Summary

Utformning av en biokompatibel drog-Eluting Trakealstent hos möss med Laryngotrakeal stenos

Published: January 21, 2020
doi:

Summary

Laryngotrakeal stenos resultat från patologiska ärr deposition som kritiskt smalnar trakealluftvägarna och saknar effektiva medicinska terapier. Med hjälp av en PLLA-PCL (70% Poly-L-lactide och 30% polycaprolactone) stent som ett lokalt läkemedel leveranssystem, potentiella terapier som syftar till att minska ärr spridning i luftstrupen kan studeras.

Abstract

Laryngotracheal stenos (LTS) är en patologisk förträngning av subglottis och luftstrupe som leder till extrathoracic obstruktion och betydande andfåddhet. LTS resultat från slemhinnor skada från en främmande kropp i luftstrupen, vilket leder till vävnadsskada och en lokal inflammatorisk reaktion som går snett, vilket leder till avsättning av patologisk ärrvävnad. Behandling för LTS är kirurgisk på grund av bristen på effektiva medicinska terapier. Syftet med denna metod är att konstruera en biokompatibel stent som kan miniatyriseras att placera i möss med LTS. Vi visade att en plla-PCL (70% Poly-L-lactide och 30% polycaprolactone) konstruera hade optimal biomekanisk styrka, var biokompatibel, praktiskt möjligt för en in vivo placering stent, och kan elminerande läkemedel. Denna metod ger ett läkemedel leveranssystem för att testa olika immunmodulerande medel för att lokalt hämma inflammation och minska luftvägs fibros. Tillverkningen av stent tar 28 − 30 h och kan återges enkelt, vilket möjliggör experiment med stora kohorter. Här har vi införlivat drogen rapamycin inom stent för att testa dess effektivitet för att minska fibros och kollagen deposition. Resultaten visade att PLLA-PCL tält visade tillförlitlig rapamycin release, var mekaniskt stabila under fysiologiska förhållanden, och var biokompatibla, inducera lite inflammatorisk respons i luftstrupen. Vidare, den rapamycin-eluting plla-PCL stent minskad ärrbildning i luftstrupen in vivo.

Introduction

Laryngotracheal stenos (LTS) är en patologisk förträngning av luftstrupen oftast på grund av iatrogen efter intubation skada. Kombinationen av bakteriell kolonisering, främmande kropp svar på en trakeostomi eller endotrakealtub, och patientspecifika faktorer leder till en avvikande inflammatorisk reaktion. Detta maladaptiva immunsvar leder till avsättning av kollagen i luftstrupen, vilket resulterar i luminala förträngning av luftstrupen och efterföljande stenos1,2. Eftersom nuvarande behandling för denna sjukdom är främst kirurgisk, utveckla en alternativmedicinskt-baserade behandling paradigm inriktning de avvikande inflammatoriska och profibrotic vägar som leder till överdriven kollagen deposition har studerats. Rapamycin, som hämmar mTOR signal komplex, har visat sig ha immunsuppressiva effekter samt en robust antifibroblast effekt. Emellertid, när rapamycin administreras systemiskt, vanliga biverkningar (t. ex., hyperlipidemi, anemi, trombocytopeni) kan uttalas3. Syftet med vår metodik är att utveckla ett fordon för lokal läkemedelsleverans möjligt för användning i luftvägarna som skulle minska dessa systemiska effekter. Våra bedömningar fokuserar på att undersöka det lokala immunsvaret på drogen leverans konstruktion samt dess förmåga att hämma fibroblast funktion och förändra den lokala immunförsvaret mikromiljö. Sjukdomsspecifika resultat inkluderar in vivo-tester som utvärderar markörer för fibros.

Biologiskt nedbrytbara läkemedel-eluerande stent har använts i djurmodeller av sjukdom i flera organsystem, inklusive luftvägarna4. För hantering av luftvägsstenos eller kollaps, tidigare undersökningar har använt läkemedel belagda silikon och nickel-baserade stent5. En PLLA-PCL-konstruktion valdes för denna speciella metod på grund av dess läkemedelelutionsprofil och mekaniska hållfasthet under fysiologiska förhållanden under en period av 3 veckor, vilket har visats i tidigare publicerade studier6. PLLA-PCL är också ett biokompatibelt och biologiskt nedbrytbart material som redan godkänts av FDA4. Biokompatibla stent elminerande cisplatin och MMC har studerats i stora djurmodeller som kaniner och hundar. Men i dessa djurmodeller, stent inte placerades i en djurmodell av sjukdom och implanterades transcervically. Denna studie ger en unik metod för att bedöma en biokompatibel Drug-eluting stent placeras transperoralt i en musmodell av luftvägs skador och laryngotrakeal stenos. En biokompatibel stent som eluera ett immunmodulerande läkemedel lokalt och kan miniatyriseras för studier i en murin-modell är värdefull för translationell preklinisk forskning. Tidigare försök till stent-användning med andra material konstruktioner genererade robusta reaktioner från främmande kropp förvärrade den underliggande inflammationen som skiljer LTS7. Denna metodik, till vår kännedom, är den första i sitt slag att studera immunmodulerande och antifibrotiska effekter av ett stent-baserat läkemedel leveranssystem i en murin modell av LTS. Den murina modellen själv erbjuder flera fördelar för att studera effekterna av en immunmodulerande läkemedel på luftstrupen. Genetiskt modifierade möss och experimentella kohorter av friska och sjuka möss kan studeras, vilket kan leda till experimentell reproducerbarhet och förbättra kostnadseffektiviteten. Dessutom, leveransen av stent transorally in i musen luftstrupe härmar klinisk leverans av en sådan stent hos människor, vilket ytterligare belyser den translationella fördelen med denna metod. Slutligen, den relativa lätthet med vilken PLLA-PCL stent med drogen kan produceras möjliggör ändringar för att leverera alternativa läkemedel terapier som syftar till att minska ärrbildning i luftstrupen.

Protocol

Anmärkning: alla metoder som beskrivs här godkändes av Johns Hopkins University djuromsorg och användning kommittén (MO12M354). 1. beredning av rapamycin i PLLA-PCL Förbered två glasflaskor (med lock) av 70:30 PLLA-PCL polymerlösningar (inneboende viskositet 1,3 − 1.8 DL/G; Tabell över material) lösningar, med en injektionsflaska innehållande 1,0% rapamycin och den andra utan rapamycin. Gör en 1,0% rapamycin innehållande polymerlösning genom a…

Representative Results

Den biologiskt nedbrytbara PLLA-PCL stent-konstruktionen laddad med rapamycin som användes i denna studie var kapabel att eluera rapamycin på ett konsekvent och förutsägbart sätt under fysiologiska förhållanden (figur 1). Figur 2 visar plla-PCL stent gjuten runt en 22 G angiocatheter för användning i en murin modell av LTS. För att avgöra om effekterna av rapamycin eluering i luftstrupen är effektiv vid dämpning av fibros, kan uppmätta förändring…

Discussion

De mest kritiska stegen för att framgångsrikt konstruera och använda en Drug-eluting stent in vivo är 1) att fastställa den optimala plla-PCL förhållandet för den önskvärda drogen eluering Rate, 2) bestämma lämplig koncentration av läkemedel för att elueras, 3) gjutning stent runt angiocatheter för in vivo användning, och 4) transoralt leverera stent till möss efter LTS induktion utan att orsaka dödlig luftvägsobstruktion.

Även om det finns flera metoder för läkemedelslev…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nationella institutet för dövhet och andra kommunikationsstörningar i National Institutes of Health under tilldelning nummer 1K23DC014082 och 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Denna studie stöddes också ekonomiskt av det Triologiska sällskapet och American College of kirurger (Alexander Hillel), American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) och ett T32 NIDCD Training Grant (Kevin Motz).

Materials

1. For stent
22-gauge angiocatheter Jelco 4050
Dichloromethane Sigma Aldrich 270997-100ML
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Available from other vendors as well.
PDLGA Sigma Aldrich 739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30) Evonik Industries AG 65053
Rapamycin LC Laboratories R-5000
2. Animal surgery
Wire brush Mill-Rose Company 320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer Abcam ab93678 Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI Cell Signaling 8961S
DMEM ThermoFisher Scientific 11965-092 Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum) MilliporeSigma F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody Lif technology a11008
Goat anti-rat-633 antibody Lif technology a21094
Hydrophilic plus slide BSB7028
PBS ThermoFisher Scientific 100-10023 Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody Abcam ab5690
Rat antiF4/80 antibody Biolengend 123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads OMNI International 19-645
Bead Mill Homoginizer OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix Life Technologies 4367659
RNeasy mini kit Qiagen 80404
StepOnePlus Real Time PCR system Life Technologies

References

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

Play Video

Cite This Article
Duvvuri, M., Motz, K., Tsai, H., Lina, I., Ding, D., Lee, A., Hillel, A. T. Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis. J. Vis. Exp. (155), e60483, doi:10.3791/60483 (2020).

View Video