Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Het doel van dit protocol is om temperatuur te gebruiken om de stroomsnelheden van driedimensionale actieve vloeistoffen te regelen. Het voordeel van deze methode maakt het niet alleen mogelijk om stroomsnelheden in situ te reguleren, maar maakt ook dynamische controle mogelijk, zoals periodiek afstemmen van stroomsnelheden op en neer.

Abstract

We presenteren een methode voor het gebruik van temperatuur om de stroomsnelheden van kinesin-driven, microtubulusgebaseerde driedimensionale (3D) actieve vloeistoffen af te stemmen. Deze methode maakt het mogelijk om de snelheden in situ te tunen zonder de noodzaak om nieuwe monsters te vervaardigen om verschillende gewenste snelheden te bereiken. Bovendien maakt deze methode de dynamische controle van de snelheid mogelijk. Fietsen de temperatuur leidt de vloeistoffen te stromen snel en langzaam, periodiek. Deze bestuurbaarheid is gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van de kinesin-microtubulusreactie, waarbij een gecontroleerd gemiddelde debietbereik van 4 – 8 μm/s wordt aangetoond. De gepresenteerde methode opent de deur naar het ontwerp van microfluïdische apparaten waarbij de stroomsnelheden in het kanaal lokaal instelbaar zijn zonder dat er een ventiel nodig is.

Introduction

Actieve materie wordt onderscheiden van conventionele passieve materie vanwege zijn vermogen om chemische energie om te zetten in mechanisch werk. Een materiaal dat dergelijke capaciteiten bezit, kan bestaan uit levende of niet-levende wezens zoals bacteriën, insecten, colloïden, granen en cytoskelet filamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Deze materiële entiteiten communiceren met hun buren. Op grotere schaal organiseren ze zichzelf in turbulente-wervelingen (actieve turbulentie) of materiaalstromen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Een goed begrip van de zelforganisatie van de actieve materie heeft geleid tot verschillende toepassingen in moleculaire shuttles, optische apparaten en parallelle berekening21,22,23. Om toepassingen naar het volgende niveau te brengen, is controle buiten zelforganisatie vereist. Palacci et al. ontwikkelde bijvoorbeeld een colloïde met hematiet-omhulde die zelfrijdend was bij blootstelling aan handmatig gecontroleerd blauw licht, wat leidde tot het ontstaan van levende kristallen24. Morin et al. richtte de controle op rollende Quincke colloïden op met behulp van een afstembare externe elektrische veld, resulterend in colloïdale massaal in een race track-achtige kanaal25. Deze eerdere werken tonen de rol van lokale controle in toepassingen aan en geven de kennisbasis van de actieve materie door.

In dit artikel richten we ons op de bestuurbaarheid van kinesin-driven, microtubulus (MT)-gebaseerde 3D-actieve vloeistoffen. De vloeistoffen bestaan uit drie hoofdbestanddelen: MTs, kinesin moleculaire motoren, en depletanten. De depletie induceren een uitputting kracht om de MTs te bundelen, die later overbrugd worden door motor clusters. Deze motoren lopen langs de MTstoward het plus-uiteinde. Wanneer een paar overbrugd mtsis Antiparallel, lopen de corresponderende motoren in tegengestelde richtingen. Echter, de motoren zijn gebonden in een cluster en zijn niet in staat om uit elkaar te lopen, zodat ze coöperatief glijden paren van MTs (interfilament glijden, Figuur 1a). Deze schuif dynamiek accumuleren, waardoor bundels van MTsto zich uitstrekken tot hun knik instabiliteit punt en breken (extensile bundels, Figuur 1B)26. De gebroken bundels worden gegloeid door de depletie kracht, die zich vervolgens weer uitstrekt, en de dynamiek herhaling. Tijdens het proces van de herhalende dynamiek roeren de bundel bewegingen de nabijgelegen vloeistof, inducerende stromen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van doping met micron-schaal tracers (Figuur 1C). Sanchez et al. en Henkin et al. hebben de gemiddelde snelheden van tracers gekarakteriseerd, bevinding dat de snelheden afstelbaar waren door de concentraties van adenosinetrifosfaat (ATP), depletanten, motor clusters en MTs19,27te variëren. Echter, dergelijke tunability bestond alleen vóór de actieve vloeistof synthese. Na de synthese ging de toenability verloren en de vloeistoffen zelf organiseerden ze op hun eigen manier. Om actieve vloeistof activiteit na synthese te regelen, rapporteerde Ross.et al. een methode met behulp van de lichtgeactiveerde door dimerisatie van motor eiwitten, waardoor vloeistof activiteit in-en uitgeschakeld kan worden met behulp van licht28. Terwijl lichtsturing handig is in termen van het lokaal activeren van de vloeistoffen, vereist de methode het herontwerpen van de structuren van motor eiwitten, samen met het wijzigen van de optische paden in een microscoop. Hier bieden we een eenvoudig te gebruiken methode voor het lokaal beheersen van vloeistofstromen zonder Microscoop modificatie, terwijl de motorische structuur intact blijft.

Onze methode voor het lokaal afstemmen van de actieve vloeistofstroom is gebaseerd op de Arrhenius-wet omdat de kinesin-MT-reactie is gemeld te verhogen met temperatuur29,30,31,32. Onze eerdere studies toonden aan dat de temperatuurafhankelijkheid van de gemiddelde snelheid van een actieve vloeistofstroom de Arrhenius-vergelijking volgde: v = a exp (-EA/RT), waarbij a een pre-exponentiële factor is, R de gasconstante is, EA de activeringsenergie, en T de systeemtemperatuur33. Daarom is de vloeistof activiteit gevoelig voor de temperatuur omgeving en moet de systeemtemperatuur consistent zijn om de motorprestaties te stabiliseren, en bijgevolg de vloeistofstroom snelheid34. In dit artikel demonstreren we het gebruik van de temperatuurafhankelijkheid van de motor om de stroomsnelheden van actieve vloeistoffen continu af te stemmen door de systeemtemperatuur aan te passen. We demonstreren ook de bereiding van een actief vloeistofmonster, gevolgd door het monteren van het monster op een Microscoop-fase waarvan de temperatuur via computer software wordt geregeld. Het verhogen van de temperatuur van 16 °C tot 36 °C versnelt de gemiddelde stromingssnelheid van 4 tot 8 μm/s. Bovendien is de instelbaarheid omkeerbaar: herhaaldelijk verhogen en verlagen de temperatuur sequentieel versnelt en vertraagt de stroom. De Gedemonstreerde methode is toepasbaar op een breed scala van systemen waarbij de belangrijkste reacties gehoorzamen aan de Arrhenius wet, zoals de MT gliding assay29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van MTs

Let op: in deze stap zuiveren we tubulinen van runderhersen weefsel. Runderhersenen kunnen een variant Creutzfeldt-Jakob-ziekte (vCJD)35veroorzaken. Daarom moeten het hersen afval en aanverwante oplossingen, flessen en pipetpunten worden opgevangen in een bioafvalzak en worden afgevoerd als biologisch gevaarlijk afval volgens de regels van de instelling.

  1. Reinig tubulinen van runderhersenen (gewijzigd van Castoldi et al.36).
    1. Vervoer ongeveer 1,5 kg verse runderhersenen van een plaatselijk slachthuis naar een koude kamer in de Universiteit. Bewaar tijdens het transport de hersenen in fosfaatbuffer (20 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,2) op ijs.
      Opmerking: om het uiteindelijke rendement van tubuline te maximaliseren, is de initiële hoeveelheid functionele tubuline in het verse hersenweefsel de sleutel. Frisser hersenen bevatten meer functionele tubulin. Om de meest verse hersenen uit het slachthuis te verkrijgen, raden we aan om de slager te vragen om de hersenen van de meest recent geslachte koeien te voorzien. Hersenen moeten niet ouder zijn dan 3 h bij het starten van de procedure, omdat het verkorten van de tijd tussen het slachten en de procedure start betere opbrengsten zal opleveren.
    2. Homogeniseren en verduidelijken de hersenen.
      1. Reinig de hersenen met behulp van scalpels te snijden bloedvaten en bindweefsel in kleinere stukken en verwijder ze uit de hersenen met de hand.
        Opmerking: de gereinigde hersenen moeten roze zijn.
      2. Dompel het gereinigde hersenweefsel onder in 1 L depolymerisatie buffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per kilogram hersenen.
      3. Homogeniseer de hersenen met een keuken blender.
      4. Centrifugeer de gehomogeniseerde hersen oplossing bij 10.000 x g en 4 °c gedurende 150 min.
    3. Polymerize MTs (eerste polymerisatie).
      1. Verzamel en meng het supernatant met gelijke hoeveelheden van de volgende oplossingen bij 37 °C: glycerol, hoge-molarity buizen buffer (HMPB: 1 M PIJPEN, 10 mM MgCl2, 20 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoehyl ether)-N, N, n ', N'-tetraazijnzuur [EGTA], pH 6,9)
      2. Voeg 1,5 mM ATP en 0,5 mM calciumguanosine trifosfaat (GTP) toe aan het mengsel.
      3. Incuberen het mengsel bij 37 °C gedurende 1 uur.
    4. Depolymerize MTs (eerste MT depolymerisatie).
      1. Pellet MT door centrifugeren bij 151.000 x g en 37 °c gedurende 30 minuten.
      2. Gooi supernatant weg en regeer elke MT pellet in 10 mL 4 °C DB.
      3. Incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
      4. Roer het mengsel om de 5 minuten met een pipetpunt om de sedimentatie van de MT te voorkomen.
        Opmerking: het mengsel moet in 30 minuten helder worden, wat aangeeft dat de MT-depolymerisatie is voltooid.
    5. Polymerize MTs (tweede MT polymerisatie).
      1. De oplossing wordt verduidelijkt door centrifugeren bij 70.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
      2. Verzamel en meng het supernatant met gelijke volumes van 37 °C glycerol en HMPB.
      3. Voeg 1,5 mM ATP en 0,5 mM GTP toe aan het mengsel.
      4. Incuberen het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    6. Herhaal stap 1.1.4, ter vervanging van hmpb met Brinkley HERMONTAGE buffer (BRB) 80 (80 mm buizen, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8), gevolgd door de klaring van het geclearde mengsel door centrifugeren bij 79.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
    7. Vang het supernatant op. Meet de extinctie van 280 nm met een spectrometer. Bepaal de tubuline-concentratie met de wet bier-Lambert (extinctiecoëfficiënt van tubuline: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Bewaar het eiwit bij-80 °C.
  2. Recycle tubulins (gewijzigd van Castoldi et al.36).
    Opmerking: om de tubuline zuiverheid te verbeteren, wordt de gezuiverde tubuline gepolymeriseerd en opnieuw gedepolymeriseerd.
    1. Polymeriseren de MTs door de gezuiverde tubuline (stap 1.1.7) te mengen met 500 μM dithiotreïtol (DTT) en 20 μM GTP, gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37 °c.
    2. Pellet de MTs.
      1. Plaats 1 mL glycerol kussen (80 mM buizen, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8) in de bodem van een centrifugebuis.
      2. Leg de gepolymeriseerde MTs bovenop het kussen.
      3. Centrifugeer bij 172.000 x g voor 90 min bij 37 °c.
    3. Depolymerize de MTs.
      1. Verwijder de supernatant en het kussen.
      2. Respendeer elke MT pellet in 150 μL van 4 °C MT buffer (M2B: 80 mM buizen, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8).
      3. Inincuberen van het mengsel op ijs gedurende 30 min.
      4. Roer het mengsel elke 5 minuten met een pipetpunt. Het mengsel moet duidelijk worden.
    4. Het mengsel te verduidelijken door centrifugeren bij 172.000 x g en 4 °c gedurende 30 min.
    5. Vang het supernatant op. Meet de eiwitconcentratie. Bewaren bij-80 °C.
  3. Label de tubuline met fluorescerende kleurstof39.
    1. Polymerize de MTs. Meng de gezuiverde tubuline (stap 1.1.7) met 500 μM DTT en 16,7 μM GTP, en inbroed het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    2. Pellet de MTs.
      1. Plaats 1 mL 37 °C hoog-pH-kussen (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 8,6) in een centrifugebuis.
      2. Leg de gepolymeriseerde MTs op het kussen.
      3. Centrifugeer bij 327.000 x g voor 50 min bij 37 °c.
    3. Label tubulin.
      1. Respendeer elke MT-pellet met 700 μL van 37 °C etiketterings buffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 40% v/v glycerol, pH 8,6).
      2. Meng de suspensie met een 10 – 20 molaire overmaat van Far-Red fluorescerende kleurstof gefunctionaliseerd met een succinimidyl Ester.
      3. Inbroed het mengsel bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker, zodat de MTs kan reageren met de ester van de fluorescerende kleurstof.
      4. Stop de etiketterings reactie door de ester van de suspenderen kleurstof met 50 mM K-glutamaat te verzaderen, inbroed gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    4. Pellet het gelabelde MTs: Herhaal stap 1.3.2, vervanging van het hoge pH-kussen met laag-pH kussen (80 mM buizen, 2 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8).
    5. Depolymerize MTs.
      1. Gooi het supernatant en het kussen weg.
      2. Respendeer de pellet in 700 μL van 4 °C M2B.
      3. Inincuberen van de suspensie op ijs.
      4. Roer elke 5 minuten met een pipetpunt tot de oplossing helder is.
    6. Verhelderend de oplossing door centrifugeren bij 184.000 x g en 4 °c gedurende 35 min.
    7. Verbeter de zuiverheid van de gelabelde tubuline-oplossing door stap 1.2.1 – 1.2.4 te herhalen.
    8. Meet de concentratie van eiwitten en fluorescerende kleurstof. Gebruik deze metingen om te bepalen van de tubuline-concentratie en de fracties van gelabelde tubuline, gedefinieerd als de verhouding van de concentraties van fluorescerende kleurstof aan tubuline.
    9. Bewaar de gelabelde tubuline-oplossing bij-80 °C.
  4. Polymeriseren de MTs (overgenomen van Sanchez et al.19):
    1. Meng de gerecycleerde tubuline (stap 1.2.5) met gelabelde tubuline (stap 1.3.9) in een verhouding die een 3% met het label tubuline fractie oplevert.
    2. Meng het mengsel van 8 mg/mL tubuline met 1 mM DTT en 0,6 mM Guanosine-5 ' [(α, β)-methyleno] trifosfaat (GMPCPP), gevolgd door 30 minuten incubatie bij 37 °C.
    3. Na de incubatie, anneal de MTs bij kamertemperatuur in het donker voor 6 h.
    4. Aliquot en bewaren bij-80 °C.

2. synthetiseren kinesin clusters

Opmerking: bacteriën bestaan alomtegenwoordig en kunnen in de media groeien en het bereidingsproces besmetten. Om besmetting te voorkomen, moeten acties met betrekking tot de celculturen (bijv. pipetteren) in de buurt van een vlam worden uitgevoerd. Gereedschappen zoals kolven, pipetten, pipetpunten, media en platen moeten voor gebruik worden geautoclaveerd.

  1. Express kinesin motoren in Escherichia coli40.
    1. Transformeer de cellen.
      1. Pipetteer 1 μL van de K401-BCCP-H6 plasmide in 10 μL van de bevoegde cellen.
      2. Incuberen op ijs gedurende 5 min.
      3. Hitteschok bij 42,5 °C voor 45 s.
      4. Inbroed de cellen op ijs voor 2 min om herstel toe te staan.
      5. Meng de cellen met 300 μL antibioticum vrij 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L gistextract, 16 g/L Tryptone).
      6. Inincuberen de cellen bij 37 °C gedurende 1 uur.
        Opmerking: tenzij gespecificeerd, is het bewaken van de celgroei niet vereist tijdens de incubatie.
    2. Inoculeren plaat media.
      1. Verdeel de celkweek op een 2XYT plaat (10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract, 10 g/L Tryptone, 15 g/L agar, 100 μg/mL ampicilyl, 25 μg/mL chlooramfenicol).
      2. Incuberen de plaat ondersteboven op 37 °C 's nachts.
    3. Inoculeren vloeibare media.
      1. Oogst vanaf de nacht plaat één geïsoleerde kolonie met een pipetpunt.
      2. Werp de punt in een kolf met 50 mL 2XYT.
      3. Inincuberen en schudden van de kweekmedia bij 37 °C en 200 rpm voor 12 – 16 uur.
    4. Vouw de cellen uit.
      1. Meng 2,5 mL celkweek in 500 mL 2XYT.
      2. Inincuberen en schudden van de 500 mL cultuur bij 37 °C en 250 rpm voor 3 – 6 uur.
    5. Eiwit expressie induceren.
      1. Bewaak tijdens de incubatie de celgroei door meting van de extinctie bij 600 nm, waarbij 2XYT als referentie wordt gebruikt. Meet de extinctie elke 60 min, totdat het OD600 = 0,3 bereikt. Meet vervolgens elke 30 minuten de extinctie tot 0,5 – 0,6 bereikt.
      2. Laat de cellen groeien tot de extinctie OD600 = 0,5 – 0,6 bereikt.
      3. Voeg 24 μg/mL Biotine en 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan de celkweek.
        Opmerking: IPTG wordt gebruikt voor het opwekken van de eiwit expressie van de kinesin-motoren, die zijn gelabeld met biotine-carboxyldrager proteïne (BCCP) en zes histidines (H6). De H6 tag wordt gebruikt in het zuiveringsproces (stap 2,2), terwijl BCCP bindt aan de toegevoegde Biotine moleculen tot biotinylaat de uitgesproken kinesin motoren.
      4. Inincuberen en schudden van de celkweek bij 20 °C en 250 rpm gedurende 12 – 20 uur.
    6. Oogst de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg. Bewaar de celpellets bij-80 °C.
  2. Reinig het kinesin motor eiwit (gewijzigd van Spriestersbach et al.41):
    1. Onderbreek de celpellet (stap 2.1.6) met een gelijk volume lysisbuffer (50 mM buizen, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mm 2-mercaptoethanol (βme), 20 mm imidazol, pH 7,2), gevolgd door toevoeging van één tablet proteaseremmer, 2 mg fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en 2 mg lysozym.
    2. Lyseer de cellen door Flash in vloeibare stikstof (LN) 3x te bevriezen en het celmengsel te ontdooien.
      Opmerking: na Lysing moet het mengsel visceus worden.
    3. Het gelyseerd-celmengsel wordt verduidelijkt door centrifugeren bij 230.000 x g en 4 °c gedurende 30 minuten.
    4. Verzamel het supernatant en stroom het door een zwaartekracht kolom, gevolgd door het wassen van de kolom met 10 mL lysisbuffer.
      Opmerking: eiwitten met een H6-tag, zoals kinesin K401-BCCP-H6, moeten in de kolom blijven staan.
    5. Elueren het gelabelde eiwit met 5 mL elutie buffer (50 mM buizen, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mm imidazol, pH 7,2). Verzamel de doorstroom opeenvolgend in fracties van 1 mL. Om de eiwit bevattende fracties te bepalen, Meng 3 μL van elke fractie met 100 μL Trifenylmethaan kleurstof. De eiwit-bevattende fracties moeten blauw worden. Combineer deze fracties en Verdun met 5x met lysisbuffer.
    6. Concentreer de eiwit oplossing.
      1. Laad de oplossing in een centrifugale filter buis.
      2. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
      3. Schud de buis zachtjes en centrifugeer opnieuw totdat het oplossings volume < 3 mL is.
    7. Meet de eiwitconcentratie met een spectrometer (extinctiecoëfficiënt: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Verdun het eiwit tot 1 mg/mL bij toevoeging van 35% w/v sucrose.
    8. Bewaren bij-80 °C.
  3. Meet de kinesin concentraties met een elektroforese gel (gemodificeerd van Taylor et al.44).
    Opmerking: om de kinesin-concentratie te meten met een elektroforese-gel, is tubuline een ideale concentratie ladder vanwege de hoge zuiverheid en de meetbare concentratie via een spectrometer (Figuur 2a)36.
    1. Bereid tubuline monsters met concentraties van 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 en 1,25 mg/mL. Meng 15 μL van elk tubuline monster en kinesin monster (stap 2.2.8) afzonderlijk met 5 μL monster buffer (200 mm tris-HCl, 8% natriumdodecylsulfaat (SDS), 400 mm DTT, 0,2% broomfenolblauw, 40% glycerol, pH 6,8) en inbroed bij 90 °c gedurende 3 minuten.
    2. Bereid de elektroforese.
      1. Vergrendel een elektroforese gel in de gelbox.
      2. Vul de doos met lopende buffer (50 mM MOPS, 50 mM tris Base, 0,1% SDS, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), pH 7,7).
        Opmerking: Zorg ervoor dat het bufferniveau zich boven de bovenste opening van de gel bevindt.
    3. Laad 10 μL eiwit standaard ladder, tubuline monsters en kinesin monster in afzonderlijke putjes en breng 200 V aan over de gel gedurende 45 min.
    4. Gel kleuring.
      1. Incuberen en rocken de gel met gekookte (ongeveer 95 °C) vlek oplossing A (0,5 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur, 25% isopropanol) gedurende 5 minuten en spoel vervolgens de gel af met gedeïoniseerd (DI) water.
      2. Herhaal met vlek oplossingen B (0,05 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur, 10% isopropanol), C (0,02 g/L Trifenylmethaan kleurstof, 10% v/v azijnzuur), en D (10% v/v azijnzuur), opeenvolgend. Inbroed en rock de gel 's nachts in DI water.
    5. Scan de gel. Zet de gel-afbeelding om in een grijswaardenafbeelding, gevolgd door een zwart-wit inversie en contrastverbetering om heldere eiwit bands in de zwarte achtergrond te onthullen.
    6. Meet de helderheid van elke band door de pixelwaarden op te vatten. Pas de lineaire pasvorm c = aB + btoe, waarbij b de helderheid is van een tubuline-band, C de corresponderende concentratie is en a en b passende parameters zijn. Bepaal de concentratie van kinesin Ck met behulp van de helderheid van de kinesin band Bk om de lineaire vergelijking te berekenen: Ck = aBk + B.
  4. Cluster de kinesin-motoren.
    1. Meng 1,5 μM kinesin (stap 2.2.8) met 120 μM DTT en 120 nM streptavidin. Incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
    2. Bewaren bij-80 °C.

3. Maak glaasjes en dekstroken met Polyacrylamide coating (gewijzigd van Lau et al.45)

  1. Laad nieuwe glaasjes en glazen dekstroken in de bijbehorende containers. Dompel de dia's en dekglaasjes in 1% v/v wasmiddel in DI water en kook vervolgens het water in een magnetron.
  2. Soniceren de dia's en dekstroken gedurende 5 minuten en spoel vervolgens af met DI-water om detergens te verwijderen.
  3. Submerge en sonificeren de dia's en dekstroken in ethanol gedurende 5 min. spoelen met di water.
  4. Submerge en sonificeren de dia's en dekstroken in 100 mm kaliumhydroxide (Koh) gedurende 5 min. spoelen met di water.
  5. Inbroed de glijbanen en dekglaasjes in een silaanoplossing (1% azijnzuur en 0,5% 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat in ethanol) gedurende 15 minuten en spoel vervolgens af met DI water.
  6. Inbroed de glijbanen en dekglaasjes in de acrylamideoplossing (2% w/w acrylamide, 0,7 mg/mL ammonium persulfaat en 0,0035% v/v tetramethylethyleendiamine in DI water) gedurende ≥ 3 uur.
  7. Bewaar de glijbanen en dekglaasjes in de acrylamide oplossing.

4. Maak kinesin-driven, op MT gebaseerde actieve vloeistoffen

  1. Bereid actieve vloeistoffen (gewijzigd van Sanchez et al.19).
    Opmerking: de volgende stappen tonen het proces van het voorbereiden van 100 μL van een actieve vloeistof met voorbeeld voorraden. Het uiteindelijke volume is schaalbaar en de concentraties van de voorbeeld voorraden kunnen worden aangepast, zolang de uiteindelijke concentratie van elk onderdeel wordt gehandhaafd.
    1. Meng 16,7 μL van 8 mg/mL MTs (stap 1.4.4) met 6,7 μL 1,8 μM kinesin motor clusters (stap 2.4.2) en 1,1 μL 500 mM DTT in hoogzout M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bundel MTs door toevoeging van 11,4 μL van 7% w/w polyethyleenglycol (PEG).
    3. Activeer kinesin motoren door 2,8 μL van 50 mM ATP toe te voegen.
    4. Houd de ATP-concentraties bij door toevoeging van 2,8 μl voorraad pyruvaatkinase/lactaat dehydrogenase (PK/LDH) en 13,3 μL van 200 mm fosfenol pyruvaat (PEP).
    5. Verminder het fotobleekeffect door toevoeging van 10 μL 20 mM Trolox, 1,1 μL van 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL van 20 mg/mL glucose oxidase, en 1,1 μL van 300 mg/mL glucose.
    6. Houd de beweging van de vloeistof bij door 1,6 μL 0,025% v/v Tracer deeltjes toe te voegen.
    7. Voeg een hoog zout M2B toe om een totaal volume van 100 μL te bereiken.
      Opmerking: de Meng orders in stappen 4.1.1 – 4.1.6 zijn uitwisselbaar. Echter, zodra ATP, MTs, en de motoren worden gemengd, de motoren beginnen te consumeren ATP terwijl intensivering langs de MTs. Het monster wordt geactiveerd met een eindige levensduur als gevolg van de beperkte brandstoffen (ATP en PEP), zodat het experiment onmiddellijk moet worden gestart. De laatste actieve vloeistof dient 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin-motor clusters te bevatten, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glucose oxidase, 3,3 mg/mL glucose, en 0,0004% v/v colloïde in High-Salt M2B.
  2. Bereid een monster in een stroom kanaal (gewijzigd van Chandrakar et al.46):
    1. Spoel een glasplaat met Polyacrylamide coating en dekslip (stap 3,7) af met DI-water. Droog de glazen met lucht onder druk. Plaats op een schone, vlakke ondergrond.
    2. Snijd twee strips van wax films met een breedte van 3 mm en dezelfde lengte als de glazen dekglaasje (20 mm). Plaats de stroken tussen de dia en de afdekplaat als kanaal spacers.
    3. Hecht het glas aan de wax film door het glas-wascomplex op een 80 °C hete plaat te plaatsen om de wax te smelten. Druk tijdens het smelten zachtjes op de afdekplaat met een pipetpunt om de wax film gelijkmatig op de glazen oppervlakken te plakken. Koel het glazen complex na hechting af op kamertemperatuur.
    4. Laad de actieve vloeistoffen (stap 4,1) naar het stroom kanaal. Sluit het kanaal af met UV-lijm.

5. controle van de monstertemperatuur

  1. Bouw een temperatuurregeling Setup (aangepast van ontwerpen in lowensohn et al. en Wu et al.47,48,49).
    1. Maak een aluminium koelblok.
      1. Frees een aluminium plaat met afmetingen van ongeveer 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Boor een binnenkanaal door de plaat (Figuur 3A) en installeer slang fittingen aan de uiteinden van het kanaal.
      3. Haak elke fitting op een waterbuis.
      4. Sluit een buis aan op een aquarium pomp in een waterreservoir en strek de andere buis uit naar het reservoir.
        Opmerking: de pomp zal reservoir water door de interne aluminium kanalen circuleren om de blok temperatuur bij ongeveer kamertemperatuur te houden.
    2. Draad een thermo-elektrische koeler (TEC) en een thermosensor op een temperatuurregelaar. Sluit de controller aan op een computer met behulp van een USB-poort (afbeelding 3B).
    3. Draad de temperatuurregelaar op een gelijkstroomvoeding. Schakel de controller in door de voeding aan te sluiten op een stopcontact.
    4. Voer de initiële set-up van de TEC uit volgens de handleiding van de controller fabrikant. Test de TEC-uitgang. Het wordt aanbevolen om de temperatuurregelaar te besturen via door de fabrikant geleverde software, waardoor sensorgegevens kunnen worden opgenomen en eenvoudigere manipulatie van de temperatuurregelaar mogelijk is.
    5. Identificeer de verwarmings-en koelings zijden van de TEC.
    6. Bevestig de koel zijde van de TEC op het koelblok (stap 5.1.1) met behulp van thermische pasta.
    7. Bevestig een saffier schijf aan de verwarming zijde van de TEC met behulp van thermische pasta.
    8. De installatie is voltooid. Het saffier oppervlak en de thermosensor kunnen contact opnemen met een monster om het monster af te koelen en te verwarmen op basis van de temperatuur en de beoogde temperatuur.
      Opmerking: het is aanbevolen dat het TEC-en Cooling-blok een uitgelijnd centraal gat hebben voor de beeldvorming van de monsters met behulp van helder-veld microscopie (Figuur 3C).
  2. Gebruik de instelling voor temperatuurregeling om de monstertemperatuur33te regelen.
    1. Koppel het voorbeeld aan de installatie.
      1. Plaats het actieve vloeistofmonster (stap 4.2.4) op het saffier oppervlak met de schuif zijde die contact heeft met het oppervlak.
      2. Bevestig de glazen glijbaan met papier tape.
      3. Bevestig de thermosensor met koperen tape aan het afdek oppervlak.
    2. Monteer de Setup op een Microscoop-fase met de afdek zijde naar de doelstellingen gericht. Bijvoorbeeld, op een omgekeerde Microscoop, de dekslip zijde moet naar beneden gericht. Beveilig de installatie met papier tape en de Microscoop naald klemmen indien van toepassing.
      Opmerking: de gepresenteerde temperatuur fase moet werken met gemeenschappelijke microscopen die ofwel omgekeerd of rechtop zijn. Om ervoor te zorgen dat de temperatuur fase tijdens het experiment niet wordt verplaatst, is het het beste om de temperatuur fase in de microscoop met tape te beveiligen.
    3. Controle van de monstertemperatuur.
      1. Zet de temperatuurregelaar en de vistank pomp aan.
      2. Volg de handleiding van de fabrikant om de gewenste temperatuur in te stellen en temperatuurregeling in te schakelen. De controller past de verwarmings-of koel kracht aan op basis van de beoogde temperatuur en de monstertemperatuur, zoals beoordeeld door de thermosensor.
    4. Neem sample temperaturen op.
      1. Volg de handleiding van de fabrikant om temperatuur gegevens van thermosensor tijdens het experiment op te nemen.
        Opmerking: de monstertemperatuur moet nu door de controller worden gecontroleerd en door de computer worden opgenomen (Figuur 3D).

6. karakteriseren de actieve vloeistof activiteit (gewijzigd van methoden door Henkin et al. en Wu et al.20,27)

Opmerking: de vorige secties worden gebruikt om actieve vloeistofmonsters (secties 1 – 4) voor te bereiden en de temperatuur te regelen (paragraaf 5). Om het gebruik van temperatuur te demonstreren om de actieve vloeistof activiteit te controleren, het vloeistof gedrag te observeren, hun activiteiten te analyseren en hun reactie op temperatuur te karakteriseren.

  1. Tracers bewaken.
    1. Beeld het monster met een constante interval Δt met behulp van groene fluorescerende proteïne (GFP) fluorescentie om de beweging van de Tracer deeltjes vast te leggen.
      Opmerking: Δt moet worden gekozen om de Tracer beweging te kunnen traceren. Grote Δt -waarden, zoals 100 s, resulteren in het verliezen van de Tracer trajecten, terwijl korte δt -waarden, zoals 0,1 s, verhinderen dat het traceer algoritme de Tracer beweging tussen frames detecteert. Een werkende Δt moet toestaan dat de Tracer verplaatsing tussen frames binnen ~ 9 pixels is. Voor beeldvormings tractoren die met een 4x objectief op 10 μm/s bewegen, wordt de Δt aanbevolen om 1 – 5 s te zijn.
    2. Sla de afbeeldingen op als TIFF-bestanden, geef de bestanden een naam op basis van het framenummer en sla ze op in een aparte map. Deze processen zijn nodig om ervoor te zorgen dat de verworven afbeeldingen correct worden geanalyseerd met het meegeleverde MATLAB-script (stap 6.2.2).
  2. Rups tracers die de tracking software adopteren die is ontwikkeld door Ouellette et al.50,51):
    1. Download de tracking software van het Environmental complexiteits laboratorium, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Zorg ervoor dat elk MATLAB-bestand zich in dezelfde map bevindt.
    2. Tracers traceren met een aangepast MATLAB-script: particle_tracking. m. Het script leest Tracer beelden (stap 6,1) en traceert Tracer beweging met behulp van de software van Ouellette et al.50,51. Het voert twee bestanden uit: 1) background. TIF, vertegenwoordigt de achtergrond van de afbeelding en 2) tracking. mat, met de deeltjes trajecten en snelheden in elk frame (Figuur 4A).
  3. Analyseer de Tracer-gemiddelde snelheden met behulp van een aangepast MATLAB-script: Analysis. m. Het script leest het traceringsbestand (tracking. mat) en voert de gemiddelde snelheid van tracers versus tijd uit, samen met een tijdgemiddelde gemiddelde snelheid met gespecificeerde gemiddeldenvensters (Figuur 4B)33.
  4. Noteer het tijdgemiddelde gemiddelde toerental.
  5. Meet de tijdgemiddelde gemiddelde snelheid door het experiment te herhalen (stap 4, 5,2 en 6.1 – 6.4) bij 10 – 40 °C. Gebruik de vastgelegde gemiddelde snelheden om de gemiddelde snelheid en temperatuur te tekenen (Figuur 4C)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het voorbereiden van de kinesin-driven, op MT gebaseerde actieve vloeistoffen vereist zowel kinesin als MTs. De MTs werden gepolymeriseerd van gelabelde tubulinen (stappen 1,3 en 1,4) die werden gezuiverd van runderhersenen (stap 1,1, Figuur 2A), gevolgd door recycling om de zuiverheid te verbeteren (stap 1,2, Figuur 2B). De kinesin-motor eiwitten werden uitgedrukt in en gezuiverd uit E. coli (stappen 2,1 en 2,2 , figuur 2B)41,52. De concentratie van de bereide kinesin voorraad werd gemeten met een SDS-gel door vergelijking van de hoofdband helderheid met die van gerecycleerde tubulinen met bekende concentraties (stap 2,3, Figuur 2B inzet). De helderheidswaarden van de tubuline-banden (B) waren lineair aangepast aan hun corresponderende concentratie (c) met behulp van de vergelijking C = aB + ε, wat een = 3,1 × 10-2 mg/ml en ε = 8,7 × 10-4 mg/ml (Figuur 2C) oplevert. De ingerichte vergelijking werd gebruikt om de concentratie van een kinesin band te bepalen door de gemeten sterkte van de band toe te passen, Bk = 1.060, wat een kinesin-concentratie van Ck = 0,95 mg/ml oplevert. Voor het bereiden van actieve vloeistofmonsters werden MT en kinesin monsters met bekende concentraties gebruikt. De actieve vloeistoffen werden gesynthetiseerd, geladen in een stroomcel met Polyacrylamide-coating en de cel werd verzegeld met UV-lijm (secties 3 en 4)46.

Om de controle van de actieve vloeistof activiteit met de temperatuur aan te tonen, werd het actieve vloeistofmonster op het zelfgemaakte temperatuur stadium gemonteerd (stap 5,2, Figuur 3A-C). De monstertemperatuur werd bewaakt en gecontroleerd door de controller volgens een proportioneel-integraal-derivaat (PID) algoritme53. Monsters gecontroleerd bij 10 °C, 20 °C, 30 °C en 40 °C leek te schommelen in temperatuur binnen 0,1 – 0,3 °C gedurende 4 uur, wat de stabiliteit en betrouwbaarheid van deze temperatuur regelinstelling aantoont (Figuur 3D).

Om het monster te observeren, werd de Setup op een epifluorescentie Microscoop gemonteerd. Het monster werd gedoseerd met Alexa 488-gelabelde tracers, die met fluorescentiemicroscopie werden afgebeeld via een GFP-kanaal (stap 6,1). De tracers werden afgebeeld elke Δt = 2 s. De sequentiële afbeeldingen toegestaan voor het traceren van Tracer trajecten ri, waarbij Ik de tracer-index vertegenwoordigt (stap 6,2, Figuur 4A). De trajecten onthulde een gemiddelde snelheid v(t) ≡ < | ri(t)- ri(t-Δt) |/Δt>i (stap 6,3). De gemiddelde snelheden gemeten bij 20 – 36 °C bleken bijna tijd onafhankelijk te zijn bij t = 0 – 2 h, terwijl bij 10 °c en 40 °c de gemiddelde snelheden snel vervallen (Figuur 4B). Het verval bij 10 °C werd veroorzaakt door de depolymerisatie van de MT onder 16 °C. Het verval bij 40 ° c was te wijten aan de kinesin clusters defect boven 36 °C. Volgens onze vorige studies verliezen deze kinesin-motor clusters de mogelijkheid om paren MTs na preincubatie te rijden bij > 36 °C33. Om de gemiddelde snelheden voor elke temperatuur te karakteriseren en de door deze factoren veroorzaakte verval te reflecteren, werden de gemiddelde snelheden gemiddeld tussen t = 1 – 2 h (stappen 6,3 en 6,4)33. De gemiddelde snelheden werden gemeten tussen 10 °C – 40 °C (stap 6,5, Figuur 4C). Onder 16 °C en boven 36 °C zijn de gemiddelde snelheden snel vervallen als gevolg van MT-depolymerisatie en defecte kinesin clusters33, terwijl de stijgende temperaturen van 16 °c tot 36 °c de gemiddelde snelheden van 4 tot 8 μm/s hebben versneld, waardoor de haalbaarheid van het afstemmen van de gemiddelde snelheid van een actieve vloeistofstroom met behulp van temperatuur is aangetoond. Om de capaciteit van de temperatuurregeling verder aan te tonen, werden de systeemtemperaturen elke 30 minuten afgewisseld tussen 20 °C en 30 °C. De gemiddelde snelheden van de actieve vloeistoffen accelereren en vertragen niet alleen dienovereenkomstig, maar reageerden ook op de temperatuurverandering binnen 10 sec. (Figuur 5). Een dergelijke omkeerbare en snelle reactie van de actieve vloeistof demonstreert de werkbaarheid van het gebruik van temperatuur om vloeistof activiteiten dynamisch te regelen.

Figure 1
Figuur 1: introductie van kinesin-driven, op Mt gebaseerde 3D-actieve vloeistoffen. A) schema's van interfilament glijden. Paren van anti parallel MTs werden gebundeld door uitputten en gedreven uit elkaar door motor clusters. (B) motor clusters collectief reed paren van MTs, leidende MT bundels uit te breiden. C) de uitstrekbaar bundels vormden een op Mt gebaseerde actieve gel (groen) die de omringende vloeistof heeft geroerd om een stroom te induceren. Om de stroom te volgen, werd de vloeistof gedoseerd met tracers (rood). Dit cijfer werd aangepast van bate et al.33. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: afbeeldingen van SDS gels uit de tubuline en kinesin-zuiveringen. A) afbeelding van een SDS-gel van gezuiverde tubulin. B) afbeelding van een SDS-gel van gerecycleerde tubulinen en gezuiverde kinesine. De rijstroken van links naar rechts waren eiwit normen, blanco, 1,25 – 0,25 mg/mL gerecycled tubulins, blanco, en kinesin voorraad. C) de concentratie van gezuiverde kinesine werd bepaald door de helderheid van de band te vergelijken met de opeenvolgende banden van tubulinen met gemeten concentraties (rode en blauwe onderbroken rechthoeken in de inzet). De helderheid van elke band werd gemeten door de pixelwaarden in een bijgesneden band afbeelding op te vatten. Om de achtergrondruis te verminderen, werd de gelafbeelding vóór het bijsnijden overgebracht naar grijswaarden, zwart-wit omgekeerd en vervolgens contrasterend-verbeterd om een zwarte achtergrond (inzet) te onthullen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: temperatuurregeling instellen. A) schema's van het aluminium blok voor de instelling van de temperatuurregeling. Het blok bevat een intern kanaal voor water om er doorheen te stromen en de door TEC gegenereerde warmte weg te nemen. Het centrale gat zorgt ervoor dat het monster aan de ene kant verlicht wordt door de heldere veld microscopie en met een objectief aan de andere kant wordt afgebeeld. B) schema's van de instelling van de temperatuurregeling. Silicium thermische pasta wordt aangebracht tussen het aluminium koelblok en de TEC en tussen de TEC en de Sapphire disc. C) beeld van een monster dat op de temperatuurgestuurde fase is gemonteerd. Waterbuizen zijn aangesloten op een pomp ondergedompeld in een waterreservoir. D) opgenomen monster temperaturen versus tijd voor streeftemperaturen 10 °c, 20 °c, 30 °c en 40 °c. De temperatuur van het monster werd gehandhaafd bij temperaturen met een schommeling van 0,1 – 0,3 °C. B en D werden aangepast van Bate et al.33. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: afstemmen van actieve vloeistofstromen via temperatuur. A) de beeldvormings tractoren (witte stippen) zijn toegestaan om de stroom trajecten opeenvolgend op te volgen (met elkaar gekleurde curven). De tracers werden elke 5 s (Δt = 5 s) bij kamertemperatuur (~ 20 °c) gecontroleerd. B) Tracer gemiddelde snelheid versus tijd bij 10 °c, 20 °c, 30 °c, 36 °c en 40 °c, respectievelijk. C) Tracer gemiddelde snelheid versus temperatuur. Elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde Tracer gemiddelde snelheid tijdens de eerste en tweede uur. Onder 16 °C de MTs gedepolymeriseerd, en boven 36 ° c, kinesin clusters ondergefunctioneerd. Daarom is de werktemperatuur tussen 16 – 36 °C, waarbij de gemiddelde snelheden varieerden van 4 – 8 μm/s. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de tijdgemiddelde gemiddelde snelheden. B en C werden aangepast van Bate et al.33. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Wissel de stromingssnelheid van actieve vloeistoffen af door periodiek de systeemtemperatuur af te wisselen. Omschakeling van de temperatuur tussen 20 °C en 30 °C elke 30 min versnelde en vertraagde stromingssnelheden herhaaldelijk, demonstreren lokale controle van actieve vloeistof activiteiten met de temperatuur. Dit cijfer werd aangepast van bate et al.33. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het beheersen van actieve materie in situ opent de deur naar gerichte zelforganisatie van actieve materie4,5,24,28,54. In dit artikel presenteren we een protocol voor het gebruik van temperatuur om kinesin-driven, op Mt gebaseerde actieve vloeistoffen in situ te controleren, gebaseerd op de Arrhenius-karakteristiek van het systeem29,30,31. Omdat het systeem op basis van eiwitten is, is het behouden van de proteïne-functionaliteit gedurende het experiment essentieel voor het succesvol toepassen van het protocol. De belangrijkste eiwitten in het systeem zijn MTs en kinesin clusters. De voormalige cellulose onder 16 °c en de laatste storing boven 36 °c33. Het behoud van de systeemtemperatuur tussen 16 – 36 °C is daarom van vitaal belang voor actieve vloeistoffen om een gestage dynamiek te ontwikkelen en om hun reactie op temperatuur reversibel mogelijk te maken (Figuur 4 en Figuur 5). De temperatuur wordt echter geregeld op basis van een PID-algoritme, dat de neiging heeft om de doeltemperatuur te overschieten53. Om deze overopname te verminderen, raden we aan om meerdere tussenliggende streeftemperaturen in te stellen voordat u de uiteindelijke doeltemperatuur instelt. Om bijvoorbeeld het monster te verwarmen van kamertemperatuur (ongeveer 20 °C) tot 35 °C, in plaats van de streef temperatuur direct bij 35 °C in te stellen, bevelen wij een tussen doeltemperatuur van 30 °C aan om de kans te verkleinen dat de temperatuur hoger is dan 36 °C, hetgeen de eiwitten33onherroepelijk zou beschadigen. Evenzo wordt het aanbevolen om bij het koelen van het monster van kamertemperatuur tot ~ 16 °C een tussentijdse streef temperatuur van 18 °C in te stellen, omdat de PID, voordat hij een steady-state bereikt, het monster onder 16 °C kan koelen, waardoor de MTs33wordt gedepolymeriseerde.

De gepresenteerde methode voor temperatuurbeheersing is afhankelijk van koeling en verwarming met behulp van een TEC. Het gebruik van de TEC zorgt ervoor dat het monster binnen enkele seconden de beoogde temperatuur bereikt, terwijl een conventionele instelling van de temperatuurregeling met behulp van een waterbad met temperatuurregeling minuten duurt om de gewenste temperatuur te bereiken (Figuur 5)55. De TEC genereert niet-nulzijnde netto warmte die wordt afgevoerd door een aluminium intern watercirculatie systeem. Echter, het water maakt schimmel te groeien, die uiteindelijk zal verstoppen het kanaal56. Een verstopte kanaal remt de waterstroom, en de warmte zal accumuleren in het aluminium blok, uiteindelijk smelten de waterbuizen. De gesmolten buizen veroorzaken water over de Microscoop en de camera te morsen, waardoor de elektronische instrumenten beschadigd worden. Daarom, om de gepresenteerde temperatuur controle Setup aan te nemen, raden we aan om 0,1% waterstofperoxide toe te voegen aan het water om schimmelgroei te remmen57,58,59. We verwachten dat deze stap ervoor zorgt dat het aluminium interne kanaal klomp vrij blijft en waterschade aan nabijgelegen elektronische apparaten voorkomt.

Het manipuleren van de temperatuur, het coaten van de stroomceloppervlakken met Polyacrylamide, en het synthetiseren van actieve vloeistoffen zijn drie kritische stappen om dit te realiseren in situ-gecontroleerde actieve vloeistof. Deze bestuurbaarheid is echter beperkt tot het temperatuurbereik waar de betrokken eiwitten normaal kunnen functioneren. In het actieve vloeistof systeem zijn de primaire eiwitten MTs en kinesin clusters, die normaal functioneren tussen 16 – 36 °C33. Binnen dit temperatuurbereik variëren de actieve vloeistoffen van 4 tot 8 μm/sec. (Figuur 4C). De gemiddelde snelheden buiten dit bereik liggen buiten de limiet van de gepresenteerde controlemethode. Ross et al. meldde daarentegen een alternatief dat het mogelijk maakt om de actieve vloeistof activiteiten in en uit te schakelen met behulp van licht28. De lichtregeling maakt het ook mogelijk actieve vloeistoffen te activeren in een schaal van 50 μm met een optisch gedefinieerde begrenzing. Een dergelijk alternatief vereist echter het wijzigen van de kinesin-structuur, samen met het afstemmen van een optisch pad in een microscoop. Ter vergelijking, de voordelen van het aannemen van de in dit artikel gepresenteerde methode zijn 1) de actieve vloeistoffen hoeven niet opnieuw te worden ontworpen, 2) de microscopen hoeven niet te worden gewijzigd, 3) de instelling van de temperatuurregeling is voordelig en gemakkelijk te gebruiken, en 4) de methode is overdraagbaar naar andere temperatuurafhankelijke systemen zoals de glij test29,30,31,32 of meer in het algemeen enzym-gebaseerde systemen60. We verwachten ook dat de gepresenteerde methode de deur zal openen voor het ontwerpen van microfluïdische systemen waarbij kanaal stromen lokaal worden gecontroleerd zonder kleppen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Plasmide K401-BCCP-H6 was een geschenk van Dr. Zvonimir Dogic. Dit onderzoek werd gesteund door Dr. kun-ta Wu's start-up Fund in het Worcester Polytechnic Institute. We danken Dr. Zvonimir Dogic voor de protocollen om tubuline te zuiveren en te labelen en actieve vloeistoffen te synthetiseren. We zijn Dr. Marc Ridilla dankbaar voor zijn expertise in eiwit expressie en zuivering. We danken Dr. William Benjamin Roger voor het assisteren bij het opbouwen van de temperatuurgestuurde stage. Wij erkennen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) voor het gebruik van de biologische materialen faciliteit (BMF). We erkennen de Royal Society of Chemistry voor het aanpassen van de cijfers van bate et al. on Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

Engineering uitgave 153 Biofysica kinesin microtubulus actieve vloeistoffen zelforganisatie temperatuur Arrhenius wet
Controle van de stroomsnelheden van 3D-actieve vloeistoffen op basis van microtubulus met behulp van temperatuur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter