Summary
Laringotracheal stenoz, trakeal hava yolunu kritik derecede daraltan ve etkili tıbbi tedavilerden yoksun patolojik skar birikiminden kaynaklanır. PlLA-PCL (%70 poli-L-laktit ve %30 polikaprolakon) stent kullanılarak lokal ilaç dağıtım sistemi olarak, trakeada skar proliferünü azaltmaya yönelik potansiyel tedaviler incelenebilir.
Abstract
Laringotracheal darlığı (LTS), subglottis ve trakeanın patolojik olarak daraltması sonucu ekstratorasik obstrüksiyon ve önemli nefes darlığı. LTS trakea yabancı bir cisimden mukozal yaralanma sonuçları, doku hasarı ve ters gider lokal inflamatuar yanıta yol açan, patolojik skar dokusunun birikimine yol açan. LTS tedavisi etkili tıbbi tedavilerin eksikliği nedeniyle cerrahidir. Bu yöntemin amacı LTS ile fareler içine yerleştirmek için minyatür olabilir bir biyouyumlu stent inşa etmektir. Biz bir PLLA-PCL (%70 poli-L-laktit ve% 30 polikaprolakton) yapı optimal biyomekanik mukavemeti olduğunu gösterdi, biyouyumlu, in vivo yerleştirme stent için uygulanabilir, ve ilaç eluting yeteneğine sahip. Bu yöntem lokal inflamasyonu inhibe etmek ve hava yolu fibrozisini azaltmak için çeşitli immünomodülatör ajanları test etmek için bir ilaç dağıtım sistemi sağlar. Stentlerin imalatı 28−30 h sürer ve kolayca çoğaltılarak büyük kohortlarla deneyler yapılmasına olanak sağlar. Burada fibrozis ve kollajen birikimini azaltmada etkinliğini test etmek için stent içinde ilaç rapamisin dahil. Sonuçlar PLLA-PCL çadırgüvenilir rapamisin salınımı gösterdi, fizyolojik koşullarda mekanik olarak stabil olduğunu ve biyouyumlu olduğunu ortaya koymuştur, trakea küçük inflamatuar yanıt indükleyen. Ayrıca, rapamisin eluting PLLA-PCL stentler in vivo trakea skar oluşumunu azalttı.
Introduction
Laringorrakheal darlık (LTS), en sık iyatrojenik post-entübasyon yaralanmasına bağlı olarak trakeanın patolojik olarak daraltılmasıdır. Bakteriyel kolonizasyon kombinasyonu, trakeostomi veya endotrakeal tüpyabancı cisim yanıtı, ve hastaya özgü faktörler anormal inflamatuar yanıtyol açar. Bu maladaptif immün yanıt trakea kollajen birikimine yol açar, trakea ve sonraki darlık luminal daralma ile sonuçlanan1,2. Bu hastalığın mevcut tedavisi öncelikle cerrahi olduğundan, aşırı kollajen birikimine yol açan anormal inflamatuar ve profibrotik yolları hedefleyen tıbbi temelli alternatif bir tedavi paradigması geliştirilmesi incelenmiştir. Rapamisin, hangi mTOR sinyal kompleksi inhibe, immünsupresif etkileri yanı sıra sağlam bir antifibroblast etkisi olduğu gösterilmiştir. Ancak, rapamisin sistemik olarak uygulandığında, yaygın yan etkiler (örn. hiperlipidemi, anemi, trombositopeni)3. Metodolojimizin amacı, bu sistemik etkileri azaltacak hava yolunda kullanılmak üzere yerel ilaç teslimatı için uygun bir araç geliştirmektir. Değerlendirmelerimiz, ilaç dağıtım yapısına verilen yerel immün yanıtın yanı sıra fibroblast fonksiyonunu inhibe etme ve yerel immün mikroçevreyi değiştirme kapasitesini araştırmaya odaklanmaktadır. Hastalığa özgü sonuçlar fibrozis belirteçlerini değerlendiren in vivo testleri içerir.
Biyobozunur ilaç eluting stentler birden fazla organ sistemlerinde hastalığın hayvan modellerinde kullanılmıştır, hava yolu da dahil olmak üzere4. Hava yolu darlığı veya çökme yönetimi için, önceki araştırmalar ilaç kaplı silikon ve nikel bazlı stent kullanmış5. Bir PLLA-PCL yapısı nedeniyle ilaç elüsyon profili ve fizyolojik koşullarda mekanik gücü nedeniyle bu özel yöntem için seçildi 3 haftalık bir süre içinde, hangi önceki yayınlanan çalışmalarda gösterilmiştir6. PLLA-PCL de biyouyumlu ve biyobozunur malzeme zaten FDA tarafından onaylanmış4. Sisplatin ve MMC'yi elüt eden biyouyumlu stentler tavşan ve köpek gibi büyük hayvan modellerinde incelenmiştir. Ancak bu hayvan modellerinde stentler hayvansal bir hastalık modeline yerleştirilmemiş ve transcerevik olarak implante edilmiştir. Bu çalışma, hava yolu yaralanması ve laringgotracheal darlık bir fare modeli transoral yerleştirilen biyouyumlu bir ilaç eluting stent değerlendirmek için benzersiz bir yöntem sağlar. Bir biyouyumlu stent yerel bir immünomodülatör ilaç elutes ve bir murine modelinde çalışma için minyatür olabilir çeviri preklinik araştırma için değerlidir. Diğer malzeme yapıları ile stent kullanımı önceki girişimleriLTSayıran altta yatan iltihabı kötüleştiren sağlam yabancı cisim tepkileri üretti 7 . Bu metodoloji, bizim bilgimize göre, LTS bir murine modelinde stent bazlı ilaç dağıtım sisteminin immünomodülatör ve antifibrotik etkilerini inceleyen türünün ilk ıdır. Murine modeli kendisi trakea üzerinde bir immünomodülatör ilacın etkilerini incelemek için çeşitli avantajlar sunuyor. Genetik olarak modifiye edilmiş fareler ve sağlıklı ve hastalıklı farelerin deneysel kohortları incelenebilir, bu da deneysel tekrarlanabilirliğe yol açabilir ve maliyet etkinliğini artırabilir. Ayrıca, stentin fare trakeasına transoral olarak verilmesi, bu yöntemin çevirisel avantajını daha da vurgulayan, insanlarda böyle bir stentin klinik olarak teslimini taklit eder. Son olarak, ilaç ile PLLA-PCL stent üretilebilir göreceli kolaylığı trakea skar oluşumunu azaltmaya yönelik alternatif ilaç tedavileri sunmak için değişiklikler için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada açıklanan tüm yöntemler Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (MO12M354) tarafından onaylanmıştır.
1. PLLA-PCL rapamisin hazırlanması
- 70:30 PLLA-PCL polimer çözeltileri (içsel viskozite 1.3−1.8 DL/G) iki cam şişe (kapaklı) hazırlayın; Malzeme Tablosu) % 1.0 rapamisin içeren bir şişe ve rapamisin olmadan diğer ile çözümler.
- Bir cam şişe de 70:30 PLLA-PCL 600 mg rapamycin 6 mg ekleyerek polimer çözeltisi içeren% 1.0 rapamisin olun.
- Rapamisin olmadan polimer çözeltisi için (kontrol), sadece cam şişe için 70:30 PLLA-PCL 600 mg ekleyin.
- Bir duman kaputunun altında, her cam şişeye 6 mL diklorometatan ekleyin.
DİkKAT: Diklorometan aşındırıcı bir malzemedir ve sadece cam pipetler kullanılmalıdır. Uygun güvenlik önlemleri kişisel göz koruması ve eldiveniçerir. - Her cam şişeye 120 μL gliserol ekleyin (%2 gliserol çözeltisi için).
NOT: Gliserol eklenmesi stent yapısında artan esneklik ve azalmış sertlik sağlar. - Cam şişeleri yeniden kaplayın ve rapamisin içeren ve rapamisinsiz 70:30 PLLA-PCL'nin 6−12 saat boyunca çözünmesini ve homojenize etmesine izin verin.
NOT: Cam şişeler de daha hızlı çözünme için dönen bir sallayarak platform üzerine yerleştirilebilir.
2. Rapamycin elüsyon testi
- Pipet 1 mL 70:30 PLLA-PCL çözeltisi içeren 1% rapamisin bir cam Petri kabıiçine.
NOT: %1 rapamisin içeren 70:30 PLLA-PCL çözeltisinin bu hacmi 120 g rapamisin içerecek ve her yapıdaki toplam rapamisin miktarını temsil eder. Alternatif hacimler ve konsantrasyonlar kullanılabilir. - 70:30 PLLA-PCL% 1 rapamycin ile cam Petri çanak düz bir disk içine sertleştirmek için izin verin.
- Sertleştikten sonra diski 2 mL fosfat tamponlu saline (PBS, pH 7.4) yerleştirin ve 37 °C'lik bir haznede inküler.
- Her 24 saatte bir PBS (2 mL) toplayın ve değiştirin ve rapamisin içeriğinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizi için toplanan PBS'yi kullanın.
- Kalibre edilmiş bir standart eğri oluşturmak için rapamisin seri seyreltmeleri ile birlikte otosampler enjektörden numuneleri çalıştırmak için bir autosampler ve C18 4,6 cm x 250 mm HPLC sütun kullanın. Her örneği triplicate olarak çalıştırın.
NOT: Test edilecek rapamisin seri seyreltmeleri içerir 10%, 1%, 0.1%, ve 0.01%. - 2.0 mL/dk. Rapamisin için HPLC sırasında set emiciliği 2,0 mL/dk akış hızıile 10/90 hacim/hacimli HPLC sınıfı su ve asetonitrile mobil faz kullanın.
NOT: Şekil 1 14 günlük bir süre içinde rapamisin elution gösterir.
3. Rapamisin-eluting PLLA-PCL murine hava yolu stentlerinin oluşturulması
NOT: In vivo ve in vitro uygulamaları etkileyecek kontaminasyonu önlemek için steril malzemeler ve steril tekniği kullanarak 3.2−3.9 adımlarını uygulayın.
- Bölüm 1'de açıklandığı gibi rapamisin içeren PLLA-PCL solüsyonları hazırlayın.
- Kauçuk balonlu cam pasteur pipeti kullanarak, 22 G florlu etilen propilen bazlı anjiyokateterin venöz kanüle %1 rapamycin içeren 1 mL PLLA-PCL çözeltisi uygulayın (Malzeme Tablosu). Anjiyokateteri bir elinizle tutun ve PLLA-PCL çözeltisini anjiyokateterin üzerine düşürmek için cam pipetkullanın. PLLA-PCL solüsyonu ile anjiyokateterin homojen bir kapsama alanı sağlamak için anjiyokateteri yavaşça döndürün.
NOT: İlk başta PLLA-PCL çözeltisi ince olacaktır, ancak diklorometan anjiyokateter üzerine uygulama sırasında buharlaştınızca, çözelti anjiyokateterüzerine küflenecek daha viskoz hale gelecektir. Uygulama sırasında anjiyokateterin sürekli olarak dönmesi faydalıdır. Bu adım stenttutarlı kalınlığını sağlamak için yavaş ve titizlikle yapılmalıdır. - Dökümlü anjiyokateteri aşağıya bakan anjiyokateterucuucuucu ve kurutmak için cam petri kabının kenarındaki kabza ile desteklendi.
- Stentlerin oda sıcaklığında bir vakum kaputunda 24 saat kurumasını bekleyin(Şekil 2A).
- Altta yatan kateteri hafifçe bükerek ve kalıplanmış stentten kaydırarak stent yapısını altta yatan anjiyokateterden çıkarın(Şekil 2B).
- Döküm işlemi sırasında ortaya çıkabilecek herhangi bir kusur için stenti çevresel olarak kontrol edin. Döküm stentte bir kusur varsa atın.
- Döküm lüzumlu stentin her ucunu ince düz makasla kırpın, böylece kenarlar eksenel dir.
- Lts(Şekil 2C)fare modelinde kullanılmak üzere döküm stentin 3 mm eksenel segmentlerini ince düz makas kullanarak kesin.
NOT: Yaklaşık 8 stent bir döküm anjiyokateter yapılabilir, her 3 mm stent rapamisin 120 μg içeren. - LTS fare modelinde kullanılmak üzere yeni 22 venöz kateter üzerine 3 mm stent yükleyin(Şekil 1).
4. Farelerde laringotracheal stenoz indüksiyonu
- In vivo fare çalışmaları nın yürütülmesinden önce Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden onay alın.
- 9 haftalık erkek C57BL/6'yı intraperitoneal ketamin (80−100 mg/kg) ve ksilezine (5−10 mg/kg) enjeksiyonu yaparak anestezi edin.
NOT: Diğer fare suşları ikame edilebilir, ancak farelerin ağırlığının 20−27 g arasında olması önerilir. - Fareleri deneysel bir gruba randomize etmek (%1 rapamisin içeren PLLA-PCL stentiçeren kemomekanik yaralanma) ve iki kontrol grubu: 1) PLLA-PCL stentin intibakı ile kemomekanik yaralanma, 2) kemomekanik yaralanma bir stent yerleştirilmesi.
- Bir fareyi cerrahi platforma supine pozisyonunda yerleştirin. Merkezi kesici dişlerin etrafında döngü tarafından servikal omurga genişletmek için platformun üst yapıştırılmış iplik küçük bir döngü kullanın.
- Farenin ellerini ve bacaklarını 2 inçlik bant parçalarını kullanarak masaya yapıştırın. Yeterli anestezi olduğundan emin olmak için fare pençesini kısTırın.
- Cerrahi bölge daha sonra hazırlanır. Örten kürk çıkarılmalı ve cilt üç kez temizlenmelidir (alternatif iyot veya klorheksidin alkol veya seyreltilmiş cilt dezenfektanı ile bodur). Alan dökümlü olmalı ve steril eldivengiyilmelidir. Sterilize edilmiş aletler kullanılmadığında steril bir yüzeye serilmelidir.
- İnce kavisli iris makası kullanarak farenin boynunda 1,5 cm'lik orta çizgi dikey kesi yapın. Üstteki timusu bölün ve trakeayı görselleştirmek için ortaya çıkan iki lobu lateralize edin. Üstteki sternohyoid ve sternotiroid (kayış) kaslarını iki taraflı olarak üstün eki olarak bölün.
NOT: Tüm laringgotracheal kompleksi bundan sonra tamamen maruz kalmalıdır. - Gırtlaktan trakeaya 22 G anjiyokateter geçirin. Anjiyokateterin doğru yerleştirilmesine yardımcı olmak için farenin ön gırtlağa basınç uygulamak için küçük forceps kullanın. Doğru yerleşim (özofagus dışı) sağlamak için trakea yoluyla beyaz anjiyokateter görselleştirin.
NOT: Fare trakeası son derece incedir ve beyaz anjiyokateter yarı saydam trakea ile görselleştirilmiş olacaktır. - Eklenen anjiyokateterden bleomisin kaplı tel fırçayı geçirin.
- Anjiyokateteri yavaşça geri çekin, böylece sadece tel fırça trakeada kalır.
- Trakeaüzerinde ince priteler kullanarak tel fırça ile trakeal lümeni mekanik olarak bozmak için karşı basınç uygulayın.
- Anjiyokateteri tel fırçanın üzerinde trakeaya tekrar yerleştirin.
- Tel fırçasını çıkarın ve bleomisini yeniden uygulayın.
- Adımları 4,8−4,12 toplam 5x tekrarlayın. Her uygulama arasındaki fırçaya bleomisin uygulayın.
NOT: Bu modelin doğrulanması ve açıklaması Hillel ve ark.8'debulunabilir. - Anjiyokateteri fare trakeasından çıkarın.
NOT: Stent konulmazsa kesi doku tutkalile kapatılabilir.
5. Farelerde transoral PLLA-PCL stent yerleşimi
- Boş bir 22 G anjiyokateter üzerine bir 3 mm döküm stent yükleyin (Şekil 3A).
NOT: Stent anjiyokateterin ucundan 5 mm uzakta olmalıdır. - 3 mm döküm stent üzerine ince siyah dikey bir çizgi çizin.
NOT: Bu çizgi, trakeada stentin daha iyi görüntülenmesine olanak tanır. - Stent ile önceden yüklenmiş anjiyokateter ile fareyi transorsel olarak entübasyona dönüştürün.
- Transservikal kesi yoluyla trakeadaki anjiyokateterdeki stenti görselleştirin (Şekil 3B).
NOT: Trakea çok incedir ve stentteki siyah boyanın trakea ile görüntülemesine olanak sağlar. Doğru trakeal yerleşimini onaylamak için bunu kullanın. - Ince forceps ile transservikal kesi ile trakea sürükleyerek yerinde stent tutun.
- İnce pratisyen ler ile stent üzerinde bir kavrama korurken anjiyokateter transorally çıkarın.
NOT: Anjiyokateter çıkarıldığında lümeni ezmemek için stent için çok fazla kuvvet uygulamamak son derece önemlidir. Ancak, stentanjiyokateter ile çıkarılmadığından emin olmak için yeterli kuvvet gereklidir. Stentin trakeadaki yerini ve yerleşimini görselleştirmek için 0.8 mm'lik bir siyalendoskop kullanılabilir. - Transservikal kesiyi doku tutkalı ile kapatın.
- Her fareyi kafesine geri koymadan önce orijinal etkinlik düzeyine geri kurtarmasına izin verin.
6. Örneklerin histolojik hazırlanması
- 7, 14 veya 21 gün sonra hayvan protokolü başına servikal çıkığı ile inhale anestezi ve kurban fareler ile fareler anestezi.
NOT: Çalışmanın kronikliğine göre farklı zaman aralıkları kullanılabilir (örneğin, 28, 30 gün, vb.). - 4.4 ve 4.5 adımlarında açıklandığı gibi fareyi cerrahi platforma yerleştirin.
- İnce kavisli iris makası kullanarak fareüzerindeki boyun kesisini yeniden açın.
- Adım 4.6 başına nefes borusunu açığa çıkar.
- İnce kavisli iris makası kullanarak distal trakeayı stent seviyesinin altına bölün.
- Proksimal trakeayı gırtlağı nağmelerin altına ve stentin üzerine ince kavisli iris makası kullanarak bölün.
NOT: Trakeanın toraksa çekilmesini önlemek için önce distal trakeanın bölünmesi önemlidir. - Bölünmüş trakeayı yemek borusundan arka arkaya ayırın ve fareden trakeayı çıkarın.
NOT: Stentler fare trakeası içinde tutulmaya devam eder. - Stenti trakeadan çıkarın ve %10 formalinle 24 saat boyunca düzeltin.
- Formalin-sabit fare trakea örneklerini distal uç odaklı parafine yerleştirin, böylece trakeanın eksenel kesimleri bir sonraki adımda yapılabilir.
- Bir mikrotom kullanarak parafin gömülü fare trakeasının 5 m'lik kesitlerini kesin.
NOT: Örnekler distal trakeadan başlayarak eksenel olarak kesilmelidir. - Numunenin uzunluğu boyunca her 250 μm'de bir 5 μm temsil ilerle.
- Her temsilci bölümünde tam H&E lekesi.
- 3 dakika boyunca slayt başına ksilen 2x yerleştirerek slaytlar deparaffinize.
- 2 dakika için% 100 etanol slaytlar yerleştirin, 2 dakika için% 95 etanol, ve 2 dakika için% 70 etanol rehydrate için.
- 2 dakika boyunca akan musluk suyu ile slaytlar yıkayın.
- 3−5 dakika hematoksilin slaytlar leke.
- 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile slaytlar yıkayın.
- 1 dakika için% 1 asit alkol slaytlar yerleştirin.
- 1 dakika boyunca akan musluk suyu ile slaytlar yıkayın.
- 30 s için% 0.2 amonya su durulayın.
- 5 dk. Daldırma için çalışan musluk suyunda slaytlar durulayın 95% etanol 10x.
- Eozin leke 30 s için eozin phloxine slayt yerleştirerek.
- 5 dakika boyunca% 95 etanol yerleştirerek slaytlar dehydrate, 5 dakika için mutlak etanol 2x takip.
- 5 dk için ksilene 2x yerleştirin.
- Slaytları ksilen tabanlı montaj ortamına monte edin.
- Hillel ve ark.8'deaçıklandığı gibi lamina propria kalınlığını ölçün.
7. Stent biyouyumluluk in vivo
- 6.1−6.4 adımlarında olduğu gibi doku kesitlerini hazırlayın. Bu trakeal kesitlerden stenti çıkarmayın ve trakeanın lümeni içindeki stentin konumuna göre iltihap değişimlerini görselleştirin.
- Stentin akut yabancı cisim yanıtını belirlemek için CD3 ve F4/80 belirteçleri kullanarak makrofaj ve T hücre aktivitesini gözlemleyiniz.
NOT: Stentin akut inflamatuar reaksiyonunu belirlemek için diğer belirteçler de kullanılabilir. - Parafin gömülü trakeanın 5 μm kesitini ticari olarak mevcut hidrofilik artı slaytlar üzerine edinin(Malzeme Tablosu). Her slayta iki bölüm yerleştirin.
NOT: Bu bölümler plla-PCL stentin yerleştirildiği trakeanın bir bölgesinden olmalıdır.
- Stentin akut yabancı cisim yanıtını belirlemek için CD3 ve F4/80 belirteçleri kullanarak makrofaj ve T hücre aktivitesini gözlemleyiniz.
- Slaytları 5 dk boyunca ksilenin 2x'e yerleştirin.
- Slaytları 3 dakika boyunca %100 etanol 2x'e yerleştirin.
- 1 dakika için% 95 etanol slaytlar yerleştirin.
- Onlar antijen alma tampon batırılır böylece bir histoloji boyama raf slaytlar yerleştirin(Malzeme Tablosu) ve daha sonra 20 dakika kaynar su ile bir sebze buharlı yerleştirin.
- Buniçin boyama raflarını buhardan çıkarın ve antijen alma tamponu atın.
- Arabelleği 1 mL PBS ile değiştirin.
- 1 dakika için ıslak bir boyama kutusuna slaytlar yerleştirin.
- PBS atın ve 30 dakika için% 10 FBS ile Dulbecco modifiye kartal orta (DMEM) ile slaytlar kuluçka.
- DMEM atın ve farklı türlerde yetiştirilen iki birincil antikorkarışımı ekleyin. Kaydırakları parafin film ile kaplayın ve karanlık bir odada gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu protokolde tavşan anti-CD3 ve sıçan anti-F4/80(Malzeme Tablosu)kullanılmıştır. - 5 dakika PBS 3x slaytlar yıkayın.
- DMEM'de seyreltilmiş birincil antikor türlerine özgü ikincil antikorlarla(Malzeme Tablosu)slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 0,5−1 saat boyunca %10 FBS ile inküler.
- PBS 3x'teki slaytları karanlıkta 5 dakika yıkayın.
- 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile montaj ortamı bir damla ile kapakları üzerinde slaytlar monte. Slaytları karanlıkta 20 °C veya 4 °C'de saklayın.
- Bir lazer taramalar konfokal mikroskop ve fotoğraf üzerinde lekeli slaytlar gözlemleyin.
- Yaralanmamış trakea ile karşılaştırıldığında DAPI ve ilgi antikorları ile boyama hücrelerinin toplam sayısını ölçmek.
8. Fare trakea nicel gen ekspresyonu analizi
- 6.1−6.7 adımlarında açıklandığı gibi fare trakeası toplayın ve stenti çıkarın.
NOT: Hasat edilen fare trakeaları -80 °C'lik bir dondurucuda 2 yıla kadar saklanabilir. - Adım 8.1'de hasat edilen trakeal dokuyu ince makas kullanarak kurutun ve ticari olarak mevcut kolon tabanlı RNA ekstraksiyon kitinin bir parçası olarak 1,4 mm seramik boncuklu boncuk değirmeni homogenizer(Malzeme Tablosu)kullanarak daha da homojenleştirin (Malzeme Tablosu).
NOT: Boncuk değirmeni homogenizer ayarları = 6 m/s'de bir 40 s döngüsü. - Üreticinin talimatlarına göre kolon bazlı ekstraksiyon ve saflaştırma kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak trakeal lysate'den RNA ayıklayın.
- Her numuneden rna'yı bir spektrofotometre(Malzeme Tablosu)kullanarak ölçün.
NOT: RNA saflığı 260/230 nm oranı kullanılarak, saf RNA numunesi 2.0 ile değerlendirilir. - Ters transkriptaz(Malzeme Tablosu)ve aşağıdaki ayarlara sahip bir termocycler kullanarak çıkarılan RNA'dan tamamlayıcı DNA oluşturun: 25 °C'de 5 dk (priming), 30 dk için 46 °C (ters transkripsiyon) ve 1 dk için 95 °C (ters transkripsiyon) için 95 °C.
- Kantitatif gerçek zamanlı PCR'de kullanılmak üzere 10−25 ng/mL konsantrasyonuna RNase içermeyen su ile tamamlayıcı DNA örneklerini seyreltin.
- Tamamlayıcı DNA'nın 1 μL'sini (10−25 ng/mL) 10 μL PCR mastermix(Malzeme Tablosu),8 μL ddH 2 O ve 0,5 μL ddH2O ve 0,5 μL'lik 10 μM ileri ve ters astarları 96 kuyulu pcr plakanın(Malzeme Tablosu)bir kuyuda ilgi geni için karıştırın.
NOT: Her kuyunun toplam hacmi 20 μL olmalıdır. 96 kuyu plakası üzerindeki her kuyuda sadece bir örnek ve bir gen bulunmalıdır. - İlgi çeken tüm genler için 8.1-8.7 adımlarını tekrarlayın ve her bir gen için her bir örneği triplicate olarak çalıştırın.
NOT: Kollajen 1, kollajen 3 ve referans gen β-aktin için gen-spesifik ileri ve ters astarlar(Malzeme Tablosu)ve referans gen β-aktin yaygın fibrozis belirteçlerini araştırmak için kullanılır. - 96 kuyu plakasını gerçek zamanlı kantitatif PCR makinesine yerleştirin ve aşağıdaki protokolü başlatın: 95 °C'de 15 s ve anneal için denatüre ve 60 °C'de 40 devir için 60 s'de uzatın.
- Her bir ilgi geninin gen ürün tespiti için döngü eşik değerini (BT) tüm numuneler için referans gen β-aktin için BT değerine normalleştirin ve her GOI için bir ΔCT elde edin. Ardından, δΔCT oluşturmak için işlenmiş ve işlenmemiş numuneler için her GOI için ΔCT değerlerini karşılaştırın.
NOT: Döngü eşiği, önceden belirlenmiş bir gen ürünü miktarı (ΔRn) bulunduğunda amplifikasyon eğrisindeki noktadır. Her reaksiyon için ΔRn değeri ilgi her gen için belirlenmeli ve amplifikasyon eğrisinin doğrusal kısmına düşmelidir.
NOT: ΔCT = CT (GOI) – CT (referans gen); ΔΔCT = ΔCT (tedavi) – ΔCT (işlenmemiş). - 2ΔΔCThesaplayarak kıvrım değişiminin bir ifadesi olarak tedavi edilen ve tedavi edilmemiş numuneler arasındaki gen ekspresyonundaki göreceli değişimi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan rapamisin yüklü biyobozunur PLLA-PCL stent yapısı fizyolojik koşullarda tutarlı ve öngörülebilir bir şekilde rapamisin eluting yeteneğine sahip oldu(Şekil 1). Şekil 2, LTS'nin bir murine modelinde kullanılmak üzere 22 G anjiyaterin etrafına serpişne plla-PCL stentini göstermektedir. Trakeada rapamisin elusiyon etkilerinin fibrozisin zayıflatılmasında etkili olup olmadığını belirlemek için, fibrozis ile ilgili gen ekspresyonundaki ölçülen değişiklikler ve akut inflamasyon belirteçleri gen ekspresyonu analizi, akış sitometrisi, immünofiforesans ve ELISA ile değerlendirilebilir. Yukarıda açıklanan yöntemle farenin trakeasına minyatür leştirilmiş bir stentin başarılı bir şekilde yerleştirilmesi gösterilmiştir. Yöntemin şemaları Şekil 3'tegösterilmiştir. Şekil 4, yarı saydam fare trakeası ile görselleştirilen stentteki siyah belirteçle gösterildiği gibi trakeada yerinde minyatürleştirilmiş biyouyumlu stenti gösterir. İlk deneylerde, stentin trakeaya yerleştirisini doğrulamak için 0.8 mm siyalendoskop kullanılması yararlı oldu. 21 gün sonra, stentin transoral yerleşiminin etkili olduğunu ve stentin ilk yerleştirildiği konumdan göç etmediğini doğrulamak için, stentin yerleşimini belirlemek için boyun kesisi yeniden açılmıştır. Şekil 4B'degösterildiği gibi, stentin siyah boya belirteci stentin trakeadaki konumunu koruduğunu göstermiştir. Stent ile 21 günlük tedaviden sonra trakeanın rezeksiyonu Şekil 4C'degösterilmiştir.
Akut ve kronik inflamasyon belirteçleri için immünofloresan boyama kullanılarak yapılan biyouyumluluk testinin temsili görüntüleri Şekil 5'tegösterilmiştir. Bu plla-PCL stent yapısı (rapamisin olmadan) yerleşimden sonra mevcut immün hücrelerin en az sayıda tarafından belirlenen immünreaktif olmadığını gösterdi. Bu yöntemde normal yaralanmamış trakeaların kullanıldığını ve yapının kendisine verilen inflamatuar yanıtı belirlemek için rapamisin içermeyen PLLA-PCL stentinin konulduğunu belirtmek önemlidir.
Sonra, rapamisin eluting PLLA-PCL stent izleri hafifletici etkili olup olmadığını belirlemek için, daha önce akut inflamasyon ve fibrozis belirteçlerinde gen ekspresyonu değişiklikleri gösterdi6. Özellikle 90.3 kat azaltma vardır (SEM ± 26.0; n = 4; p < 0.01) gün 4 col1a1 azalma yanı sıra akut inflamatuar belirteçleri INF-γ, CD11b, Arg-1, ve IL-1B6. Bazı genler için kıvrım değişimi farklılıkları önemli olmasa da, daha büyük bir fare kohortu ile önemi elde edilebilir. Uyuşturucu elution histolojik olarak nedeniyle trakeada değişiklik olup olmadığını veya stent tarafından radyal kuvvet eforu nedeniyle trakeada değişiklik olup olmadığını belirlemek için, rapamisin-eluting stentleri olmayanlara göre rapamycin-eluting stentleri ile tedavi edilen trakealarda lamina propria genişliğinde bir azalma olduğunu gösterdik6.
Şekil 1: Rapamycin PLLA-PCL elüsyonu. PLLA-PCL yapısı içeren 1% rapamycin 14 günlük bir süre içinde rapamisin tutarlı ve öngörülebilir serbest gösterdi. Veri noktaları örneklenmiş elüsyonun ortalama ± SEM'sini temsil eder (n = 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stent döküm. (A)PLLA-PCL çözeltisinin 22 G anjiyokateter etrafında kurumasına izin verildi. (B) Döküm daha sonra anjiyokateter çıkarıldı. (C) Stentler fare modeli6'dakullanılmak üzere 3 mm uzunlukta kesildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde transoral stent yerleştirilmesi. (A) Stent boş bir anjiyokatete yüklendi ve transorada trakeaya yerleştirildi. (B) Stent üzerindeki siyah boya işareti, fare trakeasındaki konumunu doğrulamak için transservikal kesi ile görülebilir. (C) Hastalıklı fare trakeasında stentin yerinde temsili çizimi6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Stentin yerinde görüntüleri. (A-B) Siyah boya işaretleri ile stent mindik trakea yerinde görülebilir. (C) 21 gün6hasat sonrası stent ve murine laringotracheal kompleksi bir görüntü . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Stent biyouyumluluğu. F4/80 (makrofajlar, kırmızı kromofor) ve CD3 (yeşil kromofor, T-lenfositler) için 4. Bu kontrastlar ile (C) yaralı bir trakea, kalınlaşmış lamina propria ve pozitif F4/80 ve CD3 boyama ile çok sayıda hücre varlığı ile6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarılı bir şekilde inşa etmek ve vivo bir ilaç eluting stent kullanmak için en kritik adımlar 1) arzu edilen ilaç elüsülasyon oranı için optimal PLLA-PCL oranını belirleme, 2) eluted için ilaç uygun konsantrasyonu belirlenmesi, 3) stent kalıplama in vivo kullanım için anjiyokateter etrafında, ve 4) transoral ölümcül hava yolu tıkanıklığı neden olmadan LTS indüksiyon sonrası fareler içine stent teslim.
Hava yolu hastalığının hayvan modellerinde stent kullanarak ilaç teslimi için çeşitli yöntemler olmakla birlikte, hastalıklı bir mürin modelinde ilaç teslimi yapabilen biyouyumlu bir stent geliştirilmesi bir ilktir. İlaç dağıtımı için bu yöntemin geliştirilmesinde yöntemde çeşitli değişiklikler yapılmıştır. Mekanik olarak trakeaya yerleştirilecek kadar sert olan stentlerin yapılması ve fizyolojik salgılara rağmen trakeada kalması için uygun PLLA-PCL bileşiminin belirlenmesi önemliydi. PLLA-PCL bir 70:30 kompozisyon başarılı bir şekilde rapamycin predicable doğada elute olabilir, çünkü bir anjiyokateter kalıp ile stent yapımı için karar verildi, bizim fare modelinde güvenli ve güvenilir bir şekilde yerleştirilir, ve fizyolojik bozulmadeğil Koşul -ları. Bu yöntemin zor ve üreticiye bağlı bir kısmı anjiyokateterlerin etrafına stent iperyor. Başlangıçta in vivo stentlerin yapımında, 22 G anjiyokateter cam pipetin ucuna yerleştirildi ve polimer çözelti anjiyokateter ile cam pipet arasındaki boşluğa dökülerek arasında bir döküm oluşturdu. Ancak bu yöntemden kaynaklanan stentlerin duvarı genellikle çok inceydi ve nefes borusuna güvenilir bir şekilde yerleştirilemedi. Anjiyokateter üzerinde stent kalıplama için mevcut yöntemin bir sınırlama tutarlılık için üreticiye bağımlılık, ve stent üretiminde homojenlik sağlamak için detay titiz dikkat ihtiyacı. Döküm stentler arasındaki kalınlıkta varyans potansiyelinin gelecekteki çalışmalarda ele alınması gerekmektedir. Daha ileri çalışmalarla, anjiyokateter ile cam kaplama arasındaki boşluğun 50 m olması gibi başka bir cam veya aşındırıcı olmayan malzeme ile çevrili 22 G anjiyokateter için bir kalıp tasarlamayı umuyoruz. trakea içine kolay yerleştirme için.
Etkilenen trakea ilaç teslim ilerlemek için biyouyumlu bir stent kullanarak çeşitli faydaları vardır. Genel olarak, ilaç içeren bir polimer ile kaplanmış metal veya silikon oluşan stentler granülasyon dokusu ve trakea zaten yaralı bir kısmına daha inflamatuar yanıt üretmek için gösterilmiştir. Tamamen biyo-uyumlu biyomalzemeden yapılmış bir stent kullanımını sorgulayan ve aynı zamanda güvenilir bir şekilde immünomodülatör bir ilaç salan bu yöntem avantajlıdır. PLLA-PCL stent de murine modelinde biyouyumlu olduğu gösterilmiştir ve akut inflamatuar yanıt ortaya almaz. Fibrozisle mücadele edebilen ilaçların incelenmesinde, plla-PCL gibi biyouyumlu malzemelerden oluşan bir stent in bu yöntemde açıklandığı gibi kullanılması faydalıdır.
Kullanılabilir stentler oluşturmak için bu yöntemi kullanarak avantajı ve kolaylığı PLLA-PCL bileşimi çeşitli olabilir, bileşimi karışık ilaç için serbest profillerde farklılıklar için izin. PLLA-PCL malzeme önceki çalışmalar PLLA-PCL karışımları varyasyon malzemenin daha fazla bozulmaya yol açabilir, daha hızlı ilaçserbestbırakılması için izin 9 göstermektedir. Ayrıca, bu yöntemi kullanarak farelerde yerleştirilebilir stent oluşturmak için avantajlıdır, hava yolu hastalığı için en stent çalışmaları büyük hayvanlarda yapıldıgibi 10,11,12. Farklı hastalık paradigmaları için modifiye edilebilir ve hastalıklı bir durumda ilaç eluting stent test için izin bir fare modelinin kullanımı idealdir. Hastalıklı bir durumda ilaç eluting stent test ve hastalığı olmayan hayvanlarda bu etkinliğini karşılaştırmak için mümkün daha fazla deneysel titizlik sağlar. Bu yöntem aynı zamanda stentlerin cerrahi olarak yerleştirildiği önceki çalışmaların aksine, hava yolu için ilaç elüt stentinin transoral olarak nasıl yerleştirilebildiğini de göstermektedir.
Bu çalışma, küçük bir hayvan modelinde stent gelişimi ve test edilmesi için çok uygun bir platform olduğunu göstermektedir. Ancak, insan deneklerde kullanılmak üzere diğer faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. Stentin sağlam ve sert yapısı göz önüne alındığında kanalize esnek bronkoskoptan geçirilemez ancak doğrudan laringoskopi ve rijit bronkoskopi ile transoral olarak yerleştirilmesi gerekir. İdeal olarak, stent retiyoloz azaltmak için hava yolunun balon dilatasyonu sonra yerleştirilir. Hasta güvenliği prospektif itibaren, stent in göç potansiyeli potansiyel olarak hayatı tehdit eden hava yolu uzlaşmayol açabilir büyük bir endişe kaynağıdır. İkinci olarak, mukus veya kan birikimine sekonder stent tıkanıklığı potansiyeli de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu riskleri en aza indirmek için daha fazla test ve geliştirme gereklidir.
Gelecekteki çalışmalar plla-PCL karışımı farklı ilaçlar test etmek için daha farklı immünsupresif tedaviler trakea skar oluşumunu azaltmak nasıl daha fazla anlamak için bu yöntemi kullanabilir. Bu tür stentler farelere yerleştirilebildiği için, daha büyük bir fare veya fare kohortu kullanılarak skar oluşturan genlerde genetik modifikasyonlar da test edilebilir. Gelecekteki deneyler de stent kronik implantasyonu sonra oluşabilir trakea değişiklikleri anlamak içerebilir (3-6 ay) ve trakea lümen değişiklikleri yanı sıra inflamatuar belirteçleri ve fibrozis gen ekspresyonu profilleri Işaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü ödül numaraları 1K23DC014082 ve 1R21DC017225 (Alexander Hillel) altında. Bu çalışma aynı zamanda Trioloji Derneği ve American College of Surgeons (Alexander Hillel), American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) ve T32 NIDCD eğitim bursu (Kevin Motz) tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
