Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Utformning av en biokompatibel drog-Eluting Trakealstent hos möss med Laryngotrakeal stenos

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60483

Summary

Laryngotrakeal stenos resultat från patologiska ärr deposition som kritiskt smalnar trakealluftvägarna och saknar effektiva medicinska terapier. Med hjälp av en PLLA-PCL (70% Poly-L-lactide och 30% polycaprolactone) stent som ett lokalt läkemedel leveranssystem, potentiella terapier som syftar till att minska ärr spridning i luftstrupen kan studeras.

Abstract

Laryngotracheal stenos (LTS) är en patologisk förträngning av subglottis och luftstrupe som leder till extrathoracic obstruktion och betydande andfåddhet. LTS resultat från slemhinnor skada från en främmande kropp i luftstrupen, vilket leder till vävnadsskada och en lokal inflammatorisk reaktion som går snett, vilket leder till avsättning av patologisk ärrvävnad. Behandling för LTS är kirurgisk på grund av bristen på effektiva medicinska terapier. Syftet med denna metod är att konstruera en biokompatibel stent som kan miniatyriseras att placera i möss med LTS. Vi visade att en plla-PCL (70% Poly-L-lactide och 30% polycaprolactone) konstruera hade optimal biomekanisk styrka, var biokompatibel, praktiskt möjligt för en in vivo placering stent, och kan elminerande läkemedel. Denna metod ger ett läkemedel leveranssystem för att testa olika immunmodulerande medel för att lokalt hämma inflammation och minska luftvägs fibros. Tillverkningen av stent tar 28 − 30 h och kan återges enkelt, vilket möjliggör experiment med stora kohorter. Här har vi införlivat drogen rapamycin inom stent för att testa dess effektivitet för att minska fibros och kollagen deposition. Resultaten visade att PLLA-PCL tält visade tillförlitlig rapamycin release, var mekaniskt stabila under fysiologiska förhållanden, och var biokompatibla, inducera lite inflammatorisk respons i luftstrupen. Vidare, den rapamycin-eluting plla-PCL stent minskad ärrbildning i luftstrupen in vivo.

Introduction

Laryngotracheal stenos (LTS) är en patologisk förträngning av luftstrupen oftast på grund av iatrogen efter intubation skada. Kombinationen av bakteriell kolonisering, främmande kropp svar på en trakeostomi eller endotrakealtub, och patientspecifika faktorer leder till en avvikande inflammatorisk reaktion. Detta maladaptiva immunsvar leder till avsättning av kollagen i luftstrupen, vilket resulterar i luminala förträngning av luftstrupen och efterföljande stenos1,2. Eftersom nuvarande behandling för denna sjukdom är främst kirurgisk, utveckla en alternativmedicinskt-baserade behandling paradigm inriktning de avvikande inflammatoriska och profibrotic vägar som leder till överdriven kollagen deposition har studerats. Rapamycin, som hämmar mTOR signal komplex, har visat sig ha immunsuppressiva effekter samt en robust antifibroblast effekt. Emellertid, när rapamycin administreras systemiskt, vanliga biverkningar (t. ex., hyperlipidemi, anemi, trombocytopeni) kan uttalas3. Syftet med vår metodik är att utveckla ett fordon för lokal läkemedelsleverans möjligt för användning i luftvägarna som skulle minska dessa systemiska effekter. Våra bedömningar fokuserar på att undersöka det lokala immunsvaret på drogen leverans konstruktion samt dess förmåga att hämma fibroblast funktion och förändra den lokala immunförsvaret mikromiljö. Sjukdomsspecifika resultat inkluderar in vivo-tester som utvärderar markörer för fibros.

Biologiskt nedbrytbara läkemedel-eluerande stent har använts i djurmodeller av sjukdom i flera organsystem, inklusive luftvägarna4. För hantering av luftvägsstenos eller kollaps, tidigare undersökningar har använt läkemedel belagda silikon och nickel-baserade stent5. En PLLA-PCL-konstruktion valdes för denna speciella metod på grund av dess läkemedelelutionsprofil och mekaniska hållfasthet under fysiologiska förhållanden under en period av 3 veckor, vilket har visats i tidigare publicerade studier6. PLLA-PCL är också ett biokompatibelt och biologiskt nedbrytbart material som redan godkänts av FDA4. Biokompatibla stent elminerande cisplatin och MMC har studerats i stora djurmodeller som kaniner och hundar. Men i dessa djurmodeller, stent inte placerades i en djurmodell av sjukdom och implanterades transcervically. Denna studie ger en unik metod för att bedöma en biokompatibel Drug-eluting stent placeras transperoralt i en musmodell av luftvägs skador och laryngotrakeal stenos. En biokompatibel stent som eluera ett immunmodulerande läkemedel lokalt och kan miniatyriseras för studier i en murin-modell är värdefull för translationell preklinisk forskning. Tidigare försök till stent-användning med andra material konstruktioner genererade robusta reaktioner från främmande kropp förvärrade den underliggande inflammationen som skiljer LTS7. Denna metodik, till vår kännedom, är den första i sitt slag att studera immunmodulerande och antifibrotiska effekter av ett stent-baserat läkemedel leveranssystem i en murin modell av LTS. Den murina modellen själv erbjuder flera fördelar för att studera effekterna av en immunmodulerande läkemedel på luftstrupen. Genetiskt modifierade möss och experimentella kohorter av friska och sjuka möss kan studeras, vilket kan leda till experimentell reproducerbarhet och förbättra kostnadseffektiviteten. Dessutom, leveransen av stent transorally in i musen luftstrupe härmar klinisk leverans av en sådan stent hos människor, vilket ytterligare belyser den translationella fördelen med denna metod. Slutligen, den relativa lätthet med vilken PLLA-PCL stent med drogen kan produceras möjliggör ändringar för att leverera alternativa läkemedel terapier som syftar till att minska ärrbildning i luftstrupen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning: alla metoder som beskrivs här godkändes av Johns Hopkins University djuromsorg och användning kommittén (MO12M354).

1. beredning av rapamycin i PLLA-PCL

  1. Förbered två glasflaskor (med lock) av 70:30 PLLA-PCL polymerlösningar (inneboende viskositet 1,3 − 1.8 DL/G; Tabell över material) lösningar, med en injektionsflaska innehållande 1,0% rapamycin och den andra utan rapamycin.
    1. Gör en 1,0% rapamycin innehållande polymerlösning genom att tillsätta 6 mg rapamycin till 600 mg 70:30 PLLA-PCL i en injektionsflaska av glas.
    2. För polymerlösning utan rapamycin (kontroll), tillsätt endast 600 mg 70:30 PLLA-PCL till injektionsflaskan med glas.
  2. Tillsätt 6 mL diklormetan till varje injektionsflaska av glas under ett dragskåp.
    FÖRSIKTIGHET: diklormetan är ett frätande material och endast glaspipetter ska användas. Lämpliga säkerhetsåtgärder inkluderar personlig ögonskydd och handskar.
  3. Tillsätt 120 μL glycerol till varje injektionsflaska av glas (för 2% glycerollösning).
    Anmärkning: tillsats av glycerol möjliggör ökad flexibilitet och minskad styvhet i stent konstruktionen.
  4. Sammanfatta glasflaskorna och låt 70:30 PLLA-PCL med och utan rapamycin upplösas och homogenisera i 6 − 12 h.
    Obs: glasflaskor kan också placeras på en roterande skakplattform för snabbare upplösning.

2. rapamycin elueringstester

  1. Pipettera över 1 mL 70:30 PLLA-PCL-lösning innehållande 1% rapamycin till ett glas petriskål.
    Obs: denna volym 70:30 PLLA-PCL lösning som innehåller 1% rapamycin kommer att innehålla 120 μg rapamycin och representerar den totala mängden rapamycin i varje konstruktion. Alternativa volymer och koncentrationer kan användas.
  2. Tillåt 70:30 PLLA-PCL med 1% rapamycin att härda i en platt disk i glas petriskål.
  3. När härdat, placera skivan i 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) och inkubera i en 37 ° c kammare.
  4. Samla och ersätt PBS (2 mL) varje 24 h och använda insamlade PBS för högpresterande vätskekromatografi (HPLC) analys av rapamycin innehåll.
  5. Använd en autosampler och en C18 4,6 cm x 250 mm HPLC-kolonn för att köra prover genom autosampler injektorn tillsammans med seriella utspädningar av rapamycin för att skapa en kalibrerad standardkurva. Kör varje prov i tre exemplar.
    Anmärkning: seriella utspädningar av rapamycin som ska testas inkluderar 10%, 1%, 0,1% och 0,01%.
  6. Använd en mobil fas av HPLC grade vatten och acetonitril med 10/90 volym/volym med en flödeshastighet på 2,0 mL/min. Ställ absorbans under HPLC för rapamycin till 280 nm.
    Anm.: figur 1 visar elueringen av rapamycin under en 14-dagarsperiod.

3. inrättande av rapamycin-eluting PLLA-PCL murina luftvägsstent

Anmärkning: Utför steg 3.2 − 3.9 med sterila material och steril teknik för att undvika kontaminering som skulle påverka in vivo-och in vitro-tillämpningar.

  1. Förbered PLLA-PCL-lösningar som innehåller rapamycin enligt beskrivningen i avsnitt 1.
  2. Använd en glas pastorpipett med en gummi ballong och applicera 1 mL PLLA-PCL-lösning med 1% rapamycin på den venösa kanylen på en 22 G fluorerad etylenpropenbaserad angiocatheter (tabell över material). Håll angiocatheter i ena handen och Använd glaspipetten för att släppa PLLA-PCL-lösningen på angiocatheter. Vrid angiocatheter långsamt för att säkerställa en homogen täckning av angiocatheter med PLLA-PCL-lösningen.
    Anmärkning: först PLLA-PCL lösning kommer att vara tunn, men eftersom diklormetan avdunstar under applicering på angiocatheter, lösningen kommer att bli mer trögflytande att forma på angiocatheter. Att kontinuerligt vrida angiocatheter under applicering är fördelaktigt. Detta steg måste göras långsamt och minutiöst för att säkerställa den konsekventa tjockleken på stent.
  3. Stötta den gjutna angiocatheter med spetsen på angiocatheter vänd nedåt och fästet på kanten av ett glas petriskål för torkning.
  4. Låt stent torka i 24 timmar i en vakuum huva i rumstemperatur (figur 2a).
  5. Ta bort stent konstruera från underliggande angiocatheter genom att försiktigt vrida den underliggande katetern fri och glida ut den ur gjuten stent (figur 2B).
  6. Kontrollera stent circumferellt för eventuella defekter som kan ha resulterat under gjutningsprocessen. Om en defekt i gjuten stent är närvarande, kassera den.
  7. Trimma varje ände av gjuten stent med fina raka saxar så att kanterna är axiella.
  8. Med fin rak sax, skära 3 mm axiella segment av rösterna stent för användning i en musmodell av LTS (figur 2C).
    Anmärkning: cirka 8 stent kan göras från en gjuten angiocatheter, med varje 3 mm stent som innehåller 120 μg rapamycin.
  9. Fyll på 3 mm stent på en ny 22 venös kateter för användning i en musmodell av LTS (figur 1).

4. induktion av laryngotrakealstenos hos möss

  1. Innan du utför in vivo mus studier inhämta godkännande från djuromsorg och användning kommittén.
  2. Anesthetize en 9-veckors gammal hane C57BL/6 genom att ge en intraperitoneal injektion av ketamin (80 − 100 mg/kg) och xylazin (5 − 10 mg/kg).
    Obs: andra möss stammar kan ersättas, men det rekommenderas att mössen väger mellan 20 − 27 g.
  3. Randomisera möss till en experimentell grupp (kemomekanisk skada med en placering av en 1% rapamycin-innehållande PLLA-PCL stent) och två kontrollgrupper: 1) kemomekanisk skada med placeringen av en PLLA-PCL stent, 2) kemomekanisk skada utan placering av en stent.
  4. Placera en mus på en kirurgisk plattform i liggande läge. Använd en liten slinga av tråden anbringas på toppen av plattformen för att förlänga halsryggen genom looping den runt de centrala framtänderna.
  5. Fästa händerna och benen på musen till bordet med 2 tums bitar av tejp. Nypa mus Paw att se till att det har haft tillräcklig anestesi.
  6. Operationsplatsen är sedan prepped. Den överliggande pälsen bör avlägsnas och huden bör rengöras (omväxlande jod eller klorhexidin skrubba med alkohol eller utspädd huddesinfektionsmedel) tre gånger. Området ska vara drautade och sterila handskar bäras. De steriliserade instrumenten bör läggas på en steril yta när de inte används.
  7. Gör en 1,5 cm mittlinje vertikalt snitt i nacken av musen med hjälp av fina böjda Iris sax. Dela den överliggande tymus och lateralize de två resulterande loberna att visualisera luftstrupen. Dela upp den överliggande sternohyoid och sternothyroid (REM) muskler på den överlägsna tillbehöret bilateralt.
    Observera: hela laryngotrakealkomplexet ska vara helt utsatt efter detta.
  8. Passera en 22 G angiocatheter transorally genom struphuvudet i luftstrupen. Använd små pinpett för att applicera tryck på den främre struphuvudet av musen för att hjälpa till korrekt placering av angiocatheter. Visualisera den vita angiocatheter genom luftstrupen för att säkerställa korrekt placering (icke-esofageal).
    Obs: musen luftstrupen är extremt tunn och den vita angiocatheter kommer att visualiseras genom den genomskinliga luftstrupen.
  9. Passera en bleomycin-belagd trådborste genom den insatta angiocatheter.
  10. Dra sakta upp angiocathetern så att endast tråd borsten finns kvar i luftstrupen.
  11. Applicera mottryck med fin tång på luftstrupen för att mekaniskt störa trakeallumen med tråd borsten.
  12. Sätt in angiocatheter i luftstrupen över tråd borsten.
  13. Ta bort tråd borsten och återapplicera bleomycin.
  14. Upprepa steg 4.8 − 4.12 totalt 5x. Applicera bleomycin på borsten mellan varje applicering.
    Anmärkning: validering och beskrivning av denna modell finns i Hillel et al.8.
  15. Ta bort angiocatheter från musen luftstrupen.
    Anmärkning: om ingen stent ska placeras, snittet kan stängas med vävnad lim.

5. transoral PLLA-PCL stent placering hos möss

  1. Fyll på en 3 mm gjuten stent på en tom 22 G angiocatheter (figur 3A).
    Obs: stent bör vila 5 mm från spetsen av angiocatheter.
  2. Rita en tunn svart vertikal linje på 3 mm gjuten stent.
    Anmärkning: denna linje möjliggör förbättrad visualisering av stent i luftstrupen.
  3. Transoralt intubera musen med angiocatheter som har förinstallerade med stent.
  4. Visualisera stent på angiocatheter i luftstrupen genom transcervikal snitt (figur 3B).
    Anmärkning: luftstrupen är mycket tunn, vilket gör att den svarta färgen på stent att visualiseras genom luftstrupen. Använd detta för att bekräfta korrekt trakealplacering.
  5. Håll stenten på plats genom att grippa luftstrupen genom transcervikal snitt med fin tång.
  6. Ta bort angiocatheter transorally samtidigt som ett grepp om stent med fina pinkben.
    Notera: det är oerhört viktigt att inte applicera för mycket kraft på stenten för att inte krossa lumen när angiocatheter avlägsnas. Emellertid, tillräckligt med kraft krävs för att säkerställa stent inte avlägsnas med angiocatheter. En 0,8 mm sialendoskop kan användas för att visualisera placeringen och placeringen av stent i luftstrupen.
  7. Stäng transcervikal snitt med vävnads lim.
  8. Låt varje mus att återhämta sig till sin ursprungliga aktivitetsnivå innan du placerar tillbaka den i sin bur.

6. histologisk beredning av prover

  1. Anesthetize möss med inhalerat bedövningsmedel och offra möss med cervikal dislokation per djur protokoll efter 7, 14, eller 21 dagar.
    Anmärkning: baserat på den kronicitet av studien, olika tidsintervall kan användas (t. ex., 28, 30 dagar, etc.).
  2. Placera en mus på den kirurgiska plattformen enligt beskrivningen i steg 4,4 och 4,5.
  3. Öppna nacken snitt på musen med hjälp av fina böjda Iris sax.
  4. Utsätt luftstrupen per steg 4,6.
  5. Dela distala luftstrupen under nivån på stent med fin böjd Iris sax.
  6. Dela den proximala luftstrupen under struphuvudet och ovanför stent med fin böjd Iris sax.
    Anmärkning: det är viktigt att dela distala luftstrupen först för att förhindra luftstrupen från att dras in i bröstkorgen.
  7. Separera den delade luftstrupen från matstrupen posteriort och ta bort luftstrupe från musen.
    Anmärkning: Stents kommer fortfarande att behållas inom mus luftstrupen.
  8. Ta bort stent från luftstrupen och Fix i 10% formalin för 24 h.
  9. Bädda formalin-fast mus luftstrupe exemplar i paraffin med distala änden orienterade fint så att axiella nedskärningar av luftstrupen kan göras i nästa steg.
  10. Skär 5 μm delar av paraffin-inbäddade mus luftstrupe med en mikrotom.
    Anmärkning: proverna bör skäras axiellt med start från distala luftstrupen.
  11. Få en representativ sektion på 5 μm varje 250 μm längs provexemplarets längd.
  12. Komplett H & E fläcken på varje representativ sektion.
    1. Deparaffinize bilderna genom att placera i xylen 2x per Slide för 3 min.
    2. Placera glidbanorna i 100% etanol i 2 min, 95% etanol i 2 min och 70% etanol i 2 min för att rehydrera.
    3. Tvätta glasen med rinnande kranvatten i 2 min.
    4. Färga glasen i hematoxylin i 3 − 5 min.
    5. Tvätta glasen med rinnande kranvatten i 5 min.
    6. Placera bilderna i 1% syra alkohol i 1 min.
    7. Tvätta glasen med rinnande kranvatten i 1 min.
    8. Skölj i 0,2% ammoniak vatten för 30 s.
    9. Skölj glasen i rinnande kranvatten i 5 min. doppa i 95% etanol 10X.
    10. Eosin fläcken genom att placera Slide i eosin phloxine för 30 s.
    11. Torka av glasen genom att placera i 95% etanol i 5 min, följt av absolut etanol 2x i 5 min.
    12. Placera i xylen 2x i 5 min.
    13. Montera glasen med xylenbaserade monteringsmedel.
  13. Mät tjockleken på lamina propria som beskrivs i Hillel et al.8.

7. stent biokompatibilitet in vivo

  1. Förbered vävnads sektionerna i steg 6.1 − 6.4. Ta inte bort stent från dessa trakealsektioner för att visualisera förändringar i inflammation i förhållande till placeringen av stent i lumen av luftstrupen.
    1. För att avgöra den akuta främmande kropp svar på stent, Observera makrofag och T cell aktivitet med CD3 och F4/80 markörer.
      Anmärkning: andra markörer kan också användas för att bestämma akut inflammatorisk reaktion på stent.
    2. Få 5 μm skurna delar av den paraffin-inbäddade luftstrupen på kommersiellt tillgängliga hydrofila plus diabilder (tabell över material). Placera två avsnitt på varje bild.
      Anmärkning: dessa avsnitt bör vara från ett område av luftstrupen där PLLA-PCL stent placerades.
  2. Placera glidbanorna i xylen 2x i 5 min vardera.
  3. Placera bilderna i 100% etanol 2x för 3 min vardera.
  4. Placera glidbanorna i 95% etanol i 1 min.
  5. Placera bilderna i en histologisk färgning rack så att de är nedsänkt i antigen hämtning buffert (tabell över material) och sedan placera i en grönsak ångbåt med kokande vatten i 20 min.
  6. Ta bort färgställningar från ångbåten och kassera antigen hämtningsbufferten.
  7. Ersätt bufferten med 1 mL PBS.
  8. Placera bilderna i en våt Färgnings låda i 1 min.
  9. Kassera PBS och inkubera bilderna med Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% FBS för 30 min.
  10. Kassera DMEM och tillsätt en blandning av två primära antikroppar som föds upp i olika arter. Täck över glidbanorna med paraffin film och inkubera över natten vid 4 ° c i ett mörkt rum.
    Anmärkning: i detta protokoll kanin anti-CD3 och råtta anti-F4/80 (tabell över material) användes.
  11. Tvätta bilderna i PBS 3x i 5 min.
  12. Inkubera glasen med sekundära antikroppar som är specifika för den primära antikropp arten (tabell över material) utspädd i DMEM med 10% FBS för 0.5 − 1 h vid rumstemperatur i mörker.
  13. Tvätta bilderna i PBS 3x för 5 min i mörker.
  14. Montera bilderna på täckglas med en droppe monteringsmedel med 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Förvara bilderna i mörker vid antingen 20 ° c eller 4 ° c.
  15. Observera de färgade bilderna på en laser Scan konfokala Mikroskop och fotografi.
  16. Kvantifiera det totala antalet celler färgning med DAPI och antikroppar av intresse för jämförelse med oskadade luftstrupen.

8. Mouse luftstrupen kvantitativ gen uttrycks analys

  1. Samla mus luftstrupen som beskrivs i steg 6.1 − 6.7 och ta bort stent.
    Obs: skördas mus tracheas kan lagras i en-80 ° c frys i upp till 2 år.
  2. Desiccate den trakealvävnad skördas i steg 8,1 med hjälp av fin sax och ytterligare homogenisera med hjälp av en pärla kvarn Homogenisatorer med 1,4 mm keramiska pärlor (tabell över material) som en del av en kommersiellt tillgänglig kolumnbaserad RNA extraktion Kit (tabell över material).
    Anmärkning: pärla Mill Homogenisatorer inställningar = 1 40 s cykel vid 6 m/s.
  3. Extrahera RNA från trakeallysat med hjälp av en kolonnbaserad extraktion och rening Kit (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Kvantifiera RNA från varje prov med hjälp av en spektrofotometer (tabell över material).
    Anmärkning: RNA renhet bedöms med hjälp av förhållandet 260/230 nm med en ren RNA-provläsning 2,0.
  5. Skapa komplementär DNA från extraherat RNA med omvänd transkriptas (tabell över material) och en termocyklern med följande inställningar: 5 min vid 25 ° c (grundning), 46 ° c i 30 min (omvänd Transkription), och sedan 95 ° c i 1 min (inaktivering av omvänd transkriptas).
  6. Späd kompletterande DNA-prover med RNase fritt vatten till en koncentration av 10 − 25 ng/mL för användning i kvantitativ realtids PCR.
  7. Blanda 1 μL av komplementär-DNA (10 − 25 ng/mL) med 10 μL av en PCR-Mastermix (tabell över material), 8 μl DDH2O och 0,5 μl med 10 μm framåt och omvänd primers för genen av intresse i en brunn av en 96-well PCR-platta (tabell över material).
    Obs: den totala volymen i varje brunn ska vara 20 μL. Varje brunn på 96 brunnen pläterar bör innehålla endast en ta prov och en gen av intresserar.
  8. Upprepa steg 8.1 – 8.7 för alla gener av intresse och kör varje prov för varje gen i tre exemplar.
    Anmärkning: de genspecifika framåtriktade och omvända primers (tabell över material) för kollagen 1, kollagen 3 och referens genen β-Actin används ofta för att undersöka markörer för fibros.
  9. Placera 96-brunnen på den kvantitativa PCR-maskinen i realtid och initiera följande protokoll: denaturering vid 95 ° c i 15 s och glödga och sträck ut vid 60 ° c i 60 s för 40 cykler.
  10. Normalisera cykelns tröskel värde (CT) för identifiering av genprodukter för varje gen av intresse (GOI) till CT-värdet för referengenen β-Actin för alla prover för att erhålla en ΔCT för varje Indiens myndigheter. Jämför sedan ΔCT-värdena för varje GOI för behandlade och obehandlade prover för att generera en ΔΔCT.
    Obs: cykel tröskeln är punkten på amplifieringskurvan när en förutbestämd mängd genprodukt finns (ΔRn). ΔRn-värdet för varje reaktion bör bestämmas för varje gen av intresse och bör falla på den linjära delen av amplifieringskurvan.
    Anmärkning: ΔCT = CT (GOI) – CT (referens gen); ΔΔCT = ΔCT (behandlad) – ΔCT (obehandlad).
  11. Beräkna den relativa förändringen i genuttryck mellan behandlade och obehandlade prover som ett uttryck för viknings förändring genom att beräkna 2ΔδCT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den biologiskt nedbrytbara PLLA-PCL stent-konstruktionen laddad med rapamycin som användes i denna studie var kapabel att eluera rapamycin på ett konsekvent och förutsägbart sätt under fysiologiska förhållanden (figur 1). Figur 2 visar plla-PCL stent gjuten runt en 22 G angiocatheter för användning i en murin modell av LTS. För att avgöra om effekterna av rapamycin eluering i luftstrupen är effektiv vid dämpning av fibros, kan uppmätta förändringar i fibros-relaterat genuttryck och markörer för akut inflammation bedömas genom gen uttrycks analys, flödescytometri, immunofluorescens, och ELISA. Framgångsrik placering av en miniatyriserad stent i luftstrupen på musen med hjälp av den metod som beskrivs ovan har visats. En schematisk metod visas i figur 3. Figur 4 visar den miniatyriserade biokompatibla stent in situ i luftstrupen som indikeras av den svarta markören på stent, som visualiseras genom den genomskinliga mus luftstrupen. I inledande experiment, med hjälp av en 0,8 mm sialendoskop för att bekräfta placeringen av stent i luftstrupen var hjälpsam. Efter 21 dagar, för att bekräfta att transoral placeringen av stent var effektiv och stent inte migrera från sin ursprungligen placerade position, var halsen snitt återupptas för att bestämma placeringen av stent. Som visas i figur 4B, den svarta färgämnes markören av stent visade stent behöll sin position i luftstrupen. Resektion av luftstrupen efter 21 dagars behandling med stent visas i figur 4C.

Representativa bilder av biokompatibilitetstester med immunofluorescensfärgning för markörer för akuta och kroniska inflammationer visas i figur 5. Detta visade att PLLA-PCL stent-konstruktionen (utan rapamycin) inte var immunoreaktiv, vilket bestämdes av det minimala antalet immunceller som fanns efter placeringen. Det är viktigt att notera att i denna metod, normala oskadade tracheas användes och en PLLA-PCL stent utan rapamycin placerades för att bestämma den inflammatoriska reaktionen på själva konstruktionen.

Därefter, för att avgöra om rapamycin-eluting PLLA-PCL stent var effektivt för att lindra ärr, visade vi tidigare gen uttrycks förändringar i markörer för akut inflammation och fibros6. Det finns närmare bestämt en minskning med 90,3 gånger (SEM ± 26,0; n = 4; p < 0,01) minskning av col1a1 vid dag 4, liksom de akuta INFLAMMATORISKA markörer inf-γ, CD11b, arg-1, och Il-1b6. Även om skillnaderna i veck förändring för vissa gener inte var signifikanta, är det möjligt att med en större kohort av möss, kan betydelsen uppnås. För att avgöra om det fanns förändringar i luftstrupen på grund av läkemedeleluering histologiskt, eller om det fanns förändringar i luftstrupen på grund av radiell kraftansträngning av stenten, vi visade att det fanns en minskning av bredden av lamina propria i de trakeosom behandlats med rapamycin-eluting stent jämfört med dem utan rapamycin-eluting stent6.

Figure 1
Figur 1: rapamycin PLLA-PCL-upplösning. PLLA-PCL-konstruktionen som innehåller 1% rapamycin uppvisade en konsekvent och förutsägbar frisättning av rapamycin under en 14-dagarsperiod. Data punkterna representerar medelvärdet av den samplade elueringen ± SEM (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: stent gjutning. (A) plla-PCL-lösningen tilläts torka runt en 22 G angiocatheter. (B) den gjutna togs sedan bort från angiocatheter. (C) stent klipptes till 3 mm längder för användning i musmodell6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Transoral stent placering hos möss. (A) stent lastades på en tom angiocatheter och placeras transorally i luftstrupen. Bden svarta färgämnes märkningen på stenten kan ses genom ett transcervikalt snitt för att bekräfta dess position i musens luftstrupe. Crepresentativ ritning av stent in situ i den sjuka mus luftstrupen6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: in situ-bilder av stent. (a-B) Stenten med svart färgmarkeringar kan ses in situ i murina luftstrupen. C en bild avstentenoch det murina laryngotrakealkomplexet efter skörd vid 21 dagar6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: stent biokompatibilitet. Immunofluorescerande färgning för F4/80 (makrofager, röd Chromophore) och CD3 (grön Chromophore, T-lymfocyter) dag 4 avslöjade minimala inflammatoriska celler i (a) oskadat luftstrupe och (B) LUFTSTRUPE med plla-PCL stent. Detta kontrasterar med (C) en skadad luftstrupe, med en förtjockad lamina propria och närvaron av många celler med positiva F4/80 och CD3 färgning6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiska stegen för att framgångsrikt konstruera och använda en Drug-eluting stent in vivo är 1) att fastställa den optimala plla-PCL förhållandet för den önskvärda drogen eluering Rate, 2) bestämma lämplig koncentration av läkemedel för att elueras, 3) gjutning stent runt angiocatheter för in vivo användning, och 4) transoralt leverera stent till möss efter LTS induktion utan att orsaka dödlig luftvägsobstruktion.

Även om det finns flera metoder för läkemedelsleverans med stent i djurmodeller av luftvägssjukdomar, utveckling av en biokompatibel stent kan läkemedelsleverans i en sjuka murin modell är en första. Vid utarbetandet av denna metod för läkemedelsleverans gjordes flera modifieringar av metoden. Det var viktigt att bestämma lämplig plla-PCL sammansättning för att göra stent som var mekaniskt styv nog att placeras i luftstrupen och att stanna kvar i luftstrupen trots fysiologiska sekret. En 70:30 sammansättning av plla-PCL beslutades om för stent konstruktion med en angiocatheter gjutning eftersom det kan framgångsrikt eluera rapamycin i en förutsebart natur, placeras på ett säkert och tillförlitligt sätt i vår musmodell, och inte försämras i fysiologiska Villkor. En svår och potentiellt tillverkarberoende del av denna metod är gjutning av stent runt angiocatheters. Inledningsvis, vid byggandet av in vivo stent, 22 G angiocatheters placerades inuti spetsen av en glaspipett och polymerlösningen hälldes i utrymmet mellan angiocatheter och glaset pipett, bildar en gjuten av utrymmet mellan. Men väggen i stent som följer av denna metod ofta var för tunn och kunde inte tillförlitligt placeras i luftstrupen. En begränsning av den nuvarande metoden för gjutning stent på angiocatheter är beroendet av tillverkaren för konsistens, och behovet av noggrann uppmärksamhet på Detaljer för att säkerställa homogenitet i stent produktion. Potentialen för varians i tjocklek mellan gjutna stent måste åtgärdas i framtida studier. Med ytterligare studier, hoppas vi att designa en mögel för en 22 G angiocatheter omgiven av ett annat glas eller icke korrosiva material så att utrymmet mellan angiocatheter och glaset innesluta är 50 μm, som vi bestämde sig för att vara en adekvat väggtjocklek av stent för enkel placering i luftstrupen.

Det finns flera fördelar med att använda en biokompatibel stent för att studera läkemedelsleverans till den drabbade luftstrupen. Sammantaget stent består av metall eller silikon som har belagts med en polymer som innehåller drogen har visat sig producera granulering vävnad och ytterligare inflammatorisk reaktion på en redan ärrad del av luftstrupen. Denna metod, som förhör användningen av en stent gjord helt av biomaterial som är biokompatibel och även släpper en immunmodulerande läkemedel på ett tillförlitligt sätt är fördelaktigt. PLLA-PCL stent är också visat sig vara biokompatibel i murina modellen och framkallar inte en akut inflammatorisk reaktion. Vid studier av läkemedel som kan bekämpa fibros, med hjälp av en stent helt består av biokompatibelt material såsom PLLA-PCL som beskrivs i denna metod är fördelaktigt.

Fördelen och enkel att använda denna metod för att konstruera användbara stent är att sammansättningen av PLLA-PCL kan varieras, vilket möjliggör skillnader i release profiler för drogen blandas i sammansättningen. Tidigare studier av PLLA-PCL-materialet visar att variation i PLLA-PCL-blandningar kan leda till större nedbrytning av materialet, vilket möjliggör snabbare läkemedelsfrisättning9. Dessutom är det fördelaktigt att använda denna metod för att konstruera stent som kan placeras på möss, eftersom de flesta stent-studierna för luftvägssjukdomar utfördes hos större djur10,11,12. Användningen av en musmodell som kan ändras för olika sjukdoms paradigm och möjliggöra testning av drogen-eluting stent i en sjuk tillstånd är idealisk. Testa drogen-eluting stent i en sjuk tillstånd och att kunna jämföra dess effekt till de i djur utan sjukdom möjliggör större experimentell noggrannhet. Denna metod visar också hur en drog-eluting stent för luftvägarna kan placeras transorally, i motsats till tidigare studier där stent implanterades kirurgiskt.

Denna studie visar en mycket användbar plattform för stent utveckling och testning i en liten djurmodell. Emellertid, andra faktorer för användning i mänskliga försökspersoner måste övervägas. Med tanke på den fasta och stela karaktären av stent det sannolikt inte kan placeras genom en kanaliseras flexibelt bronkoskop men kommer att behöva placeras transorally med direkt laryngoskopi och stel bronkoskopi. Helst skulle stent placeras efter ballong dilatation av luftvägarna för att lindra restenos. Från prospektiva patientsäkerhet, potentialen för stent att migrera är en stor oro eftersom det kan potentiellt leda till livshotande luftvägs angrepp. Sekundärt, risken för stent obstruktion sekundärt till ansamling av slem eller blod måste också övervägas. Ytterligare testning och utveckling behövs för att minimera dessa risker.

Framtida studier kan använda denna metod för att testa olika läkemedel i PLLA-PCL blandning för att förstå ytterligare hur olika immunsuppressiva behandlingar kan lindra ärrbildning i luftstrupen. Eftersom sådana stent kan placeras på möss kan man också testa att använda en större kohort av möss eller möss med genetiska modifikationer av ärr bildande gener. Framtida experiment kan också omfatta förståelse av förändringar i luftstrupen som kan inträffa efter kronisk implantation av stent (3-6 månader) och förändringar i lumen av luftstrupen samt genuttrycksprofiler av inflammatoriska markörer och fibros Markörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Nationella institutet för dövhet och andra kommunikationsstörningar i National Institutes of Health under tilldelning nummer 1K23DC014082 och 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Denna studie stöddes också ekonomiskt av det Triologiska sällskapet och American College of kirurger (Alexander Hillel), American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) och ett T32 NIDCD Training Grant (Kevin Motz).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter Jelco 4050
Dichloromethane Sigma Aldrich 270997-100ML
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5 Available from other vendors as well.
PDLGA Sigma Aldrich 739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30) Evonik Industries AG 65053
Rapamycin LC Laboratories R-5000
2. Animal surgery
Wire brush Mill-Rose Company 320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer Abcam ab93678 Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI Cell Signaling 8961S
DMEM ThermoFisher Scientific 11965-092 Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum) MilliporeSigma F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody Lif technology a11008
Goat anti-rat-633 antibody Lif technology a21094
Hydrophilic plus slide BSB7028
PBS ThermoFisher Scientific 100-10023 Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody Abcam ab5690
Rat antiF4/80 antibody Biolengend 123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads OMNI International 19-645
Bead Mill Homoginizer OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix Life Technologies 4367659
RNeasy mini kit Qiagen 80404
StepOnePlus Real Time PCR system Life Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

Tags

Bioteknik utgåva 155 läkemedels-eluting stent PLLA-PCL rapamycin laryngotrakeal stenos trakealstenos fibros
Utformning av en biokompatibel drog-Eluting Trakealstent hos möss med Laryngotrakeal stenos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duvvuri, M., Motz, K., Tsai, H. W.,More

Duvvuri, M., Motz, K., Tsai, H. W., Lina, I., Ding, D., Lee, A., Hillel, A. T. Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis. J. Vis. Exp. (155), e60483, doi:10.3791/60483 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter