Summary
A estenose de laringotracura resulta da deposição patológica da cicatriz que estreita crìtica a via aérea do traqueal e falta terapias médicas eficazes. Usando um stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactona) como um sistema local de entrega de drogas, terapias potenciais destinadas a diminuir a proliferação de cicatrizna traqueia podem ser estudadas.
Abstract
A estenose laringotraqueaca (LTS) é um estreitamento patológico da subglotee e traqueia, levando à obstrução extratorácica e significativa falta de ar. Lts resulta de lesão mucosa de um corpo estranho na traqueia, levando a danos nos tecidos e uma resposta inflamatória local que dá errado, levando à deposição de tecido cicatricial patológico. O tratamento para LTS é cirúrgico devido à falta de terapias médicas eficazes. O objetivo deste método é construir um stent biocompatível que pode ser miniaturizado para colocar em camundongos com LTS. Demonstramos que uma construção PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactona) tinha força biomecânica ideal, era biocompatível, praticável para um stent de colocação in vivo e capaz de combater a droga. Este método fornece um sistema de entrega de drogas para testar vários agentes imunomodulatórios para inibir localmente a inflamação e reduzir a fibrose das vias aéreas. A fabricação dos stents leva de 28 a 30 h e pode ser reproduzida facilmente, permitindo experimentos com grandes coortes. Aqui incorporamos a droga rapamicina dentro do stent para testar sua eficácia na redução da fibrose e deposição de colágeno. Os resultados revelaram que as tendas PLLA-PCL apresentaram liberação confiável de rapamicina, eram mecanicamente estáveis em condições fisiológicas e eram biocompatíveis, induzindo pouca resposta inflamatória na traqueia. Além disso, os stents PLLA-PCL que eluting à rapamicina reduziram a formação de cicatrizes na traqueia in vivo.
Introduction
A estenose laringotraqueatra (LTS) é um estreitamento patológico da traqueia na maioria das vezes devido a lesões iagênicas pós-intubação. A combinação de colonização bacteriana, resposta corporal estranha a uma traqueostomia ou tubo de endotraqueano e fatores específicos do paciente levam a uma resposta inflamatória aberrante. Esta resposta imune desadaptativa leva à deposição de colágeno na traqueia, resultando em estreitamento luminal da traqueia e estenose subseqüente1,2. Como o tratamento atual para esta doença é principalmente cirúrgico, o desenvolvimento de um paradigma de tratamento alternativo medicamente baseado visando as vias inflamatórias e profibrotic aberrantes que levam à deposição excessiva de colágeno tem sido estudada. Rapamicina, que inibe o complexo de sinalização mTOR, tem sido mostrado para ter efeitos imunossupressores, bem como um efeito antifibroblasto robusto. No entanto, quando a rapamicina é administrada sistemicamente, efeitos colaterais comuns (por exemplo, hiperlipidemia, anemia, trombocitoopenia) podem ser pronunciados3. O objetivo da nossa metodologia é desenvolver um veículo para a entrega local de medicamentos praticável para uso nas vias aéreas que diminuiria esses efeitos sistêmicos. Nossas avaliações se concentram em investigar a resposta imune local à construção de entrega de drogas, bem como sua capacidade de inibir a função do fibroblasto e alterar o microambiente imunológico local. Os resultados específicos da doença incluem testes in vivo que avaliam marcadores de fibrose.
Stents biodegradáveis de luta contra drogas têm sido usados em modelos animais de doença em sistemas de múltiplos órgãos, incluindo as vias aéreas4. Para a gestão da estenose das vias aéreas ou colapso, investigações anteriores têm usado silicone revestido de drogas e stents à base de níquel5. Uma construção PLLA-PCL foi escolhida para este método particular por causa de seu perfil de elução de drogas e força mecânica em condições fisiológicas durante um período de 3 semanas, o que foi demonstrado em estudos publicados anteriores6. PLLA-PCL também é um material biocompatível e biodegradável já aprovado pelo FDA4. Stents biocompatíveis que elutam cisplatina e MMC têm sido estudados em grandes modelos animais, como coelhos e cães. No entanto, nesses modelos animais, os stents não foram colocados em um modelo animal de doença e foram implantados transcervicalmente. Este estudo fornece um método original para avaliar um stent droga-eluting biocompatível colocado transorally em um modelo do rato de ferimento da via aérea e de estenose laryngotracheal. Um stent biocompatível que inviabiliza uma droga imunomodulatória localmente e pode ser miniaturizado para estudo em um modelo de urina é valioso para pesquisa pré-clínica translacional. Tentativas anteriores de utilização de stent com outras construções materiais geraram respostas robustas do corpo estranho piorando a inflamação subjacente que distingue lts7. Esta metodologia, a nosso conhecimento, é a primeira de seu tipo para estudar os efeitos imunomodulatórios e antifibrotic de um sistema stent-baseado da entrega da droga em um modelo do murine de LTS. O modelo murine em si oferece várias vantagens para estudar os efeitos de uma droga imunomodulatória na traqueia. Camundongos geneticamente modificados e coortes experimentais de camundongos saudáveis e doentes podem ser estudados, o que pode levar à reprodutibilidade experimental e melhorar a relação custo-eficácia. Além disso, a entrega do stent transoralmente na traqueia do rato imita a entrega clínica de tal stent nos seres humanos, o que destaca ainda mais a vantagem translacional deste método. Finalmente, a relativa facilidade com que o stent PLLA-PCL com a droga pode ser produzida permite modificações para fornecer terapias medicamentosas alternativas destinadas a reduzir a formação de cicatriz na traqueia.
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Protocol
NOTA: Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (MO12M354).
1. Preparação de rapamicina em PLLA-PCL
- Prepare dois frascos de vidro (com tampas) de 70:30 soluções de polímero PLLA-PCL (viscosidade inerente 1,3-1,8 DL/G; Tabela de Materiais) soluções, com um frasco contendo 1,0% de rapamicina e o outro sem rapamicina.
- Faça uma rapamicina de 1,0% contendo solução de polímero, adicionando 6 mg de rapamicina a 600 mg de 70:30 PLLA-PCL em um frasco de vidro.
- Para solução de polímero sem rapamicina (controle), adicione apenas 600 mg de 70:30 PLLA-PCL ao frasco de vidro.
- uma capa de fumaça, adicione 6 mL de diclorometano a cada frasco de vidro.
CUIDADO: Diclorometano é um material corrosivo e apenas pipetas de vidro devem ser usadas. As precauções de segurança apropriadas incluem proteção de olho pessoal e luvas. - Adicione 120 μL de glicerol a cada frasco de vidro (para solução de glicerol de 2%).
NOTA: A adição de glicerol permite maior flexibilidade e diminuição da rigidez na construção do stent. - Recapitue os frascos de vidro e permita que 70:30 PLLA-PCL com e sem rapamicina se dissolva e homogeneize para 6-12 h.
NOTA: Frascos de vidro também podem ser colocados em uma plataforma de agitação rotativa para uma dissolução mais rápida.
2. Teste de luluna de rapamicina
- Pipette 1 mL de 70:30 PLLA-PCL solução contendo 1% rapamicina em uma placa de Petri de vidro.
NOTA: Este volume de 70:30 plla-pcl solução contendo 1% rapamicina irá conter 120 μg de rapamicina e representa a quantidade total de rapamicina em cada construção. Volumes e concentrações alternativos podem ser usados. - Permita 70:30 PLLA-PCL com 1% de rapamicina para endurecer em um disco plano na placa de petri de vidro.
- Uma vez endurecido, coloque o disco em 2 mL de sostelo tampão de fosfato (PBS, pH 7.4) e incubar em uma câmara de 37 °C.
- Coletar e substituir PBS (2 mL) a cada 24 h e usar PBS coletado para análise de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de conteúdo de rapamicina.
- Use um autosampler e uma coluna HPLC c18 4,6 cm x 250 mm para executar amostras através do injetor de amostra automática, juntamente com diluições em série de rapamicina para criar uma curva padrão calibrada. Executar cada amostra em triplicado.
NOTA: Diluições em série de rapamicina a ser testada incluem 10%, 1%, 0,1% e 0,01%. - Use uma fase móvel de água de grau HPLC e acetônio com volume/volume de 10/90 com uma taxa de fluxo de 2,0 mL/min. Deabsorção definida durante o HPLC para rapamicina a 280 nm.
NOTA: A Figura 1 mostra a lubrisão da rapamicina durante um período de 14 dias.
3. Criação de stents das vias aéreas plla-PCL murine de rapamicina
NOTA: Executar etapas 3.2-3.9 usando materiais estéreis e técnica estéril para evitar a contaminação que influenciaria as aplicações in vivo e in vitro.
- Prepare soluções PLLA-PCL contendo rapamicina, conforme descrito na seção 1.
- Usando uma pipeta pasteur de vidro com um balão de borracha, aplique 1 mL de solução PLLA-PCL contendo 1% de rapamicina na cânula venosa de um angiocateter à base de etileno fluorado de 22 G (Mesa de Materiais). Segure o angiocateter em uma mão e use a pipeta de vidro para soltar a solução PLLA-PCL no angiocateter. Gire lentamente o angiocateter para assegurar uma cobertura homogênea do angiocateter com a solução PLLA-PCL.
NOTA: No início, a solução PLLA-PCL será fina, mas à medida que o diclorometano evapora durante a aplicação para o angiocateter, a solução se tornará mais viscosa para moldar o angiocateter. Transformar continuamente o angiocateter durante a aplicação é benéfico. Esta etapa deve ser feita lenta e meticulosa mente para garantir a espessura consistente do stent. - Prop o angiocateter moldado com a ponta do angiocateter voltado para baixo e o punho na borda de uma placa de Petri de vidro para secagem.
- Permitir que os stents sequem por 24 h em um capô a vácuo à temperatura ambiente (Figura 2A).
- Retire a construção do stent do angiocateter subjacente, torça suavemente o cateter subjacente livre e deslizando-o para fora do stent moldado (Figura 2B).
- Verifique o stent circuferentially para quaisquer defeitos que possam ter resultado durante o processo de fundição. Se um defeito no stent fundido estiver presente, descarte-o.
- Apare cada extremidade do stent moldado com tesouras retas finas de modo que as bordas sejam axiais.
- Usando tesouras retas finas, corte segmentos axiais de 3 mm do stent fundido para uso em um modelo de mouse de LTS(Figura 2C).
NOTA: Aproximadamente 8 stents podem ser feitos de um angiocateter fundido, com cada stent de 3 mm contendo 120 μg de rapamicina. - Carregue o stent de 3 mm em um novo cateter venoso de 22 para uso em um modelo de mouse de LTS (Figura 1).
4. Indução de estenose laringotraheal em camundongos
- Antes de realizar estudos in vivo mouse obter aprovação do Animal Care and Use Committee.
- Anestesie um C57BL/6 masculino de 9 semanas de idade, dando uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazine (5 a 10 mg/kg).
NOTA: Outras cepas de camundongos podem ser substituídas, mas recomenda-se que o peso dos ratos esteja entre 20 e 27 g. - Randomize camundongos em um grupo experimental (lesão quimiomecânica com colocação de um stent PLLA-PCL contendo rapamicina de 1%) e dois grupos de controle: 1) lesão quimiomecânica com a colocação de um stent PLLA-PCL, 2) lesão quimiomecânica sem a colocação de um stent.
- Coloque um mouse em uma plataforma cirúrgica em uma posição supina. Use um pequeno laço de linha afixada no topo da plataforma para estender a coluna cervical, looping-lo em torno dos incisivos centrais.
- Afixar as mãos e pernas do mouse para a mesa usando pedaços de fita de 2 polegadas. Pitada de pata do rato para garantir que ele teve anestesia adequada.
- O local cirúrgico é então preparado. A pele sobrejacente deve ser removida e a pele deve ser limpa (esfoliação alternada de iodo ou clorexidina com álcool ou desinfetante de pele diluída) três vezes. A área deve ser drapejada e luvas estéreis ser desgastado. Os instrumentos esterilizados devem ser colocados em uma superfície estéril quando não estiverem em uso.
- Faça uma incisão vertical de 1,5 cm no pescoço do rato usando uma tesoura fina de íris curva. Divida o timo sobrejacente e lateralize os dois lobos resultantes para visualizar a traqueia. Divida os músculos sternohyoid e sternothyroid (cinta) sobre o apego superior bilateralmente.
NOTA: Todo o complexo laringotracheal deve ser completamente exposto após isso. - Passe um angiocateter 22 G transoralmente através da laringe na traqueia. Use pequenos fórceps para aplicar pressão sobre a laringe anterior do mouse para auxiliar na colocação correta do angiocateter. Visualize o angiocateter branco através da traqueia para garantir a colocação correta (não esôfago).
NOTA: A traqueia do rato é extremamente fina e o angiocateter branco será visualizado através da traqueia translúcida. - Passe uma escova de arame revestida de bleomicina através do angiocateter inserido.
- Retire lentamente o angiocateter de modo que somente a escova de fio permaneça na traqueia.
- Aplique pressão contrária usando fórceps finos na traqueia para interromper mecanicamente o lumen traqueal com a escova de arame.
- Reinserir o angiocateter na traqueia sobre a escova de arame.
- Retire a escova de arame e reaplicar bleomicina.
- Repita os passos 4,8-4,12 um total de 5x. Aplique bleomicina no pincel entre cada aplicação.
NOTA: Validação e descrição deste modelo podem ser encontradas em Hillel et al.8. - Retire o angiocateter da traqueia do rato.
NOTA: Se nenhum stent deve ser colocado, a incisão pode ser fechada com cola de tecido.
5. Transoral PLLA-PCL colocação stent em camundongos
- Carregue um stent fundido de 3 mm em um angiocateter vazio de 22 G(Figura 3A).
NOTA: O stent deve descansar 5 mm da ponta do angiocateter. - Desenhe uma fina linha vertical preta no stent fundido de 3 mm.
NOTA: Esta linha permite uma melhor visualização do stent na traqueia. - Transolrali intuição do rato com o angiocateter que foi pré-carregado com o stent.
- Visualize o stent no angiocateter na traqueia através da incisão transcervical(Figura 3B).
NOTA: A traqueia é muito fina, permitindo que o tingelo preto no stent seja visualizado através da traqueia. Use isso para confirmar a colocação correta do traqueia. - Segure o stent no lugar, segurando a traqueia através da incisão transcervical com fórceps finos.
- Retire o angiocateter transoral, mantendo um aperto no stent com as fórceps finas.
NOTA: É extremamente importante não aplicar muita força ao stent para não esmagar o lúmen quando o angiocateter é removido. No entanto, é necessária força suficiente para garantir que o stent não seja removido com o angiocateter. Um sialendoscope de 0,8 mm pode ser usado para visualizar a localização e a colocação do stent na traqueia. - Feche a incisão transcervical com cola de tecido.
- Permita que cada rato se recupere ao seu nível de atividade original antes de colocá-lo de volta em sua gaiola.
6. Preparação histológica de amostras
- Anestésicos camundongos com anestesia inalada e camundongos sacrificam com deslocamento cervical por protocolo animal após 7, 14 ou 21 dias.
NOTA: Com base na crônica do estudo, diferentes intervalos de tempo podem ser usados (por exemplo, 28, 30 dias, etc.). - Posicione um mouse na plataforma cirúrgica, conforme descrito nos passos 4,4 e 4,5.
- Reabra a incisão do pescoço no mouse usando uma tesoura fina de íris curva.
- Expor a traqueia por passo 4,6.
- Divida a traqueia distal abaixo do nível do stent usando uma tesoura fina de íris curvada.
- Divida a traqueia proximal abaixo da laringe e acima do stent usando uma tesoura fina de íris curva.
NOTA: É importante dividir a traqueia distal primeiro para evitar que a traqueia se retraia no tórax. - Separe a traqueia dividida do esôfago posteriormente e retire a traqueia do mouse.
NOTA: Os stents ainda serão mantidos dentro da traqueia do rato. - Retire o stent da traqueia e conserte em 10% de formalina por 24 h.
- Incorporar espécimes de traqueia de camundongos fixas formais em parafina com o final distal orientado superiormente para que cortes axiais da traqueia possam ser feitos na próxima etapa.
- Corte 5 seções μm da traqueia de camundongo sinfina-encaixada com um microtome.
NOTA: Os espécimes devem ser cortados axially a partir da traqueia distal. - Obter uma seção representativa de 5 μm a cada 250 μm ao longo do comprimento do espécime.
- Complete a mancha de H&E em cada seção representativa.
- Deparaffinize os slides, colocando em xileno 2x por slide por 3 min.
- Coloque os slides em 100% de etanol por 2 min, 95% de etanol para 2 min e 70% de etanol para 2 min para reidratar.
- Lave os slides com água da torneira corrente por 2 min.
- Manchar os slides em hematoxilina para 3-5 min.
- Lave os slides com água da torneira corrente por 5 min.
- Coloque os slides em 1% de álcool ácido por 1 min.
- Lave os slides com água da torneira corrente por 1 min.
- Enxágüe em 0,2% de água de amônia para 30 s.
- Lave os toboáguas na água da torneira corrente por 5 minutos. Mergulhe em 95% de etanol 10x.
- Mancha de eosina, colocando slide em eosin a fagotina por 30 s.
- Desidratar os slides, colocando em 95% de etanol por 5 min, seguido pelo etanol absoluto 2x para 5 min.
- Coloque em xileno 2x por 5 min.
- Monte os slides com médio de montagem à base de xileno.
- Medir a espessura da propria lamina como descrito em Hillel et al.8.
7. Biocompatibilidade stent in vivo
- Prepare seções de tecido saem dos passos 6,1-6,4. Não retire o stent dessas seções traqueais, a fim de visualizar as mudanças na inflamação em relação à localização do stent dentro do lumen da traqueia.
- Para determinar a resposta aguda do corpo estranho ao stent, observe a atividade do macrófago e da pilha de T usando marcadores CD3 e De F4/80.
NOTA: Outros marcadores também podem ser usados para determinar a reação inflamatória aguda ao stent. - Obtenha 5 seções de corte μm da traqueia embutida de parafina em lâminas hidrofílicas comercialmente disponíveis (Tabela de Materiais). Coloque duas seções em cada slide.
NOTA: Estas seções devem ser de uma área da traqueia onde o stent PLLA-PCL foi colocado.
- Para determinar a resposta aguda do corpo estranho ao stent, observe a atividade do macrófago e da pilha de T usando marcadores CD3 e De F4/80.
- Coloque os slides em xileno 2x para 5 min cada.
- Coloque os slides em 100% de etanol 2x para 3 min cada.
- Coloque os slides em 95% de etanol por 1 min.
- Coloque os slides em um rack de coloração histológica para que eles sejam imersos em buffer de recuperação de antígeno(Mesa de Materiais)e, em seguida, coloque em um navio vegetal com água fervente por 20 min.
- Retire as prateleiras de coloração do navio e descarte o buffer de recuperação de antígeno.
- Substitua o buffer por 1 mL de PBS.
- Coloque os slides em uma caixa de coloração molhada por 1 min.
- Descarte o PBS e incubar os slides com o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% FBS por 30 min.
- Descarte o DMEM e adicione uma mistura de dois anticorpos primários criados em espécies diferentes. Cubra os slides com filme de parafina e incubar durante a noite em 4 °C em um quarto escuro.
NOTA: Neste protocolo coelho anti-CD3 e rato anti-F4/80(Tabela de Materiais)foram utilizados. - Lave os slides em PBS 3x por 5 min.
- Incubar os slides com anticorpos secundários específicos para as espécies primárias de anticorpos(Tabela de Materiais)diluídos em DMEM com 10% FBS por 0,5 a 1 h à temperatura ambiente no escuro.
- Lave os slides em PBS 3x por 5 min no escuro.
- Monte os slides em coverslips com uma gota de montagem médio com 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Guarde os slides no escuro a 20 °C ou 4 °C.
- Observe os slides manchados em um microscópio confocal de varredura a laser e fotografia.
- Quantificar o número total de células de coloração com DAPI e anticorpos de interesse para comparação com traqueia ilesa.
8. Análise quantitativa da expressão do gene da traquea do rato
- Coletar traqueia de camundongo, como descrito nos passos 6,1-6,7 e remover stent.
NOTA: As traqueias de camundongos colhidas podem ser armazenadas em um freezer de -80 °C por até 2 anos. - Dessecado o tecido traqueador colhido na etapa 8.1 usando tesoura fina e homogeneizar ainda mais usando um homogeneizador de moinho de contas com contas cerâmicas de 1,4 mm(Mesa de Materiais)como parte de um kit de extração de RNA(Tabela de Materiais)comercialmente disponível em colunas.
NOTA: Configurações de homogeneizador do moinho de contas = um ciclo de 40 s a 6 m/s. - Extraia RNA do lysate traqueal usando um kit de extração e purificação baseado em coluna(Tabela de Materiais)seguindo as instruções do fabricante.
- Quantificar rna de cada amostra usando um espectrômetro(Tabela de Materiais).
NOTA: A pureza do RNA é avaliada usando a relação 260/230 nm com uma leitura pura da amostra do RNA 2.0. - Crie DNA complementar a partir de RNA extraído usando transcriptase reversa(Tabela de Materiais)e um termociclo com as seguintes configurações: 5 min a 25 °C (priming), 46 °C para 30 min (transcrição reversa) e, em seguida, 95 °C para 1 min (inativação de transcrição reversa).
- Diluir amostras complementares de DNA com água livre de RNase a uma concentração de 10 a 25 ng/mL para uso em PCR quantitativo em tempo real.
- Misture 1 μL do DNA complementar (10-25 ng/mL) com 10 μL de um mastermix PCR (Tabela de Materiais), 8 μL de ddH2O e 0,5 μL de 10 μM primers para a frente e reversa para o gene de interesse em um poço de uma placa PCR de 96 poços ( Tabelade Materiais).
NOTA: O volume total em cada poço deve ser de 20 μL. Cada poço na placa de 96 poços deve conter apenas uma amostra e um gene de interesse. - Repita os passos 8.1-8.7 para todos os genes de interesse e execute cada amostra para cada gene em triplicado.
NOTA: As cartilhas para a frente e reversa específicas do gene(Tabela de Materiais)para colágeno 1, colágeno 3 e o gene de referência β-actina são comumente usadas para investigar marcadores de fibrose. - Coloque a placa de 96 poços na máquina de PCR quantitativa em tempo real e inicie o seguinte protocolo: desnaturação a 95 °C para 15 s e anneal e se estenda a 60 °C para 60 s por 40 ciclos.
- Normalize o valor limite do ciclo (TC) para detecção de produtos genéticos de cada gene de interesse (GOI) para o valor de TC para o gene de referência β-actin para todas as amostras para obter um ΔCT para cada GOI. Em seguida, compare os valores δct para cada GOI para amostras tratadas e não tratadas para gerar um ΔΔCT.
NOTA: O limite de ciclo é o ponto na curva de amplificação quando uma quantidade predeterminada de produto genético está presente (ΔRn). O valor de ΔRn para cada reação deve ser determinado para cada gene do interesse e deve cair na parcela linear da curva da amplificação.
NOTA: ΔCT = CT (GOI) - CT (gene de referência); ΔΔCT = ΔCT (tratado) - ΔCT (não tratada). - Calcule a mudança relativa na expressão gênica entre amostras tratadas e não tratadas como uma expressão de mudança de dobra, calculando 2ΔΔCT.
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Representative Results
A construção biodegradável do stent PLLA-PCL carregada com rapamicina utilizada neste estudo foi capaz de dialoar a rapamicina de forma consistente e previsível em condições fisiológicas (Figura 1). A figura 2 mostra o stent PLLA-PCL lançado em torno de um angiocateter 22 G para uso em um modelo de urina de LTS. Para determinar se os efeitos da elução da rapamicina na traqueia são eficazes na fibrose atenuante, alterações medidas na expressão gênica relacionada à fibrose e marcadores de inflamação aguda podem ser avaliados através da análise de expressão gênica, citometria de fluxo, imunofluorescência e ELISA. A colocação bem sucedida de um stent miniaturizado na traqueia do rato usando o método descrito acima foi demonstrada. Um esquema do método é mostrado na Figura 3. A Figura 4 mostra o stent biocompatível miniaturizado in situ na traqueia, como indicado pelo marcador preto no stent, que é visualizado através da traqueia translúcida do rato. Em experimentos iniciais, o uso de um sialendoscope de 0,8 mm para confirmar a colocação do stent na traqueia foi útil. Após 21 dias, para confirmar que a colocação transoral do stent era eficaz e o stent não migrou de sua posição originalmente colocada, a incisão do pescoço foi reaberta para determinar a colocação do stent. Como mostrado na Figura 4B,o marcador de tinuoso preto do stent mostrou que o stent manteve sua posição na traqueia. A ressecção da traqueia após 21 dias de tratamento com o stent é mostrada na Figura 4C.
Imagens representativas de testes de biocompatibilidade usando coloração imunofluorescente para marcadores de inflamação aguda e crônica são mostradas na Figura 5. Isso demonstrou que a construção do stent PLLA-PCL (sem rapamicina) não era imunoreativa, conforme determinado pelo número mínimo de células imunes presentes após a colocação. É importante notar que, neste método, traqueias ilesas normais foram usadas e um stent PLLA-PCL sem rapamicina foi colocado para determinar a resposta inflamatória à própria construção.
Em seguida, para determinar se o stent PLLA-PCL de eluta ção de rapamicina foi eficaz na mitigação de cicatrizes, demonstramos anteriormente mudanças de expressão gênica nos marcadores de inflamação aguda e fibrose6. Especificamente, há uma redução de 90,3 vezes (SEM ± 26,0; n = 4; p < 0,01) redução no col1a1 no dia 4, bem como os marcadores inflamatórios agudos INF-γ, CD11b, Arg-1 e IL-1B6. Embora as diferenças na mudança da dobra para alguns genes não fossem significativas, é possível que com uma coorte maior dos ratos, o significado poderia ser conseguido. Para determinar se houve mudanças na traqueia devido à elução de drogas histologicamente, ou se houve mudanças na traqueia devido ao esforço de força radial pelo stent, demonstramos que houve uma diminuição na largura da propria de laminadonas naquelas traqueias tratadas com stents de elutina de rapamicina em comparação com aqueles semstentsde elutina 6.
Figura 1: Elução de Rapamicina PLLA-PCL. A construção PLLA-PCL contendo 1% de rapamicina demonstrou uma liberação consistente e previsível de rapamicina durante um período de 14 dias. Os pontos de dados representam a média ± SEM de elução amostrada (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Elenco de stent. (A)A solução PLLA-PCL foi autorizada a secar em torno de um angiocateter 22 G. (B) O elenco foi então removido do angiocateter. (C)Stents foram cortados para 3 mm comprimentos para uso no modelo mouse6. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Colocação transoral do stent nos ratos. (A)O stent foi carregado em um angiocateter vazio e colocado transoralmente na traqueia. (B) A marcação de tintura preta no stent pode ser vista através de uma incisão transcervical para confirmar sua posição na traqueia do rato. (C)Desenho representativo do stent in situ na traqueia do rato doente6. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: In situ imagens de stent. (A-B) O stent com marcas de tintura preta pode ser visto in situ na traqueia murine. (C)Uma imagem do stent e do complexo laringotracheal murine após a colheita em 21 dias6. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Biocompatibilidade de Stent. A coloração imunofluorescente para F4/80 (macrófagos, cromóforo vermelho) e CD3 (cromóforo verde, linfócitos T) no dia 4 revelou células inflamatórias mínimas na traqueia(A)ilesa e(B)traqueia com stent PLLA-PCL. Isso contrasta com(C)uma traqueia ferida, com uma laminado laminado propria e a presença de numerosas células com f4/80 positivo e cd3mancha6. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Os passos mais críticos para construir e usar com sucesso um stent de luta contra drogas in vivo são 1) determinar a relação PLLA-PCL ideal para a taxa de elução de drogas desejável, 2) determinando a concentração adequada de drogas a ser eluted, 3) moldando os stents em torno do angiocateter para uso in vivo, e 4) transolvialmente entregando o stent para os ratos após a indução LTS sem causar obstrução das vias aéreas fatais.
Embora existam vários métodos para o parto de medicamentos usando stents em modelos animais de doença das vias aéreas, o desenvolvimento de um stent biocompatível capaz de entrega de drogas em um modelo de urina doente é um primeiro. No desenvolvimento deste método para a entrega de medicamentos, várias modificações foram feitas ao método. Era importante determinar a composição apropriada de PLLA-PCL para fazer os stents que eram mecanicamente rígidos bastante ser coloc na traqueia e permanecer na traqueia apesar das secreções physiological. Uma composição 70:30 de PLLA-PCL foi decidida para a construção do stent com um molde do angiocatheter porque poderia com sucesso o rapamycin elute em uma natureza predicable, ser coloc em uma forma segura e de confiança em nosso modelo do rato, e não degradar-se no fisiológico Condições. Uma parte difícil e potencialmente dependente do fabricante deste método está moldando o stent em torno dos angiocateterteres. Inicialmente, na construção dos stents in vivo, 22 angiocateteres G foram colocados dentro da ponta de uma pipeta de vidro e a solução de polímero foi despejada no espaço entre o angiocateter e a pipeta de vidro, formando um molde do espaço entre eles. Entretanto, a parede dos stents resultando deste método era frequentemente demasiado fina e não podia ser coloc confiantemente na traqueia. Uma limitação do método atual para moldar stents no angiocateteréter é a dependência do fabricante para a consistência, e a necessidade para a atenção meticulosa ao detalhe para assegurar a homogeneidade na produção do stent. O potencial de variância na espessura entre stents fundidos precisa ser abordado em estudos futuros. Com estudos posteriores, esperamos projetar um molde para um angiocateter 22 G cercado por outro vidro ou material não corrosivo de tal forma que o espaço entre o angiocateter e o encaling de vidro é de 50 μm, que determinamos ser uma espessura adequada da parede do stent para a colocação fácil na traqueia.
Existem vários benefícios em usar um stent biocompatível para estudar a entrega de medicamentos para a traqueia afetada. No geral, stents compostos de metal ou silicone que foram revestidos com um polímero contendo a droga foram mostrados para produzir tecido de granulação e resposta inflamatória adicional a uma porção já cicatrizada da traqueia. Este método, que interroga o uso de um stent feito inteiramente de biomaterial que é biocompatível e também libera uma droga imunomodulatória de forma confiável é vantajoso. O stent PLLA-PCL também é mostrado para ser biocompatível no modelo de urina e não provoca uma resposta inflamatória aguda. No estudo de drogas que podem combater a fibrose, o uso de um stent inteiramente composto de material biocompatível, como PLLA-PCL, conforme descrito neste método, é benéfico.
A vantagem e facilidade de usar este método para construir stents utilizáveis é que a composição do PLLA-PCL pode ser variada, permitindo diferenças nos perfis de liberação para a droga misturada na composição. Estudos anteriores do material PLLA-PCL mostram que a variação nas misturas PLLA-PCL pode levar a uma maior degradação do material, permitindo uma liberação mais rápida de medicamentos9. Além disso, o uso deste método para construir stents que podem ser colocados em camundongos é vantajoso, pois a maioria dos estudos de stent para doenças das vias aéreas foram feitos em animais maiores10,11,12. O uso de um modelo do rato que possa ser modificado para paradigmas diferentes da doença e permitir testar do stent droga-eluting em um estado doente é ideal. Testar o stent antidrogas em um estado doente e ser capaz de comparar sua eficácia com aqueles em animais sem doença permite maior rigor experimental. Este método também mostra como um stent de luta contra drogas para as vias aéreas pode ser colocado transoralmente, em oposição a estudos anteriores, onde os stents foram implantados cirurgicamente.
Este estudo demonstra uma plataforma muito utilizável para o desenvolvimento e o teste do stent em um modelo animal pequeno. No entanto, outros fatores para uso em seres humanos devem ser considerados. Dada a natureza firme e rígida do stent, provavelmente não pode ser colocado através de um broncoscópio flexível canalizado, mas terá de ser colocado transoralmente com laringoscopia direta e broncoscopia rígida. Idealmente, o stent seria colocado após a dilatação do balão das vias aéreas para ajudar a mitigar a restenose. A partir da perspectiva de segurança do paciente, o potencial para o stent migrar é uma grande preocupação, pois poderia levar a um compromisso de risco de vida das vias aéreas. Em segundo lugar, o potencial de obstrução do stent secundário ao acúmulo de muco ou sangue também deve ser considerado. Mais testes e desenvolvimento são necessários para minimizar esses riscos.
Estudos futuros podem utilizar este método para testar diferentes drogas na mistura PLLA-PCL para entender melhor como diferentes tratamentos imunossupressores poderiam mitigar a formação de cicatriz na traqueia. Porque tais stents podem ser colocados em camundongos, usando uma coorte maior de ratos ou camundongos com modificações genéticas para genes formadores de cicatriz também podem ser testados. Experimentos futuros também podem incluir a compreensão das mudanças na traqueia que podem ocorrer após a implantação crônica do stent (3-6 meses) e as mudanças no lumen da traqueia, bem como os perfis de expressão gênica de marcadores inflamatórios e fibrose Marcadores.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios de Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde os números de premiação 1K23DC014082 e 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Este estudo também foi apoiado financeiramente pela Sociedade Triológica e pelo American College of Surgeons (Alexander Hillel), pela American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) e por uma bolsa de treinamento T32 NIDCD (Kevin Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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