Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Kontrollera flödeshastigheter av Mikrotubule-baserade 3D aktiva vätskor med temperatur

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Målet med detta protokoll är att använda temperatur för att kontrollera flödeshastigheterna hos tredimensionella aktiva vätskor. Fördelen med denna metod gör det inte bara möjligt att reglera flödeshastigheter på plats, utan möjliggör även dynamisk styrning, till exempel att regelbundet trimma flödeshastigheter upp och ned.

Abstract

Vi presenterar en metod för att använda temperatur för att finjustera flödeshastigheterna för kinesindrivna, mikrotubule-baserade tredimensionella (3D) aktiva vätskor. Denna metod gör det möjligt att trimma hastigheter på plats utan att behöva tillverka nya prover för att nå olika önskade hastigheter. Dessutom möjliggör denna metod dynamisk kontroll av hastighet. Cykling temperaturen leder vätskor för att flöda snabbt och långsamt, regelbundet. Denna manövrerbarhet baseras på Arrhenius-karakteristik för kinesinmikrotubule-reaktionen, vilket visar ett kontrollerat medelvärde för flödeshastighet på 4 – 8 μm/s. Den presenterade metoden kommer att öppna dörren till utformningen av mikroflödessystem enheter där flödeshastigheter i kanalen är lokalt avstämbar utan behov av en ventil.

Introduction

Aktiv materia är differentierat från konventionell passiv materia på grund av dess förmåga att omvandla kemisk energi till mekaniskt arbete. Ett material som besitter sådan förmåga kan bestå av levande eller icke-levande enheter såsom bakterier, insekter, kolloider, korn, och cytoskelett filament1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa material enheter interagerar med sina grannar. I större skala, de själv organisera i antingen turbulenta-liknande virvlar (aktiv turbulens) eller materialflöden11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En förståelse för självorganisering av aktiv materia har lett till olika tillämpningar i molekylära shuttles, optiska enheter och parallell beräkning21,22,23. För att få program till nästa nivå kräver kontroll bortom självorganisering. Till exempel, Palacci et al. utvecklat en hematite-inkapslad kolloid som självgående endast när de utsätts för manuellt kontrollerade blått ljus, vilket ledde till uppkomsten av levande kristaller24. Morin et al. etablerat kontroll av rullande Quincke kolloider med hjälp av en avstämbara yttre elektriska fält, vilket resulterar i kolloidal flockas i en travet-liknande kanal25. Dessa tidigare arbeten visar den roll som den lokala kontrollen har i tillämpningar och avancerar kunskapsbasen för aktiv materia.

I den här artikeln fokuserar vi på manövrerbarheten av kinesindrivna, mikrotubule (MT)-baserade 3D-aktiva vätskor. Vätskorna består av tre huvudkomponenter: MTs, kinesinet molekylära motorer och nedbrytande medel. De nedbrytande inducerar en utarmning kraft för att bunta MTs, som senare överbryggas av motor kluster. Dessa motorer går längs MTstoward plus änden. När ett par brygged MTsis antiparallel, motsvarande motorer gå i motsatt riktning. Men motorerna är bundna i ett kluster och kan inte gå isär, så de kooperativt glida isär par MTs (interfilament glidande, figur 1a). Dessa glidande dynamik ackumuleras, orsakar buntar av MTsto förlänga tills de når sin buckling instabilitet punkt och bryta (extensile buntar, figur 1B)26. De trasiga buntarna glödgas av den utarmning kraft, som därefter sträcker sig igen, och dynamiken upprepa. Under processen av den upprepande dynamiken, bunt rörelser rör den närliggande vätskan, inducera flöden som kan visualiseras genom dopning med Micron-skala spårämnen (figur 1C). Sanchez et al. och Henkin et al. har karakteriserat medelvärdet av tracers, att finna att hastigheterna var avstämbara genom att variera koncentrationerna av adenosintrifosfat (ATP), beklagar, motoriska kluster, och MTS19,27. Emellertid, sådan inställnings existerade endast före aktiv vätske syntes. Efter syntesen, var inställnings förlorad, och vätskorna självorganiserade på sitt eget sätt. För att kontrollera aktiv vätske aktivitet efter syntes, rapporterade Ross.et al. en metod med hjälp av ljus-aktiverade Dimerization av motorproteiner, vilket gör att vätske aktivitet att stämmas av och på med hjälp av ljus28. Medan ljusstyrning är praktiskt när det gäller lokalt aktivera vätskor, metoden kräver omkonstruktion av strukturer av motorproteiner, tillsammans med att ändra de optiska banorna i ett mikroskop. Här ger vi en lättanvänd metod för lokalt kontrollerade vätskeflöden utan Mikroskop modifiering samtidigt som motor strukturen hålls intakt.

Vår metod för lokalt trimning av aktivt vätskeflöde baseras på Arrhenius-lagen eftersom kinesin-MT-reaktionen har rapporterats öka med temperatur29,30,31,32. Våra tidigare studier visade att temperaturberoendet av medelhastigheten av ett aktivt vätskeflöde följde Arrhenius ekvation: v = a exp (-Ea/RT), där a är en före exponentiell faktor, R är gaskonstanten, EA är aktiveringsenergin och T är system temperaturen33. Därför är vätske aktivitet känslig för temperatur miljön, och system temperaturen måste vara konsekvent för att stabilisera motorns prestanda, och därmed vätske flödeshastigheten34. I den här artikeln visar vi användningen av motorns temperaturberoende för att kontinuerligt ställa in flödeshastigheterna för aktiva vätskor genom att justera system temperaturen. Vi demonstrerar också beredningen av ett aktivt vätske prov, följt av att montera provet på ett Mikroskop skede vars temperatur styrs via datorprogram. Att öka temperaturen från 16 ° c till 36 ° c påskyndar medelvärdet av flödeshastigheterna från 4 till 8 μm/s. Dessutom är inställnings reversibel: upprepade gånger ökar och minskar temperaturen sekventiellt accelererar och bromsar flödet. Den demonstrerade metoden är tillämplig på ett brett spektrum av system där de viktigaste reaktionerna lyda Arrhenius lag, såsom MT glidflygning assay29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av MTs

FÖRSIKTIGHET: i detta steg renar vi tubuliner från nötkreatur hjärnvävnad. Bovint hjärna kan orsaka variant Creutzfeldt-Jakobs sjukdom (vCJD)35. Därför bör hjärnan avfall och relaterade lösningar, flaskor, och pipettspetsar samlas i en bioavfall påse och bortskaffas som biologiskt farligt avfallet enligt institutionens regler.

  1. Rena tubuliner från bovint hjärna (modifierad från Castoldi et al.36).
    1. Transportera cirka 1,5 kg färska nötkreatur hjärnor från ett lokalt slakteri till ett universitet kallt rum. Under transporten, förvara hjärnorna i fosfatbuffert (20 mM NaH2Po4, 150 mm nacl, pH 7,2) på is.
      Anmärkning: för att maximera den slutliga avkastningen av tubulin, den initiala mängden funktionella tubulin i den färska hjärnvävnaden är nyckeln. Fräschare hjärnor innehåller mer funktionell tubulin. För att få de färskaste hjärnorna från slakteriet rekommenderar vi att du ber slaktaren att ge hjärnor från de senast slaktade korna. Hjärnor bör inte vara äldre än 3 h vid start av förfarandet, eftersom minska tiden mellan slakt och förfarande start kommer att ge bättre avkastning.
    2. Homogenisera och klargöra hjärnorna.
      1. Rengör hjärnan med hjälp av skalpeller att skära blodkärl och bindväv i mindre bitar och ta bort dem från hjärnan för hand.
        Obs: de rengjorda hjärnorna ska vara rosa.
      2. Sänk den rensade hjärnvävnaden i 1 L depolymeriseringsbuffert (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) etansulfonsyra, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per kilogram hjärna.
      3. Homogenisera hjärnor med ett kök mixer.
      4. Centrifugera den homogeniserade hjärn lösningen vid 10 000 x g och 4 ° c i 150 min.
    3. Polymerisera MTs (första polymerisation).
      1. Samla och blanda supernatanten med lika stora volymer av följande lösningar vid 37 ° c: glycerol, buffert med hög molaritet (HMPB: 1 M rör, 10 mM MgCl2, 20 mm etylenglykol-bis (β-aminoehyl Ether)-N, N, n ',, N'-tetraättiksyra [EGTA], pH 6,9)
      2. Tillsätt 1,5 mM ATP och 0,5 mM Guanosintrifosfat (GTP) till blandningen.
      3. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 1 h.
    4. Depolymerize MTs (första MT depolymerization).
      1. Pellets MT genom centrifugering vid 151 000 x g och 37 ° c i 30 min.
      2. Kassera supernatanten och Omsuspendera varje MT-pellet i 10 mL 4 ° c DB.
      3. Inkubera på isen i 30 min.
      4. Skaka blandningen var 5 min med en pipett spets för att undvika MT sedimentation.
        Anmärkning: blandningen ska bli klar i 30 min, vilket indikerar slutförandet av MT depolymerization.
    5. Polymerisera MTs (understödja MT polymerisation).
      1. Förtydliga lösningen genom centrifugering vid 70 000 x g och 4 ° c i 30 min.
      2. Samla och blanda supernatanten med lika volymer på 37 ° c glycerol och HMPB.
      3. Tillsätt 1,5 mM ATP och 0,5 mM GTP till blandningen.
      4. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min.
    6. Upprepa steg 1.1.4, byta HMPB med Brinkley sammansättningbuffert (BRB) 80 (80 mM rör, 1 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8), följt av förtydligande av den godkända blandningen genom centrifugering vid 79 000 x g och 4 ° c i 30 min.
    7. Samla supernatanten. Mät 280 nm-absorbans med en spektrometer. Bestäm tubulinkoncentrationen med hjälp av Beer-Lambert-lagen (utdöningskoefficient för tubulin: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Förvara proteinet vid-80 ° c.
  2. Återvinn tubuliner (modifierad från Castoldi et al.36).
    Anmärkning: för att öka tubulin renhet, är den renade tubulin polymeriseras och depolymeriseras igen.
    1. Polymerisera MTS genom att blanda den renade tubulin (steg 1.1.7) med 500 μm Ditiotreitol (dTT) och 20 μm GTP, följt av 30 min inkubering vid 37 ° c.
    2. Pellets MTs.
      1. Fyll på 1 mL glyceroldyna (80 mM rör, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8) i botten av ett centrifugerör.
      2. Lägg den polymeriserade MTs ovanpå dynan.
      3. Centrifugera vid 172 000 x g för 90 min vid 37 ° c.
    3. Depolymerisera MTs.
      1. Ta bort supernatanten och kudden.
      2. Omsuspendera varje MT pellet i 150 μL av 4 ° c MT buffert (M2B: 80 mM rör, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8).
      3. Inkubera blandningen på is i 30 min.
      4. Skaka blandningen med pipettspetsen var 5: e minut. Blandningen ska bli klar.
    4. Förtydliga blandningen genom centrifugering vid 172 000 x g och 4 ° c i 30 min.
    5. Samla supernatanten. Mät protein koncentrationen. Förvaras vid-80 ° c.
  3. Märk tubulin med fluorescerande färg39.
    1. Polymerisera MTs. Blanda den renade tubulin (steg 1.1.7) med 500 μM DTT och 16,7 μM GTP, och inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min.
    2. Pellets MTs.
      1. Placera 1 mL 37 ° c hög-pH kudde (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 8,6) i ett centrifug rör.
      2. Lägg den polymeriserade MTs på dynan.
      3. Centrifugera vid 327 000 x g för 50 min vid 37 ° c.
    3. Etikett tubulin.
      1. Omsuspendera varje MT pellet med 700 μL av 37 ° c märkning buffert (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 40% v/v glycerol, pH 8,6).
      2. Blanda suspensionen med en 10 – 20 molar överskott av far-röd fluorescerande färgämne funktionaliserade med en succinimidyl Ester.
      3. Inkubera blandningen vid 37 ° c i 30 min i mörker för att tillåta MTs att reagera med Ester av fluorescerande färgämne.
      4. Stoppa märkningen reaktion genom mättat Ester av suspendera färgämne med 50 mM K-Glutamat, inkuberande för 5 min vid 37 ° c.
    4. Pellet den märkta MTs: Upprepa steg 1.3.2, ersätter hög-pH kudde med låg-pH kudde (80 mM rör, 2 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 6,8).
    5. Depolymerize MTs.
      1. Kassera supernatanten och dynan.
      2. Omsuspendera pelleten i 700 μL med 4 ° c M2B.
      3. Inkubera suspensionen på isen.
      4. Skaka varje 5 min med pipettspetsen tills lösningen är klar.
    6. Förtydliga den rensade lösningen genom centrifugering vid 184 000 x g och 4 ° c i 35 min.
    7. Förbättra renheten hos den märkta tubulinlösningen genom att upprepa steg 1.2.1 – 1.2.4.
    8. Mät koncentrationen av proteiner och fluorescerande färgämne. Använd dessa mätningar för att bestämma tubulinkoncentrationen och fraktioner av Märkt tubulin, definierat som förhållandet mellan koncentrationer av fluorescerande färg till tubulin.
    9. Förvara den märkta tubulinlösningen vid-80 ° c.
  4. Polymerisera MTs (antagen från Sanchez et al.19):
    1. Blanda den återvunna tubulin (steg 1.2.5) med Märkt tubulin (steg 1.3.9) i ett förhållande som ger en 3% Märkt tubulin fraktion.
    2. Blanda 8 mg/mL tubulin blandningen med 1 mM DTT och 0,6 mM guanosin-5 ' [(α, β)-methyleno] trifosfat (GMPCPP), följt av 30 min av inkubering vid 37 ° c.
    3. Efter inkubationen, glödga MTS vid rumstemperatur i mörker för 6 h.
    4. Alikvot och förvara vid-80 ° c.

2. syntetisera kinesinkluster

Obs: bakterier finns ubiquitously och kan växa i medierna och kontaminera förberedelseprocessen. För att förhindra kontaminering måste åtgärder som involverar kontakt med cellkulturer (t. ex. pipettering) utföras nära en flamma. Verktyg som flaskor, pipetter, pipettspetsar, media och plattor måste vara autoklaverade före användning.

  1. Express kinesinet Motors i Escherichia coli40.
    1. Omvandla cellerna.
      1. Pipettera över 1 μL av K401-BCCP-H6 plasmid till 10 μL av de behöriga cellerna.
      2. Inkubera på isen i 5 min.
      3. Värme chock vid 42,5 ° c för 45 s.
      4. Inkubera cellerna på isen i 2 minuter för att möjliggöra återhämtning.
      5. Blanda cellerna med 300 μL av antibiotika fritt 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L jästextrakt, 16 g/L Tryptone).
      6. Inkubera cellerna vid 37 ° c i 1 h.
        Anmärkning: om inte specificerat, övervakning av celltillväxt krävs inte under inkubering.
    2. Inokulera plattmedia.
      1. Sprid cellkulturen på en 2XYT-platta (10 g/L NaCl, 5 g/L jästextrakt, 10 g/L Tryptone, 15 g/L-agar, 100 μg/mL ampicillin, 25 μg/mL kloramfenikol).
      2. Inkubera plattan upp och ner vid 37 ° c över natten.
    3. Inokulera flytande media.
      1. Från natten plattan, skörda en isolerad koloni med pipett spets.
      2. Mata ut spetsen i en kolv som innehåller 50 mL 2XYT.
      3. Inkubera och skaka kultur mediet vid 37 ° c och 200 rpm i 12 – 16 timmar.
    4. Expandera cellerna.
      1. Blanda 2,5 mL av cellkulturen i 500 mL 2XYT.
      2. Inkubera och skaka den 500 mL kulturen vid 37 ° c och 250 RPM för 3 – 6 h.
    5. Inducera proteinuttryck.
      1. Under inkubationen övervakar celltillväxten genom att mäta absorbansen vid 600 Nm, med 2XYT som referens. Mät absorbansen var 60 min, tills den når OD600 = 0,3. Mät sedan absorbansen var 30: de minut tills den når 0,5 – 0,6.
      2. Låt cellerna växa tills absorbansen når OD600 = 0,5 – 0,6
      3. Tillsätt 24 μg/mL biotin och 1 mM isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) till cellkulturen.
        Anmärkning: IPTG används för att inducera proteinuttryck av kinesinmotorerna, som är märkta med biotin carboxyl Carrier protein (BCCP) och sex histidines (H6). H6-taggen används i reningsprocessen (steg 2,2), medan BCCP binder till de tillförde biotin-molekylerna för att biotinylera de uttryckta kinesinmotorerna.
      4. Inkubera och skaka cellkulturen vid 20 ° c och 250 rpm i 12 – 20 timmar.
    6. Skörda cellerna genom centrifugering vid 5 000 x g och 4 ° c i 10 min. Kassera supernatanten. Förvara cell pellets vid-80 ° c.
  2. Rena kinesinen motor protein (modifierad från Spriestersbach et al.41):
    1. Suspendera cellpelleten (steg 2.1.6) med en lika mängd lyseringsbuffert (50 mM rör, 4 mM MgCl2, 50 μm ATP, 10 mm 2-merkaptoetanol (βme), 20 mm Imidazol, pH 7,2), följt av att tillsätta en tablett proteashämmare, 2 mg fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), och 2 mg lysozym.
    2. Lyse cellerna genom att blinka i flytande kväve (LN) 3x och upptining av cell blandningen.
      Anmärkning: efter lysing bör blandningen bli trögflytande.
    3. Förtydliga den lyserade cell blandningen genom centrifugering vid 230 000 x g och 4 ° c i 30 min.
    4. Samla supernatanten och strömma den genom en gravitation kolumn, följt av tvättning kolonnen med 10 mL lyseringsbuffert.
      Proteiner med en H6-tagg, som kinesinet K401-BCCP-H6, bör finnas kvar i kolumnen.
    5. Eluera det märkta proteinet med 5 mL elueringbuffert (50 mM rör, 4 mM MgCl2, 50 μm ATP, 500 mm Imidazol, pH 7,2). Samla flödet genom sekventiellt i 1 mL fraktioner. För att bestämma de proteinhaltiga fraktioner, blanda 3 μL av varje fraktion med 100 μL av trifenylmethane Dye. De proteinhaltiga fraktionerna ska bli blåa. Kombinera dessa fraktioner och späd med 5x med lysis buffert.
    6. Koncentrera proteinlösningen.
      1. Ladda lösningen i ett centrifugalfilterrör.
      2. Centrifugera vid 3 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
      3. Skaka röret försiktigt och centrifugera igen tills lösnings volymen är < 3 mL.
    7. Mät protein koncentrationen med en spektrometer (utrotningskoefficient: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Späd proteinet till 1 mg/mL medan du lägger till 35% w/v sackaros.
    8. Förvaras vid-80 ° c.
  3. Mät kinesinkoncentrationerna med en elektrofores gel (modifierad från Taylor et al.44).
    Anmärkning: för att mäta kinesinkoncentrationen med en elektroforesis-gel är tubulin en idealisk koncentrations stege på grund av dess höga renhet och dess mätbara koncentration via en spektrometer (figur 2a)36.
    1. Bered tubulinprover med koncentrationer av 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 och 1,25 mg/mL. Blanda 15 μL av varje tubulinprov och kinesinprov (steg 2.2.8) separat med 5 μL provbuffert (200 mM Tris-HCl, 8% natriumdodecylsulfat (SDS), 400 mM DTT, 0,2% bromfenolblått, 40% glycerol, pH 6,8) och inkubera vid 90 ° c i 3 minuter.
    2. Förbered elektrofores.
      1. Lås en elektrofores gel i gel boxen.
      2. Fyll boxen med löpbuffert (50 mM moppar, 50 mM Tris bas, 0,1% SDS, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), pH 7,7).
        Obs: se till att buffertnivån ligger över Gelens övre öppning.
    3. Fyll på 10 μL protein standard stege, tubulinprover och kinesinprov i separata brunnar och applicera 200 V över gelen i 45 min.
    4. Gel färgning.
      1. Inkubera och vagga gelen med kokt (ca 95 ° c) fläck lösning A (0,5 g/L trifenylmethane Dye, 10% v/v ättiksyra, 25% isopropanol) för 5 min, skölj sedan gelen med avjoniserat (DI) vatten.
      2. Upprepa med fläck lösningar B (0,05 g/L trifenylmethane Dye, 10% v/v ättiksyra, 10% isopropanol), C (0,02 g/L trifenylmethane Dye, 10% v/v ättiksyra), och D (10% v/v ättiksyra), sekventiellt. Inkubera och vagga gelen i DI vatten över natten.
    5. Skanna gelen. Konvertera gel bilden till en gråskalebild, följt av en svart och vit inversion och kontrastförbättring för att avslöja ljusa protein band i den svarta bakgrunden.
    6. Mät ljusstyrkan för varje band genom att summera pixelvärden. Applicera linjär passning c = AB + b, där b är ljusstyrkan hos ett tubulinband, c är motsvarande koncentration, och a och b är passande parametrar. Bestäm koncentrationen av kinesinet Ck med hjälp av ljusstyrkan hos kinesinbandet Bk för att beräkna den linjära ekvationen: Ck = ABk + B.
  4. Klustret kinesinet motorer.
    1. Blanda 1,5 μM kinesinet (steg 2.2.8) med 120 μM DTT och 120 nM streptavidin. Inkubera på isen i 30 min.
    2. Förvaras vid-80 ° c.

3. Förbered polyakrylamidbelagda glas rutschbanor och täckblad (modifierade från Lau et al.45)

  1. Fyll på nya glas rutschbanor och täckglas i motsvarande behållare. Sänk samman bilderna och täckorna i 1% v/v tvättmedel i DI vatten och sedan koka vattnet i en mikrovågsugn.
  2. Sonikera bilder och täckglas i 5 min och skölj sedan med DI vatten för att ta bort tvättmedel.
  3. Sänk samman och Sonikera glidbanorna och täckorna i etanol i 5 min. Skölj med DI-vatten.
  4. Sänk och Sonikera glidbanorna och täckorna i 100 mM kaliumhydroxid (KOH) i 5 min. Skölj med DI-vatten.
  5. Inkubera glidbanorna och täckglassen i en silanlösning (1% ättiksyra och 0,5% 3-(Trimetoxysilyl) propylmetakrylat i etanol) i 15 min och skölj sedan med DI-vatten.
  6. Inkubera rutschbanorna och täckorna i akrylamidlösning (2 viktprocent akrylamid, 0,7 mg/mL ammoniumpersulfat och 0,0035% v/v tetrametylethylendiamin i DI-vatten) för ≥ 3 timmar.
  7. Förvara glidbanorna och täckorna i akrylamidlösningen.

4. Förbered kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor

  1. Förbered aktiva vätskor (modifierad från Sanchez et al.19).
    Anmärkning: följande steg visar processen för att förbereda 100 μL av en aktiv vätska med hjälp av exempel bestånd. Den slutliga volymen är skalbar, och koncentrationerna av exempel lagren kan justeras så länge den slutliga koncentrationen av varje komponent bibehålls.
    1. Blanda 16,7 μL 8 mg/mL MTs (steg 1.4.4) med 6,7 μL av 1,8 μM kinesinet-motorkluster (steg 2.4.2) och 1,1 μL 500 mM DTT i högsalt M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bunt MTs genom att tillsätta 11,4 μL av 7% w/w polyetylenglykol (PEG).
    3. Aktivera kinesinmotorer genom att tillsätta 2,8 μL 50 mM ATP.
    4. Bibehålla ATP-koncentrationerna genom att tillsätta 2,8 μL av beståndet pyruvatkinas/laktatdehydrogenas (PK/LDH) och 13,3 μL av 200 mM foshenol pyruvat (PEP).
    5. Minska foto blekning effekten genom att tillsätta 10 μL 20 mM Trolox, 1,1 μL av 3,5 mg/mL katalas, 1,1 μL av 20 mg/mL glukos oxidas, och 1,1 μL av 300 mg/mL glukos.
    6. Spåra rörelse av vätskan genom att tillsätta 1,6 μL av 0,025% v/v spår partiklar.
    7. Tillsätt hög salt M2B för att uppnå en total volym på 100 μL.
      Obs: blandnings beställningarna i steg 4.1.1 – 4.1.6 är utbytbara. Men när ATP, MTs, och motorerna är blandade, motorerna börjar konsumera ATP medan kliva längs MTs. Provet aktiveras med en begränsad livstid på grund av de begränsade bränslena (ATP och PEP), så experimentet ska startas omgående. Den sista aktiva vätskan ska innehålla 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesinet-motorkluster, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glukos oxidas, 3,3 mg/mL glukos, och 0,0004% v/v kolloid i hög salt M2B.
  2. Förbered ett prov i en flödeskanal (modifierad från Chandrakar et al.46):
    1. Skölj en polyakrylamidbelagd glasfiber bild och täckslip (steg 3,7) med DI-vatten. Torka glasögonen med trycksatt luft. Placera på en ren, plan yta.
    2. Klipp ut två remsor av vax filmer med en bredd på 3 mm och samma längd som glas täckglasets (20 mm). Sätt in remsorna mellan bilden och täckglaset som kanal distaner.
    3. Följ glaset till vax filmen genom att placera glas vax komplexet på en 80 ° c värmeplatta för att smälta vaxet. Under smältningen, tryck täckglaset försiktigt med en pipett spets för att jämnt fästa vax filmen till glasytorna. Efter vidhäftning, kyla glaset komplexa till rumstemperatur.
    4. Ladda de aktiva vätskorna (steg 4,1) till flödeskanalen. Täta kanalen med UV-lim.

5. Kontrollera provtemperaturen

  1. Bygg en temperaturkontroll inställning (modifierad från design i lowensohn et al. och Wu et al.47,48,49).
    1. Förbered ett kyl block i aluminium.
      1. Fräs en aluminiumplåt med måtten ca 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Borra en intern kanal genom plattan (figur 3a) och installera slanganslutningarna i kanal ändarna.
      3. Haka varje passande till en vattentub.
      4. Anslut ett rör till en akvarium pump i en vattenreservoar samtidigt utvidga den andra röret till reservoaren.
        Obs: pumpen kommer att cirkulera reservoarvatten genom de interna aluminium kanalerna för att bibehålla block temperaturen vid ungefär rumstemperatur.
    2. Tråd en Termoelektrisk kylare (TEC) och en termosensor till en temperaturregulator. Anslut handkontrollen till en dator med en USB-port (bild 3B).
    3. Rikta temperaturregulatorn mot en likströms strömförsörjning (DC). Sätt på handkontrollen genom att ansluta nätadaptern till ett eluttag.
    4. Utför den första uppsättningen av TEC enligt handkontrollens tillverkarens guide. Testa TEC-utdata. Det rekommenderas att kontrollera temperaturregulatorn via tillverkarens programvara, vilket möjliggör termosensor dataregistrering och enklare manipulation av temperaturregulatorn.
    5. Identifiera värme-och kyl sidorna i TEC.
    6. Fäst TEC: s kylande sida på kylblocket (steg 5.1.1) med hjälp av termisk pasta.
    7. Anslut en safirskiva till TEC: s uppvärmnings sida med termisk pasta.
    8. Installationen är klar. Safirytan och termosensorn kan kontakta ett prov för att kyla och värma provet baserat på dess temperatur och måltemperatur.
      Anmärkning: det rekommenderas att TEC och kylblocket har ett anpassat centralt hål för avbildning av proverna med hjälp av ljus fälts mikroskopi (figur 3C).
  2. Använd inställningarna för temperaturreglering för att kontrollera provtemperaturen33.
    1. Montera provet i inställningarna.
      1. Placera det aktiva vätske provet (steg 4.2.4) på safirytan med glid sidan i kontakt med ytan.
      2. Säkra glas glaset med papperstejp.
      3. Fäst termosensorn på täckytan med hjälp av koppartejp.
    2. Montera installationen på ett Mikroskop skede med täckglas sidan vänd mot målen. Till exempel, på ett inverterat Mikroskop, täckglas sidan bör vända nedåt. Fäst inställningen med papperstejp och mikroskopet skede nål klämmor om tillämpligt.
      Obs: det presenterade temperatur steget ska fungera med vanliga Mikroskop som antingen är inverterade eller upprätt. För att säkerställa att temperaturen skede inte flyttas under experimentet, är det bäst att säkra temperaturen skede till mikroskopet skede med tejp.
    3. Kontrollera provtemperaturen.
      1. Slå på temperaturregulatorn och akvarium pumpen.
      2. Följ tillverkarens guide för att ställa in måltemperaturen och aktivera temperaturkontroll. Regulatorn justerar värme-eller kyleffekten baserat på måltemperaturen och provtemperaturen enligt termosensorns bedömning.
    4. Registrera prov temperaturer.
      1. Följ tillverkarens guide för att registrera termosensor temperaturdata under experimentet.
        Anmärkning: provtemperaturen bör nu kontrolleras av styrenheten och registreras av datorn (figur 3D).

6. karakterisera den aktiva vätske aktiviteten (modifierad från metoder av Henkin et al. och Wu et al.20,27)

Anmärkning: föregående avsnitt används för att bereda aktiva vätske prov (avsnitt 1 – 4) och kontrollera deras temperatur (avsnitt 5). För att demonstrera användningen av temperatur för att kontrollera den aktiva vätske aktiviteten, Observera vätske beteenden, analysera deras aktiviteter och karakterisera deras svar på temperaturen.

  1. Övervaka tracers.
    1. Bild provet med ett konstant intervall Δt med fluorescens i grönt fluorescerande protein (GFP) för att fånga upp förflyttningen av spår partiklarna.
      Notera: Δt ska väljas så att spår förflyttningen kan spåras. Stora Δt -värden, till exempel 100 s, leder till att spår banor försvinner, medan korta Δt -värden, till exempel 0,1 s, hindrar spårningsalgoritmen från att detektera spår förflyttningen mellan ramarna. En arbetande Δt bör tillåta spår förskjutning mellan ramar för att vara inom ~ 9 pixlar. För att Imaging-spårämnen ska röra sig vid 10 μm/s med ett 4x-objektiv rekommenderas Δt vara 1 – 5 s.
    2. Spara bilderna som TIFF-filer, namnge filerna baserat på bildrutenummer och lagra dem i en separat mapp. Dessa processer är nödvändiga för att säkerställa att de förvärvade bilderna kommer att analyseras korrekt med MATLAB-skriptet som tillhandahålls (steg 6.2.2).
  2. Track spårämnen antagande av spårningsprogram som utvecklats av Ouellette et al.50,51):
    1. Ladda ner spårningsprogram varan från Environmental komplexitet Laboratory, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Se till att varje MATLAB-fil finns i samma mapp.
    2. Spåra Spårare med ett anpassat MATLAB-skript: particle_tracking. m. Skriptet läser Tracer bilder (steg 6,1) och spår Tracer rörelse med hjälp av programvaran för Ouellette et al.50,51. Det matar ut två filer: 1) Background. tif, som representerar bildens bakgrund och 2) tracking. mat, som innehåller partikel banor och hastigheter i varje ram (figur 4a).
  3. Analysera spår medelvärdet med hjälp av ett anpassat MATLAB-skript: Analysis. m. Skriptet läser spårningsfilen (tracking. mat) och matar ut medel hastigheten för spårämnen kontra tid, tillsammans med en tidsgenomsnittlig medelhastighet med specificerade medelvärdesfönster (figur 4B)33.
  4. Anteckna medelhastigheten för medelvärdet.
  5. Mät tidsmedelvärdet medelhastighet genom att upprepa experimentet (steg 4, 5,2 och 6.1 – 6.4) vid 10 – 40 ° c. Använd de inspelade medelhastigheterna för att plotta medelhastighet kontra temperatur (figur 4C)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att förbereda kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor kräver både kinesinet och MTs. MTs polymeriserades från märkta tubuliner (steg 1,3 och 1,4) som renades från nötkreatur hjärnor (steg 1,1, figur 2A), följt av återvinning för att förbättra renhet (steg 1,2, figur 2B). Kinesins motorproteiner uttrycks i och renas från E. coli (steg 2,1 och 2,2, figur 2B)41,52. Koncentrationen av det beredda kinesinbeståndet mättes med en SDS-gel genom att jämföra huvudbandets ljusstyrka med den för återvunna tubuliner med kända koncentrationer (steg 2,3, figur 2B infälld). Intensitetsvärdena för tubulinbanden (B) var linjärt lämpade för deras motsvarande koncentration (c) med hjälp av ekvationen c = AB + ε, vilket ger en = 3,1 × 10-2 mg/ml och ε = 8,7 × 10-4 mg/ml (figur 2C). Den monterade ekvationen användes för att bestämma koncentrationen av ett kinesinband genom att tillämpa det uppmätta bandets ljusstyrka, Bk = 1 060, vilket gav en kinesinkoncentration av Ck = 0,95 mg/ml. MT-och kinesinprover med kända koncentrationer användes för att bereda aktiva vätskeprover. De aktiva vätskorna syntetiserades, lastas i en polyakrylamidbelagd flöde cell, och cellen var förseglad med UV-lim (avsnitt 3 och 4)46.

För att demonstrera kontrollen av den aktiva vätske aktiviteten med temperaturen, var det aktiva vätske provet monterat på det hemmagjorda temperatur stadiet (steg 5,2, figur 3A-C). Provtemperaturen övervakades och kontrollerades av regulatorn enligt en proportionell-integral-derivatalgoritm (PID)53. Prover som kontrolleras vid 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c och 40 ° c verkade fluktuera i temperatur inom 0,1 – 0,3 ° c i 4 h, vilket visar stabiliteten och tillförlitligheten hos denna inställning av temperaturreglering (figur 3D).

För att observera provet var installationen monterad på ett epifluorescensmikroskop. Provet var dopade med Alexa 488-märkta spårämnen, som avbildades med fluorescens mikroskopi via en GFP-kanal (steg 6,1). Spårarna var avbildade varje Δt = 2 s. De sekventiella bilder som tillåts för spårning Tracer banor ri, där jag representerar Tracer index (steg 6,2, figur 4A). Den banor avslöjade en medelhastighet v(t) ≡ < | ri(t)- ri(t-Δt) |/Δt>i (steg 6,3). Medelhastigheterna mätt vid 20 – 36 ° c verkade vara nästan tidsoberoende vid t = 0 – 2 h, medan medelhastigheterna vid 10 ° c och 40 ° c snabbt förskämdes (figur 4B). Sönderfallet vid 10 ° c orsakades av MT depolymerization under 16 ° c. Förfalla på 40 ° c var tack vare kinesinen klunga krånglar över 36 ° c. Enligt våra tidigare studier förlorar dessa kinesinmotorkluster förmågan att köra par MTs efter preinkubation vid > 36 ° c33. För att karakterisera medel hastigheterna för varje temperatur medan de återspeglar sönderfallet som induceras av dessa faktorer, var medelhastigheterna i genomsnitt mellan t = 1 – 2 h (steg 6,3 och 6,4)33. De genomsnittliga medelhastigheterna mättes mellan 10 ° c och 40 ° c (steg 6,5, figur 4C). Under 16 ° c och över 36 ° c dämpas medelhastigheterna snabbt på grund av MT depolymerisation och felaktig kinesinkluster33, medan ökande temperaturer från 16 ° c till 36 ° c accelererade medel hastigheterna från 4 till 8 μm/s, vilket visar att det är möjligt att finjustera medel hastigheten för ett aktivt vätskeflöde med hjälp av temperatur. För att ytterligare demonstrera förmågan hos temperaturkontroll varvades Systemtemperaturerna mellan 20 ° c och 30 ° c var 30 min. Medel hastigheterna för de aktiva vätskorna accelererade inte bara och bromsa därefter, men de svarade också på temperaturförändringen inom 10 s (figur 5). En sådan reversibel och snabb respons av den aktiva vätskan visar arbetsförmågan att använda temperaturen för att dynamiskt styra vätske aktiviteter.

Figure 1
Figur 1: Introduktion av kinesindrivna, MT-baserade 3D-aktiva vätskor. (A) schematiska av interfilament glidande. Par av antiparallel MTs buntades av nedbrytande och drivs isär av motor kluster. (B) motor kluster körde kollektivt par MTS, ledande MT buntar att förlänga. (C) skjutas buntarna utgjorde en MT-baserad aktiv gel (grön) som rörde den omgivande vätskan för att inducera ett flöde. För att spåra flödet var vätskan dopade med spårämnen (röd). Denna siffra anpassades från BATE et al.33. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: bilder av SDS Gels från tubulin-och kinesinreningarna. A) bild av en SDS-gel av renad tubulin. B) bild av en SDS-gel av återvunna tubuliner och renad kinesin. De köer från vänster till höger var protein standarder, tom, 1,25-0,25 mg/mL återvunnet tubuliner, blank, och kinesinet lager. Ckoncentrationen av renad kinesinet bestämdes genom att jämföra bandets ljusstyrka med de sekventiella banden av tubuliner med uppmätta koncentrationer (röda och blå streckade rektanglar i infälld). Ljusstyrkan för varje band mättes genom att pixelvärdena i en beskuren band bild summeras. För att minska bakgrundsbrus, innan beskärning gel bilden överfördes till gråskala, svart-vit inverterad, och sedan kontrast-förstärkt för att avslöja en svart bakgrund (infälld). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: inställning av temperaturreglering. (A) Schematics av aluminium blocket för temperaturreglering setup. Blocket innehåller en intern kanal för vatten att flöda genom den och transportera bort TEC-genererade värmen. Det centrala hålet gör att provet kan belysas med ljus fältmikroskopi på ena sidan och avbildas med ett mål på den andra sidan. (B) schematiska inställningar för temperaturreglering. Silikon termisk pasta appliceras mellan aluminium kylblocket och TEC och mellan TEC och safir skivan. Cbild av ett prov monterat på det temperaturkontrollerade stadiet. Vattenrören är anslutna till en pump nedsänkt i en vattenreservoar. D) inspelade prov temperaturer kontra tid för mål temperaturer 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c respektive 40 ° c. Prov temperaturerna upprätthölls vid temperaturer med en fluktuation på 0,1 – 0,3 ° c. B och D anpassades från bat et al.33. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: inställning av aktiva vätskeflöden via temperatur. (A) bild spår (vita prickar) som är tillåtna för spårning av flödestrajectorier sekventiellt (omväxlande färgade kurvor). Spår spårarna övervakades var 5: e (Δt = 5 s) vid rumstemperatur (~ 20 ° c). Bspårmedelshastighet kontra tid vid 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c, 36 ° c respektive 40 ° c. Cspårmedelshastighet kontra temperatur. Varje punkt representerar medelvärdet för spår hastigheten under den första och andra timmen. Under 16 ° c MTs depolymerized, och över 36 ° c, kinesinet kluster krånglade. Därför är arbetstemperaturen mellan 16 – 36 ° c, där medel hastigheterna varierar från 4 – 8 μm/s. Felstaplarna representerar standardavvikelsen för de tidsingenomsnittliga medelhastigheterna. B och C anpassades från bat et al.33. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: alternerande flödeshastigheten hos aktiva vätskor genom att periodiskt alternera system temperaturen. Växling av temperaturen mellan 20 ° c och 30 ° c var 30 min accelererad och decelererad flödeshastighet upprepade gånger, vilket visar lokal kontroll av aktiva vätske aktiviteter med temperaturen. Denna siffra anpassades från BATE et al.33. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Styra aktiv materia in situ öppnar dörren till riktad självorganisering av aktiv materia4,5,24,28,54. I den här artikeln presenterar vi ett protokoll för att använda temperatur för att styra kinesindrivna, MT-baserade aktiva vätskor på plats, baserat på Arrhenius karakteristiska för systemet29,30,31. Eftersom systemet är proteinbaserat är det avgörande att bibehålla proteinfunktionaliteten i hela experimentet för att kunna tillämpa protokollet. De viktigaste proteinerna i systemet är MTs och kinesinkluster. Den tidigare depolymerize under 16 ° c och det senare funktionsfel över 36 ° c33. Att bibehålla system temperaturen mellan 16 – 36 ° c är därför avgörande för att aktiva vätskor ska kunna utveckla stadig dynamik och för att kunna reagera på temperatur reversibelt (figur 4 och figur 5). Men temperaturen styrs baserat på en PID-algoritm, som tenderar att överskjuta måltemperaturen53. För att minska denna överskjutning rekommenderar vi att du ställer in flera mellanliggande mål temperaturer innan du ställer in den slutliga måltemperaturen. Till exempel, för att värma upp provet från rumstemperatur (ca 20 ° c) till 35 ° c, snarare än att ställa in måltemperaturen direkt vid 35 ° c, rekommenderar vi en mellanliggande måltemperatur på 30 ° c för att minska risken för att temperaturen stiger över 36 ° c, vilket oåterkalleligt skulle skada proteinerna33. På samma sätt, vid kylning av provet från rumstemperatur till ~ 16 ° c, det rekommenderas att ställa in en mellanliggande måltemperatur på 18 ° c, eftersom innan du når ett stabilt tillstånd, PID kan kyla provet under 16 ° c, depolymerizing MTs33.

Den presenterade temperaturkontroll metoden förlitar sig på kyla och värme med hjälp av en TEC. Användningen av TEC säkerställer att provet når måltemperaturen inom några sekunder, medan en konventionell temperaturkontroll inställning med hjälp av ett temperaturstyrt vattenbad tar minuter för att nå önskad temperatur (figur 5)55. TEC genererar icke-noll netto värme som skingras av en aluminium inre vattencirkulationssystem. Dock tillåter vattnet mögel att växa, som så småningom kommer att täppa till kanalen56. En igensatt kanal hämmar vattenflödet, och värmen kommer att ackumuleras i aluminium blocket, så småningom smältande vattenrören. De smälta rören orsaka vatten att spilla över Mikroskop och kamera, skadar de elektroniska instrumenten. Därför, för att anta den presenterade temperaturreglering setup, rekommenderar vi att lägga 0,1% väteperoxid till vattnet för att hämma mögeltillväxt57,58,59. Vi förväntar oss att detta steg kommer att säkerställa att den inre aluminium kanalen förblir täppa-fri och förhindra vattenskador på närliggande elektroniska apparater.

Manipulera temperaturen, beläggning flödescellytor med polyakrylamid, och syntetisera aktiva vätskor är tre kritiska steg för att inse detta i situ-kontrollerad aktiv vätska. Denna manöverbarhet är dock begränsad till det temperaturområde där de inblandade proteinerna kan fungera normalt. I det aktiva vätskesystemet är de primära proteinerna MTs-och kinesinkluster, som normalt fungerar mellan 16 – 36 ° c33. Inom detta temperaturområde varierar aktiva vätskor deras genomsnittliga flödeshastigheter från 4 – 8 μm/s (figur 4C). Medelhastigheter utanför detta intervall ligger utanför gränsen för den presenterade kontrollmetoden. Däremot rapporterade Ross et al. ett alternativ som gör det möjligt för aktiva vätske aktiviteter slås på och av med hjälp av ljus28. Ljusstyrningen möjliggör också aktivering av aktiva vätskor i en 50 μm skala optiskt definierad gräns. Ett sådant alternativ kräver dock att kinesinstrukturen ändras tillsammans med en optisk bana i Mikroskop. I jämförelse, fördelarna med att anta den metod som presenteras i denna artikel är 1) de aktiva vätskorna behöver inte omformas, 2) Mikroskop behöver inte ändras, 3) temperaturkontroll inställningen är låg kostnad och enkel att använda, och 4) metoden kan överföras till andra temperaturberoende system såsom glid test29,30,31,32 eller mer allmänt enzymbaserade system60. Vi förväntar oss också att den presenterade metoden kommer att öppna dörren för att designa mikrofluidiska system där kanal flöden styrs lokalt utan ventiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 var en gåva från Dr Zvonimir Dogic. Denna forskning stöddes av Dr. kun-ta Wu ' s startfond i Worcester Polytechnic Institute. Vi tackar Dr Zvonimir Dogic för protokollen att rena och etikett tubulin och att syntetisera aktiva vätskor. Vi är tacksamma för Dr Marc Ridilla för hans expertis inom proteinuttryck och rening. Vi tackar Dr William Benjamin Roger för att hjälpa oss med att bygga den temperaturstyrda scenen. Vi erkänner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) för användning av biologiska material Facility (BMF). Vi erkänner det kungliga kemi förbundet för att anpassa siffrorna från BATE et al. on Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

Ingenjörskonst utgåva 153 biofysik kinesin Microtubule aktiva vätskor självorganisering temperatur Arrhenius Law
Kontrollera flödeshastigheter av Mikrotubule-baserade 3D aktiva vätskor med temperatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter