Summary
このプロトコルの目的は、温度を使用して3次元活性流体の流速を制御することです。この方法の利点は、その時点での流速を調整できるだけでなく、定期的に流量速度を上下にチューニングするなどの動的制御も可能にします。
Abstract
温度を用いてキネシン駆動の微小管系3次元(3D)活性流体の流速を調整する方法を提示する。この方法は異なった望ましい速度に達するために新しいサンプルを製造する必要性なしで座って速度を調整することを可能にする。さらに、この方法は速度の動的制御を可能にする。温度をサイクリングすると、液体は速く、ゆっくりと、定期的に流れます。この制御性は、キネシン微小管反応のアレニウス特性に基づいており、4~8μm/sの制御された平均流量速度範囲を示します。提示された方法は、チャネルの流量がバルブを必要とせずに局所的に調整できないマイクロ流体デバイスの設計への扉を開きます。
Introduction
活物質は、化学エネルギーを機械的な作業に変換する能力により、従来の受動物質と区別されます。このような能力を有する材料は、細菌、昆虫、コロイド、穀物、および細胞骨格フィラメント1、2、3、4、5、6、7、8、9、10などの生きているまたは非生きている実体から成ることができる。これらのマテリアル エンティティは、隣接するエンティティと対話します。より大きなスケールでは、乱流のような渦(アクティブ乱流)または材料流れが11、12、13、14、15、16、17、18、19、20のいずれかに自己組織化する。活性物質の自己組織化を理解することは、分子シャトル、光学デバイス、および並列計算21、22、23における様々な応用につながっている。アプリケーションを次のレベルに引き上げるには、自己組織化を超えた制御が必要です。例えば、Palacciららは、手動で制御された青色光にさらされたときにのみ自走するヘマタイト封入コロイドを開発し、生きている結晶24の出現につながった。Morin et al. は、調整不可能な外部電界を用いて圧延キンケコロイドの制御を確立し、その結果、競馬場状のチャネル25にコロイド群れが生じる。これらの以前の作品は、アプリケーションにおけるローカル制御の役割を示し、アクティブな物質のナレッジベースを進めます。
この記事では、キネシン駆動、微小管(MT)ベースの3D活性流体の制御性に焦点を当てます。流体は、MT、キネシン分子モーター、および枯渇剤の3つの主要成分で構成されています。枯渇剤は、後でモータクラスタによってブリッジされるMTをバンドルするために枯渇力を誘発します。これらのモーターはプラス端に向かってMTsに沿って歩く。一対の橋渡しされたMTsisアンチパラレルの場合、対応するモータは反対方向に歩きます。ただし、モータはクラスタ内にバインドされ、離れて歩くことができないため、一対の M (インターフィラメントスライド、図 1A)を協調的にスライドさせます。これらの摺動ダイナミクスが蓄積し、座屈不安定点とブレーク(伸張バンドル、図1B)26に達するまで拡張するMTstoの束を引き起こす。壊れたバンドルは、その後再び伸びる枯渇力によってアニールされ、ダイナミクスが繰り返されます。繰り返しダイナミクスの過程で、バンドルの動きは近くの液体をかき混ぜ、ミクロンスケールトレーサーでドーピングすることによって可視化できる流れを誘導する(図1C)。Sanchez et al. および Henkin et al. はトレーサーの平均速度を特徴付けており、アデノシン三リン酸(ATP)、枯渇剤、運動クラスター、および MTs19,27の濃度を変化させることによって速度が調整可能であったことを発見した。しかしながら、このようなタンビリティは活性流体合成の前にのみ存在していた。合成後、タンビリティが失われ、流体は独自の方法で自己組織化されました。合成後の活性流体活性を制御するために、Ross.etal.は、運動タンパク質の光活性化二量体化を用いた方法を報告し、光28を用いて流体活性をオン/オフすることを可能にする。光制御は、流体を局所的に活性化するという点で便利ですが、この方法では、顕微鏡で光路を修正するとともに、運動タンパク質の構造を再設計する必要があります。ここでは、モータ構造をそのまま維持しながら、顕微鏡の改造を行わずに流体の流れを局所的に制御するための使いやすい方法を提供します。
キネシン-MT反応は温度29、30、31、32で増加することが報告されているので、局所的に活性流体の流れを調整する私たちの方法は、アレニウス法に基づいています。これまでの研究では、活性流体流れの平均速度の温度依存性がアレニウス方程式に従ったことを示した: v = exp(-Ea/RT)、Aは前指数因子、Rはガス定数、Eは活性化エネルギー、Tはシステム温度33である。 従って、流体活性は温度環境に敏感であり、かつシステム温度がモータ性能を安定させるために一貫している必要があり、その結果、流体流量速度34。この記事では、モータの温度依存性を使用して、システム温度を調整してアクティブ流体の流速を連続的に調整する方法を示します。また、活性流体サンプルの調製をデモンストレーションし、次にコンピュータソフトウェアを介して温度を制御する顕微鏡ステージにサンプルを取り付けます。温度を16°Cから36°Cに上げると、平均流量速度が4μm/sに速くなり、さらに、タンビリティは可逆的です:温度を繰り返し増減すると、流れを順次加速および減速します。実証された方法は、MT滑空アッセイ29、30、31、32などのアレニウス法に主な反応が従う広範なシステムに適用可能である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MTの作成
注意:このステップでは、牛の脳組織からチューブリンを浄化します。牛の脳は、変異型クロイツフェルトヤコブ病(vCJD)35を引き起こす可能性があります。したがって、脳廃棄物および関連するソリューション、ボトル、およびピペットチップは、バイオ廃棄物袋に収集し、施設のルールに従ってバイオ有害廃棄物として処分する必要があります。
- 牛の脳から尿細管を浄化する (カストルディらから改変する36).
- 地元の食肉処理場から大学の冷蔵室に新鮮な牛の脳の約1.5キロを輸送します。輸送中は、脳をリン酸緩衝液(20mMNaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.2)を氷上に保存します。
注:チューブリンの最終的な収率を最大化するために、新鮮な脳組織における機能性チューブリンの初期量が重要である。新鮮な脳は、より機能的なチューブリンが含まれています.食肉処理場から新鮮な脳を得るためには、肉屋に最近虐殺された牛から脳を提供してもらうのを勧める。殺処分と処置開始の間の時間を減らすことはより良い収率を生み出すので、脳は処置を開始するとき3時間より古くてはならない。 - 均質化し、脳を明確にします。
- メスを使って血管や結合組織を小さく切り、手で脳から取り除いて脳をきれいにします。
注:きれいにされた脳はピンクでなければなりません。 - 1Lの脱重合緩衝液(DB:50 mM2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、1mM CaCl 2、pH6.6)1キログラムの脳に洗浄した脳組織を浸漬する。
- キッチンブレンダーで脳を均質化します。
- 10,000 x gおよび 4 °C で 150 分間均質化された脳溶液を遠心分離します。
- メスを使って血管や結合組織を小さく切り、手で脳から取り除いて脳をきれいにします。
- MT(第1重合)を重合する。
- 37°Cで次の溶液の等量で上清を収集し、混合する:グリセロール、高モルリティPIPESバッファー(HMPB:1 M PIPES、10 mM MgCl2、20mMエチレングリコールビス(β-アミノエヒルエーテル)-N、N'、N'-テトラ酢酸[EGTA]、pH 6.9)
- 混合物に1.5 mM ATPと0.5 mMグアノシン三リン酸(GTP)を加えます。
- 混合物を37°Cで1時間インキュベートする。
- 脱重合M(最初のMT脱重合)。
- ペレットMTは151,000 x gで遠心分離し、30分間37°Cで行う。
- 上清を廃棄し、各MTペレットを4°CDBの10 mLで再サスペンドします。
- 氷の上で30分間インキュベートする。
- MT沈下を避けるためにピペットチップで5分ごとに混合物を攪拌します。
注:混合物は、MT脱重合の完了を示す30分でクリアにする必要があります。
- MTを重合する(第2のMT重合)。
- 70,000 x gと 4 °C で 30 分間遠心分離して溶液を明確にします。
- 37°グリセロールとHMPBの等量で上清を収集し、混合します。
- 混合物に1.5 mM ATPと0.5 mM GTPを追加します。
- 37°Cで30分間インキュベートする。
- ステップ1.1.4を繰り返し、HMPBをブリンクリー再構成バッファー(BRB)80(80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1mM EGTA、pH 6.8)に置き換え、続いて79,000 x gおよび4°Cで30分間遠心分離してクリアした混合物を明らかにする。
- 上清を集める。分光器で280nmの吸光度を測定します。ビール・ランバート法(チューブリンの絶滅係数:1.15(mg/mL)-1cm-1)37、38を用いてチューブリン濃度を決定する。
- タンパク質は-80°Cで保存してください。
- 地元の食肉処理場から大学の冷蔵室に新鮮な牛の脳の約1.5キロを輸送します。輸送中は、脳をリン酸緩衝液(20mMNaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.2)を氷上に保存します。
- リサイクルチューブリン(カストルディら36から改変)。
注:チューブリン純度を高めるために、精製されたチューブリンを重合し、再び脱重合する。- 精製チューブリン(ステップ1.1.7)を500μMジチオトライタートール(DTT)と20μM GTPと混合し、続いて37°Cで30分のインキュベーションを行い、Mを重合します。
- ペレットのMT。
- 重心管の底部にグリセロールクッション(80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1mM EGTA、60%v/vグリセロール、pH 6.8)をロードします。
- クッションの上に重合したMTを置きます。
- 37 °C で 90 分間 172,000 x gで遠心分離。
- MTを脱重合します。
- 上清とクッションを取り外します。
- 各MTペレットを4°C MTバッファの150 μLで再サスペンドします(M2B:80 mMパイプ、2 mM MgCl2、1mM EGTA、pH 6.8)。
- 氷上の混合物を30分間インキュベートする。
- ピペットチップで混合物を5分ごとに攪拌します。混合物は透明にする必要があります。
- 172,000 x gと4 °Cで30分間遠心分離して混合物を明らかにします。
- 上清を集める。タンパク質濃度を測定します。-80°Cで保管してください。
- 尿細管に蛍光色素39でラベルを付ける。
- MTを重合します。精製されたチューブリン(ステップ1.1.7)を500μM DTTと16.7 μM GTPと混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
- ペレットのMT。
- 37°Cの高pHクッション(0.1 M NaHEPES、1 mM MgCl2、1mM EGTA、60%v/vグリセロール、pH 8.6)の1 mLを遠心管に入れます。
- 重合したMTをクッションの上に置きます。
- 327,000 x gで 37 °C で 50 分。
- ラベルチューブリン。
- 各 MT ペレットを 700 μL の 37 °C ラベリング バッファー (0.1 M NaHEPES、1 mM MgCl2、1mM EGTA、40% v/v glycerol、pH 8.6) で再サスペンドします。
- コハクシニミジルエステルで機能化した極赤色蛍光色素の10~20モル過剰と懸濁液を混合します。
- 暗闇の中で37°Cで混合物を30分間インキュベートし、MTが蛍光色素のエステルと反応できるようにします。
- 50mM K-グルタミン酸で中断色素のエステルを飽和させ、37°Cで5分間インキュベートして標識反応を停止する。
- ラベル付きの MT をペレット: ステップ 1.3.2 を繰り返し、高 pH クッションを低 pH クッション (80 mM パイプ、2 mM MgCl2、1mM EGTA、60% v/v グリセロール、pH 6.8) に置き換えます。
- MTを脱重合する。
- 上清とクッションを捨てます。
- ペレットを4°C M2Bの700°Lで再サスペンドします。
- 懸濁液を氷の上でインキュベートします。
- 溶液が明確になるまでピペットチップで5分ごとに攪拌します。
- 184,000 x gおよび 4 °Cで 35 分間遠心分離することにより、クリアされた溶液を明確にします。
- ステップ1.2.1~1.2.4を繰り返して、標識チューブリン溶液の純度を高めます。
- タンパク質と蛍光色素の濃度を測定します。これらの測定値を使用して、チューブリン濃度と標識チューブリンの画分を決定し、尿細管に対する蛍光色素の濃度の比として定義する。
- 標識チューブリン溶液を-80°Cで保管してください。
- MTを重合する(サンチェスら19から採用):
- リサイクルされたチューブリン(ステップ1.2.5)を、ラベル付きチューブリン(ステップ1.3.9)と混合し、3%の標識チューブリン画分を得る比率で行います。
- 8 mg/mL チューブリン混合物を 1 mM DTT と 0.6 mM グアノシン-5'[(α,β)-メチルエノ]トリリン酸(GMPCPP)と混合し、続いて 37 °C で 30 分のインキュベーションを行います。
- インキュベーション後、6時間暗闇の中で室温でMをアニールする。
- アリコートと-80°で保存します。
2. キネシンクラスターの合成
注:細菌はユビキタスに存在し、媒体中で成長し、調製プロセスを汚染することができます。汚染を防ぐために、細胞培養物との接触(例えば、ピペット)を含む作用は、炎の近くで行われなければならない。フラスコ、ピペット、ピペットチップ、メディア、プレートなどのツールは、使用前にオートクレーブする必要があります。
- 大腸菌40のエクスプレスキネシンモーター.
- セルを変換します。
- K401-BCCP-H6プラスミドのピペット1μLを10μLの有能な細胞にする。
- 氷の上で5分間インキュベートする。
- 45°Cで42.5°Cのヒートショック
- 氷上の細胞を2分間インキュベートし、回復を可能にします。
- 300 μL の抗生物質フリー 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L 酵母エキス, 16 g/L トリプトン) と細胞を混合します。
- 細胞を37°Cで1時間インキュベートする。
メモ:指定しない限り、インキュベーション中に細胞増殖を監視する必要はありません。
- プレートメディアを接種します。
- 2XYTプレート(10g/L NaCl、5 g/L酵母エキス、10g/Lトリプトン、15 g/L寒天、100 gg/mLアンピシリン、25μg/mLクロラムフェニコール)に細胞培養を広げます。
- プレートを37°Cで一晩逆さまにインキュベートします。
- 液体媒体を接種する。
- 一晩のプレートから、ピペットチップで1つの孤立したコロニーを収穫します。
- 先端を2XYTの50 mLを含むフラスコに取り出します。
- 培養媒体を37°C、200rpmで12~16時間インキュベートし、振ります。
- セルを展開します。
- 2XYTの500 mLで細胞培養物の2.5 mLを混合する。
- 500 mL培養物を37°Cで振り、3~6時間で250rpm振ります。
- タンパク質発現を誘導する。
- インキュベーション中に、600nmで吸光度を測定し、2XYTを基準として細胞の成長を監視する。OD600 = 0.3に達するまで、60分ごとに吸光度を測定します。次に、0.5~0.6に達するまで30分ごとに吸光度を測定します。
- 吸光度がOD600 = 0.5~0.6に達するまで細胞を増殖させる
- 細胞培養に24μg/mLビオチンと1mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えます。
注:IPTGは、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)および6つのヒスチジン(H6)でタグ付けされたキネシンモータのタンパク質発現を誘導するために使用されます。H6タグは精製プロセス(ステップ2.2)で使用され、BCCPは、発現されたキネシンモータをビオチン化するために添加されたビオチン分子に結合します。 - 細胞培養物を20°C、250rpmで12~20時間振る。
- 5,000 x gと4 °Cで10分間遠心分離して細胞を収穫し、上清を廃棄します。細胞ペレットを-80°Cで保管してください。
- セルを変換します。
- キネシン運動タンパク質を精製する(スプリスタースバッハら41から改変):
- 細胞ペレット(ステップ2.1.6)を同じ体積のリシスバッファー(50 mM PIPES、 4mM MgCl2、50μM ATP、10 mM 2-メルカプトエタノール(βME)、20mMイミダゾール、pH 7.2)、続いてプロテアーゼ阻害剤1錠、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)の2mg、および2mgのリゾイムを添加した。
- 液体窒素(LN)3xでフラッシュ凍結して細胞をリサーし、細胞混合物を解凍する。
注:ライジング後、混合物は粘性になるはずです。 - 230,000 x gおよび 4 °Cで 30 分間遠心分離することにより、lys化細胞混合物を明らかにします。
- 上清を収集し、重力カラムを通して流し、続いて10mLのリシスバッファーでカラムを洗浄します。
注: キネシン K401-BCCP-H6 などの H6 タグを持つタンパク質は、列に残す必要があります。 - 5 mL の溶出バッファー (50 mM PIPES、4 mM MgCl2、50μM ATP、500 mM イミダゾール、pH 7.2) でタグ付きタンパク質を溶出します。フロースルーを 1 mL の分数で順番に収集します。タンパク質含有画分を決定するには、トリフェニルメタン色素の100μLで各画分の3μLを混合します。タンパク質含有分数は青色に変わるはずです。これらの画分を組み合わせ、リシスバッファーで5倍希釈します。
- タンパク質溶液を濃縮します。
- 遠心フィルターチューブに溶液をロードします。
- 遠心分離機は3,000 x gで4°Cで10分間。
- チューブをゆっくりと振り、溶液の体積が<3 mLになるまでもう一度遠心分離します。
- 分光計でタンパク質濃度を測定する (絶滅係数: 0.549 (mg/mL)-1cm-1)42,43.35%w/vスクロースを加えながら、タンパク質を1mg/mLに希釈します。
- -80°Cで保管してください。
- 電気泳動ゲルでキネシン濃度を測定する(Taylorらから改変)。
注:電気泳動ゲルでキネシン濃度を測定するために、尿細管は、その高純度及び分光計を介した測定可能濃度(図2A)36のために理想的な濃度ラダーである。- 濃度0.25、0.5、0.75、1.00、および1.25 mg/mLのチューブリンサンプルを調製します。各チューブリンサンプルとキネシンサンプル(ステップ2.2.8)の15μLを、5μLのサンプルバッファー(200 mM Tris-HCl、8%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、400 mM DTT、0.2%ブロモフェノールブルー、40%グリセロール、pH 6.8)とインキュバテテテを別々に混ぜる。
- 電気泳動を準備します。
- 電気泳動ゲルをゲルボックスにロックします。
- ランニングバッファ(50 mM MOPS、50 mMトリスベース、0.1%SDS、1 mMエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、pH 7.7)でボックスを埋めます。
メモ:バッファレベルがゲルの上部開口部より上にあることを確認してください。
- タンパク質標準はしご、チューブリンサンプル、キネシンサンプルを10μLを別々のウェルにロードし、ゲル全体に200Vを45分間塗布します。
- ゲル染色。
- 沸騰したゲルをインキュベートしてロックし(約95°C)、染色液A(0.5g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸、25%イソプロパノール)を5分間熟成させ、脱イオン化(DI)水でゲルをすすぐします。
- 染色溶液B(0.05g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸、10%イソプロパノール)、C(0.02g/Lトリフェニルメタン色素、10%v/v酢酸)、およびD(10%v/v/v酢酸)を順次繰り返します。一晩DI水でゲルをインキュベートし、ロックします。
- ゲルをスキャンします。ゲル画像をグレースケール画像に変換し、その後に白黒反転とコントラストの強調を行い、黒の背景に明るいタンパク質バンドを表示します。
- ピクセル値を合計して、各バンドの明るさを測定します。線形フィットC =aB +bを適用し、Bはチューブリンバンドの明るさ、Cは対応する濃度、aとbはフィッティングパラメータです。キネシンバンドBkの明るさを用いてキネシンCkの濃度を求め、線方程式を計算する:C=aB k+b。
- キネシンモーターをクラスター化します。
- 120 μM DTT および 120 nM ストレプトアビジンを使用して、1.5 μM キネシン (ステップ 2.2.8) を混合します。氷の上で30分間インキュベートする。
- -80°Cで保管してください。
3. ポリアクリルアミドコーティングガラススライドとカバーリップを準備する(Lauらから改造45)
- 新しいガラススライドとガラスカバーリップを対応する容器にロードします。DI水にスライドとカバーリップを1%v/v洗剤に沈め、電子レンジで水を沸騰させます。
- スライドとカバーリップを5分間超音波処理し、DI水で洗い流して洗剤を取り除きます。
- DI水で5分間エタノールでスライドとカバーリップを水没させ、超音波処理します。
- DI水で5分間、100 mMの水酸化カリウム(KOH)でスライドとカバーリップを水没させ、超音波処理します。
- シラン溶液(1%酢酸、0.5%3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートをエタノール中にインキュベートし、DI水でリンスします。
- アクリルアミド溶液中のスライドとカバーリップ(2%w/wアクリルアミド、0.7 mg/mL過硫酸アンモニウム、およびDI水中の0.0035%v/vテトラメチルエチレンジアミン)を≥3時間でインキュベートします。
- スライドとカバーリップをアクリルアミド溶液に保管します。
4. キネシン駆動、MTベースの活性流体を準備する
- 活性流体を調製する(Sanchezら19から改変)。
注:次の手順は、サンプルストックを使用して活性流体の100°Lを調製するプロセスを示しています。最終体積はスケーラブルであり、各成分の最終濃度が維持される限り、サンプルストックの濃度を調整することができます。- 16.7 μL の 8 mg/mL MTs (ステップ 1.4.4) と 6.7 μL の 1.8 μM キネシン モーター クラスター (ステップ 2.4.2)、および高塩 M2B で 500 mM DTT の 1.1 μL (M2B + 3.9 mM MgCl2)を混合します。
- 7%w/wポリエチレングリコール(PEG)の11.4 μLを添加して、MPを束ね。
- 50 mM ATPの2.8°Lを追加してキネシンモータをアクティブにします。
- 2.8 μL のストックピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ (PK/LDH) と 200 mM ホスフェノールピルビン酸 (PEP) の 13.3 μL を加えて ATP 濃度を維持します。
- 20 mM トロックスの 10 μL、3.5 mg/mL カタラーゼの 1.1 μL、20 mg/mL グルコースオキシダーゼの 1.1 μL、および 300 mg/mL グルコースの 1.1 μL を加えることによって光漂白効果を低減します。
- 0.025% v/v トレーサー粒子の1.6°Lを追加して、流体の動きを追跡します。
- 高塩M2Bを加え、総体積100°Lを達成します。
注: 手順 4.1.1 ~ 4.1.6 の混合注文は交換可能です。しかし、ATP、MT、モータが混在すると、モーターはMTに沿って歩きながらATPを消費し始めます。サンプルは限られた燃料(ATPおよびPEP)のために有限の寿命で活性化されるので、実験は速やかに開始されるべきである。最終的な活性流体には、1.3 mg/mL MT、120 nMキネシンモータクラスタ、5.5 mM DTT、 0.8% w/w PEG, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM トロックス, 0.038 mg/mL カタレーゼ, 0.22 mg/mL グルコースオキシダーゼ, 3.3 mg/mL グルコース, 0.0004% v/v コロイド高塩塩中
- 流路でサンプルを調製する(チャンドラカールら46から改変):
- DI水でポリアクリルアミドコーティングガラススライドとカバースリップ(ステップ3.7)をすすいでください。メガネを加圧空気で乾かします。清潔で平らな面に置きます。
- 3mm幅、ガラスカバースリップ(20mm)と同じ長さのワックスフィルムを2本カットします。スライドとカバースリップの間にストリップをチャンネルスペーサーとして挿入します。
- ガラスワックス複合体を80°Cのホットプレートに置いてワックスフィルムに付着させ、ワックスを溶融します。溶融中に、ピペット先端でカバースリップを軽く押し、ワックスフィルムをガラス表面に均一に付着させます。密着後、ガラス錯体を室温まで冷却する。
- アクティブな流体(ステップ 4.1)をフロー チャネルにロードします。UV接着剤でチャネルをシールします。
5. サンプル温度の制御
- 温度制御のセットアップを構築する(Lowensohnらの設計から変更され、47、48、49)。
- アルミニウム冷却ブロックを準備します。
- 約30mm×30mm×5mmの寸法を持つアルミニウム板をミル。
- プレート(図3A)を通して内部チャンネルをドリルし、チャンネル端にホース継手を取り付けます。
- 各フィッティングを水管にフックします。
- 一方のチューブを貯水池の水槽内の魚タンクポンプに接続し、もう一方のチューブを貯水池に延長します。
メモ:ポンプは、ほぼ室温でブロック温度を維持するために、アルミニウム内部チャネルを介して貯水池の水を循環させます。
- 温度コントローラに熱電冷却器(TEC)とサーモセンサーを配線します。USBポートを使用してコントローラをコンピュータに接続します(図3B)。
- 温度コントローラを直流(DC)電源に配線します。電源をコンセントに差し込み、コントローラの電源を入れます。
- コントローラの製造元のガイドに従って、TEC の初期セットアップを実行します。TEC 出力をテストします。メーカーが提供するソフトウェアを介して温度コントローラを制御し、サーモセンサデータ記録と温度コントローラの操作を容易にすることをお勧めします。
- TEC の冷暖房面を特定します。
- サーマルペーストを使用して、TECの冷却側を冷却ブロック(ステップ5.1.1)に取り付けます。
- サーマルペーストを使用して、TECの加熱側にサファイアディスクを取り付けます。
- セットアップが完了しました。サファイア表面とサーモセンサーは、サンプルに接触して、温度と目標温度に基づいてサンプルを冷却し、加熱することができます。
メモ:TECと冷却ブロックには、明視野顕微鏡を使用してサンプルをイメージングするための中央穴を揃えてお勧めします(図3C)。
- アルミニウム冷却ブロックを準備します。
- 温度制御設定を使用して、サンプル温度33を制御します。
- サンプルをセットアップにマウントします。
- アクティブな流体サンプル(ステップ4.2.4)をサファイア表面に配置し、スライド側でサーフェスに接触させます。
- ガラスのスライドを紙テープで固定します。
- 銅テープを使用して、サーモセンサーをカバースリップ面に取り付けます。
- カバースリップ側を目的に向けた顕微鏡ステージにセットアップを取り付けます。例えば、反転顕微鏡では、カバースリップ側が下を向く必要があります。必要に応じて、紙テープと顕微鏡ステージ針クランプでセットアップを固定します。
メモ:提示された温度段階は、反転または直立した一般的な顕微鏡で動作する必要があります。実験中に温度段階が移動しないようにするには、温度段階をテープで顕微鏡段階に固定するのが最善です。 - サンプル温度を制御します。
- 温度コントローラと魚タンクポンプをオンにします。
- 製造元のガイドに従って、目標温度を設定し、温度制御を有効にします。コントローラは、温度センサによって評価される目標温度とサンプル温度に基づいて加熱または冷却電力を調整します。
- サンプル温度を記録します。
- 実験中に熱センサーの温度データを記録するには、製造元のガイドに従ってください。
メモ:サンプル温度はコントローラによって制御され、コンピュータによって記録されます(図3D)。
- 実験中に熱センサーの温度データを記録するには、製造元のガイドに従ってください。
- サンプルをセットアップにマウントします。
6. 活性流体活性を特徴付める(ヘンキンらおよび呉ら20,27)による方法から改変する)
注: 前のセクションでは、アクティブな流体サンプル(セクション 1 ~ 4)を準備し、その温度を制御するために使用します(セクション 5)。アクティブな流体活動を制御するために温度の使用を実証するには、流体の挙動を観察し、その活動を分析し、温度に対する応答を特徴付けます。
- トレーサーを監視します。
- 緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光を用いて一定間隔Δtで試料を画像化し、トレーサー粒子の動きを捕捉する。
注: トレースャーの動きを追跡できるようにするには、Δtを選択する必要があります。100 s などの大きな Δt値はトレーサー軌道を失いますが、0.1 s などの短い Δt値は、トラッキング アルゴリズムがフレーム間のトレーサーの動きを検出するのを防ぎます。作業 Δtでは、フレーム間のトレーサーの変位を~9 ピクセル以内にする必要があります。4xの目的を使用して10 μm/sで移動するイメージングトレーサーの場合、Δtは1~5sにすることをお勧めします。 - イメージを TIFF ファイルとして保存し、フレーム番号に基づいてファイルに名前を付け、別のフォルダに保存します。これらのプロセスは、取得したイメージが提供されている MATLAB スクリプトを使用して正しく分析されるようにするために必要です (手順 6.2.2)。
- 緑色蛍光タンパク質(GFP)蛍光を用いて一定間隔Δtで試料を画像化し、トレーサー粒子の動きを捕捉する。
- ウエレットら50、51によって開発された追跡ソフトウェアを採用する追跡トレーサー:
- スタンフォード大学環境複雑研究所(https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml)から追跡ソフトウェアをダウンロードします。各 MATLAB ファイルが同じフォルダにあることを確認します。
- カスタム MATLAB スクリプトを使用してトレーサーを追跡します: particle_tracking.m.このスクリプトはトレーサーイメージを読み取り(ステップ6.1)、ウエレットらのソフトウェアを使用してトレーサーの動きを追跡します。これは、画像の背景を表す1)background.tif、および2)各フレームの粒子軌道と速度を含む2つのファイルを出力します(図4A)。
- カスタム MATLAB スクリプト analysis.m を使用して、トレーサー平均速度を分析します。このスクリプトは、トラッキング ファイル (Tracking.mat) を読み取り、トレーサーと時間の平均速度と、指定された平均ウィンドウ (図 4B)33の平均平均速度を出力します。
- 時間平均平均速度を記録します。
- 実験(ステップ4、5.2、6.1~6.4)を10~40°Cで繰り返して、平均平均速度を測定します。記録された平均速度を使用して、平均速度と温度をプロットします (図 4C)33。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
キネシン駆動のMTベースの活性流体を準備するには、キネシンとMの両方が必要です。MTを、牛の脳から精製した標識チューブリン(ステップ1.3および1.4)から重合し、続いてリサイクルして純度を高めた(ステップ1.2、図2B)。キネシン運動タンパク質を大腸菌(ステップ2.1および2.2、図2B)41、52から発現および精製した。 調製したキネシンストックの濃度を、リサイクルされたチューブリンと既知の濃度との主バンド輝度と比較してSDSゲルで測定した(ステップ2.3、図2Bインセット)。チューブリンバンドの明るさ値(B)は、式C=aB+εを用いて対応する濃度(C)に直線的にフィットし、= 3.1×10-2 mg/mLおよびε=8.7×10-4mg/mL(図2C)を生じ得た。適合式は、測定されたバンド輝度Bk=1,060を適用してキネシンバンドの濃度を決定するために使用され、Ck=0.95mg/mLのキネシン濃度を生じた。 既知の濃度を有するMTおよびキネシン試料を用いて活性流体サンプルを調製した。活性流体を合成し、ポリアクリルアミド被覆フローセルに装填し、その細胞をUV接着剤で密閉した(セクション3および4)46。
温度を用した活性流体活性の制御を実証するために、活性流体試料を自家製温度ステージに取り付けた(ステップ5.2、図3A-C)。サンプル温度は、比例積分微分(PID)アルゴリズム53に従ってコントローラによって監視および制御された。10°C、20°C、30°C、および40°Cで制御されたサンプルは、0.1~0.3°C以内の温度が4時間変動するように見え、この温度制御セットアップの安定性と信頼性を実証した(図3D)。
試料を観察するために、セットアップをエピ蛍光顕微鏡に取り付けた。サンプルをAlexa 488標識トレーサーでドープし、GFPチャネルを介して蛍光顕微鏡で画像化した(ステップ6.1)。トレーサーをすべてのΔt=2sに画像化した。トレーサー軌道riの追跡に使用できるシーケンシャルイメージ。 軌道は平均速度v(t)≥ <|ri(t) - ri(t- Δt)|/Δt>I (ステップ 6.3)。20~36°Cで測定された平均速度は、t = 0~2時間でほぼ時間に依存しないように見えましたが、10°Cと40°では平均速度が急速に減衰します(図4B)。10°Cでの崩壊は、16°C以下のMT脱重合によって引き起こされた。40°Cでの崩壊は、キネシンクラスターが36°Cを超えて誤動作したためである。私たちの以前の研究によると、これらのキネシンモータークラスタは、>36 °C33でプリインキュベーション後にMTのペアを駆動する能力を失います。これらの因子によって誘発される減衰を反映しながら各温度の平均速度を特徴付けるために、平均速度はt=1〜2時間(ステップ6.3および6.4)33の間で平均化された。時間平均平均速度は10~40°Cの間で測定した(ステップ6.5、図4C)。16°Cを下回り、36°Cを超えると、MT脱重合およびキネシンクラスター33の誤動作により平均速度が急速に減衰し、16°Cから36°Cに上昇すると平均速度が4~8μm/sに加速され、温度を用いて活性流体の平均速度を調整する可能性を実証した。温度制御の能力をさらに実証するために、システム温度を30分ごとに20°Cと30°Cの間で交互に行った。活性流体の平均速度は、それに応じて加速・減速するだけでなく、10s以内の温度変化にも反応しました(図5)。このような活性流体の可逆的かつ迅速な応答は、温度を使用して流体活動を動的に制御する作業性を示す。
図1:キネシン駆動、MTベースの3D活性流体の導入(A)インターフィラメント摺動の概略図反並列性の一対のTは枯渇剤によって束ねられ、モータークラスターによって離れて駆動された。(B) モータークラスタは、MTのペアをまとめて駆動し、MTバンドルを拡張しました。(C)伸張束は、周囲の液体を攪拌して流れを誘導するMT系活性ゲル(緑色)を構成した。流れを追跡するために、液体はトレーサー(赤)でドープされた。この図は、Bateら33から適応した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:チューブリンおよびキネシン精製からのSDSゲルの画像。(A)精製チューブリンのSDSゲルの画像。(B)リサイクルされたチューブリンおよび精製キネシンのSDSゲルの画像。左から右へのレーンは、タンパク質標準、ブランク、1.25〜0.25 mg/mLリサイクルチューブリン、ブランク、キネシンストックでした。(C)精製キネシンの濃度は、測定された濃度(差し込み中の赤と青の破線長方形)を有するチューブリンのシーケンシャルバンドとバンドの明るさを比較することによって決定した。各バンドの明るさは、トリミングされたバンド画像内のピクセル値を合計することによって測定されました。バックグラウンドノイズを低減するために、ゲル画像をトリミングする前にグレースケール、白黒反転に転送し、コントラストを高め、黒の背景(差し込み)を明らかにした。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:温度制御の設定(A)温度制御セットアップ用アルミニウムブロックの回路図。ブロックには、水がそれを流れ、TECによって発生した熱を運ぶための内部チャネルが含まれています。中央の穴はサンプルが一方の側面の明るい分野の顕微鏡によって照らされ、反対側の目的とイメージすることを可能にする。(B) 温度制御設定の回路図。シリコンサーマルペーストは、アルミニウム冷却ブロックとTECの間、およびTECとサファイアディスクの間に適用されます。(C) 温度制御ステージに取り付けられたサンプルの画像。水管は、水貯留部に浸漬されたポンプに接続されています。(D) サンプル温度対目標温度の時間をそれぞれ10°C、20°C、30°C、40°Cで記録した。試料温度は0.1~0.3°Cの変動を有する温度に維持した。BおよびDは、Bateら33から適合した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:温度を介して流れる活性流体のチューニング(A)流れの軌道を順次追跡するために可能なイメージングトレーサー(白い点)(その他の色のカーブ)。トレーサーを室温(〜20°C)で5s(Δt=5s)毎に監視した。(B)トレーサー平均速度対時間対10°、20°、30°、36°、および40°Cでの時間をそれぞれ行う。(C) トレーサー平均速度対温度。各ポイントは、最初と 2 番目の時間の平均トレーサー平均速度を表します。16°C未満では、MTは脱重合し、36°を超えて、キネシンクラスターが誤作動した。したがって、作業温度は16~36°Cで、平均速度は4~8μm/sから変化します。誤差範囲は、時間平均平均速度の標準偏差を表します。BおよびCは、Bateら33から適合した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:システム温度を定期的に交互にすることにより、活性流体の流速を交互に示す。温度を30分ごとに20°Cと30°Cの間で切り替えると、流速が繰り返し加速および減速し、温度による活性流体活動の局所制御を実証しました。この図は、Bateら33から適応した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
その場所でアクティブな物質を制御することは、アクティブマター4、5、24、28、54の指向的な自己組織化への扉を開きます。本稿では、システム29、30、31のアレニウス特性に基づいて、温度を使用して現場でキネシン駆動のMTベースの活性流体を制御するためのプロトコルを提示する。このシステムはタンパク質ベースであるため、実験全体を通じてタンパク質の機能を維持することが、プロトコルを正常に適用する鍵となります。システムの主なタンパク質は、MTとキネシンクラスターです。前者は16°C以下で脱重合し、後者は36°33を超えて誤動作する。したがって、16~36 °Cの間でシステム温度を維持することは、活性流体が安定したダイナミクスを発達させ、温度に対する応答を可逆的に可能にするために不可欠です(図4と図5)。しかし、温度はPIDアルゴリズムに基づいて制御され、目標温度53をオーバーシュートする傾向がある。このオーバーシュートを減らすには、最終目標温度を設定する前に、複数の中間目標温度を設定することをお勧めします。例えば、試料を室温(約20°C)から35°Cに加熱するには、目標温度を35°Cに直接設定するのではなく、中間目標温度を30°Cに設定して、温度が36°Cを超える可能性を減らすことをお勧めします。同様に、試料を室温から〜16°Cに冷却する場合には、中間目標温度を18°Cに設定することが推奨される。
提示された温度制御方法は、TECを使用した冷却および加熱に依存する。TECを使用すると、サンプルが数秒以内に目標温度に達することを保証し、温度制御水浴を使用する従来の温度制御セットアップは、所望の温度に達するまでに数分かかります(図5)55。TECはアルミニウム内部水循環システムによって放散されるゼロ以外の正味熱を発生させる。しかし、水はカビが成長することを可能にし、最終的にはチャネル56を詰まらせます。詰まったチャネルは水の流れを阻害し、熱はアルミニウムブロックに蓄積し、最終的に水管を溶融します。溶けた管は顕微鏡やカメラの上に水をこぼし、電子機器に損傷を与えます。そこで、提示された温度制御セットアップを採用するために、カビ成長を阻害するために0.1%の過酸化水素を水に添加することを推奨する57、58、59。このステップにより、アルミニウム内部チャネルが詰まりのない状態を保ち、近くの電子機器への水の損傷を防ぐことが期待されます。
温度を操作し、フローセル表面をポリアクリルアミドでコーティングし、活性流体を合成することは、その際に制御された活性流体でこれを実現するための3つの重要なステップです。しかしながら、この制御性は、関与するタンパク質が正常に機能できる温度範囲に限定される。活性流体系では、一次タンパク質は、16~36°33の間で正常に機能するMTおよびキネシンクラスターである。この温度範囲内では、活性流体の平均流量速度は4~8μm/s(図4C)から変化します。この範囲外の平均速度は、提示された制御方法の限界を超えています。対照的に、Ross et al. は、光28を使用してアクティブな流体活動のオンとオフを切り替えることを可能にする代替を報告しました。ライト制御はまた光学的に定義された境界の50 μmのスケールの活動的な液体を活性化することを可能にする。しかしながら、このような代替手段は、顕微鏡で光経路をチューニングするとともにキネシン構造を改変する必要がある。これに対し、この記事で提示する方法を採用する利点は、1)活性流体を再設計する必要がなく、2)顕微鏡を改変する必要がなく、3)温度制御セットアップが低コストで使いやすく、4)グライダーアッセイ29、30、31、32または32以上の酵素ベースのシステムなどの他の温度依存系に転写可能である。また、提示された方法は、チャネルフローがバルブなしでローカルに制御されるマイクロ流体システムの設計への扉を開くことを期待しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
プラスミドK401-BCCP-H6はズヴォニミール・ドギック博士からの贈り物でした。この研究は、ウースター工科大学のクンタ・ウー博士のスタートアップファンドによって支援されました。我々は、ツボニミール・ドギッチ博士がチューブリンを浄化し、ラベルを付け、活性流体を合成するプロトコルに感謝する。マルク・リディラ博士のタンパク質発現と精製に関する専門知識に感謝しています。ウィリアム・ベンジャミン・ロジャー博士は、温度管理されたステージの構築を支援してくださったようお礼を申し上げます。我々は、生物学的材料施設(BMF)の使用のためのブランダイスMRSEC(NSF-MRSEC-1420382)を認めます。我々は、ソフトマター33にBateらからの数字を適応するための化学の王立協会を認める.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white - 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply | Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |
References
- Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
- Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
- Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
- Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
- Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
- Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
- Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
- Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
- Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
- Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
- Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
- Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
- Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
- Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
- Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
- Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
- Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
- Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
- Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
- Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
- Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
- Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
- Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
- Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
- Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
- Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
- Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
- Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
- Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
- Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
- Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
- Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
- Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
- Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
- Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
- Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
- Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
- Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
- Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
- Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
- Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
- Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
- Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
- Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
- Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
- Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
- Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
- Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
- Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).