse in situ dans la trachée de souris malade6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Images in situ de stent. (A-B) L'endoprothèse avec des marques de colorant noir peut être vue in situ dans la trachée murine. (C) Une image de l'endoprothèse et du complexe laryngotrachéal murine après la récolte à 21 jours6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Biocompatibilité des stents. La coloration immunofluorescente pour F4/80 (macrophages, chromophore rouge) et CD3 (chromophore vert, T-lymphocytes) au jour 4 a indiqué les cellules inflammatoires minimales dans le (A) la trachée non blessée et (B)la trachée avec l'endoprothèse de PLLA-PCL. Cela contraste avec (C) une trachée blessée, avec une propria lamina épaissie et la présence de nombreuses cellules avec f4/80 positif et CD3 coloration6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les étapes les plus critiques pour construire et utiliser avec succès un stent d'élution de drogue in vivo sont 1) déterminer le rapport optimal De PLLA-PCL pour le taux d'élution de drogue souhaitable, 2) déterminer la concentration appropriée de drogue à élucer, 3) moulant les endoprothèses autour de l'angiocatheter pour l'utilisation in vivo, et 4) transorally livrant l'endoprothèse dans les souris après induction de LTS sans causer l'obstruction mortelle de voie aérienne.
Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour l'administration de médicaments à l'aide de stents dans les modèles animaux de la maladie des voies respiratoires, le développement d'un endoprothèse biocompatible capable de l'administration de médicaments dans un modèle murine malade est une première. En développant cette méthode pour l'administration de médicaments, plusieurs modifications ont été apportées à la méthode. Il était important de déterminer la composition appropriée de PLLA-PCL pour faire des endoprothèses qui étaient mécaniquement assez rigides pour être placées dans la trachée et pour rester dans la trachée en dépit des sécrétions physiologiques. Une composition 70:30 de PLLA-PCL a été décidée pour la construction d'endoprothèse avec un moulage d'angiocatheter parce qu'elle pourrait avec succès elute rapamycin dans une nature predicable, être placée dans une mode sûre et fiable dans notre modèle de souris, et ne pas dégrader dans physiologique Conditions. Une partie difficile et potentiellement dépendante du fabricant de cette méthode est de mouler le stent autour des angiocatheters. Initialement, dans la construction des endoprothèses in vivo, 22 G angiocatheters ont été placés à l'intérieur de la pointe d'une pipette en verre et la solution de polymère a été versée dans l'espace entre l'angiocatheter et la pipette en verre, formant un moulage de l'espace entre. Cependant, la paroi des endoprothèses résultant de cette méthode était souvent trop mince et n'était pas en mesure d'être placée de façon fiable dans la trachée. Une limitation de la méthode actuelle pour moulage des endoprothèses sur l'angiocatheter est la dépendance sur le fabricant pour la cohérence, et la nécessité d'une attention méticuleuse aux détails pour assurer l'homogénéité dans la production de stents. Le potentiel de variance de l'épaisseur entre les endoprothèses moulées doit être abordé dans les études futures. Avec d'autres études, nous espérons concevoir un moule pour un angiocatheter de 22 G entouré d'un autre verre ou matériau non corrosif de telle sorte que l'espace entre l'angiocatheter et l'enveloppe de verre est de 50 m, que nous avons déterminé être une épaisseur de mur adéquate de l'endoprothèse pour un placement facile dans la trachée.
Il y a plusieurs avantages à utiliser un stent biocompatible pour étudier la livraison de drogue à la trachée affectée. Dans l'ensemble, des endoprothèses composées de métal ou de silicone qui ont été recouvertes d'un polymère contenant le médicament ont été montrées pour produire le tissu de granulation et la réponse inflammatoire supplémentaire à une partie déjà marquée de la trachée. Cette méthode, qui interroge l'utilisation d'un stent entièrement fait de biomatériau qui est biocompatible et libère également un médicament immunomodulateur d'une manière fiable est avantageuse. Le stent de PLLA-PCL est également montré pour être biocompatible dans le modèle de murine et ne suscite pas une réponse inflammatoire aigue. En étudiant les médicaments qui peuvent combattre la fibrose, l'utilisation d'un stent entièrement composé de matériel biocompatible tel que PLLA-PCL tel que décrit dans cette méthode est bénéfique.
L'avantage et la facilité d'utiliser cette méthode pour construire des endoprothèses utilisables est que la composition de la PLLA-PCL peut être variée, permettant des différences dans les profils de libération pour le médicament mélangé dans la composition. Des études antérieures du matériau PLLA-PCL montrent que la variation des mélanges PLLA-PCL peut conduire à une plus grande dégradation du matériau, permettant une libération plus rapide de médicaments9. En outre, l'utilisation de cette méthode pour construire des endoprothèses qui peuvent être placés chez les souris est avantageuse, comme la plupart des études de stent pour la maladie des voies respiratoires ont été faites chez les grands animaux10,11,12. L'utilisation d'un modèle de souris qui peut être modifié pour différents paradigmes de la maladie et permettre de tester l'endoprothèse d'élinage de médicaments dans un état malade est idéal. Tester l'endoprothèse d'éludede de drogue dans un état malade et pouvoir comparer son efficacité à ceux chez les animaux sans maladie permet une plus grande rigueur expérimentale. Cette méthode montre également comment un stent d'élinage de drogue pour les voies respiratoires peut être placé transorally, par opposition aux études précédentes où des endoprothèses ont été implantées chirurgicalement.
Cette étude démontre une plate-forme très utilisable pour le développement et l'essai d'endoprothèses dans un modèle de petit animal. Cependant, d'autres facteurs d'utilisation chez les sujets humains doivent être pris en considération. Compte tenu de la nature ferme et rigide de l'endoprothèse, il ne peut probablement pas être placé à travers un bronchoscope flexible canalisé, mais devra être placé transorally avec la ryryngoscopie directe et bronchoscopie rigide. Idéalement, l'endoprothèse serait placée après la dilatation du ballon des voies respiratoires pour aider à atténuer la reposnose. De la perspective de la sécurité des patients, le potentiel de l'endoprothèse à migrer est une grande préoccupation car il pourrait potentiellement conduire à un compromis des voies respiratoires représentant un danger pour la vie. Deuxièmement, le potentiel d'obstruction de stent secondaire à l'accumulation de mucus ou de sang doit également être considéré. D'autres essais et développements sont nécessaires pour minimiser ces risques.
De futures études peuvent utiliser cette méthode pour tester différents médicaments dans le mélange PLLA-PCL pour comprendre davantage comment différents traitements immunosuppresseurs pourraient atténuer la formation de cicatrices dans la trachée. Étant donné que ces endoprothèses peuvent être placées chez des souris, l'utilisation d'une plus grande cohorte de souris ou de souris ayant des modifications génétiques aux gènes de formation de cicatrices peut également être testée. Les expériences futures peuvent également inclure la compréhension des changements à la trachée qui peuvent se produire après l'implantation chronique de l'endoprothèse (3-6 mois) et les changements à la lumena de la trachée ainsi que les profils d'expression génique des marqueurs inflammatoires et la fibrose Marqueurs.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
National Institute on Deafness and Other Communication Disorders of the National Institutes of Health sous les numéros de récompense 1K23DC014082 et 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Cette étude a également été soutenue financièrement par la Triological Society et l'American College of Surgeons (Alexander Hillel), l'American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) et une bourse de formation T32 NIDCD (Kevin Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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