Summary
Laryngotrachealstenose resultiert aus pathologischer Narbenablagerung, die die Luftröhre kritisch verengt und keine wirksamen medizinischen Therapien hat. Mit einem PLLA-PCL (70% Poly-L-Laktid und 30% Polycaprolacton) Stent als lokales Arzneimittelabgabesystem, können mögliche Therapien zur Verringerung der Narbenproliferation in der Luftröhre untersucht werden.
Abstract
Laryngotrachealstenose (LTS) ist eine pathologische Verengung der Subglottis und Luftröhre, die zu extrathorakaler Obstruktion und signifikanter Kurzatmigkeit führt. LTS resultiert aus Schleimhautverletzungen eines Fremdkörpers in der Luftröhre, was zu Gewebeschäden und einer lokalen Entzündungsreaktion führt, die schief geht, was zur Ablagerung von pathologischem Narbengewebe führt. Die Behandlung von LTS ist chirurgisch aufgrund des Mangels an wirksamen medizinischen Therapien. Der Zweck dieser Methode ist es, einen biokompatiblen Stent zu konstruieren, der miniaturisiert werden kann, um in Mäuse mit LTS zu platzieren. Wir haben gezeigt, dass ein PLLA-PCL-Konstrukt (70% Poly-L-Laktid und 30% Polycaprolacton) eine optimale biomechanische Festigkeit aufweist, biokompatibel, praktikabel für einen In-vivo-Platzierungsstent und in der Lage ist, Medikamente zu elutieren. Diese Methode bietet ein Arzneimittelabgabesystem zur Prüfung verschiedener immunmodulatorischen Wirkstoffe, um Entzündungen lokal zu hemmen und die Atemwegsfibrose zu reduzieren. Die Herstellung der Stents dauert 28 x 30 h und kann leicht reproduziert werden, so dass Experimente mit großen Kohorten möglich sind. Hier haben wir das Medikament Rapamycin in den Stent integriert, um seine Wirksamkeit bei der Verringerung der Fibrose und Kollagenablagerung zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass PLLA-PCL-Zelte eine zuverlässige Rapamycin-Freisetzung zeigten, unter physiologischen Bedingungen mechanisch stabil waren und biokompatibel waren, was zu einer geringen Entzündungsreaktion in der Luftröhre führte. Darüber hinaus reduzierte die rapamycin-eluierende PLLA-PCL-Stents die Narbenbildung in der Luftröhre in vivo.
Introduction
Laryngotrachealstenose (LTS) ist eine pathologische Verengung der Luftröhre am häufigsten aufgrund einer iatrogenen Postintubationsverletzung. Die Kombination von bakterieller Besiedlung, Fremdkörperreaktion auf eine Tracheostomie oder Endotrachealröhre und patientenspezifische Faktoren führen zu einer abnormen Entzündungsreaktion. Diese maladaptive Immunantwort führt zur Ablagerung von Kollagen in der Luftröhre, was zu einer luminalen Verengung der Luftröhre und anschließender Stenose1,2führt. Da die aktuelle Behandlung für diese Krankheit in erster Linie chirurgisch ist, wurde die Entwicklung eines alternativen medizinisch basierten Behandlungsparadigmas untersucht, das auf die abnormen entzündlichen und profibrotischen Bahnen abzielt, die zu einer übermäßigen Kollagenablagerung führen. Rapamycin, das den mTOR-Signalkomplex hemmt, hat gezeigt, dass es immunsuppressive Effekte sowie eine robuste Antifibroblasten-Wirkung hat. Wenn Rapamycin jedoch systemisch verabreicht wird, können häufige Nebenwirkungen (z. B. Hyperlipidämie, Anämie, Thrombozytopenie) ausgesprochen werden3. Der Zweck unserer Methodik ist es, ein Fahrzeug für die lokale Medikamentenabgabe zu entwickeln, das für den Einsatz in der Atemwege praktikabel ist, das diese systemischen Effekte mindern würde. Unsere Bewertungen konzentrieren sich auf die Untersuchung der lokalen Immunantwort auf das Wirkstoffabgabekonstrukt sowie seiner Fähigkeit, die Fibroblastenfunktion zu hemmen und die lokale Immunmikroumgebung zu verändern. Zu den krankheitsspezifischen Ergebnissen gehören In-vivo-Tests, die Marker der Fibrose bewerten.
Biologisch abbaubare, medikamentöse Stents wurden in Tiermodellen von Krankheiten in mehreren Organsystemen, einschließlich derAtemwegsbahn 4, verwendet. Für das Management von Atemwegsstenose oder Kollaps haben frühere Untersuchungen drogenbeschichtetes Silikon und Nickel-basierte Stentsverwendet 5. Ein PLLA-PCL-Konstrukt wurde für diese spezielle Methode aufgrund seines Wirkstoffelutionsprofils und seiner mechanischen Festigkeit unter physiologischen Bedingungen über einen Zeitraum von 3 Wochen gewählt, was in früherenveröffentlichtenStudien 6 nachgewiesen wurde. PLLA-PCL ist auch ein biokompatibles und biologisch abbaubares Material, das bereits von der FDA4zugelassen ist. Biokompatible Stents, die Cisplatin und MMC eluieren, wurden in großen Tiermodellen wie Kaninchen und Hunden untersucht. In diesen Tiermodellen wurden Stents jedoch nicht in ein Tiermodell der Krankheit aufgenommen und transzervikal implantiert. Diese Studie bietet eine einzigartige Methode zur Beurteilung eines biokompatiblen, arzneimittelverdünnenden Stents, der transoral in ein Mausmodell von Atemwegsverletzungen und Kehlkopfhautstenose gelegt wird. Ein biokompatibler Stent, der ein immunmodulatorisches Medikament lokal eluiert und für die Studie in einem murinen Modell miniaturisiert werden kann, ist für die translationale präklinische Forschung wertvoll. Frühere Versuche der Stentnutzung mit anderen Materialkonstrukten erzeugten robuste Fremdkörperreaktionen, die die zugrunde liegende Entzündung, die LTS7unterscheidet, verschlimmerten. Diese Methode ist unserer Kenntnis nach die erste ihrer Art, die die immunmodulatorischen und antifibrotischen Wirkungen eines stentbasierten Arzneimittelabgabesystems in einem murinen Modell von LTS untersucht. Das murine Modell selbst bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Wirkung eines immunmodulatorischen Medikaments auf die Luftröhre. Es können genetisch veränderte Mäuse und experimentelle Kohorten gesunder und kranker Mäuse untersucht werden, was zu experimenteller Reproduzierbarkeit führen und die Wirtschaftlichkeit verbessern kann. Darüber hinaus imitiert die Lieferung des Stents transoral in die Mausluftröhre die klinische Abgabe eines solchen Stents beim Menschen, was den translationalen Vorteil dieser Methode weiter unterstreicht. Schließlich ermöglicht die relative Leichtigkeit, mit der der PLLA-PCL-Stent mit dem Medikament hergestellt werden kann, Modifikationen, um alternative medikamentöse Therapien zu liefern, die darauf abzielen, die Narbenbildung in der Luftröhre zu reduzieren.
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Protocol
HINWEIS: Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (MO12M354) genehmigt.
1. Herstellung von Rapamycin in PLLA-PCL
- Bereiten Sie zwei Glasfläschchen (mit Kappen) von 70:30 PLLA-PCL Polymerlösungen (inhärente Viskosität 1,3 x 1,8 DL/G; Materialtabelle) mit einer Durchstechflasche mit 1,0% Rapamycin und der anderen ohne Rapamycin.
- Machen Sie eine 1,0% Rapamycin-haltige Polymerlösung, indem Sie 6 mg Rapamycin zu 600 mg 70:30 PLLA-PCL in einer Glasdurchstechflasche hinzufügen.
- Für Polymerlösung ohne Rapamycin (Kontrolle) nur 600 mg 70:30 PLLA-PCL in die Glasdurchstechflasche geben.
- Unter einer Dunstabzugshaube 6 ml Dichlormethan in jede Glasdurchstechflasche geben.
VORSICHT: Dichlormethan ist ein korrosives Material und es sollten nur Glaspipetten verwendet werden. Geeignete Sicherheitsvorkehrungen umfassen persönlichen Augenschutz und Handschuhe. - Fügen Sie jeder Glasdurchstechflasche 120 l Glycerin hinzu (für 2% Glycerinlösung).
HINWEIS: Die Zugabe von Glycerin ermöglicht eine erhöhte Flexibilität und verminderte Steifigkeit im Stentkonstrukt. - Recap die Glasfläschchen und lassen Sie 70:30 PLLA-PCL mit und ohne Rapamycin für 6 x 12 h auflösen und homogenisieren.
HINWEIS: Glasfläschchen können auch auf einer rotierenden Schüttelplattform platziert werden, um eine schnellere Auflösung zu erreichen.
2. Rapamycin-Elutionstests
- Pipette 1 ml 70:30 PLLA-PCL Lösung mit 1% Rapamycin in eine Glas Petrischale.
ANMERKUNG: Dieses Volumen von 70:30 PLLA-PCL-Lösung, die 1% Rapamycin enthält, enthält 120 g Rapamycin und stellt die Gesamtmenge an Rapamycin in jedem Konstrukt dar. Es können alternative Volumina und Konzentrationen verwendet werden. - 70:30 PLLA-PCL mit 1% Rapamycin in eine flache Scheibe in der glasigen Petrischale aushärten lassen.
- Nach dem Aushärten die Scheibe in 2 ml phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) legen und in einer 37 °C-Kammer inkubieren.
- Sammeln und ersetzen Sie PBS (2 ml) alle 24 h und verwenden Sie gesammelte PBS für die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Analyse des Rapamycin-Gehalts.
- Verwenden Sie einen Autosampler und eine C18 4,6 cm x 250 mm HPLC-Säule, um Proben durch den Autosampler-Injektor zusammen mit seriellen Verdünnungen von Rapamycin auszuführen, um eine kalibrierte Standardkurve zu erstellen. Führen Sie jedes Beispiel in dreifacher Ausführung aus.
HINWEIS: Zu den zu testenden seriellen Verdünnungen von Rapamycin gehören 10 %, 1 %, 0,1 % und 0,01 %. - Verwenden Sie eine mobile Phase von HPLC-Wasser und Acetonitril mit 10/90 Volumen/Volumen mit einer Durchflussrate von 2,0 ml/min. Einstellung der Absorption während HPLC für Rapamycin auf 280 nm.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Elution von Rapamycin über einen Zeitraum von 14 Tagen.
3. Erstellung von Rapamycin-eluing PLLA-PCL murinen Atemwegsstents
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.2-3.9 mit sterilen Materialien und steriler Technik aus, um Kontaminationen zu vermeiden, die In-vivo- und In-vitro-Anwendungen beeinflussen würden.
- Bereiten Sie PLLA-PCL-Lösungen vor, die Rapamycin enthalten, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
- Mit einer gläsernen Pasteurpipette mit einem Gummiballon 1 ml PLLA-PCL-Lösung mit 1% Rapamycin auf die venöse Kanüle eines 22 G fluorierten Ethylenpropylen-basierten Angiokatheters auftragen (Materialtabelle). Halten Sie den Angiokatheter in einer Hand und verwenden Sie die Glaspipette, um die PLLA-PCL-Lösung auf den Angiokatheter zu legen. Drehen Sie den Angiokatheter langsam, um eine homogene Abdeckung des Angiokatheters mit der PLLA-PCL-Lösung zu gewährleisten.
HINWEIS: Zunächst wird die PLLA-PCL-Lösung dünn sein, aber da das Dichlormethan während der Anwendung auf den Angiokatheter verdampft, wird die Lösung zähflüssiger, um auf den Angiokatheter zu formen. Kontinuierliches Drehen des Angiokatheters während der Anwendung ist von Vorteil. Dieser Schritt muss langsam und akribisch durchgeführt werden, um die gleichbleibende Dicke des Stents zu gewährleisten. - Prop die geformte Angiokatheter mit der Spitze des Angiokatheters nach unten und den Griff auf den Rand einer Glas Petrischale zum Trocknen.
- Stents 24 h in einer Vakuumhaube bei Raumtemperatur trocknen lassen (Abbildung 2A).
- Entfernen Sie das Stentkonstrukt aus dem darunter liegenden Angiokatheter, indem Sie den darunter liegenden Katheter sanft verdrehen und aus dem geformten Stent herausschieben (Abbildung 2B).
- Überprüfen Sie den Stent umlaufend auf Defekte, die während des Gießprozesses entstanden sein könnten. Wenn ein Defekt im gegossenen Stent vorhanden ist, entsorgen Sie ihn.
- Schneiden Sie jedes Ende des gegossenen Stents mit einer feinen geraden Schere, so dass die Kanten axial sind.
- Schneiden Sie mit einer feinen geraden Schere 3 mm axiale Segmente des Gussstentes für den Einsatz in einem Mausmodell von LTS (Abbildung 2C).
HINWEIS: Aus einem gegossenen Angiokatheter können ca. 8 Stents hergestellt werden, wobei jeder 3 mm Stent 120 g Rapamycin enthält. - Laden Sie den 3 mm Stent auf einen neuen 22 Venenkatheter für die Verwendung in einem Mausmodell von LTS (Abbildung 1).
4. Laryngotrachealstenose-Induktion bei Mäusen
- Vor der Durchführung von in vivo Mausstudien erhalten Sie die Genehmigung des Animal Care and Use Committee.
- Anästhetisieren Sie ein 9 Wochen altes Männchen C57BL/6 durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 x 100 mg/kg) und Xylazin (5 x 10 mg/kg).
HINWEIS: Andere Stämme von Mäusen können ersetzt werden, aber es wird empfohlen, dass das Gewicht der Mäuse zwischen 20 und 27 g liegt. - Randomisieren Sie Mäuse in eine experimentelle Gruppe (chemomechanische Verletzung mit einer Platzierung von 1% Rapamycin-haltigem PLLA-PCL-Stent) und zwei Kontrollgruppen: 1) chemomechanische Verletzung mit der Platzierung eines PLLA-PCL-Stents, 2) chemomechanische Verletzung ohne Platzierung eines Stents.
- Legen Sie eine Maus auf eine chirurgische Plattform in einer Supine-Position. Verwenden Sie eine kleine Fadenschlaufe, die an der Oberseite der Plattform befestigt ist, um die Halswirbelsäule zu erweitern, indem Sie sie um die zentralen Schneidezähne kreisen.
- Befestigen Sie die Hände und Beine der Maus auf dem Tisch mit 2-Zoll-Stück Klebeband. Pinch Maus Pfote, um sicherzustellen, dass es eine ausreichende Anästhesie hatte.
- Die chirurgische Stelle wird dann vorbereitet. Das darüber liegende Fell sollte entfernt und die Haut dreimal gereinigt werden (abwechselnd Jod oder Chlorhexidinpeeling mit Alkohol oder verdünntem Hautdesinfektionsmittel). Der Bereich sollte drapiert und sterile Handschuhe getragen werden. Die sterilisierten Instrumente sollten bei Nichtgebrauch auf eine sterile Oberfläche gelegt werden.
- Machen Sie einen 1,5 cm Mittellinie vertikalen Schnitt im Hals der Maus mit feinen gebogenen Iris Schere. Teilen Sie den darüber liegenden Thymus und lateralisieren Sie die beiden resultierenden Lappen, um die Luftröhre zu visualisieren. Teilen Sie die darüber liegenden Sternohyoid- und Sternothyroid-Muskeln (Strap) an der überlegenen Befestigung bilateral.
HINWEIS: Der gesamte Kehlkopfrachekomplex sollte danach vollständig freigelegt werden. - Passieren Sie einen 22 G Angiokatheter transoral durch den Kehlkopf in die Luftröhre. Verwenden Sie kleine Zangen, um Druck auf den vorderen Kehlkopf der Maus auszuüben, um bei der korrekten Platzierung des Angiokatheters zu helfen. Visualisieren Sie den weißen Angiokatheter durch die Luftröhre, um eine korrekte Platzierung (nicht-ösophageal) zu gewährleisten.
HINWEIS: Die Mausluftröhre ist extrem dünn und der weiße Angiokatheter wird durch die transluzente Luftröhre visualisiert. - Führen Sie eine bleomycinbeschichtete Drahtbürste durch den eingelegten Angiokatheter.
- Ziehen Sie den Angiokatheter langsam zurück, so dass nur noch die Drahtbürste in der Luftröhre verbleibt.
- Wenden Sie Gegendruck mit feinen Zangen auf die Luftröhre an, um das Luftröhrenlumen mit der Drahtbürste mechanisch zu stören.
- Setzen Sie den Angiokatheter über die Drahtbürste in die Luftröhre ein.
- Entfernen Sie die Drahtbürste und tragen Sie Bleomycin erneut auf.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.8 x 4.12 insgesamt 5x. Bleomycin zwischen jeder Anwendung auf den Pinsel auftragen.
HINWEIS: Validierung und Beschreibung dieses Modells finden Sie in Hillel et al.8. - Entfernen Sie den Angiokatheter von der Mausluftröhre.
HINWEIS: Wenn kein Stent platziert werden soll, kann der Schnitt mit Gewebekleber geschlossen werden.
5. Transorale PLLA-PCL StentPlatzierung bei Mäusen
- Einen 3 mm gegossenen Stent auf einen leeren 22 G Angiokatheter laden (Abbildung 3A).
HINWEIS: Der Stent sollte 5 mm von der Spitze des Angiokatheters ruhen. - Zeichnen Sie eine dünne schwarze vertikale Linie auf dem 3 mm gegossenen Stent.
HINWEIS: Diese Linie ermöglicht eine verbesserte Visualisierung des Stents in der Luftröhre. - Intubieren Sie die Maus transoral mit dem Mitdemotheter, der mit dem Stent vorinstalliert wurde.
- Visualisieren Sie den Stent auf dem Angiokatheter in der Luftröhre durch den transzervikalen Schnitt (Abbildung 3B).
HINWEIS: Die Luftröhre ist sehr dünn, so dass der schwarze Farbstoff auf dem Stent durch die Luftröhre visualisiert werden kann. Verwenden Sie diese, um die korrekte Trachealplatzierung zu bestätigen. - Halten Sie den Stent an Ort und Stelle, indem Sie die Luftröhre durch den transzervikalen Schnitt mit feiner Zange greifen.
- Entfernen Sie den Angiocatheter transoral, während Sie den Stent mit den feinen Zangen im Griff behalten.
HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, nicht zu viel Kraft auf den Stent anzuwenden, um das Lumen nicht zu zerquetschen, wenn der Angiokatheter entfernt wird. Es ist jedoch genügend Kraft erforderlich, um sicherzustellen, dass der Stent nicht mit dem Angiokatheter entfernt wird. Ein 0,8 mm Sialendoskop kann verwendet werden, um die Position und Platzierung des Stents in der Luftröhre zu visualisieren. - Schließen Sie den transzervikalen Schnitt mit Gewebekleber.
- Lassen Sie jede Maus auf ihre ursprüngliche Aktivitätsstufe zurück, bevor Sie sie wieder in ihren Käfig legen.
6. Histologische Probenvorbereitung
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit eingeatmetem Anästhetikum und Opfern von Mäusen mit zervikaler Dislokation pro Tierprotokoll nach 7, 14 oder 21 Tagen.
HINWEIS: Basierend auf der Chronik der Studie können unterschiedliche Zeitintervalle verwendet werden (z. B. 28, 30 Tage usw.). - Positionieren Sie eine Maus auf der chirurgischen Plattform, wie in den Schritten 4.4 und 4.5 beschrieben.
- Öffnen Sie den Halsschnitt an der Maus mit einer fein gekrümmten Irisschere.
- Stellen Sie die Luftröhre pro Schritt 4.6 aus.
- Teilen Sie die distale Luftröhre unter dem Niveau des Stents mit einer fein gekrümmten Irisschere.
- Teilen Sie die proximale Luftröhre unter dem Kehlkopf und oberhalb des Stents mit einer fein gebogenen Irisschere.
HINWEIS: Es ist wichtig, die distale Luftröhre zuerst zu teilen, um zu verhindern, dass sich die Luftröhre in den Thorax zurückzieht. - Trennen Sie die geteilte Luftröhre von der Speiseröhre nach hinten und entfernen Sie Dierachea von der Maus.
HINWEIS: Stents bleiben weiterhin in der Mausluftröhre erhalten. - Stent von der Luftröhre entfernen und in 10% Formalin für 24 h fixieren.
- Einbetten formalinfixierter Mausluftröhrenproben in Paraffin mit dem distalen Ende überlegen ausgerichtet, so dass im nächsten Schritt axiale Schnitte der Luftröhre vorgenommen werden können.
- Schneiden Sie mit einem Mikrotom 5 m Abschnitte der paraffineingebetteten Maustrachea.
HINWEIS: Die Proben sollten axial ab der distalen Luftröhre geschnitten werden. - Erhalten Sie alle 250 m entlang der Länge der Probe einen 5'm-Repräsentantenabschnitt.
- Schließe den H&E-Fleck in jedem repräsentativen Abschnitt ab.
- Deparaffinisieren Sie die Dias, indem Sie in Xylol 2x pro Folie für 3 min.
- Legen Sie die Dias in 100% Ethanol für 2 min, 95% Ethanol für 2 min und 70% Ethanol für 2 min zu rehydratisieren.
- Waschen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser für 2 min.
- Die Dias in Hämatoxylin für 3 x 5 min färben.
- Waschen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser für 5 min.
- Legen Sie die Dias in 1% sauren Alkohol für 1 min.
- Waschen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser für 1 min.
- In 0,2% Ammoniakwasser für 30 s abspülen.
- Spülen Sie die Rutschen in fließendem Leitungswasser für 5 min. Tauchen Sie in 95% Ethanol 10x.
- Eosin Fleck durch die Platzierung Der Dia in Eosin phloxine für 30 s.
- Dehydrieren Sie die Dias, indem Sie 95% Ethanol für 5 min, gefolgt von absolutem Ethanol 2x für 5 min.
- In Xylol 2x für 5 min.
- Montieren Sie die Dias mit xylolbasiertem Montagemedium.
- Messen Sie die Dicke der lamina propria wie in Hillel et al.8beschrieben.
7. Stent Biokompatibilität in vivo
- Bereiten Sie Gewebeabschnitte wie in den Schritten 6.1-6.4 vor. Entfernen Sie keinen Stent aus diesen Luftröhrenabschnitten, um die Veränderungen der Entzündung im Verhältnis zur Position des Stents innerhalb des Lumens der Luftröhre zu visualisieren.
- Um die akute Fremdkörperreaktion auf den Stent zu bestimmen, beobachten Sie die Makrophagen- und T-Zellaktivität mit CD3- und F4/80-Markern.
HINWEIS: Andere Marker können auch verwendet werden, um eine akute Entzündungsreaktion auf den Stent zu bestimmen. - Erhalten Sie 5 m geschnittene Abschnitte der paraffin-eingebetteten Luftröhre auf handelsüblichen hydrophilen Plus-Dias (Tabelle der Materialien). Platzieren Sie zwei Abschnitte auf jeder Folie.
HINWEIS: Diese Abschnitte sollten aus einem Bereich der Luftröhre stammen, in dem der PLLA-PCL-Stent platziert wurde.
- Um die akute Fremdkörperreaktion auf den Stent zu bestimmen, beobachten Sie die Makrophagen- und T-Zellaktivität mit CD3- und F4/80-Markern.
- Legen Sie die Dias in Xylol 2x für jeweils 5 min.
- Legen Sie die Dias in 100% Ethanol 2x für je 3 min.
- Legen Sie die Dias in 95% Ethanol für 1 min.
- Legen Sie die Dias in eine Histologie-Färbung Rack, so dass sie in Antigen-Retrieval-Puffer eingetaucht werden (Tabelle der Materialien) und dann in einem Gemüsedampfer mit kochendem Wasser für 20 min legen.
- Entfernen Sie die Färbestangen aus dem Dampfer und entsorgen Sie den Antigen-Abrufpuffer.
- Ersetzen Sie den Puffer durch 1 ml PBS.
- Legen Sie die Dias in eine nasse Färbebox für 1 min.
- Entsorgen Sie die PBS und inkubieren Sie die Dias mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% FBS für 30 min.
- Entsorgen Sie das DMEM und fügen Sie eine Mischung aus zwei primären Antikörpern hinzu, die in verschiedenen Arten aufgezogen werden. Bedecken Sie die Dias mit Paraffinfolie und bebrüten Sie sie über Nacht bei 4 °C in einem dunklen Raum.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Kaninchen Anti-CD3 und Ratte Anti-F4/80 (Materialtabelle) verwendet. - Waschen Sie die Dias in PBS 3x für 5 min.
- Inkubieren Sie die Dias mit sekundären Antikörpern, die für die primäre Antikörperart (Materialtabelle) in DMEM mit 10% FBS für 0,5 x 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnt sind.
- Waschen Sie die Dias in PBS 3x für 5 min im Dunkeln.
- Montieren Sie die Dias auf Abdeckungen mit einem Tropfen Montagemedium mit 4'6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Bewahren Sie die Dias im Dunkeln entweder bei 20 °C oder 4 °C auf.
- Beobachten Sie die gebeizten Dias auf einem Laserscan-Konfokalmikroskop und -foto.
- Quantifizieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, die mit DAPI färben, und von Antikörpern für den Vergleich mit unverletzten Luftröhren.
8. Maus-Trachea quantitative Genexpressionsanalyse
- Sammeln Sie Mausluftröhren, wie in den Schritten 6.1-6.7 beschrieben, und entfernen Sie Stent.
HINWEIS: Geerntete Maustracheas können bis zu 2 Jahre in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. - Das in Schritt 8.1 geerntete Trachealgewebe mit einer feinen Schere entkernen und mit einem Perlenmühlenhomogenisator mit 1,4 mm Keramikperlen(Materialtabelle) als Teil eines handelsüblichen säulenbasierten RNA-Extraktionskits(Table of Materials )weiter homogenisieren.
HINWEIS: Bead Mill Homogenisator Einstellungen = ein 40 s Zyklus bei 6 m/s. - Extrahieren Sie RNA aus trachealem Lysat mit einem säulenbasierten Extraktions- und Reinigungskit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers.
- Quantifizieren Sie die RNA aus jeder Probe mit einem Spektralphotometer (Materialtabelle).
HINWEIS: Die RNA-Reinheit wird mit dem Verhältnis 260/230 nm mit einer reinen RNA-Probe mit dem Wert 2.0 bewertet. - Erstellen Sie komplementäre DNA aus extrahierter RNA mit Reverse-Transkriptase (Materialtabelle) und einem Thermocycler mit den folgenden Einstellungen: 5 min bei 25 °C (Priming), 46 °C für 30 min (Reverse Transkription) und dann 95 °C für 1 min (Inaktivierung der Reverse-Transkriptase).
- Verdünnen Sie ergänzende DNA-Proben mit RNase-freiem Wasser auf eine Konzentration von 10 bis 25 ng/ml für den Einsatz in quantitativer Echtzeit-PCR.
- Mischen Sie 1 l der komplementären DNA (10 x 25 ng/ml) mit 10 l eines PCR-Mastermix (Materialtabelle), 8 l ddH2O und 0,5 l von 10 'M vorwärts und reverse primer für das Gen von Interesse in einem Brunnen einer 96-Well PCR-Platte (Tabelle der Materialien).
ANMERKUNG: Das Gesamtvolumen in jedem Bohrgut sollte 20 l betragen. Jeder Brunnen auf der 96-Well-Platte sollte nur eine Probe und ein Gen enthalten, das von Interesse ist. - Wiederholen Sie die Schritte 8.1–8.7 für alle Gene von Interesse und führen Sie jede Probe für jedes Gen in dreifacher Ausfertigung aus.
ANMERKUNG: Die genspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle der Materialien) für Kollagen 1, Kollagen 3 und das Referenzgen -Actin werden häufig zur Untersuchung von Fibrosemarkern verwendet. - Legen Sie die 96-Well-Platte auf die quantitative Echtzeit-PCR-Maschine und initiieren Sie folgendes Protokoll: Denaturierung bei 95 °C für 15 s und Aneal und erstrecken sich bei 60 °C für 60 s für 40 Zyklen.
- Normalisieren Sie den Zyklusschwellenwert (CT) für den Genproduktnachweis jedes Gens von Interesse (GOI) auf den CT-Wert für das Referenzgen -Actin für alle Proben, um für jede goI einen CT zu erhalten. Vergleichen Sie dann die CT-Werte für jede GOI für behandelte und unbehandelte Proben, um ein CT zu generieren.
ANMERKUNG: Der Zyklusschwellenwert ist der Punkt auf der Amplifikationskurve, wenn eine vorbestimmte Menge an Genprodukt vorhanden ist. Für jedes Gen von Interesse sollte der N-Rn-Wert für jedes Gen von Interesse bestimmt werden und auf den linearen Teil der Amplifikationskurve fallen.
ANMERKUNG: CT = CT (GOI) – CT (Referenzgen); CT = CT (behandelt) – -CT (unbehandelt). - Berechnen Sie die relative Veränderung der Genexpression zwischen behandelten und unbehandelten Proben als Ausdruck der Faltenveränderung, indem Sie 2-CTberechnen.
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Representative Results
Das biologisch abbaubare PLLA-PCL-Stentkonstrukt, das mit Rapamycin beladen war, das in dieser Studie verwendet wurde, war in der Lage, Rapamycin in konsistenter und vorhersehbarer Weise unter physiologischen Bedingungen zu elutieren (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt den PLLA-PCL-Stent, der um einen 22 G Angiokatheter gegossen wurde, um ihn in einem murinen Modell von LTS zu verwenden. Um festzustellen, ob die Auswirkungen der Rapamycin-Elution in der Luftröhre wirksam bei der Dämpfung der Fibrose sind, können gemessene Veränderungen der Fibrose-bezogenen Genexpression und Marker akuter Entzündungen durch Genexpressionsanalyse, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenz und ELISA beurteilt werden. Die erfolgreiche Platzierung eines miniaturisierten Stents in die Luftröhre der Maus mit der oben beschriebenen Methode wurde nachgewiesen. Ein Schaltplan der Methode ist in Abbildung 3dargestellt. Abbildung 4 zeigt den miniaturisierten biokompatiblen Stent in situ in der Luftröhre, wie durch den schwarzen Marker auf dem Stent angezeigt wird, der durch die transluzente Mausluftröhre visualisiert wird. In ersten Experimenten war die Verwendung eines 0,8 mm Sialendoskops zur Bestätigung der Platzierung des Stents in der Luftröhre hilfreich. Nach 21 Tagen, um zu bestätigen, dass die transorale Platzierung des Stents wirksam war und der Stent nicht aus seiner ursprünglich platzierten Position wanderte, wurde der Halsschnitt wieder geöffnet, um die Platzierung des Stents zu bestimmen. Wie in Abbildung 4Bdargestellt, zeigte der schwarze Farbstoffmarker des Stents, dass der Stent seine Position in der Luftröhre beibehielt. Die Resektion der Luftröhre nach 21 Tagen Behandlung mit dem Stent ist in Abbildung 4Cdargestellt.
Repräsentative Bilder von Biokompatibilitätstests mit immunfluoreszierender Färbung für Marker akuter und chronischer Entzündungen sind in Abbildung 5dargestellt. Dies zeigte, dass das PLLA-PCL-Stentkonstrukt (ohne Rapamycin) nicht immunreaktiv war, wie durch die minimale Anzahl von Immunzellen nach der Platzierung bestimmt. Es ist wichtig zu beachten, dass bei dieser Methode normale unverletzte Luftröhren verwendet wurden und ein PLLA-PCL-Stent ohne Rapamycin platziert wurde, um die Entzündungsreaktion auf das Konstrukt selbst zu bestimmen.
Als nächstes, um festzustellen, ob der rapamycin-eluierende PLLA-PCL Stent bei der Milderung von Narben wirksam war, haben wir zuvor Genexpressionsänderungen in Markern akuter Entzündung und Fibrose6nachgewiesen. Insbesondere gibt es eine 90,3-fache Reduktion (SEM bei 26,0; n = 4; p < 0.01) Reduktion von col1a1 an Tag 4, sowie der akuten Entzündungsmarker INF-, CD11b, Arg-1 und IL-1B6. Obwohl die Unterschiede in der Faltenveränderung für einige Gene nicht signifikant waren, ist es möglich, dass mit einer größeren Kohorte von Mäusen, Bedeutung erreicht werden könnte. Um festzustellen, ob es Veränderungen der Luftröhre aufgrund der hetologisch-hebologischen Arzneimittelelution gab oder ob es Veränderungen der Luftröhre aufgrund der Radialkraftbelastung durch den Stent gab, zeigten wir, dass es eine Abnahme der Breite der Lamina propria in jenen Mitrapazien behandelten Torten gab, die mit Rapamycin-elutierenden Stents behandelt wurden, im Vergleich zu denen ohne Rapamycin-eluierende Stents6.
Abbildung 1: Rapamycin PLLA-PCL-Elution. Das PLLA-PCL-Konstrukt, das 1% Rapamycin enthält, zeigte eine konsistente und vorhersehbare Freisetzung von Rapamycin über einen Zeitraum von 14 Tagen. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert der stichprobenartig beprobten Elution dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Stentguss. (A) Die PLLA-PCL-Lösung durfte um einen 22 G Angiokatheter trocknen. (B) Der Guss wurde dann aus dem Angiokatheter entfernt. (C) Stents wurden auf 3 mm Länge für den Einsatz im Mausmodell6geschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Transorale Stentplatzierung bei Mäusen. (A) Der Stent wurde auf einen leeren Angiokatheter geladen und transoral in die Luftröhre gelegt. (B) Die schwarze Farbstoffmarkierung auf dem Stent kann durch einen transzervikalen Schnitt gesehen werden, um seine Position in der Mausluftröhre zu bestätigen. (C) Repräsentative Zeichnung des Stents in situ in der erkrankten Mausluftröhre6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: In-situ-Bilder von Stent. (A-B) Der Stent mit schwarzen Farbstoffmarkierungen kann vor Ort in der murinen Luftröhre gesehen werden. (C) Ein Bild des Stents und des murinen Kehlkopfrachekomplexes nach der Ernte nach 21 Tagen6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Stent-Biokompatibilität. Immunfluoreszierende Färbung für F4/80 (Makrophagen, rotes Chromophor) und CD3 (grünes Chromophor, T-Lymphozyten) an Tag 4 zeigte minimale entzündliche Zellen in der (A) unverletzten Luftröhre und (B) Trachea mit PLLA-PCL Stent. Dies steht im Gegensatz zu (C) einer verletzten Luftröhre, mit einer verdickten Lamina propria und dem Vorhandensein zahlreicher Zellen mit positiver F4/80- und CD3-Färbung6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Aufbau und die Verwendung eines drogenverdünnenden Stents in vivo sind 1) Bestimmung des optimalen PLLA-PCL-Verhältnisses für die wünschenswerte Wirkstoffelutionsrate, 2) Bestimmung der geeigneten Konzentration des zu eluierenden Arzneimittels, 3) Formen der Stents um den Angiokatheter für den In-vivo-Einsatz und 4) transoral das Stent in die Mäuse nach LTS-Induktion zu liefern, ohne tödliche Atemwegsverstopfung zu verursachen.
Zwar gibt es mehrere Methoden für die Medikamentenabgabe mit Stents in Tiermodellen der Atemwegserkrankung, aber die Entwicklung eines biokompatiblen Stents, der in der Lage ist, Medikamente in einem kranken murinen Modell zu liefern, ist eine Premiere. Bei der Entwicklung dieser Methode für die Medikamentenabgabe wurden mehrere Änderungen an der Methode vorgenommen. Es war wichtig, die geeignete PLLA-PCL-Zusammensetzung zu bestimmen, um Stents herzustellen, die mechanisch starr genug waren, um in die Luftröhre gelegt zu werden und trotz physiologischer Sekrete in der Luftröhre zu bleiben. Eine 70:30 Zusammensetzung von PLLA-PCL wurde für stent-Konstruktion mit einem Angiokatheter Formung beschlossen, weil es erfolgreich elute rapamycin in einer prädizeren Natur, in einer sicheren und zuverlässigen Art und Weise in unserem Mausmodell platziert werden konnte, und nicht in physiologischen Bedingungen. Ein schwieriger und potenziell herstellerabhängiger Teil dieser Methode ist das Formen des Stents um die Angiokatheter. Zunächst wurden beim Bau der In-vivo-Stents 22 G-Angiokatheter in die Spitze einer Glaspipette gelegt und die Polymerlösung in den Raum zwischen dem Angiokatheter und der Glaspipette gegossen und bildete einen Guss des Dazwischenbaus. Die Wand der Stents, die sich aus dieser Methode ergab, war jedoch oft zu dünn und konnte nicht zuverlässig in die Luftröhre gelegt werden. Eine Einschränkung der aktuellen Methode zum Formen von Stents auf dem Angiokatheter ist die Abhängigkeit vom Hersteller für Konsistenz und die Notwendigkeit von sorgfältiger Liebe zum Detail, um Homogenität in der Stentproduktion zu gewährleisten. Das Potenzial für die Varianz der Dicke zwischen gegossenen Stents muss in zukünftigen Studien berücksichtigt werden. Mit weiteren Studien hoffen wir, eine Form für einen 22 G Angiokatheter zu entwerfen, der von einem anderen Glas oder nicht korrosiven Material umgeben ist, so dass der Raum zwischen dem Angiokatheter und der Glasummantelung 50 m beträgt, was wir als eine angemessene Wanddicke des Stents bestimmt haben. für eine einfache Platzierung in die Luftröhre.
Es gibt mehrere Vorteile der Verwendung eines biokompatiblen Stent, um die Medikamentenabgabe an die betroffene Luftröhre zu studieren. Insgesamt haben Stents aus Metall oder Silikon, die mit einem Polymer beschichtet wurden, das das Medikament enthält, nachweislich Granulationsgewebe und eine weitere Entzündungsreaktion auf einen bereits vernarbten Teil der Luftröhre erzeugt. Diese Methode, die die Verwendung eines Stents aus biokompatiblem Biomaterial hinterfragt und auch ein immunmodulatorisches Medikament zuverlässig freisetzt, ist vorteilhaft. Der PLLA-PCL-Stent zeigt sich auch im murinen Modell biokompatibel und löst keine akute Entzündungsreaktion aus. Bei der Untersuchung von Medikamenten, die Fibrose bekämpfen können, ist die Verwendung eines Stents, der vollständig aus biokompatiblem Material wie PLLA-PCL besteht, wie in dieser Methode beschrieben, von Vorteil.
Der Vorteil und die Leichtigkeit der Verwendung dieser Methode, um nutzbare Stents zu konstruieren, besteht darin, dass die Zusammensetzung der PLLA-PCL variiert werden kann, was Unterschiede in den Freisetzungsprofilen für das in der Zusammensetzung gemischte Medikament ermöglicht. Frühere Studien des PLLA-PCL-Materials zeigen, dass Variationen in PLLA-PCL-Mischungen zu einer größeren Verschlechterung des Materials führen können, was eine schnellere Freisetzung von Medikamenten9ermöglicht. Darüber hinaus ist die Verwendung dieser Methode, um Stents zu konstruieren, die in Mäusen platziert werden können, von Vorteil, da die meisten Stentstudien für Atemwegserkrankungen bei größeren Tieren durchgeführt wurden10,11,12. Die Verwendung eines Mausmodells, das für verschiedene Krankheitsparadigmen modifiziert werden kann und das Testen des drogenverdünnenden Stents in einem kranken Zustand ermöglicht, ist ideal. Die Prüfung des drogenverdünnenden Stents in einem erkrankten Zustand und die Möglichkeit, seine Wirksamkeit mit der bei Tieren ohne Krankheit zu vergleichen, ermöglicht eine größere experimentelle Strenge. Diese Methode zeigt auch, wie ein medikamentös-elutierender Stent für die Atemwege transoral platziert werden kann, im Gegensatz zu früheren Studien, in denen Stents chirurgisch implantiert wurden.
Diese Studie zeigt eine sehr nutzbare Plattform für stent Entwicklung und Tests in einem Kleintiermodell. Es müssen jedoch auch andere Faktoren für den Einsatz bei Menschen berücksichtigt werden. Angesichts der festen und starren Natur des Stents kann er wahrscheinlich nicht durch ein kanalisiertes flexibles Bronchoskop platziert werden, sondern muss transoral mit direkter Laryngoskopie und starrer Bronchoskopie platziert werden. Idealerweise würde der Stent nach der Ballonerweiterung der Atemwege platziert werden, um die Restenose zu mildern. Aus der Perspektive der Patientensicherheit ist das Potenzial für den Stent, zu migrieren, ein großes Problem, da es potenziell zu lebensbedrohlichen Atemwegskompromissen führen könnte. Zweitens muss auch das Potenzial für Stentobstruktion sekundär zur Ansammlung von Schleim oder Blut berücksichtigt werden. Um diese Risiken zu minimieren, sind weitere Tests und Entwicklungen erforderlich.
Zukünftige Studien können diese Methode nutzen, um verschiedene Medikamente in der PLLA-PCL-Mischung zu testen, um weiter zu verstehen, wie verschiedene immunsuppressive Behandlungen die Narbenbildung in der Luftröhre mildern könnten. Da solche Stents in Mäusen platziert werden können, kann auch die Verwendung einer größeren Kohorte von Mäusen oder Mäusen mit genetischen Modifikationen an narbenbildenden Genen getestet werden. Zukünftige Experimente können auch das Verständnis der Veränderungen der Luftröhre umfassen, die nach chronischer Implantation des Stents (3–6 Monate) auftreten können, und die Veränderungen des Lumens der Luftröhre sowie die Genexpressionsprofile von Entzündungsmarkern und Fibrose. Marker.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
National Institute on Deafness and Other Communication Disorders of the National Institutes of Health under award numbers 1K23DC014082 and 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Diese Studie wurde auch von der Triological Society und dem American College of Surgeons (Alexander Hillel), der American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) und einem T32 NIDCD-Ausbildungsstipendium (Kevin Motz) finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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