Summary
Laryngotracheal стеноз результатом патологического осаждения рубцов, что критически сужает трахеи дыхательных путей и не хватает эффективной медицинской терапии. Используя стент PLLA-PCL (70% поли-L-лактида и 30% поликапролактон) в качестве местной системы доставки лекарств, можно изучить потенциальные методы лечения, направленные на уменьшение пролиферации шрамов в трахее.
Abstract
Laryngotracheal стеноз (LTS) является патологическим сужение субглоттиса и трахеи, ведущих к экстраторакальной обструкции и значительной одышки. LTS является результатом слизистой травмы от инородного тела в трахее, что приводит к повреждению тканей и местной воспалительной реакции, которая идет наперекосяк, что приводит к осаждению патологических рубцовой ткани. Лечение LTS является хирургическим из-за отсутствия эффективных медицинских методов лечения. Цель этого метода заключается в построении биосовместимого стента, который может быть миниатюризирован для размещения в мышей с LTS. Мы продемонстрировали, что конструкция PLLA-PCL (70% поли-Л-лактида и 30% поликапролактона) имела оптимальную биомеханическую прочность, была биосовместима, практически осуществима для стента размещения in vivo и способна принимать препарат. Этот метод обеспечивает систему доставки лекарств для тестирования различных иммуномодулирующих агентов для локального ингибирования воспаления и снижения фиброза дыхательных путей. Изготовление стентов занимает 28-30 ч и может быть воспроизведено легко, что позволяет проводить эксперименты с большими когортами. Здесь мы включили препарат рапамицин в стент, чтобы проверить его эффективность в снижении фиброза и осаждения коллагена. Результаты показали, что палатки PLLA-PCL показали надежное высвобождение рапамицина, были механически стабильными в физиологических условиях и были биосовместимы, вызывая небольшую воспалительную реакцию в трахеееи. Кроме того, рэпамицин-eluting PLLA-PCL стенты снижение образования рубцов в трахеи in vivo.
Introduction
Laryngotracheal стеноз (LTS) является патологическим сужение трахеи чаще всего из-за ятрогенной после интубации травмы. Сочетание бактериальной колонизации, реакции инородного тела на трахеостомию или эндотрахеальную трубку, а также специфические факторы пациента приводят к аномальной воспалительной реакции. Этот неадаптивный иммунный ответ приводит к осаждению коллагена в трахее, что приводит к сужению стены и последующему стенозу1,2. В настоящее время лечение этого заболевания в первую очередь хирургическое, разработка альтернативной медицинской парадигмы лечения ориентации аномальных воспалительных и профиброзных путей, которые приводят к чрезмерному осаждению коллагена была изучена. Рапамицин, который ингибирует mTOR сигнальный комплекс, было показано, что иммуносупрессивные эффекты, а также надежный эффект антифибробластов. Однако, когда рапамицин системно вводят, общие побочные эффекты (например, гиперлипидемия, анемия, тромбоцитопения) могут быть произнесены3. Цель нашей методологии заключается в разработке транспортного средства для местной доставки лекарств, осуществимых для использования в дыхательных путих, что позволит ухудшить эти системные эффекты. Наши оценки сосредоточены на изучении местного иммунного ответа на конструкцию доставки лекарств, а также его способности подавлять функцию фибробластов и изменять местную иммунную микросреду. Специфические результаты болезни включают тестирование in vivo, которое оценивает маркеры фиброза.
Биоразлагаемые медикаментозно-элютные стенты использовались в животных моделях болезней в системах залпового огня, в том числе в дыхательных путях4. Для управления стенозом дыхательных путей или коллапса, предыдущие исследования использовали сатрики с наркотического покрытия и никель основе стентов5. Конструкция PLLA-PCL была выбрана для этого конкретного метода из-за его профиля elution снадобья и механической прочности в физиологических условиях над периодом 3 неделей, которая была продемонстрирована в предыдущих опубликованных изучениях6. PLLA-PCL также является биосовместимым и биоразлагаемым материалом, уже одобренным FDA4. Биосовместимые стенты, eluting цисплатин и MMC были изучены в крупных животных моделей, таких как кролики и собаки. Однако, в этих животных моделях, стенты не были помещены в животной модели болезни и были имплантированы трансцервически. Это исследование предоставляет уникальный метод для оценки биосовместимых наркотиков eluting стент помещен трансорально в мышиной модели повреждения дыхательных путей и laryngotracheal стеноз. Биосовместимый стент, который выражает иммуномодулирующий препарат локально и может быть миниатюризирован для изучения в модели мурина, ценен для трансляционных доклинических исследований. Предыдущие попытки использования стента с другими материальными конструкциями генерировали надежные реакции инородного тела, ухудшающие основное воспаление, которое отличает LTS7. Эта методология, насколько нам известно, является первой в своем роде для изучения иммуномодулирующих и антифибротических эффектов системы доставки стентов в модели murine LTS. Сама модель мурин предлагает ряд преимуществ для изучения влияния иммуномодулирующего препарата на трахею. Генетически модифицированные мыши и экспериментальные когорты здоровых и больных мышей могут быть изучены, что может привести к экспериментальной воспроизводимости и повышению рентабельности. Более того, доставка стента трансорально в трахею мыши имитирует клиническую доставку такого стента у человека, что еще больше подчеркивает переводное преимущество этого метода. Наконец, относительная легкость, с которой PLLA-PCL стент с препаратом может быть произведена позволяет модификации для доставки альтернативных методов лечения наркотиков, направленных на снижение образования рубцов в трахеи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Университета Джонса Хопкинса (MO12M354).
1. Подготовка рапамицина в PLLA-PCL
- Приготовьте два стеклянных флакона (с колпачками) полимерных растворов PLLA-PCL PLLA-PCL (присущая вязкости 1,3–1,8 DL/G; Таблица материалов) растворы, с одним флаконом, содержащим 1,0% рапамицин, а другой без рапамицина.
- Сделать 1,0% рапамицин, содержащий полимерный раствор, добавив 6 мг рапамицина до 600 мг 70:30 PLLA-PCL в стеклянном флаконе.
- Для полимерного раствора без рапамицина (контроль) добавьте в стеклянный флакон 600 мг 70:30 PLLA-PCL.
- Под капотом дыма добавьте 6 мл дихлорметана к каждому стеклянному флакону.
ВНИМАНИЕ: Дихлорметан является коррозионным материалом, и следует использовать только стеклянные пипетки. Соответствующие меры предосторожности включают личную защиту глаз и перчатки. - Добавьте 120 л глицерола к каждому стеклянному флакону (для 2% глицерола).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление глицерола обеспечивает повышенную гибкость и снижение жесткости в конструкции стента. - Нависшите стеклянные флаконы и дайте 70:30 PLLA-PCL с и без рапамицина растворить и гомогензировать в течение 6-12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные флаконы также могут быть размещены на вращающейся встряхивая платформе для более быстрого растворения.
2. Тестирование на элуцию Рапамицина
- Пипетка 1 мл 70:30 PLLA-PCL раствор, содержащий 1% рапамицина в стеклянную чашку Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем 70:30 PLLA-PCL решение, содержащее 1% рапамицин будет содержать 120 мкг рапамицина и представляет собой общее количество рапамицина в каждой конструкции. Можно использовать альтернативные объемы и концентрации. - Разрешить 70:30 PLLA-PCL с 1% рапамицин затвердеть в плоский диск в стеклянной чашке Петри.
- После затвердевания поместите диск в 2 мл фосфат-буферного солима (PBS, рН 7.4) и инкубировать в камере 37 градусов по Цельсию.
- Сбор и замена PBS (2 мл) каждые 24 ч и использовать собранные PBS для высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) анализ содержания рапамицина.
- Используйте автосэмпемер и C18 4,6 см х 250 мм HPLC колонки для запуска образцов через инжектор автосэмпера вместе с серийными разбавления рапамицина для создания калиброванных стандартной кривой. Выполнить каждый образец в тройном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серийные разбавления рапамицина, которые должны быть протестированы включают 10%, 1%, 0,1% и 0,01%. - Используйте подвижную фазу воды класса HPLC и ацетонитрила с объемом 10/90/объемом с скоростью потока 2,0 мл/мин. Установить абсорбцию во время HPLC для рапамицина до 280 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показано вырабатывание рапамицина в течение 14-дневного периода.
3. Создание рапамидцин-элютирующих стентов PLLA-PCL murine
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.2'3.9 с использованием стерильных материалов и стерильной техники, чтобы избежать загрязнения, которое повлияло бы на приложения in vivo и in vitro.
- Подготовьте решения PLLA-PCL, содержащие рапамицин, как описано в разделе 1.
- Используя стеклянную пипетку Pasteur с резиновым шариком, нанесите 1 мл раствора PLLA-PCL, содержащего 1% рапамицина, на венозную канюлю 22 G фторенного этилена на основе ангиокатетера(Таблица материалов). Держите ангиокатетер в одной руке и используйте стеклянную пипетку, чтобы уронить раствор PLLA-PCL на ангиокатетер. Медленно поверните ангиокатер, чтобы обеспечить однородное покрытие ангиокатера раствором PLLA-PCL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, раствор PLLA-PCL будет тонким, но, как дихлорметан испаряется во время применения на ангиокатетер, раствор станет более вязким, чтобы плесень на ангиокатетер. Непрерывное превращение ангиокатера во время применения полезно. Этот шаг должен быть сделан медленно и тщательно, чтобы обеспечить последовательную толщину стента. - Prop формованных ангиокатер с кончиком ангиокатетер лицом вниз и рукоятки на краю стеклянной чашки Петри для сушки.
- Разрешить стенты высохнуть в течение 24 ч в вакуумном капоте при комнатной температуре(рисунок 2A).
- Удалите стент построить из основного ангиокатетера, мягко скручивая основной катетер бесплатно и скольжения его из формованных стент(Рисунок 2B).
- Проверьте стент в окружности на наличие дефектов, которые могут возникнуть в процессе литья. Если дефект в литой стент присутствует, отбросьте его.
- Обрезать каждый конец литой стент с тонкими прямыми ножницами так, чтобы края осевые.
- Используя тонкие прямые ножницы, вырезать 3 мм осевые сегменты литого стента для использования в мышиной модели LTS(рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 8 стентов могут быть сделаны из одного отлитого ангиокатетера, с каждым стентом 3 мм, содержащим 120 мкг рапамицина. - Загрузите 3 мм стент на новый 22 венозный катетер для использования в мышиной модели LTS(рисунок 1).
4. Laryngotracheal стеноз индукции у мышей
- Перед проведением исследований в области мыши vivo получить одобрение от Комитета по уходу и использованию животных.
- Анестезия 9-недельного мужчины C57BL/6, давая интраперитонеальную инъекцию кетамина (80–100 мг/кг) и ксилазина (5–10 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие штаммы мышей могут быть заменены, но рекомендуется, чтобы вес мышей между 20-27 г. - Рандомизация мышей в экспериментальную группу (химиомеханическая травма с размещением 1% рапамицин-содержащих стент PLLA-PCL) и две контрольные группы: 1) химиомеханическая травма с размещением стента PLLA-PCL, 2) химиотерапии без размещение стента.
- Поместите мышь на хирургическую платформу в положении на спине. Используйте небольшую петлю нити, прикрепленную к верхней части платформы, чтобы расширить шейный позвоночник, зацикливая его вокруг центральных резцов.
- Прикрепите руки и ноги мыши к столу с помощью 2-дюймовых кусочков ленты. Pinch мыши лапой, чтобы убедиться, что он имел адекватную анестезию.
- Хирургическое место затем готовится. Надивной мех должен быть удален и кожа должна быть очищена (чередуя йод или хлоргексидин скраб с алкоголем или разбавленной кожи дезинфицирующее средство) в три раза. Область должна быть драпирована и стерильные перчатки носить. Стерилизованные инструменты следует укладывать на стерильную поверхность, когда они не используются.
- Сделайте вертикальный разрез средней линии 1,5 см в шее мыши тонкими изогнутыми ножницами радужной оболочки глаза. Разделите надлежащую тимуса и боковой две образовавшиеся доли, чтобы визуализировать трахею. Разделите надлежащую стерногиоидную и стернотиреоидную (ловушку) мышцы при превосходном вложении на двусторонней основе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь ларинготрахеевийский комплекс должен быть полностью разоблачен после этого. - Передайте 22 G ангиокатетер аренально через гортань в трахею. Используйте небольшие щипцвы для оказания давления на переднюю гортань мыши, чтобы помочь в правильном размещении ангиокатетера. Визуализируйте белый ангиокатетер через трахею, чтобы обеспечить правильное размещение (не эзофагеал).
ПРИМЕЧАНИЕ: Трахея мыши очень тонкая, и белый ангиокатетер будет визуализирован через полупрозрачную трахею. - Пройдите bleomycin покрытием проволоки щеткой через вставленный ангиокатетер.
- Медленно снимите ангиокатетер так, чтобы только проволочная кисть осталась в трахее.
- Применить встречное давление с помощью тонких щипцы на трахею, чтобы механически нарушить трахеи просвет с проволокой кисти.
- Вставьте ангиокатетер в трахею над проволокой щеткой.
- Снимите проволочную щетку и повторно нанесите блеомицин.
- Повторите шаги 4.8-4.12 в общей сложности 5x. Нанесите блеомицин на кисть между каждым приложением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка и описание этой модели можно найти в Hillel et al.8. - Удалить ангиокатетер из трахеи мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нет стента должен быть помещен, разрез может быть закрыт с клей ткани.
5. Трансоральный PLLA-PCL стент размещения у мышей
- Загрузите один 3 мм отлитый стент на пустой 22 G ангиокатер(рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стент должен отдыхать 5 мм от кончика ангиокатера. - Нарисуйте тонкую черную вертикальную линию на 3 мм литой стент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта линия позволяет улучшить визуализацию стента в трахее. - Трансорально интубировать мышь с ангиокатетер, который был предустановлен стентом.
- Визуализируйте стент на ангиокатетере в трахее через трансцервикальный разрез(рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Трахея очень тонкая, что позволяет черный краситель на стенте, чтобы быть визуализированы через трахею. Используйте это для подтверждения правильного размещения трахеи. - Держите стент на месте, сжимая трахею через трансцервикальный разрез с тонкими щипками.
- Удалите ангокатетер трансорально, сохраняя при этом сцепление на стенте с тонкими щипцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезвычайно важно не применять слишком много силы к стенту, чтобы не раздавить просвет, когда ангокатетер удаляется. Тем не менее, требуется достаточно силы, чтобы гарантировать, что стент не удаляется с ангиокатером. Сиалендоскоп калибра 0,8 мм может быть использован для визуализации расположения и размещения стента в трахее. - Закройте трансцервикальный разрез с помощью тканевого клея.
- Разрешить каждой мыши, чтобы восстановить свой первоначальный уровень активности, прежде чем поместить его обратно в клетку.
6. Гистологическая подготовка образцов
- Анестезия мышей с вдыхаемым анестетиком и жертвоприношения мышей с вывихом шейки матки на животных протокола после 7, 14 или 21 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из хроники исследования, могут использоваться различные временные интервалы (например, 28, 30 дней и т.д.). - Расположите мышь на хирургической платформе, как описано в шагах 4.4 и 4.5.
- Откройте разрез шеи на мыши с помощью тонких изогнутых ножниц радужной оболочки глаза.
- Выставляют трахею на шаг 4,6.
- Разделите дистальную трахею ниже уровня стента с помощью тонких изогнутых ножниц радужной оболочки глаза.
- Разделите проксимальную трахею ниже гортани и над стентом, используя тонкие изогнутые ножницы радужной оболочки глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сначала разделить дистальную трахею, чтобы предотвратить втягивание трахеи в грудную клетку. - Отделить разделенную трахею от пищевода задним и удалить трахею из мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стенты по-прежнему будут сохранены в трахееи мыши. - Удалить стент из трахеи и исправить в 10% формалин на 24 ч.
- Встраиваемые формалин-фиксированные образцы трахеи мыши в парафине с дистальным концом ориентированы превосходно так, что осевые разрезы трахеи могут быть сделаны в следующем шаге.
- Вырезать 5 мкм разделов парафин-встроенных трахеи мыши с помощью микротома.
ПРИМЕЧАНИЕ: Specimens должны быть сокращены аксиально, начиная с дистальной трахеи. - Получить 5 мкм репрезентативной секции каждые 250 мкм по длине образца.
- Полное пятно Н И E на каждом репрезентативном разделе.
- Депарафинизировать слайды, поместив в ксилена 2x на слайд в течение 3 мин.
- Поместите горки в 100% этанола в течение 2 мин, 95% этанола в течение 2 мин и 70% этанола в течение 2 мин для регидратации.
- Вымойте горки с проточной водопроводной водой в течение 2 минут.
- Пятно слайды в гематаксилине в течение 3'5 мин.
- Вымойте горки с проточной водопроводной водой в течение 5 минут.
- Поместите горки в 1% кислотного спирта в течение 1 мин.
- Вымойте горки с проточной водопроводной водой в течение 1 мин.
- Промыть в 0,2% аммиачной воды на 30 с.
- Промыть горки в проточной водопроводной воде в течение 5 мин. Dip в 95% этанола 10x.
- Eosin пятно, поместив слайд в эозина флоксин для 30 с.
- Обезвоживать горки, разместив 95% этанола в течение 5 мин, а затем абсолютный этанол 2x в течение 5 мин.
- Место в ксилене 2x в течение 5 мин.
- Смонтировать горки с ксиленовой средой крепления.
- Измерьте толщину проприии ламины, как описано в Hillel et al.8.
7. Стент биосовместимости в vivo
- Подготовьте разделы тканей по мере того, как в шагах 6.1-6.4. Не удаляйте стент из этих секций трахеи, чтобы визуализировать изменения воспаления относительно расположения стента в просвете трахеи.
- Чтобы определить острую реакцию инородного тела на стент, наблюдайте макрофаг и активность Т-клеток с помощью маркеров CD3 и F4/80.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие маркеры также могут быть использованы для определения острой воспалительной реакции на стент. - Получить 5 мкм сократить разделы парафин-встроенных трахеи на коммерчески доступных гидрофильных плюс слайды (Таблица материалов). Поместите две секции на каждом слайде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти разделы должны быть из области трахеи, где был помещен стент PLLA-PCL.
- Чтобы определить острую реакцию инородного тела на стент, наблюдайте макрофаг и активность Т-клеток с помощью маркеров CD3 и F4/80.
- Поместите слайды в ксилен 2x в течение 5 минут каждый.
- Поместите слайды в 100% этанола 2x на 3 мин каждый.
- Поместите горки в 95% этанола в течение 1 мин.
- Поместите слайды в гистологии окрашивания стойку, чтобы они погружаются в антиген аспы(Таблица материалов), а затем поместить в овощной пароход с кипящей водой в течение 20 минут.
- Удалите окрашивание стеллажи с парохода и отбросить антигена извлечения буфера.
- Замените буфер 1 мл PBS.
- Поместите горки в мокрую окрашивание коробки в течение 1 мин.
- Откажитесь от PBS и инкубировать слайды с модифицированной средой орла Dulbecco (DMEM) с 10% FBS в течение 30 минут.
- Откажитесь от DMEM и добавьте смесь двух основных антител, выращенных у разных видов. Обложка слайды с парафина пленки и инкубировать на ночь при 4 градусах по Цельсию в темной комнате.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе кролик анти-CD3 и крысы анти-F4/80 (Таблица материалов) были использованы. - Вымойте слайды в PBS 3x в течение 5 минут.
- Инкубировать слайды со вторичными антителами, специфичными для первичных видов антител(Таблица Материалов),разбавленных в DMEM с 10% FBS для 0,5-1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Вымойте слайды в PBS 3x в течение 5 минут в темноте.
- Смонтировать горки на крышках с каплей монтажа среды с 4'6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Храните слайды в темноте при 20 градусах или 4 градусах по Цельсию.
- Наблюдайте за окрашенными слайдами на лазерном сканировании конфокального микроскопа и фотографии.
- Количественное общее количество клеток окрашивания с DAPI и антител, представляющих интерес для сравнения с невредимой трахеи.
8. Анализ экспрессии мышечной трахеи количественного анализа экспрессии генов
- Соберите трахею мыши, как описано в шагах 6.1'6.7 и удалите стент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трахеи мышью можно хранить в морозильной камере с -80 градусов по Цельсию в течение 2 лет. - Обезображивание трахеальной ткани, собранной в шаге 8.1 с помощью тонких ножниц и дальнейшее гомогенизации с помощью бисера мельницы гомогенизатор с 1,4 мм керамические бусы (Таблица материалов) как часть коммерчески доступных колонки на основе РНК экстракт комплекта (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки гомогенизатора бисора мельницы - один цикл 40 с при 6 м/с. - Извлеките РНК из трахеального лисата с помощью комплекта для добычи и очистки на основе колонки(Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- Количественная РНК из каждого образца с помощью спектрофотометра(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота РНК оценивается с использованием соотношения 260/230 нм с чистым чтением образца РНК 2.0. - Создайте дополнительную ДНК из извлеченной РНК с помощью обратной транскриптазы(Таблица материалов)и термоциклоза со следующими настройками: 5 мин при 25 градусах По цельсии (грунтовка), 46 градусов по Цельсию в течение 30 мин (обратная транскрипция), а затем 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин (инактивация обратной транскрипции).
- Разбавить дополнительные образцы ДНК свободной водой RNase до концентрации 10-25 нг/мл для использования в количественном пЦР в реальном времени.
- Смешайте 1 зл и комплементарную ДНК (10-25 нг/мл) с 10 зл и рцмиком ПЦР(Таблица материалов),8 qL ddH2O и 0,5 зл и 0,5 л 10 мкм вперед и обратные грунтовки для гена интереса в одном колодце 96-хорошо ПЦР пластины (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в каждой скважине должен быть 20 зл. Каждая скважина на пластине 96 скважин должна содержать только один образец и один ген интереса. - Повторите шаги 8.1-8.7 для всех генов, представляющих интерес, и запустите каждый образец для каждого гена в тройном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ген-специфические передние и обратные грунтовки (Таблица материалов) для коллагена 1, коллагена 3, и эталонный ген з-актин обычно используются для исследования маркеров фиброза. - Поместите пластину 96 скважин на количественный пЦР-машину в реальном времени и инициируйте следующий протокол: денатурируйте при 95 градусах по Цельсию для 15 с и анналь и расширьте на 60 градусов по Цельсию в течение 40 циклов.
- Нормализуйте значение порогового цикла (КТ) для обнаружения генного продукта каждого гена, представляющих интерес (GOI) к значению КТ для эталонного гена и актина для всех образцов для получения ЗКТ для каждого ГОИ. Затем сравните значения зКТ для каждого GOI для обработанных и необработанных образцов, чтобы создать ККТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порог цикла является точкой на кривой усиления, когда присутствует заранее определенное количество генного продукта (ЗРН). Значение Rn для каждой реакции должно быть определено для каждого гена интереса и должно упасть на линейной части кривой усиления.
ПРИМЕЧАНИЕ: КТ КТ (GOI) - КТ (справочный ген); ККТ ККТ (лечение) - КТ (необработанные). - Рассчитайте относительное изменение экспрессии генов между обработанными и необработанными образцами как выражение изменения склада, вычислив 2кВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Биоразлагаемые PLLA-PCL стент конструкции загружены рапамицин используется в этом исследовании был способен eluting рапамицин в последовательной и предсказуемой моды в физиологических условиях (Рисунок 1). На рисунке 2 показан стент PLLA-PCL, отлитый вокруг ангиокатера 22 G для использования в модели murine LTS. Чтобы определить, если эффекты элютации рапамицина в трахееее является эффективным в ослаблении фиброза, измеренные изменения в фиброзсвязанных экспрессии генов и маркеры острого воспаления могут быть оценены с помощью анализа экспрессии генов, цитометрии потока, иммунофлуоресценции, и ELISA. Было продемонстрировано успешное размещение миниатюрного стента в трахею мыши с использованием описанного выше метода. Схема метода показана на рисунке 3. На рисунке 4 показан миниатюрный биосовместимый стент на месте в трахее, как указано черным маркером на стенте, который визуализируется через полупрозрачную трахею мыши. В первоначальных экспериментах было полезно использовать сиалендоскоп калибра 0,8 мм для подтверждения размещения стента в трахее. После 21 дней, чтобы подтвердить, что трансорольное размещение стента было эффективным и стент не мигрировал из первоначально размещенного положения, разрез шеи был вновь открыт для определения размещения стента. Как показано на рисунке 4B,черный маркер красителя стента показал, что стент сохранил свое положение в трахее. Резекция трахеи после 21 дня лечения стентом показана на рисунке 4С.
Репрезентативные изображения биосовместимости тестирования с использованием иммунофлуоресцентных окрашивания для маркеров острого и хронического воспаления показаны на рисунке 5. Это показало, что конструкция стента PLLA-PCL (без рапамицина) не была иммунореактивной, как это было определено минимальным количеством иммунных клеток, присутствующих после размещения. Важно отметить, что в этом методе были использованы нормальные невредимые трахеи и стент PLLA-PCL без рапамицина для определения воспалительной реакции на саму конструкцию.
Далее, чтобы определить, является ли rapamycin-eluting PLLA-PCL стент был эффективным в смягчении рубцов, мы ранее продемонстрировали изменения экспрессии генов в маркерах острого воспаления и фиброза6. В частности, есть 90,3 раза сокращение (SEM 26,0; n 4; р Злт; 0,01) снижение col1a1 на 4-й день, а также острые воспалительные маркеры INF-Я, CD11b, Arg-1, и IL-1B6. Хотя различия в изменении складок для некоторых генов не были значительными, вполне возможно, что с большей когорты мышей, значение может быть достигнуто. Чтобы определить, были ли изменения в трахееи из-за наркотиков elution гистологически, или были ли изменения в трахееи из-за лучевой нагрузки силы стентом, мы показали, что было снижение ширины ламинированной проприии в тех трахеи, обработанных с рапамицин-eluting стенты по сравнению с теми, без рапамицин-eluts.
Рисунок 1: Рапамицин PLLA-PCL elution. Конструкция PLLA-PCL, содержащая 1% рапамицина, продемонстрировала последовательное и предсказуемое высвобождение рапамицина в течение 14 дней. Точки данных представляют собой среднее количество SEM выборки elution (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стент литья. (A) Раствор PLLA-PCL было разрешено высохнуть вокруг 22 G ангиокатер. (B) Бросок был затем удален из ангиокатера. (C) Стенты были сокращены до 3 мм длины для использования в модели мыши6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Трансоральный стент размещения у мышей. (A) Стент был загружен на пустой ангиокатетер и помещены трансорально в трахею. (B) Черный краситель маркировки на стенте можно увидеть через трансцервикальный разрез, чтобы подтвердить свое положение в трахее мыши. (C) Представитель рисунок стента на месте в больной трахеи мыши6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: На месте изображения стента. (A-B) Стент с черными маркировками красителя можно увидеть на месте в трахееи моурина. (C) Изображение стента и мурин laryngotracheal комплекса после сбора урожая в 21 дней6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Биосовместимость стента. Иммунофлуоресцентное окрашивание для F4/80 (макрофаги, красный хромофор) и CD3 (зеленый хромофор, Т-лимфоциты) на 4-й день выявили минимальные воспалительные клетки в (A) невредимой трахеи и(B)трахеи с стентом PLLA-PCL. Это контрастирует с (C) поврежденной трахеи, с утолщенной ламиной проприией и наличием многочисленных клеток с положительным f4/80 и CD3 окрашивание6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важными шагами для успешного построения и использования медикаментозного стента in vivo являются 1) определение оптимального соотношения PLLA-PCL для желательной скорости униции препарата, 2) определение соответствующей концентрации препарата, который будет выслан, 3) литье стентов вокруг ангиокатетера для использования in vivo, и 4) трансорально доставки стента в мышей после индукции LTS, не вызывая фатальной обструкции дыхательных путей.
Хотя существует несколько методов доставки лекарств с использованием стентов в животных моделях болезни дыхательных путей, развитие биосовместимого стента, способного доставлять лекарства в больной модели мурина является первым. При разработке этого метода доставки лекарств к этому методу было внесено несколько изменений. Важно было определить соответствующий состав PLLA-PCL для изготовления стентов, которые были достаточно механически жесткими, чтобы быть помещены в трахею и оставаться в трахее, несмотря на физиологические выделения. 70:30 состав PLLA-PCL было решено для стента строительства с ангиокатетер литья, поскольку он может успешно elute рапамицин в предициозный характер, быть помещены в безопасной и надежной моды в нашей модели мыши, а не деградировать в физиологических Условия. Сложная и потенциально зависящая от производителя часть этого метода – это литье стента вокруг ангиокатетов. Первоначально, при построении стентов in vivo, 22 G ангиокатеры были помещены внутри кончика стеклянной пипетки и полимерный раствор был вылил в пространство между ангиокатетером и стеклянной пипеткой, образуя литые пространства между ними. Однако стенки стентов, вытекающих из этого метода, часто были слишком тонкими и не могли быть надежно помещены в трахею. Ограничением нынешнего метода литья стентов на ангиокатере является зависимость от производителя к онсогласованности и необходимость тщательного внимания к деталям для обеспечения однородности в производстве стента. Потенциал дисперсии в толщине между литыми стентами необходимо учитывать в будущих исследованиях. С дальнейших исследований, мы надеемся разработать форму для 22 G ангиокатер окружен другим стеклом или некоррозионным материалом, таким образом, что пространство между ангиокатер и стекло encasing составляет 50 мкм, которые мы определили, чтобы быть адекватной толщиной стента стента для легкого размещения в трахею.
Есть несколько преимуществ использования биосовместимого стента для изучения доставки лекарств к пораженной трахееее. В целом, стенты, состоящие из металла или силикона, которые были покрыты полимером, содержащим препарат, были показаны для производства гранулированной ткани и дальнейшей воспалительной реакции на уже шрамы часть трахеи. Этот метод, который рассматривает использование стента, полностью сделанного из биоматериала, который является биосовместимым, а также высвобождает иммуномодулирующий препарат надежным способом, является выгодным. Стент PLLA-PCL также показан биосовместимым в модели мурина и не вызывает острой воспалительной реакции. При изучении препаратов, которые могут бороться с фиброзом, использование стента полностью состоит из биосовместимых материалов, таких как PLLA-PCL, как описано в этом методе является полезным.
Преимущество и простота использования этого метода для построения пригодных для использования стентов заключается в том, что состав PLLA-PCL может быть разнообразным, что позволяет различия в профилях выпуска препарата, смешанного в составе. Предыдущие исследования материала PLLA-PCL показывают, что изменение смесей PLLA-PCL может привести к большей деградации материала, что позволяет быстрее высвобождение препарата9. Кроме того, с помощью этого метода для создания стентов, которые могут быть размещены на мышах выгодно, так как большинство стент исследований для заболеваний дыхательных путей были сделаны в крупных животных10,11,12. Идеально подходит использование мышиной модели, которая может быть модифицирована для различных парадигм заболеваний и позволяет проводить тестирование стента, применяющего наркотики, в заболеваемом состоянии. Тестирование медикаментозного стента в больном состоянии и возможность сравнить его эффективность с эффективностью у животных без болезней позволяет повысить экспериментальную строгость. Этот метод также показывает, как медикаментозный стент для дыхательных путей может быть размещен трансорально, в отличие от предыдущих исследований, где стенты были имплантированы хирургическим путем.
Это исследование демонстрирует очень пригоденную к удобоваемой платформе для разработки стентов и тестирования в маленькой животной модели. Однако необходимо учитывать и другие факторы для использования в субъектах человека. Учитывая твердый и жесткий характер стента он, вероятно, не может быть помещен через направляемый гибкий бронхоскоп, но должны быть размещены трансорально с прямой ларингоскопии и жесткой бронхоскопии. В идеале, стент будет размещен после расширения воздушного шара дыхательных путей, чтобы помочь смягчить restenosis. С точки зрения безопасности пациентов, потенциал для стента мигрировать является большой проблемой, поскольку это потенциально может привести к опасной для жизни дыхательных путей компромисса. Во-вторых, также необходимо учитывать потенциал стентирования, вторичного к накоплению слизи или крови. Необходимы дальнейшие испытания и разработки, чтобы свести к минимуму эти риски.
Будущие исследования могут использовать этот метод для тестирования различных препаратов в PLLA-PCL смесь, чтобы понять далее, как различные иммуносупрессивные методы лечения может смягчить образование рубцов в трахее. Потому что такие стенты могут быть помещены в мышах, используя более большую когорту мышей или мышей с генетическими изменениями к шрам-образуя генам можно также испытать. Будущие эксперименты могут также включать понимание изменений в трахееи, которые могут произойти после хронической имплантации стента (3-6 месяцев) и изменения промена трахеи, а также профили экспрессии генов воспалительных маркеров и фиброза Маркеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Национальный институт по глухоте и другим коммуникационным расстройствам Национальных институтов здравоохранения под номерами премии 1K23DC014082 и 1R21DC017225 (Александр Хиллель). Это исследование также получило финансовую поддержку Триологического общества и Американского колледжа хирургов (Александр Хиллель), Американской медицинской ассоциации Фонда, Чикаго, IL (Madhavi Duvvuri) и T32 NIDCD учебный грант (Кевин Мотц).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
