Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Styring af strømningshastigheder for 3D-aktive væsker med mikrotubulus ved hjælp af temperatur

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Målet med denne protokol er at bruge temperatur til at styre strømningshastigheden af tredimensionelle aktive væsker. Fordelen ved denne metode ikke kun giver mulighed for regulering af strømningshastigheder in situ, men også giver mulighed for dynamisk kontrol, såsom periodisk tuning flow hastigheder op og ned.

Abstract

Vi præsenterer en metode til at bruge temperatur til at tune strømningshastigheder af kinesin-drevne, microtubule-baserede tredimensionale (3D) aktive væsker. Denne metode giver mulighed for tuning hastigheder in situ uden at det er nødvendigt at fremstille nye prøver for at nå forskellige ønskede hastigheder. Desuden giver denne metode mulighed for dynamisk kontrol af hastighed. Cykling temperaturen fører væsker til at flyde hurtigt og langsomt, periodisk. Denne styrbarhed er baseret på Arrhenius-karakteristikken af kinesin-microtubule-reaktionen, der viser et kontrolleret gennemsnitligt strømningshastighedsområde på 4 – 8 μm/s. Den præsenterede metode vil åbne døren til udformningen af mikrofluidisk enheder, hvor strømningshastigheder i kanalen er lokalt tunable uden behov for en ventil.

Introduction

Aktivstof er differentieret fra konventionelle passive stoffer på grund af sin evne til at omdanne kemisk energi til mekanisk arbejde. Et materiale, der besidder en sådan kapacitet kan bestå af levende eller ikke-levende enheder såsom bakterier, insekter, kolloider, kerner, og cytoskeletale filamenter1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse materielle enheder interagerer med deres naboer. I større målestok, de selv-organisere sig i enten turbulente-lignende hvirvler (aktiv turbulens) eller materialestrømme11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En forståelse af selvorganisering af aktivstof har ført til forskellige anvendelser i molekylære Shuttles, optiske enheder, og parallel beregning21,22,23. At bringe ansøgninger til det næste niveau kræver kontrol ud over selvorganisering. For eksempel, Palacci et al. udviklet en hematite-indkapslet kolloid, at selvkørende kun når de udsættes for manuelt kontrolleret blåt lys, hvilket førte til fremkomsten af levende krystaller24. Morin et al. etablerede kontrol af rullende Quincke kolloider ved hjælp af en tunable ekstern elektrisk felt, hvilket resulterer i kolloid strømmer i en væddeløbsbane-lignende kanal25. Disse tidligere værker demonstrere rollen som lokal kontrol i applikationer og fremme videnbasen af aktive stof.

I denne artikel fokuserer vi på styrbarhed af kinesin-drevne, mikrotubulus (MT)-baserede 3D-aktive væsker. Væskerne består af tre hovedkomponenter: MTs, kinesin Molecular Motors og depletants. De depletanter fremkalde en udtynding kraft til at bundte MTs, som senere bridged af motor klynger. Disse motorer går langs MTstoward plus enden. Når et par bridged MTsis antiparallel, de tilsvarende motorer gå i modsatte retninger. Men motorerne er bundet i en klynge og er ude af stand til at gå fra hinanden, så de i samarbejde glider fra hinanden par af MTs (interfilament glidende, figur 1a). Disse glidende dynamik ophobes, forårsager bundter af MTsto forlænge indtil nå deres Buckling ustabilitet punkt og pause (extensile bundter, figur 1B)26. De brudte bundter er udglødet af nedbrydningen kraft, som efterfølgende strækker sig igen, og dynamikken gentage. Under processen med den gentagne dynamik, røre bundt bevægelser de nærliggende flydende, inducerende strømme, der kan visualiseres ved doping med micron-Scale røbestoffer (figur 1C). Sanchez et al. og henkin et al. har karakteriseret de gennemsnitlige hastigheder af røbestoffer, konstatering af, at hastigheder var tunable ved at variere koncentrationerne af adenosin trifosfat (ATP), depletants, motor klynger, og MTs19,27. Men, en sådan tunbarhed eksisterede kun før aktiv væske syntese. Efter syntese, den tunbarhed var tabt, og væsker selvorganiserede på deres egen måde. For at kontrollere aktiv væske aktivitet efter syntese, Ross.et al. rapporteret en metode ved hjælp af lys-aktiveret denne af motor proteiner, så væske aktivitet, der skal tunet til og fra ved hjælp af lys28. Mens lys kontrol er praktisk i form af lokalt aktivering af væsker, metoden kræver redesigne strukturerne af motor proteiner, sammen med at ændre de optiske stier i et mikroskop. Her giver vi en brugervenlig metode til lokal styring af væske strømme uden mikroskop modifikation, samtidig med at motor strukturen bevares intakt.

Vores metode til lokal tuning aktiv fluid flow er baseret på Arrhenius loven, fordi kinesin-MT reaktion er blevet rapporteret at stige med temperatur29,30,31,32. Vores tidligere undersøgelser viste, at temperatur afhængigheden af den gennemsnitlige hastighed af en aktiv fluid flow fulgte Arrhenius ligningen: v = a exp (-EA/rt), hvor a er en præ-eksponentiel faktor, R er gaskonstanten, EA er aktiveringsenergien, og T er systemets temperatur33. Derfor er flydende aktivitet følsom over for temperatur miljøet, og system temperaturen skal være konsistent for at stabilisere motorens ydeevne, og dermed væskestrømmen hastighed34. I denne artikel viser vi brugen af motorens temperaturafhængighed til løbende at finjustere strømningshastigheden af aktive væsker ved at justere system temperaturen. Vi demonstrerer også forberedelsen af en aktiv væskeprøve, efterfulgt af montering af prøven på et mikroskop stadie, hvis temperatur styres via computer software. En forøgelse af temperaturen fra 16 °C til 36 °C øger den gennemsnitlige strømningshastighed fra 4 til 8 μm/s. Desuden er tunbarhed reversibel: gentagne gange øger og sænker temperaturen sekventielt accelererer og decelererer flowet. Den demonstrerede metode gælder for en lang række systemer, hvor de vigtigste reaktioner adlyder Arrhenius-loven, såsom MT gliding assay29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af MTs

Forsigtig: i dette trin renser vi tubuliner fra bovin hjernevæv. Bovin hjernen kan forårsage variant Creutzfeldt-Jakob sygdom (vCJD)35. Derfor bør hjerne affald og relaterede opløsninger, flasker og pipettespidser opsamles i en bioaffald taske og bortskaffes som biologisk farligt affald i henhold til institutionens regler.

  1. Purify tubuliner fra kvæg hjernen (modificeret fra Castoldi et al.36).
    1. Transporterer ca. 1,5 kg fersk kvæg hjerner fra et lokalt slagteri til et Universitets kølerum. Under transporten opbevares hjernen i fosfatbuffer (20 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 7,2) på is.
      Bemærk: for at maksimere det endelige udbytte af Tubulin er den oprindelige mængde af funktionel Tubulin i det friske hjernevæv nøglen. Friskere hjerner indeholder mere funktionel Tubulin. For at få de friskeste hjerner fra slagteriet anbefaler vi at bede slagteren om at give hjerner fra de senest slagtede køer. Hjerner bør ikke være ældre end 3 h, når du starter proceduren, fordi at reducere tiden mellem slagtning og procedurestart vil give bedre udbytte.
    2. Homogeniser og tydeliggør hjernen.
      1. Rengør hjernen ved at bruge skalpeller til at skære blodkar og bindevæv i mindre stykker og fjerne dem fra hjernen i hånden.
        Bemærk: den rensede hjerne skal være lyserød.
      2. Nedsænk det rensede hjernevæv i 1 L depolymeriserings buffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre, 1 mM CaCl2, ph 6,6) pr. kg hjerne.
      3. Homogeniser hjernen med en køkken blender.
      4. Den homogeniserede hjerne opløsning centrifugeres ved 10.000 x g og 4 °c i 150 min.
    3. Polymerize MTs (første polymerisering).
      1. Saml og bland supernatanten med lige store mængder af følgende opløsninger ved 37 °C: glycerol, højmolaritet PIPES buffer (HMPB: 1 M rør, 10 mM MgCl2, 20 mm ethylenglycol-bis (β-aminoehyl ether)-N, N, n ', N'-tetraeddikesyre [EGTA], ph 6,9
      2. Tilsæt 1,5 mM ATP og 0,5 mM Guanosintrifosfat (GTP) til blandingen.
      3. Blandingen inkubates ved 37 °C i 1 time.
    4. Depolymerize MTs (første MT depolymerisering).
      1. Pellet MT ved centrifugering ved 151.000 x g og 37 °c i 30 min.
      2. Supernatanten kasseres, og hver MT-pille opslæmmes i 10 mL 4 °C DB.
      3. Inkuber på is i 30 minutter.
      4. Omrypér blandingen hver 5 min med en pipettespids for at undgå MT sedimentation.
        Bemærk: blandingen skal blive klar i 30 min, hvilket indikerer færdiggørelse af MT depolymerisering.
    5. Polymerize MTs (anden MT polymerisering).
      1. Opløsningen klargøres ved at centrifuger ved 70.000 x g og 4 °c i 30 minutter.
      2. Supernatanten opsamles og blandes med lige store mængder 37 °C glycerol og HMPB.
      3. Tilsæt 1,5 mM ATP og 0,5 mM GTP til blandingen.
      4. Blandingen inkubates ved 37 °C i 30 minutter.
    6. Gentag trin 1.1.4, udskiftning af hmpb med Brinkley genmontering buffer (BRB) 80 (80 mm rør, 1 mm mgcl2, 1 mm EGTA, ph 6,8), efterfulgt af afklaring af den ryddede blanding ved centrifugering ved 79.000 x g og 4 °c i 30 min.
    7. Saml supernatanten. Mål 280 Nm absorbans med et spektrometer. Bestemmelse af tubulinkoncentrationen ved hjælp af Beer-Lambert-loven (ekstinktionskoefficient for Tubulin: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Opbevar proteinet ved-80 °C.
  2. Genbrug tubuliner (modificeret fra Castoldi et al.36).
    Bemærk: for at forbedre tubulins renhed er den rensede Tubulin polymeriseret og depolymeriseret igen.
    1. Polymerisere MTs ved at blande den rensede Tubulin (trin 1.1.7) med 500 μm ditiotreitol (DTT) og 20 μM GTP, efterfulgt af 30 min inkubation ved 37 °c.
    2. Pellet MTs.
      1. 1 mL glycerol pude (80 mM rør, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, ph 6,8) i bunden af et centrifugeglas.
      2. Læg den polymeriserede MTs oven på puden.
      3. Centrifuge ved 172.000 x g for 90 min ved 37 °c.
    3. Depolymerisere MTs.
      1. Fjern supernatanten og puden.
      2. Resuspension hver MT pellet i 150 μL af 4 °C MT buffer (M2B: 80 mM rør, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, ph 6,8).
      3. Blandingen inkubates på is i 30 minutter.
      4. Blande blandingen med en pipettespids hver 5 min. Blandingen skal blive klar.
    4. Blandingen klargøres ved centrifugering ved 172.000 x g og 4 °c i 30 minutter.
    5. Saml supernatanten. Måle proteinkoncentrationen. Opbevares ved-80 °C.
  3. Mærk Tubulin med fluorescerende farvestof39.
    1. Polymeriserer MTs. Bland den rensede Tubulin (trin 1.1.7) med 500 μM DTT og 16,7 μM GTP, og Inkuber blandingen ved 37 °C i 30 min.
    2. Pellet MTs.
      1. 1 mL 37 °C høj pH-pude (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, pH 8,6) placeres i et centrifugeglas.
      2. Læg den polymeriserede MTs på puden.
      3. Centrifuge ved 327.000 x g for 50 min ved 37 °c.
    3. Label Tubulin.
      1. Resuspension hver MT pellet med 700 μL 37 °C mærknings buffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm egta, 40% v/v glycerol, pH 8,6).
      2. Bland suspensionen med en 10 – 20 Molar overskydende fjern røde fluorescerende farvestof funktionaliseret med en succinimidyl ester.
      3. Blandingen inkubateres ved 37 °C i 30 minutter i mørke for at tillade MTs at reagere med ester af fluorescerende farvestof.
      4. Stop mærknings reaktionen ved at mægle ester af det suspenderende farvestof med 50 mM K-glutamat, inkuberet i 5 min ved 37 °C.
    4. Pellet den mærkede MTs: Gentag trin 1.3.2, udskiftning af høj-pH pude med lav-pH pude (80 mM rør, 2 mM MgCl2, 1 mm egta, 60% v/v glycerol, ph 6,8).
    5. Depolymerize MTs.
      1. Kassér supernatanten og puden.
      2. Resuspension af pellet i 700 μL af 4 °C M2B.
      3. Inkuber suspensionen på is.
      4. Agitér hver 5 min med en pipettespids, indtil opløsningen er klar.
    6. Den ryddede opløsning klargøres ved centrifugering ved 184.000 x g og 4 °c i 35 min.
    7. Forbedre renheden af den mærkede Tubulin opløsning ved at gentage trin 1.2.1-1.2.4.
    8. Mål koncentrationen af proteiner og fluorescerende farvestof. Disse målinger anvendes til bestemmelse af tubulinkoncentrationen og fraktioner af mærket Tubulin, defineret som forholdet mellem koncentrationen af fluorescerende farvestof og Tubulin.
    9. Opbevar den mærkede Tubulin-opløsning ved-80 °C.
  4. Polymeriserer MTs (vedtaget fra Sanchez et al.19):
    1. Bland den genvundne Tubulin (trin 1.2.5) med mærket Tubulin (trin 1.3.9) i et forhold, der giver en 3% mærket Tubulin fraktion.
    2. Bland 8 mg/mL Tubulin blandingen med 1 mM DTT og 0,6 mM guanosine-5 ' [(α, β)-methyleno] trifosfat (GMPCPP), efterfulgt af 30 min inkubation ved 37 °C.
    3. Efter inkubationen, anneal MTs ved stuetemperatur i mørke for 6 h.
    4. Og opbevares ved-80 °C.

2. syntetisere kinesin-klynger

Bemærk: bakterier findes allestedsnærværende og kan vokse i medierne og kontaminere forberedelsesprocessen. For at undgå kontaminering skal handlinger, der involverer kontakt med cellekulturer (f. eks. pipettering), udføres i nærheden af en flamme. Værktøjer som kolber, pipetter, pipettespidser, medier og plader skal autoklave før brug.

  1. Express kinesin Motors i Escherichia coli40.
    1. Transformere cellerne.
      1. 1 μL af K401-BCCP-H6 plasmid afpipetteres i 10 μL af de kompetente celler.
      2. Inkuber på is i 5 minutter.
      3. Varmechok ved 42,5 °C for 45 s.
      4. Inkuber cellerne på is i 2 minutter for at tillade nyttiggørelse.
      5. Bland cellerne med 300 μL antibiotikum-fri 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L gær ekstrakt, 16 g/L tryptone).
      6. Cellerne inkubates ved 37 °C i 1 time.
        Bemærk: medmindre andet er angivet, er det ikke nødvendigt at overvåge cellevæksten under inkubationen.
    2. Indokulere plade medier.
      1. Spred cellekulturen på en 2XYT plade (10 g/L NaCl, 5 g/L gær ekstrakt, 10 g/L tryptone, 15 g/L agar, 100 μg/mL ampicillin, 25 μg/mL chloramphenicol).
      2. Inkuber pladen på hovedet ved 37 °C natten over.
    3. Inokulere flydende medier.
      1. Fra overnight pladen, høst en isoleret koloni med en pipettespids.
      2. Skub spidsen ind i en kolbe, der indeholder 50 mL 2XYT.
      3. Inkubatér og ryst kulturmediet ved 37 °C og 200 rpm i 12 – 16 timer.
    4. Udvid cellerne.
      1. Bland 2,5 mL af cellekulturen i 500 mL 2XYT.
      2. Inkubatér og ryst 500 mL-kulturen ved 37 °C og 250 rpm i 3 – 6 timer.
    5. Inducerer protein ekspression.
      1. Under inkubationen, overvåge cellevækst ved at måle absorbansen ved 600 nm, ved hjælp af 2XYT som reference. Absorbansen måles hver 60 min., indtil den når OD600 = 0,3. Derefter måles absorbansen hver 30 min., indtil den når 0,5 – 0,6.
      2. Lad cellerne vokse, indtil absorbansen når OD600 = 0,5 – 0,6
      3. Tilsæt 24 μg/mL biotin og 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til cellekulturen.
        Bemærk: IPTG anvendes til at inducere protein ekspression af kinesinmotorerne, som er mærket med biotin carboxylbærerprotein (BCCP) og seks histidiner (H6). H6-mærket bruges i rensningsprocessen (trin 2,2), mens BCCP binder sig til de tilføjede biotinmolekyler til biotinylat de udtrykte kinesinmotorer.
      4. Inkubatér og ryst cellekulturen ved 20 °C og 250 rpm i 12 – 20 timer.
    6. Cellerne høstes ved centrifugering ved 5.000 x g og 4 °c i 10 min. kassér supernatanten. Opbevar celle pillerne ved-80 °C.
  2. Renser kinesin motor protein (modificeret fra Spriestersbach et al.41):
    1. Celle pellet (trin 2.1.6) suspenderes med samme mængde lyse buffer (50 mM rør, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mm 2-mercaptoethanol (βme), 20 mm imidazol, pH 7,2), efterfulgt af tilsætning af en proteasehæmmer, 2 mg phenylmethylsulfonylfluorid (pmsf) og 2 mg lysozym.
    2. Lysere cellerne ved Flash frysning i flydende nitrogen (LN) 3x og optøning af celle blandingen.
      Bemærk: efter Lysing skal blandingen blive viskøs.
    3. Klargøre den lyserede celle blanding ved centrifugering ved 230.000 x g og 4 °c i 30 min.
    4. Opsaml supernatanten, og flow den gennem en gravitations kolonne, efterfulgt af vask af søjlen med 10 mL lysisbuffer.
      Bemærk: proteiner med et H6-tag, såsom kinesin K401-BCCP-H6, bør forblive i kolonnen.
    5. Det mærkede protein eluerer med 5 mL elelueringsbuffer (50 mM rør, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mm imidazol, pH 7,2). Saml gennemstrømnings-through sekventielt i 1 mL fraktioner. For at bestemme de protein-holdige fraktioner blandes 3 μL af hver fraktion med 100 μL triphenylmethane farve. De protein-holdige fraktioner bør blive blå. Kombiner disse fraktioner og fortyndes med 5x med lysis buffer.
    6. Koncentrer protein opløsningen.
      1. Læg opløsningen i et centrifugal filterrør.
      2. Centrifugeres ved 3.000 x g i 10 minutter ved 4 °c.
      3. Ryst røret forsigtigt og centrifugeres igen, indtil opløsningen er < 3 mL.
    7. Proteinkoncentrationen måles med et spektrometer (ekstinktionskoefficient: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Proteinet fortyndes til 1 mg/mL, samtidig med at 35% w/v saccharose.
    8. Opbevares ved-80 °C.
  3. Mål kinesinkoncentrationerne med en elektroforese gel (modificeret fra Taylor et al.44).
    Bemærk: for at måle kinesinkoncentrationen med en elektroforese gel er Tubulin en ideel koncentrations stige på grund af dens høje renhed og dens målbare koncentration via et spektrometer (figur 2a)36.
    1. Forbered tubulinprøver med koncentrationer på 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 og 1,25 mg/mL. Bland 15 μl af hver tubulinprøve og kinesin-prøve (trin 2.2.8) separat med 5 μl prøve buffer (200 mm Tris-HCl, 8% natriumdodecylsulfat (SDS), 400 mm DTT, 0,2% bromphenolblåt blå, 40% glycerol, ph 6,8) og Inkuber ved 90 °c i 3 min.
    2. Forbered elektroforesen.
      1. Lås en elektroforese gel ind i gel boksen.
      2. Fyld kassen med løbe buffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris base, 0,1% SDS, 1 mM ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), pH 7,7).
        Bemærk: Sørg for, at buffer niveauet ligger over gelens øverste åbning.
    3. Læg 10 μL protein standard stigen, Tubulin prøver og kinesin prøve i separate brønde, og Påfør 200 V på tværs af gelen i 45 min.
    4. Gel farvning.
      1. Inkuber og rock gelen med kogt (ca. 95 °C) bejdsning opløsning A (0,5 g/L triphenylmethan farvestof, 10% v/v eddikesyre, 25% isopropanol) i 5 min, derefter skylles gelen med deioniseret (DI) vand.
      2. Gentag med plet opløsninger B (0,05 g/L triphenylmethan farvestof, 10% v/v eddikesyre, 10% isopropanol), C (0,02 g/L triphenylmethan farvestof, 10% v/v eddikesyre), og D (10% v/v eddikesyre), sekventielt. Inkuber og rock gelen i DI vand natten over.
    5. Scan gelen. Konverter gel billedet til et gråtonebillede, efterfulgt af en sort og hvid inversion og kontrastforbedring for at afsløre lyse protein bånd i den sorte baggrund.
    6. Mål lysstyrken for hvert bånd ved at addere pixelværdierne. Anvend den lineære pasform C = AB + b, hvor b er lysstyrken i et Tubulin-bånd, c er den tilsvarende koncentration, og a og b er tilpasnings parametre. Koncentrationen af kinesin Ck bestemmes ved hjælp af lysstyrken på Kinesin-båndet Bk for at beregne den lineære ligning: Ck = ABk + B.
  4. Klynge kinesinmotorerne.
    1. Bland 1,5 μM kinesin (trin 2.2.8) med 120 μM DTT og 120 nM streptavidin. Inkuber på is i 30 minutter.
    2. Opbevares ved-80 °C.

3. Forbered polyacrylamid-belagte glas skred og dæksedler (modificeret fra Lau et al.45)

  1. Læg nye glas glider og glas dæksedler i tilsvarende beholdere. Nedsænk slides og dæksedler i 1% v/v rengøringsmiddel i DI vand og kog derefter vandet i en mikrobølgeovn.
  2. Soniter slides og dæksedler i 5 minutter og skyl derefter med DI vand for at fjerne vaskemiddel.
  3. Nedsænk og soniter slides og dæksedler i ethanol i 5 min. Skyl med DI vand.
  4. Nedsænk og soniter slides og dæksedler i 100 mM kaliumhydroxid (KOH) i 5 min. Skyl med DI vand.
  5. Der inkubaterer lysbilleder og dæksedler i en silan-opløsning (1% eddikesyre og 0,5% 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat i ethanol) i 15 minutter og skylles derefter med di-vand.
  6. Inkubatter og dæksedler i acrylamid opløsning (2% w/w acrylamid, 0,7 mg/mL ammonium persulfat og 0,0035% v/v tetramethylethylenediamin i DI vand) i ≥ 3 timer.
  7. Opbevar lysbilleder og dæksedler i acrylamid opløsningen.

4. Forbered kinesin-drevne, MT-baserede aktive væsker

  1. Forbered aktive væsker (modificeret fra Sanchez et al.19).
    Bemærk: følgende trin viser processen med at forberede 100 μL af en aktiv væske ved hjælp af eksempel bestande. Den endelige volumen er skalerbar, og koncentrationerne af eksemplet bestande kan justeres, så længe den endelige koncentration af hver komponent opretholdes.
    1. Bland 16,7 μL 8 mg/mL MTs (trin 1.4.4) med 6,7 μL 1,8 μM kinesin-motor klynger (trin 2.4.2) og 1,1 μL af 500 mM DTT i højsalt M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bundt MTs ved at tilføje 11,4 μL af 7% w/w polyethylenglycol (PEG).
    3. Aktiver kinesin-motorerne ved at tilsætte 2,8 μL 50 mM ATP.
    4. ATP-koncentrationerne opretholdes ved tilsætning af 2,8 μL pyruvatkinase/lactat dehydrogenase (PK/LDH) og 13,3 μL 200 mM phosphenol pyruvat (PEP).
    5. Reducere foto blegning effekt ved tilsætning af 10 μL af 20 mM Trolox, 1,1 μL 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL af 20 mg/mL glucoseoxidase, og 1,1 μL af 300 mg/mL glucose.
    6. Spor bevægelsen af væsken ved at tilføje 1,6 μL 0,025% v/v Tracer partikler.
    7. Tilsæt High-salt M2B for at opnå et samlet volumen på 100 μL.
      Bemærk: blandings ordrerne i trin 4.1.1-4.1.6 er udskiftelige. Men når ATP, MTs, og motorerne blandes, begynder motorerne at forbruge ATP, mens de træder langs MTs. Prøven aktiveres med en begrænset levetid på grund af de begrænsede brændstoffer (ATP og PEP), så eksperimentet bør påbegyndes straks. Den endelige aktive væske skal indeholde 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesinmotorik, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PIND, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glucoseoxidase, 3,3 mg/mL glucose, og 0,0004% v/v kolloid i High-salt M2B.
  2. Forbered en prøve i en flow kanal (modificeret fra Chandrakar et al.46):
    1. Skyl en polyacrylamid-belagt glas rutsjebane og dækseddel (trin 3,7) med DI-vand. Tør brillerne med trykluft. Placer på en ren, flad overflade.
    2. Skær to strimler af voks film med en bredde på 3 mm og samme længde som glas dæksedlen (20 mm). Sæt strimlerne mellem sliden og dæksedlen som kanal afstandsstykker.
    3. Fastgør glasset til voks filmen ved at placere glas voks komplekset på en 80 °C varm plade for at smelte voks. Under smeltningen skal du forsigtigt trykke dæksedlen med en pipettespids for at holde voks filmen på glas overfladerne ensartet. Efter adhæsion afkøles glas komplekset til stuetemperatur.
    4. Ilæg de aktive væsker (trin 4,1) til flow kanalen. Forsegl kanalen med UV-lim.

5. kontrol af prøvens temperatur

  1. Byg en temperaturkontrol opsætning (modificeret fra designs i lowensohn et al. og Wu et al.47,48,49).
    1. Forbered en aluminiums køleblok.
      1. Mill en aluminiumsplade med dimensioner på ca. 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Bor en intern kanal gennem pladen (figur 3A), og Installer slange beslag ved kanal enderne.
      3. Fastgør hver montering til et vandrør.
      4. Forbind et rør til en fisketank pumpe i et vandreservoir, mens du udvider det andet rør til reservoiret.
        Bemærk: pumpen vil cirkulere reservoir vand gennem de interne aluminiums kanaler for at opretholde blok temperaturen ved ca. stuetemperatur.
    2. Wire en Termoelektrisk køler (TEC) og en termo sensor til en temperaturregulator. Tilslut controlleren til en computer ved hjælp af en USB-port (figur 3B).
    3. Wire temperaturregulatoren til en strømforsyning med jævnstrøm (DC). Tænd for controlleren ved at tilslutte strømforsyningen til en stikkontakt.
    4. Udfør den indledende opsætning af TEC efter controlleren producentens vejledning. Test TEC-output. Det anbefales at styre temperaturregulatoren via producent-forudsat software, så termosensor dataregistrering og lettere manipulation af temperaturregulator.
    5. Identificere varme-og køle siderne i TEC.
    6. Fastgør TEC-køle siden på køle blokken (trin 5.1.1) ved hjælp af termisk pasta.
    7. Fastgør en safir disk til TEC'S varme side ved hjælp af termisk pasta.
    8. Opsætningen er fuldført. Safir overfladen og termo sensoren kan kontakte en prøve for at køle og opvarme prøven baseret på dens temperatur og måltemperatur.
      Bemærk: det anbefales, at TEC og køle blokken har et justeret central hul til billeddannelse af prøverne ved hjælp af lysfelt mikroskopi (figur 3C).
  2. Brug opsætningen af temperaturstyring til at styre prøvetemperaturen33.
    1. Monter eksemplet på opsætningen.
      1. Placer den aktive væskeprøve (trin 4.2.4) på safir overfladen med glide siden ved kontakt med overfladen.
      2. Fastgør glas sliden med papir tape.
      3. Fastgør termo sensoren på coverskridens overflade ved hjælp af kobber tape.
    2. Monter opsætningen på et mikroskop stadie med dækglas-siden mod målene. For eksempel, på et inverteret mikroskop, bør dækglas side med forsiden nedad. Fastgør opsætningen med papir tape og mikroskop nåle klemmerne, hvis det er relevant.
      Bemærk: den præsenterede temperatur fase bør arbejde med almindeligt mikroskoper, der enten er inverteret eller oprejst. For at sikre, at temperatur stadiet ikke flyttes under eksperimentet, er det bedst at sikre temperatur stadiet til mikroskopet scenen med tape.
    3. Kontroller prøvetemperaturen.
      1. Tænd for temperaturregulator og fisketank pumpe.
      2. Følg producentens vejledning for at indstille måltemperaturen og aktivere temperaturstyring. Controlleren justerer varme-eller køleeffekten baseret på måltemperaturen og prøvetemperaturen som vurderet af termo sensoren.
    4. Optag prøve temperaturer.
      1. Følg producentens vejledning til registrering af termosensor temperatur data under eksperimentet.
        Bemærk: prøvetemperaturen skal nu styres af controlleren og registreres af computeren (figur 3D).

6. karakteriser den aktive væske aktivitet (modificeret fra metoder af henkin et al. og Wu et al.20,27)

Bemærk: de foregående sektioner bruges til at tilberede aktive væskeprøver (afsnit 1 – 4) og styre deres temperatur (punkt 5). For at demonstrere brugen af temperatur til at styre den aktive væske aktivitet, observere den flydende adfærd, analysere deres aktiviteter, og karakterisere deres reaktion på temperaturen.

  1. Monitor Tracers.
    1. Billede prøven med et konstant interval Δt ved hjælp af fluorescens med grønt fluorescerende protein (gfp) for at opfange spor partiklernes bevægelser.
      Bemærk: Δt skal vælges, for at Tracer-bevægelsen kan spores. Store Δt -værdier, såsom 100 s, resulterer i at tabe spor forløbskurver, hvorimod korte Δt -værdier, såsom 0,1 s, forhindrer sporings algoritmen i at registrere spor bevægelsen mellem rammer. En fungerende Δt bør gøre det muligt for Tracer forskydning mellem frames til at være inden ~ 9 pixels. For billedbehandlings spor, der bevæger sig ved 10 μm/s ved hjælp af en 4X-målsætning, anbefales Δt at være 1 – 5 s.
    2. Gem billederne som TIFF-filer, Navngiv filerne baseret på rammenummer, og opbevar dem i en separat mappe. Disse processer er nødvendige for at sikre, at de erhvervede billeder vil blive korrekt analyseret med MATLAB scriptet forudsat (trin 6.2.2).
  2. Track røbestoffer vedtagelse tracking software udviklet af Ouellette et al.50,51):
    1. Download tracking software fra Environmental kompleksitet Laboratory, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Sørg for, at hver MATLAB-fil er i den samme mappe.
    2. Spor røbestoffer ved hjælp af en brugerdefineret MATLAB script: particle_tracking. m. Scriptet læser Tracer images (trin 6,1) og sporer Tracer bevægelse ved hjælp af softwaren af Ouellette et al.50,51. Den udsender to filer: 1) background. tif, som repræsenterer billedets baggrund, og 2) tracking. mat, der indeholder partikel forløbskurver og hastigheden i hver ramme (figur 4A).
  3. Analysér de gennemsnitlige hastigheder ved hjælp af et tilpasset MATLAB-script: Analysis. m. Scriptet læser sporingsfilen (tracking. mat) og udsender den gennemsnitlige hastighed for røbestoffer vs. tid, sammen med en tids gennemsnitlig gennemsnitshastighed med specificerede gennemsnits vinduer (figur 4B)33.
  4. Registrer den gennemsnitlige gennemsnitshastighed for tiden.
  5. Mål den gennemsnitlige gennemsnitshastighed ved at gentage eksperimentet (trin 4, 5,2 og 6.1 – 6.4) ved 10 – 40 °C. Brug de registrerede middel hastigheder til at afbilde gennemsnitshastigheden vs. temperatur (figur 4C)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klargøring af kinesin-drevne, MT-baserede aktive væsker kræver både kinesin og MTs. MTs blev polymeriseret fra mærkede tubuliner (trin 1,3 og 1,4), der blev renset fra kvæg hjerner (trin 1,1, figur 2A), efterfulgt af genanvendelse for at forbedre renhed (trin 1,2, figur 2B). Kinesinmotorproteinerne blev udtrykt i og renset fra E. coli (trin 2,1 og 2,2, figur 2B)41,52. Koncentrationen af den fremstillede kinesin-bestand blev målt med en SDS-gel ved at sammenligne lysstyrken i hovedbåndet med de genvundne tubuliner med kendte koncentrationer (trin 2,3, figur 2B justerings). Lysstyrkeværdierne for Tubulin-båndene (B) var lineært tilpasset deres tilsvarende koncentration (c) ved hjælp af ligningen c = AB + ε, hvilket giver en = 3,1 × 10-2 mg/ml og ε = 8,7 × 10-4 mg/ml (figur 2C). Den monterede ligning blev anvendt til at bestemme koncentrationen af et kinesin-bånd ved at anvende den målte bånd lysstyrke, Bk = 1.060, hvilket giver en kinesin-koncentration på Ck = 0,95 mg/ml. Der blev anvendt prøver af MT og kinesin med kendte koncentrationer til at tilberede aktive væskeprøver. De aktive væsker blev syntetiseret, indlæst i en polyacrylamid-belagt flowcelle, og cellen blev forseglet med UV-lim (punkt 3 og 4)46.

For at demonstrere kontrol af den aktive væske aktivitet med temperaturen blev den aktive væskeprøve monteret på det hjemmelavede temperaturtrin (trin 5,2, figur 3A-C). Prøvetemperaturen blev overvåget og kontrolleret af controlleren i henhold til en proportional-Integral-afledt (PID) algoritme53. Prøver kontrolleret ved 10 °C, 20 °C, 30 °C og 40 °C viste sig at svinge i temperatur inden for 0,1 – 0,3 °C i 4 timer, hvilket viser stabiliteten og pålideligheden af dette temperatur regulerings setup (figur 3D).

For at observere prøven blev opsætningen monteret på et epifluorescens mikroskop. Prøven blev doseret med Alexa 488-mærkede trackere, som blev afbildet med Fluorescens mikroskopi via en gfp-kanal (trin 6,1). Røbestoffer blev afbildet hver Δt = 2 s. De sekventielle billeder, der er tilladt til sporing af sporings forløbskurver ri, hvor jeg repræsenterer tracer-indekset (trin 6,2, figur 4A). Forløbskurver afslørede en gennemsnitlig hastighed v(t) ≡ < | ri(t)- ri(t-Δt) |/Δt>i (trin 6,3). Gennemsnits hastighederne målt ved 20 – 36 °C viste sig at være næsten tidsuafhængige ved t = 0 – 2 h, hvorimod gennemsnits hastighederne ved 10 °c og 40 °c hurtigt afveg (figur 4B). Henfaldet ved 10 °C skyldtes MT depolymerisering under 16 °C. Henfaldet ved 40 °C skyldtes, at kinesin-klyngerne havde funktionsfejl over 36 °C. I henhold til vores tidligere undersøgelser mister disse kinesin-motor klynger evnen til at drive par MTs efter præinkubation ved > 36 °C33. For at karakterisere gennemsnitshastigheden for hver temperatur og samtidig afspejle henfaldet induceret af disse faktorer, var gennemsnitshastigheden gennemsnitligt mellem t = 1 – 2 h (trin 6,3 og 6,4)33. De gennemsnitlige gennemsnitshastigheder for tiden blev målt mellem 10 °C – 40 °C (trin 6,5, fig. 4C). Under 16 °C og over 36 °C gennemsnitlige hastigheder forrådner sig hurtigt på grund af MT depolymerisering og funktionssvigt kinesin klynger33, mens stigende temperaturer fra 16 °c til 36 °c accelererede middel hastigheden fra 4 til 8 μm/s, hvilket viser, at det er muligt at justere gennemsnitshastigheden for et aktivt fluid flow ved hjælp af temperatur. For yderligere at påvise temperatur kontrollens evne blev system temperaturerne vekslet mellem 20 °C og 30 °C hver 30 min. De gennemsnitlige hastigheder for de aktive væsker accelererer og decelererer ikke kun i overensstemmelse hermed, men de reagerede også på temperaturændringen inden for 10 s (figur 5). En sådan reversibel og hurtig respons af den aktive væske demonstrerer muligheden for at bruge temperatur til dynamisk kontrol af væske aktiviteter.

Figure 1
Figur 1: indførelse af kinesin-drevne, MT-baserede 3D-aktive væsker. A) skemaer over glidende interfilament. Par af antiparallel MTs blev bundtet af depletants og drevet fra hinanden af motor klynger. (B) motor klynger kollektivt kørte par MTs, førende MT bundter at udvide. (C) extensile bundterne udgjorde en MT-baseret aktiv gel (grøn), der omrørter den omgivende væske for at inducere et flow. For at spore strømmen blev væsken doseret med røbestoffer (rød). Dette tal blev tilpasset fra BATE et al.33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: billeder af SDS gels fra Tubulin og kinesin-rensninger. A) billede af en SDS-gel af renset Tubulin. B) billede af en SDS-gel af genvundne tubuliner og renset kinesin. Banerne fra venstre mod højre var protein standarder, blank, 1,25-0,25 mg/mL genbrugs tubuliner, blank, og kinesin bestand. C) koncentrationen af renset kinesin blev bestemt ved at sammenligne lysstyrken i båndet med de sekventielle bånd af tubuliner med målte koncentrationer (røde og blå stiplede rektangler i inset). Lysstyrken for hvert bånd blev målt ved at addere pixelværdierne i et beskåret bånd billede. For at reducere baggrundsstøj, før beskæring gel billedet blev overført til gråtoner, sort-hvid inverteret, og derefter kontrast-forstærket for at afsløre en sort baggrund (inset). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Opsætning af temperaturstyring. (A) skematik af aluminiums blokken til temperaturstyringen setup. Blokken indeholder en intern kanal for vand til at flyde gennem det og bære væk TEC-genereret varme. Det centrale hul gør det muligt for prøven at blive belyst af lyse felt mikroskopi på den ene side og afbildet med et mål på den anden side. (B) skematik af opsætningen af temperaturstyringen. Silicium termisk pasta påføres mellem aluminiums køleblokken og TEC og mellem TEC og Sapphire disc. C) billede af en prøve monteret på det temperaturregulerede trin. Vandrørene er forbundet til en pumpe nedsænket i et vandreservoir. D) registrerede prøve temperaturer vs. tid for måltemperaturer på henholdsvis 10 °c, 20 °c, 30 °c og 40 °c. Prøve temperaturerne blev opretholdt ved temperaturer med en udsving på 0,1 – 0,3 °C. B og D blev tilpasset fra Bate et al.33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tuning aktiv væske strømmer via temperatur. (A) billedbehandlings spor (hvide prikker), der er tilladt til sporing af strømnings forløb sekventielt (miscellaneously farvede kurver). Tracerne blev overvåget hver 5 s (Δt = 5 s) ved stuetemperatur (~ 20 °c). B) gennemsnitlig hastighed i Tracer vs. tid ved henholdsvis 10 °c, 20 °c, 30 °c, 36 °c og 40 °c. C) gennemsnitlig hastighed i Tracer vs. temperatur. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige hastighed for spor hastigheden i den første og anden time. Under 16 °C er MTs depolymeriseret, og over 36 °C, kinesin-klynger fejlbehæftet. Derfor er Arbejdstemperaturen mellem 16 – 36 °C, hvor gennemsnitshastigheden varierede fra 4 – 8 μm/s. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen for de tidsgennemsnit lige gennemsnitshastigheder. B og C blev tilpasset fra Bate et al.33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Skift af strømningshastigheden for aktive væsker ved periodisk skift af system temperaturen. Skift af temperatur mellem 20 °C og 30 °C hver 30 min. accelererede og decelerede strømningshastigheder gentagne gange, hvilket demonstrerer lokal kontrol af aktive væske aktiviteter med temperaturen. Dette tal blev tilpasset fra BATE et al.33. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontrol af aktiv substans in situ åbner døren til styret selvorganisering af aktivstof4,5,24,28,54. I denne artikel præsenterer vi en protokol for brug af temperatur til at kontrollere kinesin-drevne, MT-baserede aktive væsker in situ, baseret på Arrhenius-karakteristisk for systemet29,30,31. Da systemet er protein baseret, er det nøglen til en vellykket anvendelse af protokollen at opretholde protein funktionaliteten i hele eksperimentet. De vigtigste proteiner i systemet er MTs og kinesin klynger. Den tidligere depolymerize under 16 °C og sidstnævnte funktionsfejl over 36 °C33. Opretholdelse af system temperaturen mellem 16 – 36 °C er derfor afgørende for aktive væsker for at udvikle en stabil dynamik og for at gøre det muligt at reagere på temperaturen reversibelt (figur 4 og figur 5). Men temperaturen styres baseret på en PID-algoritme, som har tendens til at over skyde måltemperaturen53. For at reducere denne overskridelse anbefaler vi, at du indstiller flere mellemliggende måltemperaturer, før du indstiller den endelige måltemperatur. For eksempel, for at opvarme prøven fra stuetemperatur (ca. 20 °C) til 35 °C, i stedet for at indstille måltemperaturen direkte ved 35 °C, anbefaler vi en mellemliggende måltemperatur på 30 °C for at reducere risikoen for, at temperaturen stiger til over 36 °C, hvilket ville beskadige proteinerne33. På samme måde anbefales det, når prøven afkøles fra stuetemperatur til ~ 16 °C, at fastsætte en mellemliggende måltemperatur på 18 °C, da PID, inden den når en steady state, kan afkøle prøven under 16 °C og depolymeriserende MTs33.

Den præsenterede temperaturkontrol metode er afhængig af køling og opvarmning ved hjælp af en TEC. Brugen af TEC sikrer, at prøven når måltemperaturen inden for få sekunder, hvorimod en konventionel temperaturkontrol opsætning ved hjælp af et temperaturkontrolleret vandbad tager minutter for at nå den ønskede temperatur (figur 5)55. TEC genererer forskellig fra nul nettovarme, der spredes af en aluminium indre vandcirkulation system. Men vandet tillader skimmel at vokse, som i sidste ende vil tilstoppe kanalen56. En tilstoppet kanal hæmmer vandstrømmen, og varmen vil ophobes i aluminiums blokken og til sidst smeltevand rørene. De smeltede rør forårsager vand til at spilde over mikroskop og kamera, beskadige de elektroniske instrumenter. Derfor, at vedtage den præsenterede temperaturkontrol setup, anbefaler vi at tilføje 0,1% hydrogenperoxid til vandet for at hæmme skimmelvækst57,58,59. Vi forventer, at dette skridt vil sikre, at aluminium interne kanal forbliver tilstoppe-fri og forhindre vandskader på nærliggende elektroniske enheder.

Manipulere temperatur, belægning flowcelle overflader med polyacrylamid, og syntetisere aktive væsker er tre kritiske trin til at realisere denne in situ-kontrollerede aktive væske. Denne kontrolbarhed er dog begrænset til det temperaturområde, hvor de involverede proteiner kan fungere normalt. I det aktive Fluid system er de primære proteiner MTs og kinesinklynger, der fungerer normalt mellem 16 – 36 °C33. Inden for dette temperaturområde varierer aktive væsker deres gennemsnitlige strømningshastigheder fra 4 – 8 μm/s (figur 4C). Gennemsnitlige hastigheder uden for dette interval ligger over grænsen for den viste kontrolmetode. I modsætning hertil rapporterede Ross et al. et alternativ, der gør det muligt at tænde og slukke for de aktive Fluid aktiviteter ved hjælp af Light28. Lysstyringen gør det også muligt at aktivere aktive væsker i en 50 μm-skala optisk defineret grænse. Men et sådant alternativ kræver ændring af kinesin struktur sammen med tuning en optisk vej i et mikroskop. Til sammenligning er fordelene ved at anvende den metode, der præsenteres i denne artikel, 1) de aktive væsker behøver ikke at blive redesignet, 2) mikroskoper behøver ikke at blive ændret, 3) opsætningen af temperaturstyringen er billig og nem at bruge, og 4) metoden kan overføres til andre temperaturafhængige systemer såsom gliding assay29,30,31,32 eller mere generelt enzym baserede systemer60. Vi forventer også, at den præsenterede metode vil åbne døren til at designe mikrofluidisk systemer, hvor kanal strømme styres lokalt uden ventiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 var en gave fra Dr. Zvonimir Dogic. Denne forskning blev støttet af Dr. kun-ta Wus opstartsfond i Worcester Polytechnic Institute. Vi takker Dr. Zvonimir Dogic for protokollerne til at rense og mærke Tubulin og til at syntetisere aktive væsker. Vi er taknemmelige for Dr. Marc Ridilla for hans ekspertise i protein ekspression og rensning. Vi takker Dr. William Benjamin Roger for at hjælpe os med at bygge det temperaturstyrede stadie. Vi anerkender Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) for brug af den biologiske materiale facilitet (BMF). Vi anerkender det kongelige kemi selskab for at tilpasse tallene fra BATE et al. på Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

Ingeniørvidenskab biophysics kinesin microtubule aktive væsker selvorganisering temperatur Arrhenius lov
Styring af strømningshastigheder for 3D-aktive væsker med mikrotubulus ved hjælp af temperatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter