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Engineering

使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

该协议的目的是使用温度来控制三维有源流体的流动速度。这种方法的优点不仅允许原地调节流速，还可实现动态控制，例如定期调优流速。

Abstract

我们提出了一种利用温度来调整运动因子驱动的基于微管的三维（3D）有源流体的流速的方法。此方法允许原地调整速度，而无需制造新样品以达到不同的期望速度。此外，该方法可实现速度的动态控制。循环温度会导致流体周期性地快速流动和缓慢流动。这种可控性基于激酶-微管反应的Arrhenius特性，显示了4~8μm/s的受控平均流速范围。提出的方法将为微流体器件的设计打开大门，在微流体器件中，通道中的流速可局部调节，无需阀门。

Introduction

主动物质与传统无源物质不同，因为能将化学能转化为机械工作。具有这种能力的材料可以包括活的或非生物的实体，如细菌、昆虫、胶体、谷物和细胞骨骼细丝1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。这些物质实体与其邻居交互。在更大的尺度上，它们自组织成湍状涡流（主动湍流）或物质流动11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。对活性物质自组织的理解已导致分子穿梭、光学器件和并行计算21、22、23的各种应用。要将应用程序带到一个新的水平，需要超越自组织的控制。例如，Palacci等人研制出一种赤铁矿封装的胶体，只有在暴露在手动控制的蓝光下才能自行推进，这导致了活晶体24的出现。Morin等人利用可调谐的外部电场建立了滚动昆克胶体的控制，导致胶体在赛道状的通道25中形成。这些以前的工作展示了局部控制在应用中的作用，并推进了活性物质的知识库。

在本文中，我们重点介绍了运动因子驱动的基于微管 （MT） 的 3D 活性流体的可控性。流体由三个主要成分组成：MT、激酶分子马达和消耗物。消耗物会产生消耗力来捆绑 MT，这些 MT 后来被电机簇桥接。这些电机沿着 MT 向加端移动。当一对桥接的MTsis反平行时，相应的电机朝相反的方向行走。但是，电机被绑定在一个簇中，无法分开，因此它们协同滑动成对的 MT（间丝滑动，图 1 A）。这些滑动动力学积累，导致束的MTsto延伸，直到达到其屈曲不稳定点和断裂（扩展束，图1B）26。破碎的束被耗尽力退火，随后再次延伸，动态重复。在重复动力学过程中，捆绑运动搅动附近的液体，诱导流动，可以通过使用微米级示踪剂进行掺平来可视化（图1C）。桑切斯等人和Henkin等人对示踪剂的平均速度进行了描述，发现通过改变三磷酸腺苷（ATP）、消耗物、电机簇和MC19、27的浓度，速度是可调节的。然而，这种可调谐性仅在活性流体合成之前存在。合成后，适应性丧失，流体以自己的方式自行组织。为了控制合成后的活性流体活性，Ross.etal.报告了一种使用光激活的马达蛋白二聚化方法，允许使用光28调节流体活性。虽然光控制在局部激活流体方面是方便的，但该方法需要重新设计运动蛋白的结构，同时在显微镜中修改光学路径。在这里，我们提供了一种易于使用的方法，用于在无需显微镜修改的情况下控制流体流动，同时保持电机结构不变。

我们的局部调谐有源流体流动的方法基于阿雷尼乌斯定律，因为激酶-MT反应已经报告随着温度29，30，31，32增加。我们先前的研究表明，活性流体流的平均速度的温度依赖性遵循Arrhenius方程：v = A exp（- Ea/RT），其中A是指数前因子，R是气体常数，Ea是活化能，T是系统温度33。因此，流体活性对温度环境敏感，系统温度需要一致，以稳定电机性能，因此，流体流动速度为34。在本文中，我们演示了利用电机的温度依赖性通过调整系统温度来持续调整有源流体的流速。我们还演示了活性流体样品的制备，然后将样品安装在通过计算机软件控制温度的显微镜阶段。将温度从16°C提高到36°C可加快平均流速从4至8μm/s。 此外，可调节性是可逆的：反复升高和降低温度顺序加速和减速流。演示的方法适用于主要反应遵循Arrhenius定律的各种系统，如MT滑翔测定29、30、31、32。

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Protocol

1. 编制MT

注意：在这一步中，我们从牛脑组织中纯化牛头蛋白。牛脑可能导致变种克罗伊茨费尔特-雅科布病（vCJD）35。因此，应将脑废物及相关溶液、瓶子和移液器吸头收集在生物垃圾袋中，并按照机构规定作为生物危险废物进行处理。

  1. 从牛脑中纯化牛头蛋白（从Castoldi等人改过自36年）。
    1. 将大约1.5公斤的新鲜牛脑从当地的屠宰场运送到大学冷室。在运输过程中，将大脑储存在磷酸盐缓冲液（20mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.2）的冰上。
      注：为了最大化图布林的最终产量，新鲜脑组织中功能性图布林的初始量是关键。新鲜的大脑含有更多的功能性图布林。为了从屠宰场获得最新鲜的大脑，我们建议让屠夫提供最近屠宰的奶牛的大脑。启动手术时，大脑不应超过3小时，因为减少屠宰和手术开始之间的时间将产生更好的产量。
    2. 同质化和澄清大脑。
      1. 使用手术刀将血管和结缔组织切成小块，用手从大脑中去除，清洁大脑。
        注：清洁的大脑应该是粉红色的。
      2. 每公斤脑的去聚合缓冲液（DB：50 mM 2-（N-变形）酸，1 mM CaCl 2，pH 6.6）中浸润的脑组织。
      3. 用厨房搅拌机使大脑均匀化。
      4. 在10，000 x g和4°C下将均质脑溶液离心150分钟。
    3. 聚合 MT（第一次聚合）。
      1. 在 37°C 下收集并混合具有相同体积的以下溶液：甘油、高摩尔性 PIPES 缓冲液（HMPB： 1 M PIPES、10 mMMgCl 2、20 mM 乙二醇-二乙二醇-二酯（β-氨基乙醚）-N、N'、N'-四乙酸 [EGTA]、pH 6.9）
      2. 在混合物中加入1.5 mM ATP和0.5 mM三磷酸基苯基。
      3. 在37°C孵育混合物1小时。
    4. 脱聚MT（第一次MT去聚合）。
      1. 在 151，000 x g和 37 °C 下离心 30 分钟。
      2. 丢弃上清液，将每个 MT 颗粒重新悬浮在 4 °C DB 的 10 mL 中。
      3. 在冰上孵育30分钟。
      4. 每 5 分钟用移液器尖搅拌一次混合物，以避免 MT 沉淀。
        注：混合物应在30分钟内变清楚，表明MT去聚合完成。
    5. 聚合 MT（第二 MT 聚合）。
      1. 通过在 70，000 x g和 4 °C 下离心 30 分钟来澄清溶液。
      2. 收集并混合上清液，其体积等于37°C甘油和HMPB。
      3. 在混合物中加入 1.5 mM ATP 和 0.5 mM GTP。
      4. 在37°C下孵育混合物30分钟。
    6. 重复步骤1.1.4，用布林克利重装缓冲液（BRB）80（80 mM PPIPES，1 mM MgCl2，1mM EGTA，pH 6.8）替换HMPB，然后通过在79，000 x g和4°C处离心30分钟澄清清除的混合物。
    7. 收集上清液。使用光谱仪测量 280 nm 的吸光度。使用啤酒-兰伯特定律确定图布林浓度（图布林的灭绝系数：1.15 （mg/mL）-1厘米-1）37，38。
    8. 将蛋白质储存在-80°C。
  2. 回收土布林（从Castoldi等人36修改）。
    注：为了提高图布林的纯度，纯化的图布林再次聚合和去聚合。
    1. 通过将纯化的图布林（步骤1.1.7）与500μM二硫硫醇（DTT）和20μM GTP混合，然后30分钟在37°C下孵育，从而聚合MT。
    2. 粒点的 MT。
      1. 在离心管底部装载 1 mL 的甘油缓冲（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1mM EGTA，60% v/v 甘油，pH 6.8）。
      2. 将聚合的 MT 放在垫子顶部。
      3. 在37°C下以172，000 x g离心90分钟。
    3. 去聚合的MTs。
      1. 拆下上清液和垫子。
      2. 将每 MT 颗粒重新悬浮在 150 μL 的 4 °C MT 缓冲液中（M2B： 80 mM PIPES，2 mM MgCl2， 1 mM EGTA， pH 6.8）。
      3. 在冰上孵育混合物30分钟。
      4. 每 5 分钟用移液器吸头搅拌混合物。混合物应变清楚。
    4. 在172，000 x g和4°C处离心30分钟，通过离心来澄清混合物。
    5. 收集上清液。测量蛋白质浓度。储存在-80°C。
  3. 用荧光染料39标记图布林。
    1. 聚合性MT.将纯化的图布林（步骤1.1.7）与500μM DTT和16.7μM GTP混合，并在37°C下孵育混合物30分钟。
    2. 粒点的 MT。
      1. 将 1 mL 的 37 °C 高 pH 垫（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA， 60% v/v 甘油， pH 8.6） 放入离心管中。
      2. 将聚合的 MT 放在垫子上。
      3. 在37°C下以327，000 x g离心50分钟。
    3. 标签图布林。
      1. 用 700 μL 的 37 °C 标记缓冲液（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA， 40% v/v 甘油， pH 8.6） 重新悬浮每个 MT 颗粒。
      2. 将悬浮液与10~20摩尔过量的远红荧光染料混合，与苏奇尼米酯混合。
      3. 在黑暗中在37°C下孵育混合物30分钟，使MT与荧光染料的酯反应。
      4. 用50mM K-谷氨酸饱和悬浮染料的酯，在37°C下孵育5分钟，从而停止标记反应。
    4. 标记的 MT：重复步骤 1.3.2，用低 pH 垫（80 mM 管道、2 mM MgCl2、1mM EGTA、60% v/v 甘油、pH 6.8）替换高 pH 垫。
    5. 去聚合的MT。
      1. 丢弃上清液和垫子。
      2. 在 4 °C M2B 的 700 μL 中重新悬浮颗粒。
      3. 在冰上孵育悬浮液。
      4. 每 5 分钟用移液器吸头搅拌一次，直到溶液清晰。
    6. 通过在 184，000 x g和 4 °C 下离心 35 分钟，阐明清除溶液。
    7. 通过重复步骤 1.2.1~1.2.4 提高标记的 Tubulin 溶液的纯度。
    8. 测量蛋白质和荧光染料的浓度。使用这些测量来确定塔布林浓度和标记的图布林的馏分，定义为荧光染料与图布林的浓度之比。
    9. 将标记的土布林溶液储存在-80°C。
  4. 聚合的MTs（从桑切斯等人19采用）：
    1. 将回收的图布林（步骤 1.2.5）与标记的图布林（步骤 1.3.9）混合，其比例可产生 3% 标记的图布林分数。
    2. 将8mg/mL图布林混合物与1 mM DTT和0.6 mM瓜诺辛-5'（β，α）-甲基三磷酸（GMPCPP）混合，随后在37°C下孵育30分钟。
    3. 孵育后，在黑暗中将MT在室温下退火6小时。
    4. 在-80°C下，以-80°C的分量和储存。

2. 合成运动体簇

注：细菌无处不在，可以在介质中生长并污染制备过程。为了防止污染，必须在火焰附近执行与细胞培养物接触（例如移液）的操作。使用前必须对烧瓶、移液器、移液器尖端、介质和板等工具进行高压灭菌。

  1. 快速激酶电机在大肠杆菌40。
    1. 转换单元格。
      1. 将K401-BCCP-H6质粒的移液器1μL放入10μL的合格细胞中。
      2. 在冰上孵育5分钟。
      3. 42.5 °C 的热休克，45 s。
      4. 在冰上孵育细胞2分钟，以便恢复。
      5. 将细胞与300 μL的无抗生素2XYT（5克/L NaCl，10克/L酵母提取物，16克/L胰腺酮）混合。
      6. 在37°C孵育细胞1小时。
        注：除非指定，否则在孵育期间不需要监测细胞生长。
    2. 接种板介质。
      1. 在 2XYT 板上传播细胞培养物（10 g/L NaCl，5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰腺酮，15 g/L 琼脂，100 μg/mL 阿霉素，25微克/mL氯霉素）。
      2. 在37°C过夜时倒置孵育板。
    3. 接种液体介质。
      1. 从隔夜的盘子里，用移液器尖收获一个孤立的菌群。
      2. 将尖端喷射到装有 50 mL 2XYT 的烧瓶中。
      3. 在 37°C 和 200 rpm 下孵育和摇动培养基，12~16 小时。
    4. 展开单元格。
      1. 在 500 mL 的 2XYT 中混合 2.5 mL 的细胞培养。
      2. 在 37°C 和 250 rpm 下孵育和摇动 500 mL 培养基，3~6 小时。
    5. 诱导蛋白质表达。
      1. 在孵育过程中，使用2XYT作为参考，在600nm处测量吸收率，以监测细胞生长。每 60 分钟测量一次吸光度，直到达到 OD600 = 0.3。然后每 30 分钟测量一次吸光度，直到达到 0.5~0.6。
      2. 允许细胞生长，直到吸收率达到 OD600 = 0.5±0.6
      3. 在细胞培养中加入24微克/mL生物素和1 mM等丙基β-D-1-硫丙酮（IPTG）。
        注：IPTG用于诱导运动蛋白的表达，其标记为生物蛋白卡贝基载体蛋白（BCCP）和六种分子（H6）。H6 标记用于纯化过程（步骤 2.2），而 BCCP 与添加的生物素分子结合，对表达的激酶电机进行生物素化。
      4. 在20°C和250rpm下孵育和摇动细胞培养，12~20小时。
    6. 在5000 x g和4°C下离心10分钟，收获细胞。丢弃上清液。将细胞颗粒储存在-80°C。
  2. 纯化激酶运动蛋白（从斯普里斯特巴赫等人改性：
    1. 使用相同体积的莱沙缓冲液（50 mM PIPES， 4 mM MgCl2， 50 μM ATP， 10 mM 2-甲基苯丙胺 （βME）， 20 mM imidazole， pH 7.2）， 然后加入一片蛋白酶抑制剂， 2毫克苯基甲基磺酸氟化物 （PMSF）， 和 2 毫克溶酶.
    2. 通过在液氮（LN）中闪冻结3倍并解冻细胞混合物来使细胞变亮。
      注：乳化后，混合物应变得粘稠。
    3. 在230，000 x g和4°C处离心30分钟，通过离心来澄清裂化细胞混合物。
    4. 收集上清液并将其流过重力柱，然后用 10 mL 的液化缓冲液清洗该柱。
      注：带有 H6 标记的蛋白质（如激酶 K401-BCCP-H6）应保留在列中。
    5. 用5 mL洗脱缓冲液（50 mM PIPES，4 mM MgCl2，50μM ATP，500 mM imidazole，pH 7.2）对标记的蛋白质进行脱脂。以 1 mL 分数顺序收集流。要确定含蛋白质的馏分，将每个馏分的3μL与100μL的三烯甲烷染料混合。含蛋白质的分数应该变成蓝色。将这些分数合并，与莱沙缓冲液稀释5倍。
    6. 浓缩蛋白质溶液。
      1. 将溶液装入离心滤管中。
      2. 在 3，000 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。
      3. 轻轻摇动管，然后再次离心，直到溶液体积为 <3 mL。
    7. 使用光谱仪测量蛋白质浓度（消光系数：0.549 （mg/mL）-1cm-1）42，43。将蛋白质稀释至1mg/mL，同时加入35%的蔗糖。
    8. 储存在-80°C。
  3. 用电泳凝胶测量激酶浓度（从泰勒等人44中修饰）。
    注：为了用电泳凝胶测量激酶浓度，图布林是一种理想的浓度阶梯，因为它纯度高，并通过光谱仪（图2A）36可测量的浓度。
    1. 制备浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25毫克/升/mL的图布林样品。将每个图布林样品和激酶样品（步骤2.2.8）的15μL分别与5μL样品缓冲液（200 mM Tris-HCl，8%硫酸钠（SDS）、400 mM DTT、0.2%溴酚蓝、40%甘油、pHH 6.8）混合，并在90°C孵育3分钟。
    2. 准备电泳。
      1. 将电泳凝胶锁入凝胶盒中。
      2. 在箱内填充运行缓冲液（50 mM MOPS、50 mM Tris 底座、0.1% SDS、1 mM 乙烯二甲酸乙酸 （EDTA）、pH 7.7）。
        注：确保缓冲液水平高于凝胶的顶部开口。
    3. 将10μL的蛋白质标准梯、图布林样品和激酶样品加载到单独的井中，在凝胶中涂抹200 V45分钟。
    4. 凝胶染色。
      1. 用煮沸（约95°C）染色溶液A（0.5克/升三烯甲烷染料，10%v/v醋酸，25%异丙醇）孵育和摇动凝胶5分钟，然后用去离子（DI）水冲洗凝胶。
      2. 重复染色溶液B（0.05 g/L三苯甲酸，10%v/v醋酸，10%异丙醇），C（0.02克/升三烯甲烷染料，10%v/v醋酸）和D（10%v/v醋酸），顺序顺序。孵育和摇动凝胶在DI水中过夜。
    5. 扫描凝胶。将凝胶图像转换为灰度图像，然后进行黑白反转和对比度增强，以显示黑色背景中的明亮蛋白质带。
    6. 通过对像素值求和来测量每个波段的亮度。应用线性拟合C = aB = b，其中B是图布林带的亮度，C是相应的浓度，a和b是拟合参数。使用激酶带Bk的亮度计算线性方程：Ck = aBk = b，确定激酶Ck的浓度。
  4. 聚组运动位。
    1. 将 1.5 μM 激酶（步骤 2.2.8）与 120 μM DTT 和 120 nM 链球菌。在冰上孵育30分钟。
    2. 储存在-80°C。

3. 制备聚丙烯酰胺涂层玻璃玻片和盖玻片（从Lau等人修改为45）

  1. 将新的玻璃玻片和玻璃盖玻片装入相应的容器中。在 DI 水中将幻灯片和盖玻片浸入 1% v/v 洗涤剂中，然后在微波炉中煮沸。
  2. 将幻灯片和盖玻片松口5分钟，然后用DI水冲洗以去除洗涤剂。
  3. 在乙醇中浸入和声波滑片和盖玻片5分钟，用DI水冲洗。
  4. 在 100 mM 氢氧化钾 （KOH） 中浸入并声波滑动和盖玻片 5 分钟，用 DI 水冲洗。
  5. 在硅烷溶液中孵育滑片和盖玻片（1%醋酸和0.5%3-（三聚氧乙酰）丙酸丙烯酸丙烯酸酯，在乙醇中孵育15分钟，然后用DI水冲洗。
  6. 在丙烯酰胺溶液中孵育幻灯片和盖玻片（2% w/w丙烯酰胺，0.7 mg/mL 二铵，DI 水中0.0035%v/v四甲基二甲二胺）的含量为±3小时。
  7. 将幻灯片和盖玻片存储在丙烯酰胺溶液中。

4. 制备运动动酶驱动、基于MT的有源流体

  1. 制备活性流体（从桑切斯等人19号修改）。
    注：以下步骤演示了使用示例库存制备 100 μL 活性流体的过程。最终交易量是可扩展的，只要保持每个组件的最终浓度，就可以调整示例库存的浓度。
    1. 将 16.7 μL 的 8 mg/mL MT（步骤 1.4.4）与 6.7 μL 的 1.8 μM 激动素电机簇（步骤 2.4.2）和 1.1 μL 的 500 mM DTT 在高盐 M2B （M2B = 3.9 mM MgCl2） 中混合。
    2. 通过添加 11.4 μL 的 7% 的 7% 不含聚乙烯乙二醇 （PEG） 来捆绑 MT。
    3. 通过添加 2.8 μL 的 50 mM ATP 来激活运动因子电机。
    4. 通过加入2.8 μL的血酸激酶/乳酸脱氢酶（PK/LDH）和13.3 μL的200 mM磷苯丙酸酯（PEP），维持ATP浓度。
    5. 通过添加 10 μL 的 20 mM Trolox、1.1 μL 3.5 mg/mL 催化酶、1.1 μL 20 mg/mL 葡萄糖氧化酶和 1.1 μL 300 mg/mL 葡萄糖，降低光漂白效果。
    6. 通过添加 1.6 μL 的 0.025% v/v 示踪颗粒来跟踪流体的运动。
    7. 加入高盐M2B，达到100μL的总体积。
      注： 步骤 4.1.1~4.1.6 中的混合顺序可互换。但是，一旦 ATP、MT 和电机混合，电机开始消耗 ATP，同时沿着 MT 步进。由于燃料有限（ATP 和 PEP），样品的激活寿命有限，因此应迅速启动实验。最终有源流体应含有1.3mg/mL MT，120 nM运动体运动簇， 5.5 mM DTT， 0.8% w/w PEG， 1.4 mM ATP， 2.8% v/v PK/LDH， 27 mM PEP， 2 mM Trolox， 0.038 mg/mL 催化酶， 0.22 mg/mL 葡萄糖氧化酶， 3.3 mg/mL 葡萄糖， 和 0.0004% v/v 在高盐 M2B 中。
  2. 在流道中制备样品（从钱德拉卡尔等人46中修改）：
    1. 用DI水冲洗聚丙烯酰胺涂层玻璃滑块和盖玻片（步骤3.7）。用加压空气擦干玻璃杯。放置在干净、平坦的表面上。
    2. 切割两条蜡膜，宽度为 3 mm，长度与玻璃盖玻片（20 mm）相同。将滑轨和盖玻片作为通道垫片插入。
    3. 将玻璃蜡复合物放在 80°C 热板上以熔化蜡，将玻璃粘附在蜡膜上。在熔炼过程中，用移液器尖端轻轻按压盖玻片，将蜡膜均匀地粘附在玻璃表面。粘附后，将玻璃复合物冷却至室温。
    4. 将有源流体（步骤 4.1）加载到流道。用紫外线胶水密封通道。

5. 控制样品温度

  1. 建立一个温度控制设置（从Lowensohn等人和Wu等人47、48、49等设计中修改）。
    1. 准备铝制冷却块。
      1. 铣削尺寸约为 30 mm × 30 mm × 5 mm 的铝板。
      2. 钻穿板的内部通道（图3A），并在通道端安装软管接头。
      3. 将每个配件钩到水管上。
      4. 将一根管连接到水箱中的鱼缸泵，同时将另一根管延伸到储水箱。
        注：泵将通过铝内部通道循环储液罐水，使缸体温度保持在大约室温。
    2. 将热电冷却器 （TEC） 和热传感器连接到温度控制器。使用 USB 端口将控制器连接到计算机 （图 3B）。
    3. 将温度控制器连接到直流 （DC） 电源。将电源插入电源插座，打开控制器。
    4. 按照控制器制造商指南执行 TEC 的初始设置。测试 TEC 输出。建议通过制造商提供的软件控制温度控制器，允许热传感器数据记录和更容易操作温度控制器。
    5. 确定 TEC 的加热和冷却侧。
    6. 使用热浆将 TEC 的冷却侧连接到冷却块（步骤 5.1.1）。
    7. 使用热膏将蓝宝石圆盘连接到 TEC 的加热侧。
    8. 设置已完成。蓝宝石表面和热传感器可以接触样品，根据样品的温度和目标温度对样品进行冷却和加热。
      注：建议 TEC 和冷却模块具有对齐的中心孔，用于使用明热场显微镜对样品进行成像（图 3C）。
  2. 使用温度控制设置控制样品温度33。
    1. 将示例装载到设置中。
      1. 将活性流体样品（步骤 4.2.4）放在蓝宝石表面，滑动侧与表面接触。
      2. 用纸带固定玻璃滑块。
      3. 使用铜胶带将热传感器连接到盖玻片表面。
    2. 将设置安装在显微镜台上，盖玻片侧朝向目标。例如，在倒置显微镜上，盖玻片侧应朝下。使用纸带和显微镜级针夹（如果适用）固定设置。
      注：呈现的温度级应与倒置或直立的普通显微镜配合使用。为确保在实验期间温度级不移动，最好用胶带将温度级固定到显微镜级。
    3. 控制样品温度。
      1. 打开温度控制器和鱼缸泵。
      2. 按照制造商指南设置目标温度并启用温度控制。控制器将根据目标温度和样品温度调整加热或冷却功率，由热传感器进行评估。
    4. 记录样品温度。
      1. 在实验期间，请按照制造商指南记录热传感器温度数据。
        注：样品温度现在应由控制器控制并由计算机记录（图3D）。

6. 描述活性流体活性（根据Henkin等人和Wu等人20、27的方法修改）

注：前几节用于制备活性流体样品（第 1-4 节）并控制其温度（第 5 节）。演示使用温度来控制活性流体活动，观察流体行为，分析其活动，并描述其对温度的反应。

  1. 监视跟踪器。
    1. 使用绿色荧光蛋白 （GFP） 荧光以捕获示踪粒子的运动，使用恒定间隔 μt对样品进行成像。
      注： 应选择μt以允许跟踪器移动。大 μt值（如 100 s）会导致跟踪轨迹丢失，而短 μt值（如 0.1 s）会阻止跟踪算法检测帧之间的跟踪器移动。工作 μt应允许帧之间的跟踪器位移在 ±9 像素内。对于使用 4 倍物镜以 10 μm/s 移动的成像示踪剂，建议 μt为 1⁄5 s。
    2. 将图像另存为 TIFF 文件，根据帧号命名文件，并将它们存储在单独的文件夹中。这些过程对于确保使用提供的 MATLAB 脚本（步骤 6.2.2）正确分析获取的图像是必要的。
  2. 跟踪跟踪器采用由Ouellette等人开发的跟踪软件50，51）：
    1. 从斯坦福大学环境复杂性实验室（https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml）下载跟踪软件。确保每个 MATLAB 文件都位于同一文件夹中。
    2. 使用自定义 MATLAB 脚本跟踪跟踪器：particle_tracking.该脚本读取跟踪图像（步骤6.1），并使用Ouellette等人50，51的软件跟踪跟踪器运动。它输出两个文件：1）背景.tif，表示图像背景，和2）跟踪.mat，包含粒子轨迹和速度在每个帧（图4A）。
  3. 使用自定义 MATLAB 脚本分析跟踪器的平均速度：分析.该脚本读取跟踪文件（Tracktrack.mat），并输出跟踪器与时间的平均速度，以及具有指定平均窗口的时间平均平均速度（图4B）33。
  4. 记录时间平均平均速度。
  5. 在 10–40 °C 处重复实验（步骤 4、5.2 和 6.1-6.4），测量时间平均平均速度。使用记录的平均速度绘制平均速度与温度（图4C）33。

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Representative Results

准备运动动酶驱动的基于MT的有源流体需要运动因子和MT。MC 从标记的 tubulin（步骤 1.3 和 1.4）中聚合，这些牛脑被纯化（步骤 1.1，图 2A），然后回收以提高纯度（步骤 1.2，图 2B）。激酶运动蛋白在大肠杆菌中表达和纯化（步骤2.1和2.2，图2B）41，52。 通过比较主带亮度与已知浓度的再生图布林的亮度（步骤2.3，图2B内窥，用SDS凝胶测量制备的激酶的浓度）。图布林带（B） 的亮度值线性适合其相应的浓度 （C）， 使用方程C = aB = + + + ， 产生± 3.1 × 10-2 mg/mL 和 + = 8.7 × 10-4 mg/mL （图 2C）。拟合方程用于通过应用测得的带亮度Bk = 1，060 来确定激酶带的浓度，产生Ck = 0.95 mg/mL 的激酶浓度。具有已知浓度的MT和激酶样品用于制备活性流体样品。活性流体被合成，加载到聚丙烯酰胺涂层流动单元中，细胞用UV胶密封（第3节和第4节）46。

为了演示对活性流体活性与温度的控制，活性流体样品安装在自制温度级（步骤5.2，图3A-C）。样品温度由控制器根据比例积分导数（PID）算法53进行监测和控制。在10°C、20°C、30°C和40°C下控制的样品在0.1~0.3°C范围内出现4小时波动，表明这种温度控制设置的稳定性和可靠性（图3D）。

为了观察样品，设置被安装在荧光显微镜上。样品掺杂了Alexa 488标记的示踪剂，通过GFP通道（步骤6.1）用荧光显微镜成像。跟踪器每被成像一次 μt = 2 s。允许跟踪跟踪轨迹 ri的顺序图像，其中i表示跟踪器索引（步骤 6.2，图4A）。轨迹揭示了平均速度v（t） [lt;]ri（t） - ri（t- =t） =/=t>I （步骤 6.3）。在 20-36 °C 下测量的平均速度在t = 0~2 小时时似乎几乎与时间无关，而在 10 °C 和 40 °C 时，平均速度会迅速衰减（图 4B）。10°C的衰变是由MT去聚合在16°C以下引起的。40°C时的衰变是由于运动素簇在36°C以上发生故障。根据我们以前的研究，这些激酶运动簇在>36°C33预孵育后失去驱动对MT的能力。为了描述每个温度的平均速度，同时反映这些因素引起的衰减，平均速度平均在t = 1⁄2 h （步骤 6.3 和 6.4）33之间。时间平均平均速度测量在10°C~40°C之间（步骤6.5，图4C）。在 16°C 和 36°C 以上，由于 MT 去聚合和运动素簇33故障，平均速度迅速衰减，而将温度从 16 °C 增加到 36 °C 将平均速度从 4 ° c 加速到 8 μm/s，证明了使用温度调整有源流体流的平均速度的可行性。为了进一步证明温度控制的能力，系统温度每30分钟在20°C和30°C之间交替。有源流体的平均速度不仅相应加速和减速，而且对10秒内的温度变化做出反应（图5）。活性流体的这种可逆和快速的反应证明了使用温度动态控制流体活动的可行性。

Figure 1
图1：运动因子驱动、基于MT的3D有源流体的介绍。（A） 交相滑动的原理图.反平行的MT成对由消耗物捆绑，由电机簇驱动。（B） 电机集群共同驱动对 MT，导致 MT 捆绑包扩展。（C） 扩展束构成基于 MT 的活性凝胶（绿色），搅动周围的液体以诱导流动。为了跟踪流动，液体被掺杂了示踪剂（红色）。这个数字是改编自贝特等人33。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：来自气布蛋白和激酶纯化的SDS凝胶图像。（A） 纯化图布林的SDS凝胶的图像.（B） 回收的tubulin和纯化运动蛋白的SDS凝胶的图像。从左到右的通道是蛋白质标准，空白，1.25~0.25毫克/毫克/毫克的再生图布林，空白和运动蛋白库存。（C） 纯化运动素的浓度是通过将带亮度与具有测量浓度（内联中的红色和蓝色虚线矩形）的图布林顺序带进行比较来确定的。每个波段的亮度是通过对裁剪的波段图像中的像素值求和来测量的。为了降低背景噪音，在裁剪凝胶图像之前，将凝胶图像转移到灰度、黑白倒置，然后对比增强以显示黑色背景（内接）。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3：温度控制设置。（A） 用于温度控制设置的铝块的原理图.该块包含一个内部通道，供水流过，并带走 TEC 产生的热量。中央孔允许样品在一侧通过明亮的场显微镜进行照明，并在另一侧以目标成像。（B） 温度控制设置的原理图.硅热浆在铝冷却块和 TEC 之间以及 TEC 和蓝宝石盘之间应用。（C） 安装在温度控制台上的样品的图像.水管连接到浸入水箱中的泵。（D） 记录的样品温度与目标温度的时间之比分别为 10 °C、20 °C、30 °C 和 40 °C。样品温度保持在0.1~0.3 °C的温度下。B和D改编自贝特等人33。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：调节活性流体通过温度流动。（A） 成像示踪器（白点）允许按顺序跟踪流轨迹（杂色曲线）。在室温（+20°C）下，每5s（μt = 5 s）监测示踪剂。（B） 跟踪器的平均速度与 10°C、20 °C、30 °C、36 °C 和 40 °C 的时间。（C） 跟踪器平均速度与温度每个点表示第一和第二个小时内的平均跟踪器平均速度。低于16°C的MT脱聚，36°C以上，激酶簇故障。因此，工作温度在 16-36 °C 之间，平均速度从 4~8 μm/s 不等。误差条表示时间平均平均速度的标准偏差。B和C改编自贝特等人33。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：通过定期交替系统温度来改变有源流体的流速。每 30 分钟将温度切换在 20°C 到 30°C 之间，可重复加速和减速流速，从而证明随温度对活性流体活动进行局部控制。这个数字是改编自贝特等人33。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

就地控制活性物质为主动物质4、5、24、28、54的定向自组织打开了大门。在本文中，我们提出了一个协议，使用温度来控制运动因子驱动的，基于MT的有源流体的原位，基于系统的Arrhenius特性29，30，31。由于该系统基于蛋白质，因此在整个实验中保持蛋白质功能是成功应用该协议的关键。系统中的主要蛋白质是MT和激酶簇。前者在16°C以下脱聚，后者故障在36°C以上33。因此，保持系统温度在16~36°C之间对于有源流体发展稳定动力学和使其对温度的可逆反应至关重要（图4和图5）。然而，温度是基于PID算法控制的，该算法往往超过目标温度53。为了减少这种过冲，我们建议在设置最终目标温度之前设置多个中间目标温度。例如，为了将样品从室温（约20°C）加热到35°C，而不是将目标温度直接设定在35°C，我们建议中间目标温度为30°C，以减少温度上升超过36°C的可能性，这将不可逆转地损害蛋白质33。同样，当样品从室温冷却到+16°C时，建议将中间目标温度设定为18°C，因为在达到稳定状态之前，PID可能会冷却样品低于16°C，去聚性MTs3。

提出的温度控制方法依赖于使用TEC的冷却和加热。使用TEC可确保样品在几秒钟内达到目标温度，而使用温度控制水浴的传统温度控制设置需要几分钟才能达到所需温度（图5）55。TEC 产生非零净热，由铝内部水循环系统消散。然而，水允许模具生长，这将最终堵塞通道56。堵塞的通道抑制水流，热量会积聚在铝块中，最终熔化水管。熔化的管子导致水溢出显微镜和照相机，损坏电子仪器。因此，采用目前采用的温度控制设置，我们建议在水中加入0.1%的过氧化氢，以抑制霉菌生长57、58、59。我们希望此步骤将确保铝内部通道保持无堵塞，并防止水损坏附近的电子设备。

操纵温度、用聚丙烯酰胺涂覆流动细胞表面以及合成活性流体是实现这一原位控制的活性流体的三个关键步骤。然而，这种可控性仅限于所涉及的蛋白质可以正常工作的温度范围。在有源流体系统中，主要蛋白质是MT和激酶簇，它们在16-36°C33之间正常工作。在此温度范围内，有源流体的平均流动速度从 4–8 μm/s（图 4C） 变化。超出此范围的平均速度超出了所呈现的控制方法的极限。相反，Ross等人报告了一种替代方案，允许使用28光打开和关闭有源流体活动。光控制还允许在 50 μm 比例尺光学定义的边界内激活有源流体。然而，这种替代方法需要修改运动体结构，同时调整显微镜中的光学路径。相比之下，采用本文所述方法的优点是：1）活性流体不需要重新设计，2）显微镜不需要修改，3）温度控制设置成本低，使用方便;4）该方法可转移到其他温度依赖系统，如滑翔测定29、30、31、32或更多一般酶基系统60。我们还期望，提出的方法将为设计微流体系统打开大门，在微流体系统中，通道流量在无需阀门的情况下进行局部控制。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

疟原虫K401-BCCP-H6是兹沃尼米尔·多吉奇博士的礼物。这项研究得到了吴坤达博士在伍斯特理工学院的创业基金的支持。我们感谢Zvonimir Dogic博士为净化和标记图布林和合成活性液体的协议。我们感谢马克·里迪拉博士在蛋白质表达和纯化方面的专长。我们感谢威廉·本杰明·罗杰博士协助我们建立温控阶段。我们确认布兰代斯 MRSEC （NSF-MRSEC-1420382） 使用生物材料设施 （BMF）。我们感谢英国皇家化学学会对贝特等人关于软物质33的数据进行了调整。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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