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Engineering

Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la temperatura per controllare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali. Il vantaggio di questo metodo non solo consente di regolare le velocità di flusso in situ, ma consente anche il controllo dinamico, ad esempio l'ottimizzazione periodica delle velocità di flusso verso l'alto e verso il basso.

Abstract

Presentiamo un metodo per utilizzare la temperatura per ottimizzare le velocità di flusso dei fluidi attivi tridimensionali (3D) basati sulla kinesina e basati su microtubuli. Questo metodo consente di regolare le velocità in situ senza la necessità di produrre nuovi campioni per raggiungere diverse velocità desiderate. Inoltre, questo metodo consente il controllo dinamico della velocità. In bicicletta la temperatura porta i fluidi a fluire veloce e lento, periodicamente. Questa controllabilità si basa sulla caratteristica di Arrhenius della reazione kinesina-microtubule, dimostrando un intervallo di velocità di flusso medio controllato di 4-8 sm/s. Il metodo presentato aprirà la porta alla progettazione di dispositivi microfluidici in cui le portate nel canale sono localmente regolabili senza la necessità di una valvola.

Introduction

La materia attiva è differenziata dalla materia passiva convenzionale a causa della sua capacità di convertire l'energia chimica in lavoro meccanico. Un materiale che possiede tale capacità può consistere in entità viventi o non viventi come batteri, insetti, colloidi, cereali e filamenti citoscheletrici1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Queste entità materiali interagiscono con i rispettivi vicini. Su scala più ampia, si auto-organizzano in vortici turbolenti (turbolenza attiva) o flussi di materiale11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. La comprensione dell'auto-organizzazione della materia attiva ha portato a varie applicazioni in navette molecolari, dispositivi ottici e calcolo parallelo21,22,23. Per portare le applicazioni al livello successivo richiede un controllo al di là dell'auto-organizzazione. Ad esempio, Palacci e altri hanno sviluppato un colloide incapsulato di ematite che si è autopropulso solo se esposto alla luce blu controllata manualmente, che ha portato alla comparsa di cristalli viventi24. Morin ealtri stabilì il controllo dei colloidi Quincke rotolanti utilizzando un campo elettrico esterno regolabile, con conseguente affollamento colloidale in un canale 25 simile a uncircuito. Questi lavori precedenti dimostrano il ruolo del controllo locale nelle applicazioni e migliorano la base di conoscenze della materia attiva.

In questo articolo, ci concentriamo sulla controllabilità dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli (MT) basati sulla kinesina. I fluidi sono costituiti da tre componenti principali: MT, motori molecolari di chinasina e impoveritori. Gli esaurienti inducono una forza di esaurimento per impacchettare le MT, che vengono successivamente colmeggiate da cluster motori. Questi motori camminano lungo l'MTsverso l'estremità più. Quando una coppia di MTsis pontianti antiparallela, i motori corrispondenti camminano in direzioni opposte. Tuttavia, i motori sono legati in un cluster e non sono in grado di camminare a parte, in modo da scivolare in modo cooperativo coppie di MT (interfilamento scorrevole, Figura 1A). Queste dinamiche scorrevoli si accumulano, causando fasci di MT per estendere fino a raggiungere il loro punto di instabilità deformazione e rottura (fasci estensivi, Figura 1B)26. I fasci rotti sono anneriti dalla forza di esaurimento, che successivamente si estende di nuovo, e le dinamiche si ripetono. Durante il processo della dinamica di ripetizione, i movimenti del fascio mescolano il liquido vicino, inducendo flussi che possono essere visualizzati doping con traccianti in scala micron(Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. hanno caratterizzato le velocità medi dei traccianti, scoprendo che le velocità erano regolabili variando le concentrazioni di adenosina tripfofoso (ATP), impoverimenti, gruppi motori, e MT19,27. Tuttavia, tale sintunabilità esisteva solo prima della sintesi del fluido attivo. Dopo la sintesi, la sintonificabilità è stata persa e i fluidi si sono auto-organizzati a modo loro. Per controllare l'attività dei fluidi attivi dopo la sintesi, Ross.et al. ha riportato un metodo utilizzando la dimerizzazione attivata dalla luce delle proteine motorie, consentendo di attivare e disattivare l'attività del fluido utilizzando la luce28. Mentre il controllo della luce è conveniente in termini di attivazione locale dei fluidi, il metodo richiede di riprogettare le strutture delle proteine motorie, insieme a modificare i percorsi ottici in un microscopio. Qui, forniamo un metodo facile da usare per controllare localmente i flussi fluidi senza modifica del microscopio, mantenendo intatta la struttura motoria.

Il nostro metodo di sintonizzazione locale del flusso di fluido attivo si basa sulla legge Arrhenius perché la reazione kinesin-MT è stata segnalata per aumentare con temperatura29,30,31,32. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che la dipendenza dalla temperatura della velocità media di un flusso di fluido attivo ha seguito l'equazione di Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), dove A è un fattore pre-esponenziale, R è la costante di gas, Ea è l'energia di attivazione e T è la temperatura del sistema33. Pertanto, l'attività del fluido è sensibile all'ambiente di temperatura e la temperatura del sistema deve essere costante per stabilizzare le prestazioni del motore e, di conseguenza, la velocità di flusso del fluido34. In questo articolo, dimostriamo l'uso della dipendenza dalla temperatura del motore per ottimizzare continuamente le velocità di flusso dei fluidi attivi regolando la temperatura del sistema. Dimostriamo anche la preparazione di un campione di fluido attivo, seguito dal montaggio del campione in una fase del microscopio la cui temperatura è controllata tramite software per computer. L'aumento della temperatura da 16 a 36 gradi centigradi accelera la velocità media di flusso da 4 a 8 m/s. Inoltre, la sintonabilità è reversibile: aumentando ripetutamente e diminuendo la temperatura in sequenza accelera e decelera il flusso. Il metodo dimostrato è applicabile a una vasta gamma di sistemi in cui le principali reazioni obbediscono alla legge Arrhenius, come l'analisi MT che scivola29,30,31,32.

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Protocol

1. Preparazione delle MT

AVVISO: In questo passaggio purifichiamo le tubuline dal tessuto cerebrale bovino. Cervello bovino può causare variante malattia di Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Pertanto, i rifiuti cerebrali e le relative soluzioni, bottiglie e punte di pipette dovrebbero essere raccolti in un sacchetto di rifiuti organici e smaltiti come rifiuti biopericolosi secondo le regole dell'istituzione.

  1. Purificare le tubuline dal cervello bovino (modificato da Castoldi et al.36).
    1. Trasportare circa 1,5 kg di cervelli bovini freschi da un macello locale a una cella frigorifera universitaria. Durante il trasporto, conservare su ghiaccio i cervelli nel buffer di fosfato (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2).
      NOTA: Per massimizzare la resa finale della tubulina, la quantità iniziale di tubulina funzionale nel tessuto cerebrale fresco è fondamentale. Cervelli più freschi contengono tubulina più funzionale. Per ottenere i cervelli più freschi dal macello, si consiglia di chiedere al macellaio di fornire cervelli dalle mucche macellaite più di recente. I cervelli non dovrebbero essere più vecchi di 3 h all'avvio della procedura, perché ridurre il tempo tra la macellazione e l'inizio della procedura produrrà rese migliori.
    2. Omogeneizzare e chiarire il cervello.
      1. Pulire il cervello utilizzando bisturi per tagliare i vasi sanguigni e tessuto connettivo in pezzi più piccoli e rimuoverli dal cervello a mano.
        NOTA: I cervelli puliti devono essere rosa.
      2. Immergere il tessuto cerebrale pulito in 1 L del buffer di depolimerizzazione (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) acido etanonico, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per chilogrammo di cervello.
      3. Omogeneizzare il cervello con un frullatore da cucina.
      4. Centrifugare la soluzione cerebrale omogeneizzata a 10.000 x g e 4 gradi centigradi per 150 min.
    3. Polimerizzare gli MT (prima polimerizzazione).
      1. Raccogliere e mescolare il supernatante con volumi uguali delle seguenti soluzioni a 37 : glicerolo, ad alta molarità PIPES buffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM etilene glycol-bis(-aminoehyl etere)-N,N,N',N'-----acido tenacetico [EGTA], pH 6.9)
      2. Aggiungere 1,5 mM ATP e 0,5 mM guanosine triposfato (GTP) alla miscela.
      3. Incubare il composto a 37 gradi centigradi per 1 h.
    4. Depolimerizzare gli MT (prima depolimerizzazione MT).
      1. Pellet MT centrifugando a 151.000 x g e 37 gradi centigradi per 30 min.
      2. Scartare supernatante e risospendere ogni pellet MT in 10 mL di 4 c.
      3. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
      4. Agitare la miscela ogni 5 min con una punta di pipetta per evitare la sedimentazione MT.
        NOTA: La miscela deve essere libera in 30 min, indicando il completamento della depolimerizzazione MT.
    5. Polimerizzare gli MT (seconda polimerizzazione MT).
      1. Chiarire la soluzione centrifugando a 70.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
      2. Raccogliere e mescolare il supernatante con volumi uguali di 37 .C glicerol e HMPB.
      3. Aggiungere 1,5 mM ATP e 0,5 mM GTP alla miscela.
      4. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min.
    6. Ripetere il passaggio 1.1.4, sostituendo HMPB con Brinkley reassembly buffer (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8), seguito da chiarire la miscela deselezionata scanaverla a 79.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    7. Raccogli il super-natante. Misura l'assorbimento di 280 nm con uno spettrometro. Determinare la concentrazione di tubulina utilizzando la legge Birra-Lambert (coefficiente di estinzione della tubulina: 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Conservare la proteina a -80 gradi centigradi.
  2. Riciclare le tubuline (modificate da Castoldi et al.36).
    NOTA: Per migliorare la purezza della tubulina, la tubulina purificata viene polimerizzata e depolimerata di nuovo.
    1. Polimerizzare le MT mescolando la tubulina purificata (passaggio 1.1,7) con 500 m dithiothreitol (DTT) e 20 -M GTP, seguiti da 30 min di incubazione a 37 .
    2. Pellet le MT.
      1. Caricare 1 mL di cuscino glicerolo (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6,8) nella parte inferiore di un tubo di centrifuga.
      2. Posare le MT polimerizzate sopra il cuscino.
      3. Centrifuga a 172.000 x g per 90 min a 37 gradi centigradi.
    3. Depolerare le MT.
      1. Rimuovere il supernatante e il cuscino.
      2. Risospendere ogni pellet MT in 150 : L di buffer 4 MT (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8).
      3. Incubare la miscela sul ghiaccio per 30 min.
      4. Agitare il composto con una punta di pipetta ogni 5 min. La miscela dovrebbe diventare chiara.
    4. Chiarire la miscela centrifugando a 172.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    5. Raccogli il super-natante. Misurare la concentrazione proteica. Conservare a -80 gradi centigradi.
  3. Etichettare la tubulina con la tintura fluorescente39.
    1. Polimerizza le MT. Mescolare la tubulina purificata (passaggio 1.1.7) con 500 SM DTT e 16,7 -M GTP, e incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min.
    2. Pellet le MT.
      1. Collocare 1 mL di 37 gradi centigradi di cuscino ad alto pH (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerolo, pH 8,6) in un tubo di centrifuga.
      2. Posare le MT polimerizzate sul cuscino.
      3. Centrifuga a 327.000 x g per 50 min a 37 gradi centigradi.
    3. Etichetta tubulina.
      1. Risospendere ogni pellet MT con 700 l un buffer di etichettatura di 37 M (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40% v/v glicerol, pH 8,6).
      2. Mescolare le sospensioni con un eccesso di 10-20 molari di coloraria fluorescente di gran lunga rossa funzionalizzato con un ester succinimidyl.
      3. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi per 30 min al buio per consentire alle MT di reagire con l'ester del coloranti fluorescente.
      4. Fermare la reazione di etichettatura saturando l'estere del colorante di sospensione con 50 mM K-glutammato, incubando per 5 min a 37 gradi centigradi.
    4. Pellet i MT etichettati: Ripetere la fase 1.3.2, sostituendo il cuscino ad alto pH con cuscino a basso pH (80 mM di tubi, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8).
    5. Depolimerizzare le MT.
      1. Scartare il supernatante e il cuscino.
      2. Risospendere il pellet a 700 gradi l.l di 4 gradi centigradi M2B.
      3. Incubare le sospensioni sul ghiaccio.
      4. Agitare ogni 5 min con una punta di pipetta fino a quando la soluzione è chiara.
    6. Chiarire la soluzione chiarita con la centrifuga a 184.000 x g e 4 gradi centigradi per 35 min.
    7. Migliorare la purezza della soluzione di tubulina etichettata ripetendo i passaggi 1.2.1–1.2.4.
    8. Misurare la concentrazione di proteine e tinture fluorescenti. Utilizzare queste misurazioni per determinare la concentrazione di tubulina e le frazioni di tubulina etichettata, definite come il rapporto tra le concentrazioni di tintura fluorescente e la tubulina.
    9. Conservare la soluzione di tubulina etichettata a -80 gradi centigradi.
  4. Polimerizzare le MT (adottato da Sanchez et al.19):
    1. Mescolare la tubulina riciclata (passaggio 1.2.5) con la tubulina etichettata (passaggio 1.3.9) in un rapporto che produce una frazione di tubulina etichettata del 3%.
    2. Mescolare la miscela di tubulina 8 mg/mL con 1 mM DTT e 0,6 mM di guanosina-5'[(z, z)-metilino]trifosfato (GMPCPP), seguito da 30 min di incubazione a 37 gradi centigradi.
    3. Dopo l'incubazione, anneal le MTs a temperatura ambiente al buio per 6 h.
    4. Aliquota e conservare a -80 gradi centigradi.

2. Sintetizzare gli ammassi di kinesin

NOTA: I batteri esistono onnipresenti e possono crescere nei media e contaminare il processo di preparazione. Per prevenire la contaminazione, le azioni che coinvolgono il contatto con le colture cellulari (ad esempio, il pipettaggio) DEVONO essere eseguite vicino a una fiamma. Utensili come flaconi, pipette, punte di pipette, supporti e piastre DEVONO essere autoclaved prima dell'uso.

  1. Esprimere i motori kinesin in Escherichia coli40.
    1. Trasforma le celle.
      1. Pipetta 1 - L del plasmide K401-BCCP-H6 in 10 - L di cellule competenti.
      2. Incubare sul ghiaccio per 5 min.
      3. Scossa di calore a 42,5 gradi centigradi per 45 s.
      4. Incubare le cellule sul ghiaccio per 2 min per consentire il recupero.
      5. Mescolare le cellule con 300 litri di 2XYT senza antibiotici (5 g/L NaCl, 10 g/L di estratto di lievito, 16 g/L di tryptone).
      6. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi per 1 h.
        NOTA: se non specificato, il monitoraggio della crescita cellulare non è necessario durante l'incubazione.
    2. Supporti piastra inoculata.
      1. Stendere la coltura cellulare su una piastra 2XYT (10 g/L NaCl, 5 g/l di lievito, 10 g/L tryptone, 15 g/l di agar, 100 ampicillina g/mL, 25 g/mL di clautoramenico).
      2. Incubare la piastra a testa in giù a 37 gradi durante la notte.
    3. Inoculare i supporti liquidi.
      1. Dalla piastra notturna, raccogliere una colonia isolata con una punta di pipetta.
      2. Espellere la punta in un flacone contenente 50 mL di 2XYT.
      3. Incubare e scuotere i mezzi di coltura a 37 e 200 giri/min per 12-16 h.
    4. Espandere le celle.
      1. Mescolare 2,5 mL della coltura cellulare in 500 mL di 2XYT.
      2. Incubare e scuotere la coltura di 500 mL a 37 e 250 giri/mm per 3-6 h.
    5. Indurre l'espressione proteica.
      1. Durante l'incubazione, monitorare la crescita delle cellule misurando l'assorbimento a 600 nm, utilizzando 2XYT come riferimento. Misurare l'assorbimento ogni 60 min, fino a raggiungere OD600 - 0.3. Quindi misurare l'assorbimento ogni 30 min fino a raggiungere 0,5–0,6.
      2. Lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere l'assorbimento600 - 0,5–0,6
      3. Aggiungete alla coltura cellulare 24 biotina g/mL e 1 mM di isopropile -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
        NOTA: IPTG viene utilizzato per indurre l'espressione proteica dei motori della kinesina, che sono etichettati con proteina portaborse a biotina (BCCP) e sei istidine (H6). Il tag H6 viene utilizzato nel processo di purificazione (fase 2.2), mentre il BCCP si lega alle molecole di biotina aggiunte per biotinyilare i motori della cinesia espressi.
      4. Incubare e scuotere la coltura cellulare a 20 e 250 rpm per 12-20 h.
    6. Raccogliere le cellule centrifundo a 5.000 x g e 4 gradi centigradi per 10 min. Conservare i pellet cellulari a -80 gradi centigradi.
  2. Purificare la proteina motoria della cinesia (modificata da Spriestersbach et al.41):
    1. Sospendere il pellet cellulare (passaggio 2.1.6) con un volume uguale di buffer di lisi (50 mM PIPE, 4 mM MgCl2, 50 s ATP, 10 mM 2-mercaptoetanolo (-ME), 20 mM imidazole, pH 7.2), seguito dall'aggiunta di una compressa di inibitore proteasi, 2 mg di fluoruro fenilmethyl (PMSF) e 2 mg di lisita.
    2. Lisciviazione delle cellule con congelamento lampo in azoto liquido (LN) 3x e scongelare la miscela cellulare.
      NOTA: Dopo il lising, la miscela dovrebbe diventare viscosa.
    3. Chiarire la miscela di cellule lised centrifugando a 230.000 x g e 4 gradi centigradi per 30 min.
    4. Raccogliere il supernatante e fluire attraverso una colonna di gravità, seguito da lavare la colonna con 10 mL di lisi tampone.
      NOTA: Le proteine con tag H6, come kinesin K401-BCCP-H6, devono rimanere nella colonna.
    5. Eluare la proteina marcata con 5 mL di tampone di eluizione (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 ATP, 500 mM imidazole, pH 7.2). Raccogliere il flow-through in sequenza in frazioni da 1 mL. Per determinare le frazioni contenenti proteine, mescolare 3 l di ogni frazione con 100 -L di colorante tripenylmethane. Le frazioni contenenti proteine dovrebbero diventare blu. Combinare queste frazioni e diluire di 5x con buffer di lisi.
    6. Concentrare la soluzione proteica.
      1. Caricare la soluzione in un tubo filtrante centrifugo.
      2. Centrifuga a 3.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
      3. Agitare delicatamente il tubo e centrifugare di nuovo fino a quando il volume della soluzione è di <3 mL.
    7. Misurare la concentrazione proteica con uno spettrometro (coefficiente di estinzione: 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43. Diluire la proteina a 1 mg/mL aggiungendo il 35% di saccarosio w/v.
    8. Conservare a -80 gradi centigradi.
  3. Misurare le concentrazioni di kinesin con un gel di elettroforesi (modificato da Taylor et al.44).
    NOTA: Per misurare la concentrazione di cinesina con un gel di elettroforesi, la tubulina è una scala di concentrazione ideale a causa della sua elevata purezza e della sua concentrazione misurabile tramite uno spettrometro (Figura 2A)36.
    1. Preparare campioni di tubulina con concentrazioni di 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 e 1,25 mg/mL. Mescolare 15 l di ogni campione di tubulina e di kinesina (passaggio 2.2,8) separatamente con 5 l di buffer campione (200 mM Tris-HCl, 8% solfato di solfato di sodio di sodio (SDS), 400 mM DTT, 0,2% blu bromofenolo, 40% glicerolo, pH 6,8) e incubare a 90 s C per 3 min.
    2. Preparare l'elettroforesi.
      1. Bloccare un gel per l'elettroforesi nella scatola del gel.
      2. Riempire la scatola con buffer in esecuzione (50 mM MOPS, 50 mM Tris base, 0.1% SDS, 1 mM di acido etilenediaminetraceacetica (EDTA), pH 7.7).
        NOTA: Assicurarsi che il livello del buffer sia superiore all'apertura superiore del gel.
    3. Caricare 10 L di proteine standard ladder, campioni di tubulina, e il campione di kinesina in pozzi separati e applicare 200 V attraverso il gel per 45 min.
    4. Colorazione del gel.
      1. Incubare e cullare il gel con una soluzione di macchia bollita (circa 95 gradi centigradi) con una soluzione di colorazione A (0,5 g/L di triphenylmethane, 10% v/v di acido acetico, 25% isopropanolo) per 5 min, quindi sciacquare il gel con acqua deionizzata (DI).
      2. Ripetere con le soluzioni di colorazione B (0,05 g/L di tripenylmethane, 10% v/v acetic acito acetico, 10% isopropanol), C (0,02 g/L triphenylmethane dye, 10% v acetica) e D (10% v/v acetica), in sequenza. Incubare e scuotere il gel in acqua DI durante la notte.
    5. Scansionare il gel. Convertire l'immagine gel in un'immagine in scala di grigi, seguita da un'inversione in bianco e nero e miglioramento del contrasto per rivelare bande proteiche luminose sullo sfondo nero.
    6. Misurare la luminosità di ogni banda sommando i valori dei pixel. Applicare l'adattamento lineare C , aB , dove B è la luminosità di una banda di tubulina, C è la concentrazione corrispondente e a e b sono parametri di raccordo. Determinare la concentrazione di kinesin Ck utilizzando la luminosità della banda kinesinB kper calcolare l'equazione lineare: Ck
  4. Ammassare i motori kinesin.
    1. Mescolare la kinesina 1,5 M (passaggio 2,2,8) con 120 M DTT e 120 nM streptavidin. Incubare sul ghiaccio per 30 min.
    2. Conservare a -80 gradi centigradi.

3. Preparare vetrini e copricapi in vetro rivestiti in poliacrilammide (modificati da Lau et al.45)

  1. Caricare nuovi vetrini di vetro e coperture di vetrolips in contenitori corrispondenti. Immergere i vetrini e i copriletti in detersivo v/v dell'acqua DI e quindi far bollire l'acqua in un forno a microonde.
  2. Sonicare i vetrini e coprilabbra per 5 min e poi risciacquare con acqua DI per rimuovere il detersivo.
  3. Immergere e sonicare i vetrini e coprilabbra in etanolo per 5 min.
  4. Immergere e sonicare i vetrini e copriletti in idrossido di potassio 100 mM (KOH) per 5 min.
  5. Incubare i vetrini e i copriletti in una soluzione silane (1% di acido acetico e 0,5% 3-(trimethoxylyl)propyl methacrylate in etanolo) per 15 min e poi risciacquare con acqua DI.
  6. Incubare i vetrini e i copricapi in soluzione acrilamide (2% w/w acrilamide, 0,7 mg/mL persodatore di ammonio e 0,0035% v/v tetramethylelelediamine in acqua DI) per 3 h.
  7. Conservare i vetrini e i copricapi nella soluzione acrilammide.

4. Preparare fluidi attivi basati su MT guidati dalla kinesina

  1. Preparare i fluidi attivi (modificati da Sanchez et al.19).
    NOTA: i passaggi seguenti illustrano il processo di preparazione di 100 l-l di un fluido attivo utilizzando supporti di esempio. Il volume finale è scalabile e le concentrazioni degli stock di esempio possono essere rettificate fino a quando viene mantenuta la concentrazione finale di ciascun componente.
    1. Mescolare 16,7 L di 8 mg/mL Di MT (passaggio 1,4,4) con 6,7 -L di 1,8 M di cluster di motori di kinesina (passaggio 2.4.2) e 1,1 L di 500 mM DTT in M2B ad alto sale (M2B - 3,9 m MgCl2).
    2. Inbundle MT con l'aggiunta di 11,4 L del 7% w/w polietilene glicole (PEG).
    3. Attivare i motori kinesin sommando 2,8 litri di 50 mM ATP.
    4. Mantenere le concentrazioni di ATP aggiungendo 2,8 l- di dehydrogenasi/lacrate di pisofato di pisello (PEP) e 13,3 - L di 200 mM di piratrae fosfenolo (PEP).
    5. Riduci l'effetto fotosbiancante aggiungendo 10 -L di 20 mM Trolox, 1,1 litri di catalasi da 3,5 mg/mL, 1,1 l di 20 mg/mL di glucosio ossidase e 1,1 l di 300 mg/mL di glucosio.
    6. Tracciare il movimento del fluido aggiungendo 1,6 - L di 0,025% di particelle tracciante v/v.
    7. Aggiungere M2B ad alto sale per ottenere un volume totale di 100 l.
      NOTA: gli ordini di miscelazione nei passaggi da 4.1.1 a 4.1.6 sono intercambiabili. Tuttavia, una volta che ATP, MT e motori sono mescolati, i motori iniziano a consumare ATP mentre passo lungo le MT. Il campione viene attivato con una durata limitata a causa dei combustibili limitati (ATP e PEP), quindi l'esperimento deve essere avviato prontamente. Il fluido attivo finale deve contenere 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin cluster motori, 5,5 mM DTT, 0.8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0.038 mg/mL catalasi, 0.22 mg/mL di ossidasi di glucosio, 3,3 mg/mL di glucosio e 0,0004% v/v colloid in-mB.
  2. Preparare un campione in un canale di flusso (modificato da Chandrakar et al.46):
    1. Sciacquare uno scivolo in vetro rivestito in poliacrilammide e un coperchio (passaggio 3.7) con acqua DI. Asciugare i bicchieri con aria pressurizzata. Posizionare su una superficie pulita e piana.
    2. Tagliare due strisce di pellicole di cera con una larghezza di 3 mm e la stessa lunghezza della vetrina di vetro (20 mm). Inserire le strisce tra la diapositiva e coverslip come distanziali dei canali.
    3. Aderire il vetro alla pellicola di cera mettendo il complesso di cera di vetro su una piastra calda di 80 gradi centigradi per sciogliere la cera. Durante la fusione, premere delicatamente il coperchio della copertina con una punta di pipetta per aderire uniformemente la pellicola di cera alle superfici vetrate. Dopo l'adesione, raffreddare il complesso di vetro a temperatura ambiente.
    4. Caricare i fluidi attivi (passaggio 4.1) sul canale di flusso. Sigillare il canale con colla UV.

5. Controllare la temperatura del campione

  1. Costruire un setup di controllo della temperatura (modificato da disegni in Lowensohn et al. e Wu et al.47,48,49).
    1. Preparare un blocco di raffreddamento in alluminio.
      1. Fresa una piastra di alluminio con dimensioni di circa 30 mm , 30 mm e 5 mm.
      2. Forare un canale interno attraverso la piastra (Figura 3A) e installare i raccordi del tubo flessibile alle estremità del canale.
      3. Agganciare ogni raccordo a un tubo dell'acqua.
      4. Collegare un tubo a una pompa di serbatoio di pesce in un serbatoio d'acqua mentre si estende l'altro tubo al serbatoio.
        NOTA: La pompa farà circolare l'acqua del serbatoio attraverso i canali interni in alluminio per mantenere la temperatura del blocco a temperatura approssimativamente ambiente.
    2. Collegare un dispositivo di raffreddamento termoelettrico (TEC) e un termosensore a un regolatore di temperatura. Collegare il controller a un computer utilizzando una porta USB (Figura 3B).
    3. Collegare il controller di temperatura a un alimentatore a corrente diretta (DC). Accendere il controller collegando l'alimentatore a una presa elettrica.
    4. Eseguire la configurazione iniziale del TEC seguendo la guida del produttore del controller. Testare l'output TEC. Si raccomanda di controllare il controller di temperatura tramite il software fornito dal produttore, consentendo la registrazione dei dati termosensoriali e una più facile manipolazione del controller di temperatura.
    5. Identificare i lati di riscaldamento e raffreddamento del TEC.
    6. Fissare il lato di raffreddamento del TEC sul blocco di raffreddamento (passaggio 5.1.1) utilizzando la pasta termica.
    7. Collegare un disco zaffiro al lato riscaldante del TEC utilizzando la pasta termica.
    8. La configurazione è completa. La superficie zaffiro e il termosensore possono contattare un campione per raffreddare e riscaldare il campione in base alla temperatura e alla temperatura di destinazione.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare il TEC e il blocco di raffreddamento per l'imaging dei campioni mediante microscopia a campo luminoso (Figura 3C).
  2. Utilizzare la configurazione del controllo della temperatura per controllare la temperatura del campione33.
    1. Montare il campione nella configurazione.
      1. Posizionare il campione di fluido attivo (passaggio 4.2.4) sulla superficie dello zaffiro con il lato scorrevole che contatta la superficie.
      2. Fissare lo scivolo di vetro con nastro adesivo.
      3. Attaccare il termosensore alla superficie dello scivolo di copertura utilizzando nastro adesivo di rame.
    2. Montare l'impostazione su uno stadio al microscopio con il lato coverslip rivolto verso gli obiettivi. Ad esempio, su un microscopio invertito, il lato coverslip dovrebbe essere rivolto verso il basso. Fissare l'installazione con nastro di carta e i morsetti aghi al microscopio, se applicabile.
      NOTA: La fase di temperatura presentata dovrebbe funzionare con microscopi comuni invertiti o verticali. Per garantire che la fase di temperatura non venga spostata durante l'esperimento, è meglio fissare la fase di temperatura allo stadio del microscopio con nastro adesivo.
    3. Controllare la temperatura del campione.
      1. Accendere il controller di temperatura e la pompa del serbatoio del pesce.
      2. Seguire la guida del produttore per impostare la temperatura di destinazione e attivare il controllo della temperatura. Il controller regolerà la potenza di riscaldamento o di raffreddamento in base alla temperatura di destinazione e alla temperatura del campione, come valutato dal termosensore.
    4. Registrare le temperature del campione.
      1. Seguire la guida del produttore per registrare i dati sulla temperatura del termosensore durante l'esperimento.
        NOTA: la temperatura del campione deve ora essere controllata dal controllore e registrata dal computer(Figura 3D).

6. Caratterizzare l'attività del fluido attivo (modificata dai metodi di Henkin et al. e Wu et al.20,27)

NOTA: le sezioni precedenti vengono utilizzate per preparare campioni di fluidi attivi (sezioni 1–4) e controllarne la temperatura (sezione 5). Per dimostrare l'uso della temperatura per controllare l'attività del fluido attivo, osservare i comportamenti dei fluidi, analizzare le loro attività e caratterizzare la loro risposta alla temperatura.

  1. Monitorare i traccianti.
    1. Immagine del campione con un intervallo costanteche usa la fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) per catturare il movimento delle particelle traccianti.
      NOTA: è necessario scegliere l'opzioneT per consentire la tracciazione del movimento del tracciante. Valorit di grandi dimensioni, come 100 s, comportano la perdita delle traiettorie del tracciante, mentre brevi valoridi t, come 0,1 s, impediscono all'algoritmo di tracciamento di rilevare il movimento del tracciante tra i fotogrammi. Unvalore t di lavoro deve consentire allo spostamento del tracciante tra i fotogrammi di essere compreso tra 9 pixel. Per i traccianti di imaging che si muovono a 10 m/s utilizzando un obiettivo 4x, si consiglia di utilizzare lat di 1-5 s.
    2. Salvare le immagini come file TIFF, assegnare un nome ai file in base al numero di fotogramma e memorizzarle in una cartella separata. Questi processi sono necessari per garantire che le immagini acquisite vengano analizzate correttamente con lo script MATLAB fornito (passaggio 6.2.2).
  2. Traccia traccia che adottano il software di tracciamento sviluppato da Ouellette et al.50,51):
    1. Scarica il software di monitoraggio dall'Environmental Complexity Laboratory, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Assicurarsi che ogni file MATLAB si trova nella stessa cartella.
    2. Tracciare i traccianti utilizzando uno script MATLAB personalizzato: particle_tracking.m. Lo script legge le immagini del tracciante (passaggio 6.1) e tiene traccia del movimento dei traccianti utilizzando il software di Ouellette et al.50,51. Restituisce due file: 1) background.tif, che rappresenta lo sfondo dell'immagine, e 2) Tracking.mat, contenente le traiettorie e le velocità delle particelle in ogni fotogramma (Figura 4A).
  3. Analizzare le velocità medi di tracciamento utilizzando uno script MATLAB personalizzato: analysis.m. Lo script legge il file di rilevamento (Tracking.mat) e restituisce la velocità media dei traccianti rispetto al tempo, insieme a una velocità media media con le finestre medie specificate (Figura 4B)33.
  4. Registrare la velocità media media media del tempo.
  5. Misurare la velocità media media ripetendo l'esperimento (passaggi 4, 5.2 e 6,1–6,4) a 10-40 gradi centigradi. Utilizzare le velocità mediche registrate per tracciare la velocità media rispetto alla temperatura (Figura 4C)33.

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Representative Results

La preparazione dei fluidi attivi basati sulla kinesina e basati su MT richiede sia kinesin che MT. Le MT sono state polimerizzate dalle tubuline etichettate (passaggi 1.3 e 1.4) che sono state purificate dai cervelli bovini (passaggio 1.1, Figura 2A), seguiti dal riciclaggio per migliorare la purezza (passaggio 1.2, Figura 2B). Le proteine motorie della cinesia sono state espresse e purificate da E. coli (passaggi 2.1 e 2.2, Figura 2B)41,52. La concentrazione dello stock di kinesina preparato è stata misurata con un gel SDS confrontando la luminosità della banda principale con quella delle tubuline riciclate con concentrazioni note (passaggio 2.3, Insorgenza della Figura 2B ). I valori di luminosità delle bande di tubulina (B) erano linearmente adattati alla loro concentrazione corrispondente (C) utilizzando l'equazione C , aB , producendo un valore di 3,1 - 10-2 mg/mL e s.p. L'equazione adattata è stata utilizzata per determinare la concentrazione di una banda di kinesina applicando la luminosità misurata della banda, Bk - 1.060, producendo una concentrazione di cinesina di Ck - 0,95 mg/mL. Sono stati utilizzati campioni di MT e kinesina con concentrazioni note per preparare campioni di liquidi attivi. I fluidi attivi sono stati sintetizzati, caricati in una cella di flusso rivestita di poliacrilammide, e la cella è stata sigillata con colla UV (sezioni 3 e 4)46.

Per dimostrare il controllo dell'attività del fluido attivo con la temperatura, il campione di fluido attivo è stato montato sullo stadio di temperatura fatta in casa (passaggio 5.2, Figura 3A-C). La temperatura del campione è stata monitorata e controllata dal controllore secondo un algoritmo decennale (PID) proporzionale-integrale-derivato53. I campioni controllati a 10 , 20 gradi centigradi, 30 gradi centigradi e 40 gradi centigradi sembravano fluttuare a temperatura entro 0,1-0,3 gradi centigradi per 4 h, dimostrando la stabilità e l'affidabilità di questa configurazione di controllo della temperatura (Figura 3D).

Per osservare il campione, l'installazione è stata montata su un microscopio a epifluorescenza. Il campione è stato imbecillato con traccianti etichettati Con Alexa 488, che sono stati immagini con microscopia a fluorescenza tramite un canale GFP (passaggio 6.1). I traccianti sono stati immagini di ogniz- Le immagini sequenziali consentite per tenere traccia delle traiettorie di tracciabilità ri, dove i rappresenta l'indice di tracciante (passaggio 6.2, Figura 4A). Le traiettorie hanno rivelato una velocità media v(t) - < ri(t) - ri(t-t- n. ) Le velocità medie, misurate a 20-36 gradi centigradi, sembravano essere quasi indipendenti nel tempo a 0-2 h, mentre a 10 e 40 gradi centigradi le velocità medie sono decadute rapidamente(Figura 4B). Il decadimento a 10 gradi centigradi è stato causato dalla depolimerizzazione di MT al di sotto dei 16 gradi centigradi. Il decadimento a 40 gradi centigradi è dovuto al malfunzionamento degli ammassi di kinesina al di sopra dei 36 gradi centigradi. Secondo i nostri studi precedenti questi cluster motori kinesin perdono la capacità di guidare coppie di MT dopo la preincubazione a >36 C33. Per caratterizzare le velocità medie per ogni temperatura riflettendo il decadimento indotto da questi fattori, le velocità medie sono state medie tra t e 1-2 h (passaggi 6.3 e 6.4)33. Le velocità medie medie nel tempo sono state misurate tra i 10 e i 40 gradi centigradi (passaggio 6,5, figura 4C). Al di sotto dei 16 e al di più dei 36 gradi centigradi la velocità media è decaduta rapidamente a causa della depolimerizzazione della MT e del malfunzionamento dei cluster di kinesina33, mentre l'aumento delle temperature da 16 a 36 gradi centigradi ha accelerato la velocità media da 4 a 8 m/s, dimostrando la fattibilità della regolazione della velocità media di una temperatura di flusso del fluido attiva utilizzando. Per dimostrare ulteriormente la capacità del controllo della temperatura, le temperature del sistema sono state alternate tra i 20 e i 30 gradi centigradi ogni 30 min. La velocità media dei fluidi attivi non solo ha accelerato e decelerato di conseguenza, ma hanno anche risposto al cambiamento di temperatura entro 10 s (Figura 5). Una tale risposta reversibile e rapida del fluido attivo dimostra la fattibilità dell'utilizzo della temperatura per controllare dinamicamente le attività dei fluidi.

Figure 1
Figura 1: Introduzione dei fluidi attivi 3D basati sulla kinesina, basati su MT. (A) Schemi di interfilamento scorrevole. Coppie di MT antiparalleli sono stati impacchettati da spoverimenti e allontanati da cluster motori. (B) I cluster di motori hanno guidato collettivamente coppie di MT, portando i fasci di MT ad estendersi. (C) I fasci estensili costituivano un gel attivo basato su MT (verde) che agitava il liquido circostante per indurre un flusso. Per tracciare il flusso, il liquido è stato dopato con traccianti (rosso). Questa cifra è stata adattata da Bate etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini di gel SDS dalle purificazioni di tubulina e kinesina. (A) Immagine di un gel SDS di tubulina purificata. (B) Immagine di un gel SDS di tubuline riciclate e cinesina purificata. Le corsie da sinistra a destra erano standard proteici, vuoti, 1,25–0,25 mg/mL di tubuline riciclate, bianco e ninesina. (C) La concentrazione di cinesina purificata è stata determinata confrontando la luminosità della banda con le bande sequenziali di tubuline con concentrazioni misurate (rettangoli rossi e blu tratteggiati in rientro). La luminosità di ogni banda è stata misurata sommando i valori dei pixel all'interno di un'immagine della banda ritagliata. Per ridurre il rumore di fondo, prima di ritagliare l'immagine gel è stato trasferito in scala di grigi, in bianco e nero invertito, e quindi migliorato al contrasto per rivelare uno sfondo nero (ingresso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Impostazione del controllo della temperatura. (A) Schemi del blocco di alluminio per la configurazione del controllo della temperatura. Il blocco contiene un canale interno per l'acqua di fluire attraverso di esso e portare via il calore generato TEC. Il foro centrale permette al campione di essere illuminato da microscopia a campo luminoso su un lato e immagine con un obiettivo sull'altro lato. (B) Schemi dell'impostazione del controllo della temperatura. La pasta termica in silicio viene applicata tra il blocco di raffreddamento in alluminio e il TEC e tra il TEC e il disco in zaffiro. (C) Immagine di un campione montato sullo stadio a temperatura controllata. I tubi dell'acqua sono collegati a una pompa immersa in un serbatoio d'acqua. (D) Temperatura di campionamento registrata rispetto al tempo per le temperature di destinazione rispettivamente di 10 gradi, 20 gradi centigradi, 30 e 40 gradi centigradi. Le temperature di campionamento sono state mantenute a temperature con una fluttuazione di 0,1-0,3 gradi centigradi. B e D sono stati adattati da Bate etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Regolazione dei flussi di fluido attivo tramite la temperatura. (A) Tracciatori di imaging (punti bianchi) consentiti per tracciare le traiettorie di flusso in sequenza (curve colorate varie). I traccianti sono stati monitorati ogni 5 s(t - 5 s) a temperatura ambiente . (B) Velocità tracciante rispetto al tempo a 10 , 20 gradi centigradi, 30 gradi centigradi, 36 e 40 gradi centigradi, rispettivamente. (C) Velocità tracciante rispetto alla temperatura. Ogni punto rappresenta la velocità media del tracciante durante la prima e la seconda ora. Al di sotto dei 16 gradi centigradi le MT depolimerizzate, e al di sopra dei 36 gradi centigradi, gli ammassi di kinesina non funzionarono correttamente. Pertanto, la temperatura di lavoro è compresa tra 16 e 36 gradi centigradi, dove la velocità media variava da 4-8 m/s. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle velocità medie medie medie del tempo. B e C sono stati adattati da Bate etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Alternanza della velocità di flusso dei fluidi attivi alternando periodicamente la temperatura del sistema. Cambiando la temperatura tra i 20 e i 30 gradi centigradi ogni 30 min velocità di flusso accelerate e decelerate ripetutamente, dimostrando il controllo locale delle attività dei fluidi attivi con la temperatura. Questa cifra è stata adattata da Bate etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il controllo della materia attiva in situ apre la porta all'auto-organizzazione diretta della materia attiva4,5,24,28,54. In questo articolo, presentiamo un protocollo per l'utilizzo della temperatura per controllare i fluidi attivi guidati dalla chinesina, basati su MT in situ, in base alla caratteristica di Arrhenius del sistema29,30,31. Poiché il sistema è basato sulle proteine, mantenere la funzionalità proteica durante l'esperimento è fondamentale per applicare correttamente il protocollo. Le principali proteine del sistema sono le MT e gli ammassi di kinesina. Il primo depolimera al di sotto dei 16 gradi centigradi e il secondo malfunzionamento al di sopra dei36gradi centigradi. Mantenere la temperatura del sistema tra i 16 e i 36 gradi c è quindi fondamentale per i fluidi attivi sviluppare dinamiche stabili e consentire la loro risposta alla temperatura in modo reversibile(Figura 4 e Figura 5). Tuttavia, la temperatura viene controllata in base a un algoritmo PID, che tende a superare la temperatura di destinazione53. Per ridurre questo overshooting, si consiglia di impostare più temperature intermedie prima di impostare la temperatura di destinazione finale. Ad esempio, per riscaldare il campione dalla temperatura ambiente (circa 20 gradi centigradi) a 35 gradi centigradi, invece di impostare la temperatura di destinazione direttamente a 35 gradi centigradi, si consiglia una temperatura obiettivo intermedia di 30 gradi centigradi per ridurre la probabilità che la temperatura aumenti al di sopra dei 36 gradi centigradi, il che danneggerebbe irreversibilmente le proteine33. Allo stesso modo, quando si raffredda il campione dalla temperatura ambiente a 16 gradi centigradi, si raccomanda di impostare una temperatura target intermedia di 18 gradi centigradi, perché prima di raggiungere uno stato costante, il PID può raffreddare il campione al di sotto dei 16 gradi centigradi, depolizzando le MT33.

Il metodo di controllo della temperatura presentato si basa sul raffreddamento e sul riscaldamento utilizzando un TEC. L'uso del TEC assicura che il campione raggiunga la temperatura di destinazione in pochi secondi, mentre una configurazione convenzionale di controllo della temperatura utilizzando un bagno d'acqua a temperatura controllata richiede minuti per raggiungere la temperatura desiderata (Figura 5)55. Il TEC genera calore netto diverso da zero che viene dissipato da un sistema di circolazione interna dell'acqua in alluminio. Tuttavia, l'acqua permette alla muffa di crescere, che alla fine intasare il canale56. Un canale intasato inibisce il flusso d'acqua, e il calore si accumula nel blocco di alluminio, sciogliendo infine i tubi dell'acqua. I tubi fusi causano la fuoriuscita di acqua al microscopio e alla telecamera, danneggiando gli strumenti elettronici. Pertanto, per adottare la configurazione di controllo della temperatura presentata, si consiglia di aggiungere 0.1% di perossido di idrogeno all'acqua per inibire la crescita dello stampo57,58,59. Prevediamo che questo passaggio garantirà che il canale interno in alluminio rimanga privo di intasati e prevenga danni causati dall'acqua ai dispositivi elettronici vicini.

La manipolazione della temperatura, il rivestimento delle superfici delle cellule di flusso con poliacrilammide e la sintesi dei fluidi attivi sono tre passaggi fondamentali per realizzare questo fluido attivo controllato in situ. Tuttavia, questa controllabilità è limitata all'intervallo di temperatura in cui le proteine coinvolte possono funzionare normalmente. Nel sistema dei fluidi attivi, le proteine primarie sono le MT e i cluster di kinesina, che funzionano normalmente tra i 16 e i36gradi centigradi. All'interno di questo intervallo di temperatura, i fluidi attivi variano la loro velocità di flusso media da 4-8 m/s (Figura 4C). Le velocità medi al di fuori di questo intervallo superano il limite del metodo di controllo presentato. Al contrario, Ross et al. ha segnalato un'alternativa che consente di attivare e disattivare le attività del fluido attivo utilizzando la luce28. Il controllo della luce consente inoltre di attivare i fluidi attivi in una scala di 50 m definita otticamente. Tuttavia, tale alternativa richiede la modifica della struttura della kinesina insieme alla messa a punto di un percorso ottico in un microscopio. In confronto, i vantaggi di adottare il metodo presentato in questo articolo sono 1) i fluidi attivi non hanno bisogno di essere ridisegnati, 2) i microscopi non hanno bisogno di essere modificati, 3) l'impostazione di controllo della temperatura è a basso costo e facile da usare, e 4) il metodo è trasferibile ad altri sistemi dipendenti dalla temperatura come il filo di volo a vela29,30,31,32 o più generalmente-based sistemi enzimatici60. Prevediamo inoltre che il metodo presentato aprirà le porte alla progettazione di sistemi microfluidici in cui i flussi dei canali sono controllati localmente senza valvole.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 è stato un dono del Dr. Svonimir Dogic. Questa ricerca è stata sostenuta dal fondo start-up del Dr. Kun-Ta Wu nel Worcester Polytechnic Institute. Ringraziamo il Dr. vonimir Dogic per i protocolli per purificare ed etichettare la tubulina e per sintetizzare i fluidi attivi. Siamo grati al Dr. Marc Ridilla per la sua esperienza nell'espressione e purificazione delle proteine. Ringraziamo il dottor William Benjamin Roger per averci aiutato a costruire il palco a temperatura controllata. Riconosciamo Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) per l'uso dello strumento dei materiali biologici (BMF). Riconosciamo la Royal Society of Chemistry per l'adattamento delle figure di Bate et al. su Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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Ingegneria Numero 153 biofisica cinesi microtubuli fluidi attivi auto-organizzazione temperatura legge Arrhenius
Controllo delle velocità di flusso dei fluidi attivi 3D basati su microtubuli utilizzando la temperatura
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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