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Bioengineering

लारिंगोट्रेचेल स्टेनोसिस के साथ चूहों में एक जैव संगत दवा-Eluting Tracheal स्टेंट का डिजाइन

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60483
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2
1Department of General Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Johns Hopkins School of Medicine

Summary

लारिंगोट्रेचेल स्टेनोसिस रोगविस्टिक निशान जमाव से परिणाम देता है जो सांस के लिए वायुमार्ग को गंभीर रूप से संकुचित करता है और प्रभावी चिकित्सा उपचारों का अभाव है। एक स्थानीय दवा वितरण प्रणाली के रूप में पीएलएएल-पीसीएल (70% पॉली-एल-लैक्टाइड और 30% पॉलीकैप्रोलेक्टोन) स्टेंट का उपयोग करना, श्वासनली में निशान प्रसार को कम करने के उद्देश्य से संभावित उपचारों का अध्ययन किया जा सकता है।

Abstract

लैरिंगोट्रेचेल स्टेनोसिस (एलटीएस) सबग्लोटिस और ट्रेचिया का एक पैथोलॉजिकल संकुचन है जिससे बाहरी बाधा और सांस लेने में महत्वपूर्ण तकलीफ होती है। LTS श्वासनली में एक विदेशी शरीर से म्यूकोसल चोट से परिणाम है, ऊतक क्षति और एक स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया है कि धराशायी हो जाता है, रोगगोनिक निशान ऊतक के बयान के लिए अग्रणी के लिए अग्रणी । प्रभावी चिकित्सा उपचारों की कमी के कारण एलटीएस के लिए उपचार शल्य चिकित्सा है। इस विधि का उद्देश्य एक जैव संगत स्टेंट का निर्माण करना है जिसे एलटीएस के साथ चूहों में रखने के लिए छोटा किया जा सकता है। हमने दिखा दिया कि एक पीएलएएलए-पीसीएल (70% पॉली-एल-लैक्टाइड और 30% पॉलीकैप्रोलैक्टोन) के निर्माण में इष्टतम जैव यांत्रिक शक्ति थी, जैव संगत थी, जो वीवो प्लेसमेंट स्टेंट में एक के लिए व्यवहार्य थी, और दवा को कम करने में सक्षम थी। यह विधि स्थानीय रूप से सूजन को बाधित करने और वायुमार्ग फाइब्रोसिस को कम करने के लिए विभिन्न इम्यूनोमोडुलेक्टरी एजेंटों के परीक्षण के लिए एक दवा वितरण प्रणाली प्रदान करती है। स्टेंट का निर्माण 28−30 घंटे लेता है और इसे आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है, जिससे बड़े साथियों के साथ प्रयोगों की अनुमति मिल जाती है। यहां हमने फाइब्रोसिस और कोलेजन जमाव को कम करने में इसकी प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए स्टेंट के भीतर दवा रैपमाइसिन को शामिल किया। परिणामों से पता चला है कि पीएलए-पीसीएल टेंट ने विश्वसनीय रैपमाइसिन रिलीज दिखाई, शारीरिक परिस्थितियों में यांत्रिक रूप से स्थिर थे, और जैव संगत थे, श्वासनली में थोड़ी भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित कर रहे थे। इसके अलावा राप्राविसिन-एल्यूटिंग पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट ने वीवो में ट्रेलिया में निशान बनने में कमी की।

Introduction

लैरिंगोट्रेचस्ट स्टेनोसिस (एलटीएस) इंट्राजेनिक पोस्ट-इंट्यूबेशन इंजरी के कारण अक्सर श्वासनली का एक पैथोलॉजिकल संकुचन होता है। बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण का संयोजन, एक ट्रेकिस्टोमी या एंडोट्राचेल ट्यूब के लिए विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया, और रोगी-विशिष्ट कारक एक अदम्य भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनते हैं। यह दुर्योधनी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया श्वासनलिया में कोलेजन के जमाव की ओर ले जाती है, जिसके परिणामस्वरूप श्वासनलिया का चमकदार संकुचन होता है और बाद में स्टेनोसिस1,2होता है। चूंकि इस बीमारी के लिए वर्तमान उपचार मुख्य रूप से शल्य चिकित्सा है, एक वैकल्पिक चिकित्सकीय आधारित उपचार प्रतिमान विकसित करना जो अत्यधिक कोलेजन जमाव का कारण बनने वाले अदनागार भड़काऊ और अपवित्र मार्गों को लक्षित करता है। रैपमाइसिन, जो एमटीओआर सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स को रोकता है, को इम्यूनोसप्रेसिव प्रभाव के साथ-साथ एक मजबूत एंटीफिब्रोब्लास्ट प्रभाव दिखाया गया है। हालांकि, जब रैपामाइसिन को व्यवस्थित रूप से प्रशासित किया जाता है, तो सामान्य दुष्प्रभाव (उदाहरण के लिए, हाइपरलिपिडेमिया, एनीमिया, थ्रोम्बोसाइटोपेनिया) को3स्पष्ट किया जा सकता है। हमारी कार्यप्रणाली का उद्देश्य वायुमार्ग में उपयोग के लिए व्यावहारिक स्थानीय दवा वितरण के लिए एक वाहन विकसित करना है जो इन प्रणालीगत प्रभावों को कम करेगा। हमारा आकलन दवा वितरण निर्माण के लिए स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच के साथ-साथ फाइब्रोब्लास्ट फ़ंक्शन को बाधित करने और स्थानीय प्रतिरक्षा माइक्रोएनवायरमेंट को बदलने की क्षमता पर केंद्रित है। रोग-विशिष्ट परिणामों में वीवो परीक्षण में शामिल है जो फाइब्रोसिस के मार्कर का मूल्यांकन करते हैं।

बायोडिग्रेडेबल ड्रग-एल्यूटिंग स्टेंट का इस्तेमाल एयरवे4सहित कई ऑर्गन सिस्टम में बीमारी के एनिमल मॉडल्स में किया गया है । वायुमार्ग स्टेनोसिस या पतन के प्रबंधन के लिए, पिछली जांच दवा लेपित सिलिकॉन और निकल आधारित स्टेंट5का इस्तेमाल किया है । एक पीएलए-पीसीएल निर्माण को इस विशेष विधि के लिए चुना गया था क्योंकि इसकी दवा एल्यूशन प्रोफाइल और 3 सप्ताह की अवधि में शारीरिक परिस्थितियों में यांत्रिक शक्ति थी, जिसे पिछले प्रकाशितअध्ययन6में प्रदर्शित किया गया है। पीएलएएलए-पीसीएल एफडीए4द्वारा पहले से ही अनुमोदित एक जैव संगत और बायोडिग्रेडेबल सामग्री भी है। सिस्प्लैटिन और एमएमसी को जटिल करने वाले बायोसंगत स्टेंट खरगोशों और कुत्तों जैसे बड़े पशु मॉडलों में अध्ययन किया गया है। हालांकि, इन एनिमल मॉडल्स में स्टेंट को डिजीज के एनिमल मॉडल में नहीं रखा गया और ट्रांससर्वाग्निसे इंप्लांट किया गया । यह अध्ययन वायुमार्ग चोट और लैरिंगोट्रेचेल स्टेनोसिस के माउस मॉडल में ट्रांसलीवाइज रूप से रखे गए जैव संगत दवा-एल्यूटिंग स्टेंट का आकलन करने के लिए एक अनूठी विधि प्रदान करता है। एक जैव संगत स्टेंट जो स्थानीय रूप से एक इम्यूनोमोडुलेटरी दवा को कम करता है और एक मूत्र मॉडल में अध्ययन के लिए लघुकृत किया जा सकता है, अनुवादपूर्व अनुसंधान के लिए मूल्यवान है। अन्य सामग्री के साथ स्टेंट उपयोग के पिछले प्रयासों से विदेशी शरीर की मजबूत प्रतिक्रियाएं उत्पन्न होती हैं जो एलटीएस7को अलग करती हैं। यह पद्धति, हमारी जानकारी के लिए, एलटीएस के एक मूत्र मॉडल में स्टेंट आधारित दवा वितरण प्रणाली के इम्यूनोमोडुलाटी और एंटीफिब्रोटिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अपनी तरह की पहली है। मूत्र मॉडल ही श्वासनली पर एक इम्यूनोमोडुलरी दवा के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कई फायदे प्रदान करता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और स्वस्थ और रोगग्रस्त चूहों के प्रयोगात्मक साथियों का अध्ययन किया जा सकता है, जो प्रायोगिक प्रजनन क्षमता का कारण बन सकता है और लागत प्रभावशीलता में सुधार कर सकता है। इसके अलावा, माउस ट्रेचिया में ट्रांसलीवली स्टेंट की डिलीवरी मनुष्यों में इस तरह के स्टेंट के नैदानिक वितरण की नकल करती है, जो इस विधि के अनुवादीय लाभ को और उजागर करती है। अंत में, सापेक्ष आसानी जिसके साथ दवा के साथ पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट का उत्पादन किया जा सकता है, वह श्वासनली में निशान गठन को कम करने के उद्देश्य से वैकल्पिक दवा उपचार देने के लिए संशोधनों के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

नोट: यहां वर्णित सभी तरीकों को जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (MO12M354) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. पीएलएलए-पीसीएल में रैपमाइसिन की तैयारी

  1. 70:30 पीएलए-पीसीएल बहुलक समाधान (अंतर्निहित चिपचिपाहट 1.3−1.8 डीएल/जी) के दो ग्लास शीशियों (टोपियां के साथ) तैयार करें; सामग्री की तालिका) समाधान, एक शीशी जिसमें 1.0% रैपामाइसिन और दूसरा बिना रैपमाइसिन शामिल है।
    1. एक ग्लास शीशी में 70:30 पीएलएएलए-पीसीएल के 600 मिलीग्राम में 6 मिलीग्राम रैपामाइसिन जोड़कर पॉलीमर समाधान युक्त 1.0% रैपामाइसिन बनाएं।
    2. रैपमाइसिन (नियंत्रण) के बिना बहुलक समाधान के लिए, केवल ग्लास शीशी में 70:30 पीएलए-पीसीएल की 600 मिलीग्राम जोड़ें।
  2. एक धुएं के हुड के नीचे, प्रत्येक ग्लास शीशी में डाइक्लोरोमीथेन के 6 mL जोड़ें।
    सावधानी: डाइक्लोरोमीथेन एक संक्षारक सामग्री है और केवल ग्लास पिपेट का उपयोग किया जाना चाहिए। उचित सुरक्षा सावधानियों में व्यक्तिगत आंखों की सुरक्षा और दस्ताने शामिल हैं।
  3. प्रत्येक ग्लास शीशी (2% ग्लाइसेरोल समाधान के लिए) में ग्लाइसेरोल के 120 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: ग्लाइसेरोल के अलावा स्टेंट निर्माण में लचीलेपन और कम कठोरता के लिए अनुमति देता है।
  4. कांच की शीशियों को संक्षिप्त करें और 6−12 घंटे के लिए भंग और समरूपता करने के लिए रैपमाइसिन के साथ और बिना 70:30 पीएलएएलए-पीसीएल की अनुमति दें।
    नोट: कांच की शीशियों को तेजी से विघटन के लिए घूर्णन मिलाते हुए मंच पर भी रखा जा सकता है।

2. रैपमाइसिन एलुशन परीक्षण

  1. 70:30 पीएलए-पीसीएल समाधान का पिपेट 1 एल एक ग्लास पेट्री डिश में 1% रैपमाइसिन युक्त।
    नोट: 70:30 पीएलएएलए-पीसीएल समाधान की यह मात्रा जिसमें 1% रैपामाइसिन शामिल होगा 120 μg रैपामाइसिन शामिल है और प्रत्येक निर्माण में रैपामाइसिन की कुल मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। वैकल्पिक मात्रा और सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है।
  2. ग्लास पेट्री डिश में एक फ्लैट डिस्क में कठोर होने के लिए 1% रैपमाइसिन के साथ 70:30 पीएलए-पीसीएल की अनुमति दें।
  3. एक बार कठोर होने के बाद, डिस्क को फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस, पीएच 7.4) के 2 मिलील में रखें और 37 डिग्री सेल्सियस कक्ष में इनक्यूबेट करें।
  4. हर 24 एच पीबीएस (2 एमसीएल) को इकट्ठा करें और बदलें और रैपमाइसिन सामग्री के उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए पीबीएस का उपयोग करें।
  5. एक कैलिब्रेटेड मानक वक्र बनाने के लिए रैपमाइसिन के धारावाहिक कमजोर होने के साथ-साथ ऑटोसैंपलर इंजेक्टर के माध्यम से नमूने चलाने के लिए एक ऑटोसैंपलर और सी18 4.6 सेमी x 250 मिमी एचपीएलसी कॉलम का उपयोग करें। प्रत्येक नमूने को ट्रिपलेट में चलाएं।
    नोट: रैपमाइसिन के धारावाहिक कमजोर होने का परीक्षण किया जाना है जिसमें 10%, 1%, 0.1%, और 0.01% शामिल हैं।
  6. 2.0 मीटर/मिन की प्रवाह दर के साथ 10/90 वॉल्यूम/वॉल्यूम के साथ एचपीएलसी ग्रेड वॉटर और एसीटोनिट्रिल के मोबाइल चरण का उपयोग करें। 280 एनएम तक रैपामाइसिन के लिए एचपीएलसी के दौरान अवशोषण सेट करें।
    नोट: चित्रा 1 14 दिन की अवधि में रैपमाइसिन के elution से पता चलता है ।

3. रैपमाइसिन-एल्यूटिंग पीएलएलए-पीसीएल मैरिन एयरवे स्टेंट का निर्माण

नोट: संदूषण से बचने के लिए बाँझ सामग्री और बाँझ तकनीक का उपयोग करके चरण 3.2−3.9 करें जो वीवो और इन विट्रो अनुप्रयोगों में प्रभावित होगा।

  1. धारा 1 में वर्णित रैपमाइसिन वाले पीएलएएलए-पीसीएल समाधान तैयार करें।
  2. रबर के गुब्बारे के साथ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, पीएलएल-पीसीएल समाधान के 1 मिलील को लागू करें जिसमें 22 जी फ्लोरिनेट एथिलीन प्रोपलीन आधारित एंजियोकेथेटर(सामग्री की तालिका)के वेनस कैनुला पर 1% रैपमाइसिन युक्त है। एंजियोथेटर को एक हाथ में पकड़ें और पीएलए-पीसीएल समाधान को एंजियोकेथेटर पर छोड़ने के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग करें। पीएलए-पीसीएल समाधान के साथ एंजियोकाथेटर का समरूप कवरेज सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे एंजियोथेटर घुमाएं।
    नोट: सबसे पहले, पीएलए-पीसीएल समाधान पतला होगा, लेकिन जैसे ही डिक्लोरोमीथेन एंजियोथेटर पर आवेदन के दौरान वाष्पित हो जाता है, समाधान एंजियोकेथेटर पर मोल्ड करने के लिए अधिक चिपचिपा हो जाएगा। आवेदन के दौरान लगातार एंजियोकाथेटर को बदलना फायदेमंद है। स्टेंट की लगातार मोटाई सुनिश्चित करने के लिए यह कदम धीरे-धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए।
  3. नीचे की ओर सामना कर रहे एंजियोकाथेटर की नोक के साथ ढाला एंजियोथेटर सहारा और सुखाने के लिए एक गिलास पेट्री डिश के किनारे पर हिंट।
  4. स्टेंट कमरे के तापमान पर एक वैक्यूम हुड में 24 घंटे के लिए सूखने के लिए अनुमति दें(चित्र ा 2ए)।
  5. अंतर्निहित कैथेटर मुक्त घुमा और यह ढाला स्टेंट(चित्रा 2बी)से बाहर फिसलने द्वारा अंतर्निहित एंजियोथेटर से स्टेंट का निर्माण निकालें ।
  6. कास्टिंग प्रक्रिया के दौरान हुई किसी भी दोष के लिए स्टेंट की जांच करें। यदि डाले गए स्टेंट में कोई दोष मौजूद है तो उसे त्याग दें।
  7. ठीक सीधे कैंची के साथ डाली स्टेंट के प्रत्येक छोर ट्रिम इतना है कि किनारों अक्षीय हैं ।
  8. ठीक सीधे कैंची का उपयोग करना, एलटीएस(चित्रा 2सी)के माउस मॉडल में उपयोग के लिए कास्ट स्टेंट के 3 मिमी अक्षीय खंडों में कटौती करें।
    नोट: लगभग 8 स्टेंट एक डाली एंजियोथेटर से बनाया जा सकता है, प्रत्येक 3 मिमी स्टेंट के साथ रैपमाइसिन के 120 μg युक्त।
  9. एलटीएस(चित्रा 1)के माउस मॉडल में उपयोग के लिए एक नए 22 वेनस कैथेटर पर 3 मिमी स्टेंट लोड करें।

4. चूहों में लारिंगोट्रेहील स्टेनोसिस इंडक्शन

  1. वीवो माउस अध्ययन में आयोजित करने से पहले पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन प्राप्त करते हैं।
  2. एनेस्थेटाइज 9 हफ्ते पुराने पुरुष C57BL/6 केटामाइन (80−100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (5−10 मिलीग्राम/किलो) का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन देकर।
    नोट: चूहों के अन्य उपभेदों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन यह सिफारिश की जाती है कि चूहों का वजन 20−27 ग्राम के बीच हो।
  3. चूहों को एक प्रायोगिक समूह में यादृच्छिक (1% रैपामाइसिन युक्त पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट) और दो नियंत्रण समूहों के प्लेसमेंट के साथ कीमोमैकेनिकल चोट: 1) पीएलएएलए-पीसीएल स्टेंट, 2) कीमोमैकेनिकल चोट के प्लेसमेंट के साथ कीमोमैकेनिकल चोट स्टेंट की नियुक्ति।
  4. एक सर्जिकल मंच पर एक माउस को एक सुपीन स्थिति में रखें। केंद्रीय छेदक के चारों ओर लूपिंग करके सर्वाइकल स्पाइन का विस्तार करने के लिए मंच के शीर्ष पर चिपका धागे के एक छोटे लूप का उपयोग करें।
  5. टेप के 2 इंच टुकड़ों का उपयोग करमेज करने के लिए माउस के हाथ और पैर प्रत्यय। चुटकी माउस पंजा यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त संज्ञाहरण पड़ा है ।
  6. इसके बाद सर्जिकल साइट को प्रीपेड किया जाता है। ओवरलाइंग फर को हटा दिया जाना चाहिए और त्वचा को साफ किया जाना चाहिए (बारी आयोडीन या क्लोरहेक्सिडीन स्क्रब शराब या पतला त्वचा कीटाणुनाशक के साथ) तीन बार। क्षेत्र को लिपटा होना चाहिए और बाँझ दस्ताने पहने जाने चाहिए। निष्फल उपकरणों को उपयोग में नहीं होने पर बाँझ सतह पर रखा जाना चाहिए।
  7. ठीक घुमावदार आईरिस कैंची का उपयोग करमाउस की गर्दन में 1.5 सेमी मिडलाइन ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। ओवरलाइंग थाइमस को विभाजित करें और श्वासनली की कल्पना करने के लिए दो परिणामी लोबको को पार्श्वकृत करें। द्विपक्षीय रूप से बेहतर लगाव पर अंतर्निहित स्टर्नोहॉइड और स्टेनोथायराइड (पट्टा) मांसपेशियों को विभाजित करें।
    नोट: पूरे लैरिंगोट्रेहील कॉम्प्लेक्स को इसके बाद पूरी तरह से उजागर किया जाना चाहिए।
  8. श्वासनली में गला के माध्यम से ट्रांसलेटर रूप से 22 जी एंजियोकाथेटर पास करें। एंजियोथेटर के सही प्लेसमेंट में सहायता करने के लिए माउस के पूर्वकाल गला पर दबाव लागू करने के लिए छोटे संदंश का उपयोग करें। सही प्लेसमेंट (गैर-एसोफेगल) सुनिश्चित करने के लिए श्वासनक के माध्यम से सफेद एंजियोथेटर की कल्पना करें।
    नोट: माउस श्वासनली बेहद पतली है और पारदर्शी श्वासनली के माध्यम से सफेद एंजियोकाथेटर की कल्पना की जाएगी।
  9. डाला एंजियोकाथेटर के माध्यम से एक ब्लेओमाइसिन-लेपित तार ब्रश पास करें।
  10. धीरे-धीरे एंजियोकेथेटर को वापस लें ताकि केवल वायर ब्रश ही ट्रेलिया में रह सके।
  11. तार ब्रश के साथ श्वासनली लुमेन को यांत्रिक रूप से बाधित करने के लिए श्वासनली पर ठीक संदंश का उपयोग करके काउंटर दबाव लागू करें।
  12. तार ब्रश पर श्वासनली में एंजियोथेटर को फिर से डालें।
  13. वायर ब्रश निकालें और ब्लेओमाइसिन को फिर से लागू करें।
  14. दोहराएं चरण 4.8−4.12 कुल 5x। प्रत्येक आवेदन के बीच ब्रश करने के लिए ब्लेओमाइसिन लागू करें।
    नोट: इस मॉडल का सत्यापन और विवरण हिलेल एट अल8में पाया जा सकता है।
  15. माउस ट्रेचिया से एंजियोकाथेटर निकालें।
    नोट: यदि कोई स्टेंट नहीं रखना है, तो चीरा ऊतक गोंद के साथ बंद किया जा सकता है।

5. चूहों में ट्रांसलरपीएलए-पीसीएल स्टेंट प्लेसमेंट

  1. लोड एक 3 मिमी एक खाली 22 जी एंजियोकाथेटर(चित्रा 3ए)पर स्टेंट डाली ।
    नोट: स्टेंट एंजियोकेथेटर की नोक से 5 मिमी आराम करना चाहिए।
  2. 3 मिमी कास्ट स्टेंट पर एक पतली काली ऊर्ध्वाधर रेखा ड्रा करें।
    नोट: यह लाइन श्वासनली में स्टेंट के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है।
  3. ट्रांसलीतौर से स्टेंट के साथ प्रीलोडेड एंजियोथेटर के साथ माउस को इंटुकेट करें।
  4. ट्रांससर्वाइकल चीरा(चित्रा 3बी)के माध्यम से श्वासनलिया में एंजियोथेटर पर स्टेंट की कल्पना करें।
    नोट: श्वासनली बहुत पतली है, स्टेंट पर काले रंग की अनुमति श्वासनली के माध्यम से कल्पना की जा सकती है । सही श्वासनली प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए इसका उपयोग करें।
  5. स्टेंट को ठीक संदंश के साथ ट्रांससर्वाइकल चीरा के माध्यम से श्वासनली को मनोरंजक बनाकर पकड़ें।
  6. ठीक संदंश के साथ स्टेंट पर पकड़ बनाए रखते हुए एंजियोथेटर को ट्रांसलेटर से हटा दें।
    नोट: यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि स्टेंट के लिए बहुत अधिक बल लागू नहीं करने के लिए lumen क्रश नहीं है जब एंजियोकाथेटर हटा दिया जाता है । हालांकि, यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त बल की आवश्यकता होती है कि एंजियोथेटर के साथ स्टेंट को हटाया न जाए। ट्रेलिया में स्टेंट के स्थान और प्लेसमेंट की कल्पना करने के लिए 0.8 मिमी सियालेंडोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है।
  7. ऊतक गोंद के साथ ट्रांससर्वाइकल चीरा बंद करें।
  8. प्रत्येक माउस को अपने पिंजरे में वापस रखने से पहले अपने मूल गतिविधि के स्तर पर ठीक होने की अनुमति दें।

6. नमूनों की हिस्टोलॉजिक तैयारी

  1. 7, 14 या 21 दिनों के बाद पशु प्रोटोकॉल के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ चूहों को साँस लेने और बलिदान चूहों के साथ एनेस्थेटिकइज़ करें।
    नोट: अध्ययन की पुरानीता के आधार पर, अलग-अलग समय अंतराल का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 28, 30 दिन, आदि)।
  2. 4.4 और 4.5 चरणों में वर्णित सर्जिकल प्लेटफ़ॉर्म पर माउस की स्थिति।
  3. ठीक घुमावदार आईरिस कैंची का उपयोग कर माउस पर गर्दन चीरा फिर से खोलें।
  4. प्रति चरण 4.6 श्वासनलिया का पर्दाफाश करें।
  5. ठीक घुमावदार आईरिस कैंची का उपयोग करस्टेंट के स्तर से नीचे डिस्टल श्वासनली को विभाजित करें।
  6. ठीक घुमावदार आईरिस कैंची का उपयोग करके गला के नीचे और स्टेंट के ऊपर समीपस्थ श्वासनली को विभाजित करें।
    नोट: श्वासनक को छाती में वापस लेने से रोकने के लिए सबसे पहले डिस्टल ट्रेकिया को विभाजित करना महत्वपूर्ण है।
  7. विभाजित श्वासनली को घेघा से पीछे से अलग करें और माउस से श्वासनली को हटा दें।
    नोट: स्टेंट अभी भी माउस श्वासनली के भीतर बनाए रखा जाएगा ।
  8. श्वासनली से स्टेंट निकालें और 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में ठीक करें।
  9. डिस्टल एंड ओरिएंटेड श्रेष्ठता के साथ पैराफिन में फॉर्मेलिन-फिक्स्ड माउस ट्रेचिया नमूनों को एम्बेड करें ताकि श्वासनली की अक्षीय कटौती अगले चरण में की जा सके।
  10. माइक्रोटोम का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड माउस ट्रेचिया के 5 माइक्रोन सेक्शन को काट ें।
    नोट: नमूनों को डिस्टल ट्रेलिया से शुरू करके axially में काटा जाना चाहिए।
  11. नमूने की लंबाई के साथ हर 250 माइक्रोन एक 5 μm प्रतिनिधि अनुभाग प्राप्त करें।
  12. प्रत्येक प्रतिनिधि अनुभाग पर एच एंड ई दाग पूरा करें।
    1. स्लाइड्स में डालकर 3 मिन के लिए जाइलेन 2x प्रति स्लाइड में रखकर डिपरफ़िन करें।
    2. स्लाइड्स में रखें 2 मिन के लिए 100% इथेनॉल, 2 मिन के लिए 95% इथेनॉल और 2 मिन के लिए 70% इथेनॉल को रिहाइड्रेट करें।
    3. स्लाइड्स में 2 मिन के लिए चल रहे नल का पानी।
    4. स्लाइड्स में है3−5 मिन के लिए हेमैटक्सीलिन का दाग।
    5. आगे की स्लाइड्स में 5 मिन के लिए चल रहे नल के पानी से धोएं।
    6. स्लाइड्स में रखें 1% एसिड अल्कोहल 1 मिन के लिए।
    7. स्लाइड्स में 1 मिन के लिए चल रहे नल के पानी से धोएं।
    8. 30 एस के लिए 0.2% अमोनिया पानी में कुल्ला।
    9. आगे की स्लाइड्स में देखें 5 मिन के लिए नल का पानी। 95% इथेनॉल 10x में डिप करें।
    10. 30 एस के लिए eosin phloxine में स्लाइड रखकर Eosin दाग।
    11. 5 मिन के लिए 95% इथेनॉल में रखकर स्लाइड्स को डिहाइड्रेट करें, इसके बाद 5 मिन के लिए निरपेक्ष इथेनॉल 2x।
    12. 5 मिन के लिए जाइलीन 2x में रखें।
    13. स्लाइड्स में जानिए जाइलीन बेस्ड बढ़ते मीडियम के साथ।
  13. हिलेल एट अल 8 में वर्णित लेमिना प्रोपेरिया की मोटाई कोमापें।

7. वीवो में स्टेंट बायोकॉम्पिटीबिलिटी

  1. 6.1−6.4 चरणों के रूप में ऊतक वर्गों को तैयार करें। श्वासनली के लुमेन के भीतर स्टेंट के स्थान के सापेक्ष सूजन में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए इन श्वासनली वर्गों से स्टेंट न हटाएं।
    1. स्टेंट के लिए तीव्र विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए, CD3 और F4/80 मार्कर का उपयोग कर मैक्रोफेज और टी सेल गतिविधि का निरीक्षण करें ।
      नोट: अन्य मार्कर भी स्टेंट के लिए तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हाइड्रोफिलिक प्लस स्लाइड(सामग्रीकी तालिका) पर पैराफिन-एम्बेडेड श्वासनली के 5 μm कट अनुभाग प्राप्त करें। प्रत्येक स्लाइड पर दो वर्गरखें।
      नोट: ये धाराएं ट्रेलिया के उस क्षेत्र से होनी चाहिए जहां पीएलएएलए-पीसीएल स्टेंट रखा गया था।
  2. आगे की स्लाइड्स में रखें जाइलीन 2x में 5 मिन के लिए।
  3. 3 मिन प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल 2x में स्लाइड्स रखें।
  4. 1 मिन के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड्स रखें।
  5. स्लाइड्स को हिस्टोलॉजी धुंधला रैक में रखें ताकि वे एंटीजन रिट्रीवल बफर(सामग्री की तालिका)में डूबे हों और फिर 20 मिन के लिए उबलते पानी के साथ सब्जी स्टीमर में रखें।
  6. स्टीमर से धुंधला रैक निकालें और एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर को त्याग दें।
  7. बफर को पीबीएस के 1 एमएल से बदलें।
  8. स्लाइड्स में 1 मिन के लिए गीले धुंधला बॉक्स में रखें।
  9. पीबीएस को त्यागें और 30 मिन के लिए 10% एफबीएस के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) के साथ स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  10. डीएमईएम को त्यागें और विभिन्न प्रजातियों में उठाए गए दो प्राथमिक एंटीबॉडी का मिश्रण जोड़ें। स्लाइड्स में देखिए पैराफिन फिल्म और इनक्यूबेट के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे कमरे में।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में खरगोश विरोधी CD3 और चूहा विरोधी F4/80(सामग्री की मेज) काइस्तेमाल किया गया ।
  11. 5 मिन के लिए PBS 3x में स्लाइड्स में धोएं।
  12. स्लाइड्स में प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजातियों(सामग्री की तालिका)के लिए विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 0.5−1 घंटे के लिए 10% एफबीएस के साथ पतला।
  13. स्लाइड्स में देखें अंधेरे में 5 मिन के लिए पीबीएस 3x।
  14. स्लाइड्स में है 4'6- डिमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ बढ़ते मीडियम की एक बूंद के साथ कवरस्लिप पर माउंट करें। स्लाइड्स को अंधेरे में या तो 20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. एक लेजर स्कैन माइक्रोस्कोप और तस्वीर पर दाग स्लाइड देखें ।
  16. अघायल श्वासनली की तुलना में डीएपीआई और ब्याज के एंटीबॉडी के साथ धुंधला कोशिकाओं की कुल संख्या की मात्रा निर्धारित करें।

8. माउस श्वासनली मात्रात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. 6.1−6.7 चरणों में वर्णित माउस ट्रेचिया को इकट्ठा करें और स्टेंट हटा दें।
    नोट: काटा माउस श्वासनली 2 साल तक के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम-आधारित आरएनए निष्कर्षण किट(सामग्री की तालिका)के हिस्से के रूप में 1.4 मिमी सिरेमिक मोतियों(सामग्री की तालिका)के साथ एक मनका मिल समरूपता का उपयोग करके चरण 8.1 में काटे गए श्वास ऊतक को डेसिकेट करें।
    नोट: बीड मिल समरूप सेटिंग्स = 6 मीटर/एस पर एक ४० एस चक्र ।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए कॉलम-आधारित निष्कर्षण और शुद्धिकरण किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके सांस से आरएनए निकालें।
  4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके प्रत्येक नमूने से आरएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: आरएनए शुद्धता एक शुद्ध आरएनए नमूना पढ़ने २.० के साथ 260/230 एनएम अनुपात का उपयोग कर मूल्यांकन किया जाता है ।
  5. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके निकाले गए आरएनए से पूरक डीएनए बनाएं और निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक थर्मोसाइकिलर: 25 डिग्री सेल्सियस (प्राइमिंग) पर 5 मिन, 30 मिन (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन) के लिए 46 डिग्री सेल्सियस, और फिर 1 मिन (रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस की निष्क्रियता) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
  6. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर में उपयोग के लिए 10−25 एनजी/एमएल की एकाग्रता के लिए RNase मुक्त पानी के साथ पूरक डीएनए नमूनों को पतला करें।
  7. पीसीआर मास्टरमिक्स(टेबल ऑफ मैटेरियल),डीएच 2 ओ के 8 माइक्रोन और 10 माइक्रोन फॉरवर्ड के 0.5 माइक्रोन के साथ पूरक डीएनए (10−25 एनजी/एमएल) के 1 माइक्रोन मिलाएं और 96-वेल पीसीआर प्लेट(टेबल ऑफ मैटेरियल)के एक कुएं में ब्याज के जीन के लिए डीएच2ओ के 8 माइक्रोन और 0.5 माइक्रोन को रिवर्स प्राइमर करें।
    नोट: प्रत्येक कुएं में कुल मात्रा 20 μL होनी चाहिए। ९६ अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक अच्छी तरह से केवल एक नमूना और ब्याज का एक जीन शामिल होना चाहिए ।
  8. ब्याज के सभी जीन के लिए 8.1-8.7 कदम दोहराएं और प्रत्येक नमूने को ट्रिपलेट में प्रत्येक जीन के लिए चलाएं।
    नोट: जीन विशिष्ट आगे और रिवर्स प्राइमर(सामग्री की तालिका)कोलेजन 1, कोलेजन 3, और संदर्भ जीन के लिए एक्सिन आमतौर पर फाइब्रोसिस के मार्कर की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  9. वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर मशीन पर 96 अच्छी प्लेट रखें और निम्नलिखित प्रोटोकॉल शुरू करें: 15 एस और एनील के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विघटित करें और 40 चक्रों के लिए 60 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर विस्तारित करें।
  10. प्रत्येक भारत सरकार के लिए एक सीटी प्राप्त करने के लिए सभी नमूनों के लिए संदर्भ जीन के लिए सीटी मूल्य के लिए ब्याज (भारत सरकार) के जीन उत्पाद का पता लगाने के लिए चक्र सीमा मूल्य (सीटी) को सामान्य करें। फिर, प्रत्येक भारत सरकार के लिए इलाज और अनुपचारित नमूनों के लिए एक सीटी मूल्यों की तुलना करें ताकि एक सीटी उत्पन्न किया जा सके।
    नोट: चक्र सीमा प्रवर्धन वक्र पर बिंदु है जब जीन उत्पाद की एक पूर्व निर्धारित राशि मौजूद है (ΤRn) । प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए एक मूल्य ब्याज के प्रत्येक जीन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए और प्रवर्धन वक्र के रैखिक भाग पर गिर जाना चाहिए।
    नोट: सीटी = सीटी (सरकार) - सीटी (संदर्भ जीन); Hindi News: सीटी (इलाज) - सीटी (अनुपचारित) ।
  11. 200सीटीकी गणना करके गुना परिवर्तन की अभिव्यक्ति के रूप में इलाज और अनुपचारित नमूनों के बीच जीन अभिव्यक्ति में सापेक्ष परिवर्तन की गणना करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले रैपमाइसिन से भरा बायोडिग्रेडेबल पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट निर्माण शारीरिक परिस्थितियों में एक सुसंगत और उम्मीद के मुताबिक फैशन में रैपमाइसिन को eluting करने में सक्षम था(चित्रा 1)। चित्रा 2 पीएलएल-पीसीएल स्टेंट को एलटीएस के एक मूत्र मॉडल में उपयोग के लिए 22 जी एंजियोकाथेटर के आसपास कास्ट किया गया दिखाता है। यह निर्धारित करने के लिए कि ट्रेकिया में रैपमाइसिन एलुशन के प्रभाव फाइब्रोसिस को क्षीण करने में प्रभावोत्पादक हैं, फाइब्रोसिस से संबंधित जीन अभिव्यक्ति में मापा गया परिवर्तन और तीव्र सूजन के मार्कर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और एलिसा के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर माउस के श्वासनली में एक लघुकृत स्टेंट की सफल नियुक्ति का प्रदर्शन किया गया है। विधि का एक योजनाबद्ध चित्रित 3 मेंदिखाया गया है। चित्रा 4 श्वासनली में सीटू में लघुकृत जैव संगत स्टेंट को दिखाता है जैसा कि स्टेंट पर काले मार्कर द्वारा इंगित किया गया है, जिसे पारदर्शी माउस ट्रेचिया के माध्यम से कल्पना की जाती है। प्रारंभिक प्रयोगों में, श्वासनली में स्टेंट की नियुक्ति की पुष्टि करने के लिए 0.8 मिमी सियालेंडोस्कोप का उपयोग करना मददगार था। 21 दिनों के बाद, इस बात की पुष्टि करने के लिए कि स्टेंट का ट्रांसलनल प्लेसमेंट प्रभावोत्पादक था और स्टेंट अपनी मूल रूप से रखी गई स्थिति से माइग्रेट नहीं हुआ, स्टेंट की नियुक्ति का निर्धारण करने के लिए गर्दन का चीरा फिर से खोल दिया गया । जैसा कि चित्रा 4बीमें दिखाया गया है, स्टेंट के काले रंग के मार्कर ने पता चला कि स्टेंट ने श्वासनली में अपनी स्थिति बनाए रखी। स्टेंट के साथ उपचार के 21 दिनों के बाद श्वासनली का रीसेक्शन चित्रा 4सीमें दिखाया गया है।

तीव्र और पुरानी सूजन के मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला का उपयोग करके जैव अनुकूलता परीक्षण की प्रतिनिधि छवियों को चित्र5में दिखाया गया है । इसने दिखा दिया कि पीएलएला-पीसीएल स्टेंट निर्माण (रैपमाइसिन के बिना) अमुनोर्एक्टिव नहीं था जैसा कि प्लेसमेंट के बाद मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या से निर्धारित होता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस विधि में, सामान्य अघायल श्वासनली का उपयोग किया गया था और निर्माण के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए रैपमाइसिन के बिना पीएलएएलए-पीसीएल स्टेंट रखा गया था।

इसके बाद, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या रैपमाइसिन-एल्यूटिंग पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट निशान को कम करने में प्रभावी था, हमने पहले तीव्र सूजन और फाइब्रोसिस6के मार्कर में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का प्रदर्शन किया था। विशेष रूप से, 90.3 गुना कमी (एसईएम ± 26.0; एन = 4; पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.01) 4 दिन में col1a1 में कमी, साथ ही तीव्र भड़काऊ मार्कर INF-1, CD11b, Arg-1, और आईएल-1B6। हालांकि कुछ जीन के लिए गुना परिवर्तन में अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे, यह संभव है कि चूहों की एक बड़ी पलटन के साथ, महत्व को प्राप्त किया जा सकता है । यह निर्धारित करने के लिए कि क्या दवा एल्यूशन हिस्टोलॉजिकल रूप से ट्रेलिया में परिवर्तन थे, या क्या स्टेंट द्वारा रेडियल फोर्स श्रम के कारण श्वासनली में परिवर्तन थे, हमने दिखा दिया कि रैपमाइसिन-एल्यूटिंगस्टेंटके बिना उन लोगों की तुलना में रापैमाइसिन-एल्यूटिंग स्टेंट के साथ इलाज करने वालों में लेमिना प्रोपेरिया की चौड़ाई में कमी आई है।

Figure 1
चित्रा 1: रैपमाइसिन पीएलएलए-पीसीएल एल्यूशन। पीएलएलए-पीसीएल 1% रैपमाइसिन युक्त निर्माण ने 14 दिन की अवधि में रैपमाइसिन की एक सुसंगत और उम्मीद के मुताबिक रिहाई का प्रदर्शन किया। डेटा अंक नमूना elution (n = 3) के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्टेंट कास्टिंग । (A)पीएलए-पीसीएल समाधान को 22 जी एंजियोकेथेटर के आसपास सूखने की अनुमति दी गई थी । (ख)इसके बाद कास्ट को एंजियोथेटर से हटा दिया गया । (ग) माउस मॉडल6में उपयोग के लिए स्टेंट को 3 मिमी लंबाई तक काट दिया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहों में ट्रांसलस्टेंट प्लेसमेंट। (क)स्टेंट को एक खाली एंजियोथेटर पर लोड किया गया था और ट्रांसलीवली रूप से ट्रेलिया में रखा गया था । (ख)माउस ट्रेलिया में अपनी स्थिति की पुष्टि करने के लिए स्टेंट पर ब्लैक डाया मार्किंग ट्रांससर्वाइकल चीरा के माध्यम से देखी जा सकती है । (ग) रोगग्रस्त माउस श्वासनली6में सीटू में स्टेंट का प्रतिनिधि ड्राइंग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र4: स्टेंट की सीटू छवियों में। (ए-बी) ब्लैक डाये के निशान वाला स्टेंट मिमूत्र श्वासाचिया में सीटू में देखा जा सकता है। (ग) 21 दिन6बजे फसल के बाद स्टेंट और मूत्र लैरिंगोट्रेचेल परिसर की एक छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: स्टेंट बायोकॉम्पिटीबिलिटी। 4 दिन में F4/80 (मैक्रोफेज, लाल गुणसूत्र) और सीडी 3 (हरी गुणसूत्र, टी-लिंफोसाइट्स) के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने से पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट के साथ(ए)अघायल ट्रेलिया और(बी)ट्रेलिया में न्यूनतम भड़काऊ कोशिकाओं का पता चला । यहएकघायल श्वासनली के साथ विरोधाभासों, एक मोटा लेमिना प्रोपेरिया और सकारात्मक F4/80 और CD3 धुंधला6के साथ कई कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सफलतापूर्वक निर्माण और वीवो में एक दवा eluting स्टेंट का उपयोग करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम 1) वांछनीय दवा elution दर के लिए इष्टतम PLLA-पीसीएल अनुपात का निर्धारण, 2) दवा की उचित एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए eluted, 3) स्टेंट मोल्डिंग वीवो उपयोग में एंजियोथेटर के आसपास, और 4) घातक वायुमार्ग बाधा पैदा किए बिना एलटीएस इंडक्शन के बाद चूहों में स्टेंट पहुंचाते हैं।

जबकि वायुमार्ग रोग के पशु मॉडल में स्टेंट का उपयोग कर दवा वितरण के लिए कई तरीके हैं, एक रोगग्रस्त मूत्र मॉडल में दवा वितरण में सक्षम जैव संगत स्टेंट का विकास एक पहले है। दवा वितरण के लिए इस विधि को विकसित करने में, विधि में कई संशोधन किए गए थे। स्टेंट बनाने के लिए उपयुक्त पीएलएएलए-पीसीएल संरचना निर्धारित करना महत्वपूर्ण था जो यांत्रिक रूप से पर्याप्त कठोर थे जिन्हें श्वासनली में रखा गया था और शारीरिक स्राव के बावजूद श्वासनली में रहना था। पीएलएएलए-पीसीएल की 70:30 संरचना पर एक एंजियोकेथर मोल्डिंग के साथ स्टेंट निर्माण के लिए निर्णय लिया गया था क्योंकि यह सफलतापूर्वक एक दुर्दशापूर्ण प्रकृति में रैपामाइसिन को एलिट कर सकता है, हमारे माउस मॉडल में एक सुरक्षित और विश्वसनीय फैशन में रखा जा सकता है, और शारीरिक रूप से नीचा नहीं शर्तों. इस विधि का एक कठिन और संभावित निर्माता-निर्भर हिस्सा एंजियोथेटर्स के चारों ओर स्टेंट को ढाल रहा है। प्रारंभ में, वीवो स्टेंट में निर्माण में, 22 जी एंजियोथेटर को एक ग्लास पिपेट की नोक के अंदर रखा गया था और पॉलिमर समाधान एंजियोकेथेटर और ग्लास पिपेट के बीच की जगह में डाला गया था, जो बीच में अंतरिक्ष की एक डाली बना रहा था। हालांकि, इस विधि के परिणामस्वरूप स्टेंट की दीवार अक्सर बहुत पतली थी और ट्रेलिया में मज़बूती से नहीं रखी जा पा रही थी। एंजियोकेथेटर पर स्टेंट मोल्डिंग के लिए वर्तमान विधि की एक सीमा स्थिरता के लिए निर्माता पर निर्भरता है, और स्टेंट उत्पादन में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए विस्तार पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। कास्ट किए गए स्टेंट के बीच मोटाई में भिन्नता की संभावना को भविष्य के अध्ययनों में संबोधित करने की आवश्यकता है। आगे के अध्ययनों के साथ, हम एक और गिलास या गैर-संकारी सामग्री से घिरे 22 जी एंजियोकेथेटर के लिए एक मोल्ड डिजाइन करने की उम्मीद करते हैं, जैसे कि एंजियोकेथेटर और ग्लास एन्केशिंग के बीच की जगह 50 माइक्रोन है, जिसे हमने स्टेंट की पर्याप्त दीवार मोटाई बनने की ठानली है श्वासनली में आसान प्लेसमेंट के लिए।

प्रभावित श्वासनली में दवा वितरण का अध्ययन करने के लिए जैव संगत स्टेंट का उपयोग करने के कई लाभ हैं। कुल मिलाकर, धातु या सिलिकॉन से बना स्टेंट जिन्हें दवा युक्त बहुलक के साथ लेपित किया गया है, को ग्रेनुलेशन ऊतक का उत्पादन करने और श्वासनली के पहले से ही जख्मवाले हिस्से के लिए आगे भड़काऊ प्रतिक्रिया दिखाई गई है। यह विधि, जो पूरी तरह से बायोमटेरियल से बने स्टेंट के उपयोग से पूछताछ करती है जो जैव संगत है और विश्वसनीय तरीके से एक इम्यूनोमोडुलेटरी दवा भी जारी करती है, लाभप्रद है। पीएलएलए-पीसीएल स्टेंट को मूत्र मॉडल में जैव संगत भी दिखाया गया है और यह तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया नहीं देता है। फाइब्रोसिस का मुकाबला कर सकती हैं कि दवाओं का अध्ययन करने में, पूरी तरह से इस विधि में वर्णित पीएलएएलए-पीसीएल जैसे जैव संगत सामग्री से बना स्टेंट का उपयोग करना फायदेमंद है।

उपयोग करने योग्य स्टेंट का निर्माण करने के लिए इस विधि का उपयोग करने में लाभ और आसानी यह है कि पीएलए-पीसीएल की संरचना को विविध किया जा सकता है, जिससे संरचना में मिश्रित दवा के लिए रिलीज प्रोफाइल में अंतर होता है। पीएलएएलए-पीसीएल सामग्री के पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि पीएलएएलए-पीसीएल मिश्रणों में भिन्नता सामग्री के अधिक क्षरण का कारण बन सकती है, जिससे तेजी से दवा रिलीज9की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, चूहों में रखे जा सकने वाले स्टेंट बनाने के लिए इस विधि का उपयोग करना लाभप्रद है, क्योंकि वायुमार्ग रोग के लिए अधिकांश स्टेंट अध्ययन बड़े जानवरों में किए गए थे10,11,12। एक माउस मॉडल का उपयोग जिसे विभिन्न रोग प्रतिमानों के लिए संशोधित किया जा सकता है और रोगग्रस्त राज्य में दवा-एल्यूटिंग स्टेंट के परीक्षण के लिए अनुमति देता है, आदर्श है। एक रोगग्रस्त राज्य में दवा-eluting स्टेंट का परीक्षण और रोग के बिना जानवरों में उन लोगों के लिए अपनी प्रभावकारिता की तुलना करने में सक्षम किया जा रहा है अधिक से अधिक प्रयोगात्मक कठोरता के लिए अनुमति देता है । इस विधि से यह भी पता चलता है कि कैसे वायुमार्ग के लिए एक दवा-eluting स्टेंट ट्रांसलीवाइज रखा जा सकता है, जैसा कि पिछले अध्ययनों के विपरीत था जहां स्टेंट शल्य चिकित्सा से प्रत्यारोपित किए गए थे।

यह अध्ययन स्टेंट विकास और एक छोटे से पशु मॉडल में परीक्षण के लिए एक बहुत ही गुणयोबल मंच को दर्शाता है । हालांकि, मानव विषयों में उपयोग के लिए अन्य कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। स्टेंट की दृढ़ और कठोर प्रकृति को देखते हुए यह संभावना एक मोड़ा लचीला ब्रोंकोस्कोप के माध्यम से नहीं रखा जा सकता है, लेकिन प्रत्यक्ष laryngoscopy और कठोर ब्रोंकोस्कोपी के साथ ट्रांसकोरतरी के साथ रखा जाना चाहिए । आदर्श रूप से, स्टेंट को रेस्टेनोसिस को कम करने में मदद करने के लिए वायुमार्ग के गुब्बारे फैलाव के बाद रखा जाएगा। रोगी सुरक्षा के संभावित से, स्टेंट के लिए प्रवास करने की क्षमता एक बड़ी चिंता का विषय है क्योंकि यह संभवतः जीवन की धमकी वायुमार्ग समझौता करने के लिए नेतृत्व कर सकता है । माध्यमिक रूप से, बलगम या रक्त के संचय के लिए स्टेंट बाधा माध्यमिक की क्षमता पर भी विचार किया जाना चाहिए। इन जोखिमों को कम करने के लिए आगे परीक्षण और विकास की जरूरत है ।

भविष्य के अध्ययन इस विधि का उपयोग पीएलए-पीसीएल मिश्रण में विभिन्न दवाओं का परीक्षण करने के लिए आगे समझ सकते हैं कि कैसे अलग इम्यूनोसप्रेसिव उपचार श्वासनली में निशान गठन को कम कर सकता है। क्योंकि इस तरह के स्टेंट चूहों में रखा जा सकता है, निशान बनाने जीन के लिए आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों या चूहों की एक बड़ी पलटन का उपयोग कर भी परीक्षण किया जा सकता है । भविष्य के प्रयोगों में स्टेंट (3-6 महीने) के क्रोनिक प्रत्यारोपण के बाद हो सकने वाले श्वासनली में परिवर्तन ों को समझना और श्वासनली के लुमेन में परिवर्तन के साथ-साथ भड़काऊ मार्कर और फाइब्रोसिस के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को भी शामिल किया जा सकता है मार्करों.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

राष्ट्रीय बधिरता और स्वास्थ्य के अन्य संचार विकारों पर संस्थान पुरस्कार संख्या 1K23DC014082 और 1R21DC017225 (अलेक्जेंडर Hillel) के तहत स्वास्थ्य संस्थानों । इस अध्ययन को ट्राइओलॉजिकल सोसायटी और अमेरिकन कॉलेज ऑफ सर्जन (अलेक्जेंडर हिलेल), अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन फाउंडेशन, शिकागो, आईएल (माधवी डुवुपुरी) और एक T32 NIDCD प्रशिक्षण अनुदान (केविन Motz) द्वारा भी आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter Jelco 4050
Dichloromethane Sigma Aldrich 270997-100ML
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Available from other vendors as well.
PDLGA Sigma Aldrich 739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30) Evonik Industries AG 65053
Rapamycin LC Laboratories R-5000
2. Animal surgery
Wire brush Mill-Rose Company 320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer Abcam ab93678 Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI Cell Signaling 8961S
DMEM ThermoFisher Scientific 11965-092 Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum) MilliporeSigma F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody Lif technology a11008
Goat anti-rat-633 antibody Lif technology a21094
Hydrophilic plus slide BSB7028
PBS ThermoFisher Scientific 100-10023 Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody Abcam ab5690
Rat antiF4/80 antibody Biolengend 123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads OMNI International 19-645
Bead Mill Homoginizer OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix Life Technologies 4367659
RNeasy mini kit Qiagen 80404
StepOnePlus Real Time PCR system Life Technologies

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References

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लारिंगोट्रेचेल स्टेनोसिस के साथ चूहों में एक जैव संगत दवा-Eluting Tracheal स्टेंट का डिजाइन
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Duvvuri, M., Motz, K., Tsai, H. W.,… More

Duvvuri, M., Motz, K., Tsai, H. W., Lina, I., Ding, D., Lee, A., Hillel, A. T. Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis. J. Vis. Exp. (155), e60483, doi:10.3791/60483 (2020).

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