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Engineering

Contrôle des vitesses de débit des fluides actifs 3D à base de microtubules à l'aide de la température

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Le but de ce protocole est d'utiliser la température pour contrôler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels. L'avantage de cette méthode permet non seulement de réguler les vitesses de débit in situ, mais permet également un contrôle dynamique, comme le mise au point périodiquement des vitesses de débit de haut en bas.

Abstract

Nous présentons une méthode pour utiliser la température pour régler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels (3D) à base de kinésine. Cette méthode permet de tuning les vitesses in situ sans avoir besoin de fabriquer de nouveaux échantillons pour atteindre différentes vitesses souhaitées. En outre, cette méthode permet le contrôle dynamique de la vitesse. Le cycle de la température conduit les fluides à circuler rapidement et lentement, périodiquement. Cette maniabilité est basée sur la caractéristique Arrhenius de la réaction kinesin-microtubule, démontrant une plage de vitesse moyenne contrôlée de 4 à 8 m/s. La méthode présentée ouvrira la porte à la conception de dispositifs microfluidiques où les débits dans le canal sont localement réglables sans avoir besoin d'une valve.

Introduction

La matière active est différenciée de la matière passive conventionnelle en raison de sa capacité à convertir l'énergie chimique en travaux mécaniques. Un matériau qui possède une telle capacité peut consister en des entités vivantes ou non vivantes telles que les bactéries, les insectes, les colloïdes, les grains et les filaments cytosquelettiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ces entités matérielles interagissent avec leurs voisins. À plus grande échelle, ils s'auto-organisent en tourbillons turbulents (turbulence active) ou flux matériels11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Une compréhension de l'auto-organisation de la matière active a conduit à diverses applications dans les navettes moléculaires, dispositifs optiques, et le calcul parallèle21,22,23. Pour amener les applications au niveau suivant, il faut contrôler au-delà de l'auto-organisation. Par exemple, Palacci et coll. ont mis au point un colloïd encapsulé par hématite qui n'est automoteur que lorsqu'il est exposé à la lumière bleue contrôlée manuellement, ce qui a mené à l'émergence de cristaux vivants24. Morin et coll. ont établi le contrôle des colloïdes Quincke roulants à l'aide d'un champ électrique externe réglable, ce qui a entraîné un affluement colloïdal dans un canal de course25. Ces travaux antérieurs démontrent le rôle du contrôle local dans les applications et font progresser la base de connaissances de la matière active.

Dans cet article, nous nous concentrons sur la contrôlabilité des fluides actifs 3D à base de microtubule (MT) à base de kinésie. Les fluides se composent de trois composants principaux : les TM, les moteurs moléculaires de kinésie et les appauvrissements. Les appauvrissements induisent une force d'épuisement pour empaqueter les MT, qui sont plus tard comblés par des groupes moteurs. Ces moteurs marchent le long de la MTstoward l'extrémité plus. Lorsqu'une paire de MTsis pontée antiparallèle, les moteurs correspondants marchent dans des directions opposées. Cependant, les moteurs sont liés dans un cluster et sont incapables de marcher à part, de sorte qu'ils glissent en collaboration à part les paires de MTs (glissement interfilament, Figure 1A). Ces dynamiques de glissement s'accumulent, causant des faisceaux de MTsto s'étendre jusqu'à atteindre leur point d'instabilité et de rupture (faisceaux extésiles, Figure 1B)26. Les faisceaux cassés sont annealed par la force d'épuisement, qui s'étend par la suite encore, et la dynamique se répète. Pendant le processus de la dynamique de répétition, les mouvements de faisceau remuer le liquide voisin, induisant des flux qui peuvent être visualisés par le dopage avec des traceurs à l'échelle micron (Figure 1C). Sanchez et coll. et Henkin et coll. ont caractérisé les vitesses moyennes des traceurs, constatant que les vitesses étaient réglables en variant les concentrationsde triphosphate d'adénosine (ATP), d'épuisements, de grappes motrices et de MT1,27. Cependant, une telle tunability n'existait qu'avant la synthèse active des fluides. Après synthèse, l'amaigrabilité a été perdue, et les fluides auto-organisés à leur manière. Pour contrôler l'activité active des fluides après synthèse, Ross.et al. a signalé une méthode utilisant la dimérisation activée par la lumière des protéines motrices, permettant à l'activité des fluides d'être réglée et désactivée à l'aide de la lumière28. Alors que le contrôle de la lumière est pratique en termes d'activation locale des fluides, la méthode nécessite de repenser les structures des protéines motrices, ainsi que de modifier les trajectoires optiques dans un microscope. Ici, nous fournissons une méthode facile à utiliser pour contrôler localement les flux de fluides sans modification de microscope tout en gardant la structure du moteur intacte.

Notre méthode de régler localement le flux de fluide actif est basée sur la loi Arrhenius parce que la réaction kinesin-MT a été rapportée pour augmenter avec la température29,30,31,32. Nos études précédentes ont montré que la dépendance à la température de la vitesse moyenne d'un flux de fluide actif a suivi l'équation D'Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), où A est un facteur pré-exponentiel, R est la constante du gaz, Ea est l'énergie d'activation, et T est la température du système33. Par conséquent, l'activité des fluides est sensible à l'environnement de température, et la température du système doit être cohérente pour stabiliser les performances du moteur, et par conséquent, la vitesse d'écoulement du fluide34. Dans cet article, nous démontrons l'utilisation de la dépendance à la température du moteur pour régler en permanence les vitesses d'écoulement des fluides actifs en ajustant la température du système. Nous démontrons également la préparation d'un échantillon actif de fluide, suivi par le montage de l'échantillon sur une étape de microscope dont la température est commandée par l'intermédiaire du logiciel d'ordinateur. L'augmentation de la température de 16 à 36 oC accélère la vitesse moyenne d'écoulement de 4 à 8 m/s. De plus, l'advisibilité est réversible : augmenter et diminuer à plusieurs reprises la température accélère et ralentit séquentiellement le débit. La méthode démontrée s'applique à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi Arrhenius, comme l'assay MT29,30,31,32.

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Protocol

1. Préparation des MT

CAUTION: Dans cette étape, nous purifions les tubulines à partir de tissus cérébraux bovins. Le cerveau bovin peut causer la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ)35. Par conséquent, les déchets cérébraux et les solutions connexes, les bouteilles et les pointes de pipette doivent être collectés dans un sac de biodéchets et éliminés comme déchets biodangereux selon les règles de l'institution.

  1. Purifier les tubulines du cerveau bovin (modifié à partir de Castoldi et al.,36).
    1. Transportez environ 1,5 kg de cerveaux de bovins frais d'un abattoir local à une chambre froide universitaire. Pendant le transport, entreposez les cerveaux dans un tampon de phosphate (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2) sur glace.
      REMARQUE : Pour maximiser le rendement final de la tubuline, la quantité initiale de tubuline fonctionnelle dans le tissu nouveau de cerveau est la clef. Les cerveaux plus frais contiennent plus de tubuline fonctionnelle. Pour obtenir les cerveaux les plus frais de l'abattoir, nous recommandons de demander au boucher de fournir des cerveaux des vaches les plus récemment abattues. Les cerveaux ne doivent pas être plus âgés que 3 h au début de la procédure, parce que la réduction du temps entre l'abattage et le début de la procédure produira de meilleurs rendements.
    2. Homogénéiser et clarifier le cerveau.
      1. Nettoyez le cerveau en utilisant des scalpels pour couper les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs en petits morceaux et les retirer du cerveau à la main.
        REMARQUE : Les cerveaux nettoyés doivent être roses.
      2. Immerger le tissu cérébral nettoyé dans 1 L de tampon de dépolymérisation (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) acide éthanesulfonique, 1 mM CaCl2, pH 6,6) par kilogramme de cerveau.
      3. Homogénéiser le cerveau avec un mélangeur de cuisine.
      4. Centrifugeuse solution cérébrale homogénéisée à 10 000 x g et 4 oC pendant 150 min.
    3. Polymériser les MT (première polymérisation).
      1. Recueillir et mélanger le supernatant avec des volumes égaux des solutions suivantes à 37 oC : glycérol, tampon PIPES à haute molarité (HMPB : 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM d'éthylène glycol-bis (éthylité aminoehyl)-N,N,N',N'-tétraacetic acid [EGTA], pH 6.9)
      2. Ajouter 1,5 mM D'ATP et 0,5 mM de guanosine triphosphate (GTP) au mélange.
      3. Incuber le mélange à 37 oC pendant 1 h.
    4. Dépolymériser les MT (première dépolymérisation MT).
      1. Pellet MT en centrifuge à 151 000 x g et 37 oC pendant 30 min.
      2. Jeter le supernatant et resuspendre chaque granule de MT dans 10 ml de 4 OC DB.
      3. Incuber sur glace pendant 30 min.
      4. Agiter le mélange toutes les 5 min avec une pointe de pipette pour éviter la sédimentation MT.
        REMARQUE: Le mélange doit se dégager en 30 min, ce qui indique l'achèvement de la dépolymérisation MT.
    5. Polymériser les MT (deuxième polymérisation MT).
      1. Clarifier la solution en centrifugeant à 70 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
      2. Recueillir et mélanger le supernatant avec des volumes égaux de 37 oC de glycérol et de HMPB.
      3. Ajouter 1,5 mM ATP et 0,5 mM GTP au mélange.
      4. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min.
    6. Répéter l'étape 1.1.4, en remplaçant le HMPB par le tampon de réassemblage De brinkley (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8), puis en clarifiant le mélange défriché en centrifuant à 79 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    7. Recueillir le supernatant. Mesurer l'absorption de 280 nm à l'égard d'un spectromètre. Déterminer la concentration de tubuline à l'aide de la loi Beer-Lambert (coefficient d'extinction de la tubuline : 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Conserver la protéine à -80 oC.
  2. Recycler les tubulines (modifiées à partir de Castoldi et coll.36).
    REMARQUE : Pour améliorer la pureté de la tubuline, la tubuline purifiée est polymérisée et dépolymérisée à nouveau.
    1. Polymériser les MT en mélangeant la tubuline purifiée (étape 1.1.7) avec 500 M dithiothreitol (DTT) et 20 'M GTP, suivie de 30 min d'incubation à 37 oC.
    2. Pellet les MTs.
      1. Chargez 1 mL de coussin de glycérol (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glycérol, pH 6.8) dans le fond d'un tube de centrifugeuse.
      2. Déposer les MT polymérisés sur le dessus du coussin.
      3. Centrifugeuse à 172 000 x g pendant 90 min à 37 oC.
    3. Dépolymériser les MT.
      1. Retirer le supernatant et le coussin.
      2. Resuspendre chaque granule de MT dans 150 'L de 4 'C MT tampon (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. Incuber le mélange sur glace pendant 30 min.
      4. Agiter le mélange avec une pointe de pipette toutes les 5 min. Le mélange doit être clair.
    4. Clarifier le mélange en centrifugeant à 172 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    5. Recueillir le supernatant. Mesurer la concentration en protéines. Conserver à -80 oC.
  3. Étiqueter la tubuline avec un colorant fluorescent39.
    1. Polymériser les MT. Mélanger la tubuline purifiée (étape 1.1.7) avec 500 M DTT et 16,7 M GTP, et incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min.
    2. Pellet les MTs.
      1. Placer 1 ml de coussin à pH élevé de 37 oC (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60 % v/v glycérol, pH 8,6) dans un tube de centrifugeuse.
      2. Déposer les MT polymérisés sur le coussin.
      3. Centrifugeuse à 327 000 x g pendant 50 min à 37 oC.
    3. Étiquette tubuline.
      1. Resuspendre chaque granule de MT avec 700 oL de tampon d'étiquetage de 37 oC (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40 % v/v glycérol, pH 8,6).
      2. Mélanger la suspension avec un excès de 10 à 20 molaires de colorant fluorescent rouge lointain fonctionnalisé avec un ester succinimidyl.
      3. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min dans l'obscurité pour permettre aux MT de réagir avec l'ester du colorant fluorescent.
      4. Arrêtez la réaction d'étiquetage en saturant l'ester du colorant suspendu avec 50 mM k-glutamate, en couve pendant 5 min à 37 oC.
    4. Pelletles les MT étiquetés : Répétez l'étape 1.3.2, en remplaçant le coussin à pH élevé par un coussin à faible pH (80 mM de tuyaux, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glycerol, pH 6.8).
    5. Dépolymériser les MT.
      1. Jeter le supernatant et le coussin.
      2. Resuspendre la pastille en 700 oL de 4 oC M2B.
      3. Incuber la suspension sur glace.
      4. Agiter toutes les 5 min avec une pointe de pipette jusqu'à ce que la solution soit claire.
    6. Clarifier la solution défrichée en centrifugeant à 184 000 x g et 4 oC pendant 35 min.
    7. Améliorez la pureté de la solution de tubuline étiquetée en répétant les étapes 1.2.1-1.2.4.
    8. Mesurer la concentration de protéines et de colorant fluorescent. Utilisez ces mesures pour déterminer la concentration de tubuline et les fractions de tubuline étiquetée, définie comme le rapport des concentrations de colorant fluorescent à la tubuline.
    9. Conserver la solution de tubulin étiquetée à -80 oC.
  4. Polymériser les MT (adoptés par Sanchez etal.19):
    1. Mélanger la tubuline recyclée (étape 1.2.5) avec la tubuline étiquetée (étape 1.3.9) dans un rapport qui donne une fraction de tubulin étiquetée de 3%.
    2. Mélanger le mélange de tubuline de 8 mg/ml avec 1 mM de TNT et 0,6 mM de guanosine-5'[,)-méthyleno)-triphosphate (GMPCPP), suivi de 30 min d'incubation à 37 oC.
    3. Après l'incubation, anneal les MTs à température ambiante dans l'obscurité pendant 6 h.
    4. Aliquot et magasin à -80 oC.

2. Synthétiser les grappes de kinésie

REMARQUE : Les bactéries existent de façon omniprésente et peuvent se développer dans les médias et contaminer le processus de préparation. Pour prévenir la contamination, les actions impliquant un contact avec les cultures cellulaires (p. ex., le tuyauterie) DOIVENT être effectuées près d'une flamme. Les outils tels que les flacons, les pipettes, les pointes de pipette, les supports et les plaques DOIVENT être autoclaved avant utilisation.

  1. Moteurs de kinésie express dans Escherichia coli40.
    1. Transformez les cellules.
      1. Pipette 1 l du plasmide K401-BCCP-H6 en 10 l de cellules compétentes.
      2. Incuber sur glace pendant 5 min.
      3. Choc thermique à 42,5 oC pour 45 s.
      4. Incuber les cellules sur la glace pendant 2 min pour permettre la récupération.
      5. Mélanger les cellules avec 300 l de 2XYT sans antibiotiques (5 g/L NaCl, 10 g/L extrait de levure, 16 g/L tryptone).
      6. Incuber les cellules à 37 oC pendant 1 h.
        REMARQUE : Sauf indication, la surveillance de la croissance cellulaire n'est pas nécessaire pendant l'incubation.
    2. Inoculer les supports de plaque.
      1. Étendre la culture cellulaire sur une plaque de 2XYT (10 g/L NaCl, extrait de levure de 5 g/L, 10 g/L tryptone, 15 g/L agar, 100 g/mL d'ampicilline, 25 g/mL de chloramphenicol).
      2. Incuber la plaque à l'envers à 37 oC pendant la nuit.
    3. Inoculer les supports liquides.
      1. De la plaque de nuit, récoltez une colonie isolée avec une pointe de pipette.
      2. Éjecter la pointe dans un flacon contenant 50 ml de 2XYT.
      3. Incuber et secouer les médias de culture à 37 oC et 200 tr/min pour 12 à 16 h.
    4. Élargir les cellules.
      1. Mélanger 2,5 ml de la culture cellulaire en 500 ml de 2XYT.
      2. Incuber et secouer la culture de 500 ml à 37 oC et 250 tr/min pendant 3 à 6 h.
    5. Induire l'expression des protéines.
      1. Pendant l'incubation, surveillez la croissance cellulaire en mesurant l'absorption à 600 nm, en utilisant 2XYT comme référence. Mesurer l'absorption toutes les 60 min, jusqu'à ce qu'elle atteigneOD 600 -0,3. Ensuite, mesurez l'absorption toutes les 30 min jusqu'à ce qu'elle atteigne 0,5 à 0,6.
      2. Permettre aux cellules de se développer jusqu'à ce que l'absorption atteigneoD 600 - 0,5 à 0,6
      3. Ajouter 24 'g/mL de biotine et 1 mM d'isopropyl '-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture cellulaire.
        REMARQUE : L'IPTG est utilisé pour induire l'expression des protéines des moteurs de kinésie, qui sont marqués avec la protéine porteuse de carboxyl de biotine (BCCP) et six histidines (H6). L'étiquette H6 est utilisée dans le processus de purification (étape 2.2), tandis que BCCP se lie aux molécules de biotine ajoutées pour biotinylate les moteurs de kinésie exprimés.
      4. Incuber et secouer la culture cellulaire à 20 oC et 250 tr/min pendant 12 à 20 h.
    6. Récolter les cellules en centrifuge à 5 000 x g et 4 oC pendant 10 min. Jeter le supernatant. Entreposer les granulés de cellules à -80 oC.
  2. Purifier la protéine moteur kinesicine (modifiée à partir de Spriestersbach etal.41):
    1. Suspendre le granule cellulaire (étape 2.1.6) avec un volume égal de tampon de lyse (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 M ATP, 10 mM 2-mercaptoethanol (ME), 20 mM imidazole, pH 7,2), suivi par l'ajout d'un comprimé d'inhibiteur de la protéase, 2 mg de fluorure de méthyle phénylthyle (PMSF), et 2 mg de lysozyme.
    2. Lyser les cellules en gelant au flash dans l'azote liquide (LN) 3x et en dégelant le mélange cellulaire.
      REMARQUE : Après lysing, le mélange devrait devenir visqueux.
    3. Clarifier le mélange de cellules lysées en centrifugeant à 230 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    4. Recueillir le supernatant et le couler à travers une colonne de gravité, suivie par le lavage de la colonne avec 10 ml de tampon de lyse.
      REMARQUE : Les protéines munis d'une étiquette H6, comme la kinésie K401-BCCP-H6, doivent rester dans la colonne.
    5. Élitez la protéine étiquetée avec 5 ml de tampon d'élution (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 M ATP, 500 mM imidazole, pH 7,2). Recueillir le flux à travers séquentiellement en 1 ml fractions. Pour déterminer les fractions contenant des protéines, mélangez 3 ll de chaque fraction avec 100 l de colorant triphenylmethane. Les fractions contenant des protéines devraient devenir bleues. Combinez ces fractions et diluez par 5x avec le tampon de lyse.
    6. Concentrez la solution protéique.
      1. Chargez la solution dans un tube de filtre centrifuge.
      2. Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
      3. Secouez doucement le tube et la centrifugeuse à nouveau jusqu'à ce que le volume de la solution soit de 3 ml.
    7. Mesurer la concentration protéique à l'aide d'un spectromètre (coefficient d'extinction : 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43. Diluer la protéine à 1 mg/mL tout en ajoutant 35% w/v sucrose.
    8. Conserver à -80 oC.
  3. Mesurer les concentrations de kinésie à l'égard d'un gel électrophoresis (modifié à partir de Taylor et coll.44).
    REMARQUE : Pour mesurer la concentration de kinésie avec un gel d'électrophoresis, la tubuline est une échelle de concentration idéale en raison de sa grande pureté et de sa concentration mesurable par l'intermédiaire d'un spectromètre (figure 2A)36.
    1. Préparer des échantillons de tubuline avec des concentrations de 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 et 1,25 mg/mL. Mélanger séparément 15 l de chaque échantillon de tubuline et de kinésie (étape 2,2,8) avec 5 ll de tampon d'échantillon (200 mM Tris-HCl, 8 % de sulfate de dodecyl de sodium (SDS), 400 mM DTT, 0,2 % de bleu bromophéol, 40 % de glycérol, pH 6,8) et incubé à 90 min 3 min.
    2. Préparer l'électrophoresis.
      1. Verrouillez un gel d'électrophoresis dans la boîte de gel.
      2. Remplissez la boîte d'un tampon de fonctionnement (50 mM MOPS, base De 50 mM Tris, 0,1 % SDS, 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 7,7).
        REMARQUE : Assurez-vous que le niveau tampon est au-dessus de l'ouverture supérieure du gel.
    3. Chargez 10 L d'échelle standard protéique, d'échantillons de tubuline et de kinésine dans des puits séparés et appliquez 200 V sur le gel pendant 45 min.
    4. Gel coloration.
      1. Incuber et bercer le gel avec la solution de tache bouillie (environ 95 oC) A (0,5 g/L de tréphénylméthane, 10 % d'acide acétique v/v, 25 % d'isopropanol) pendant 5 min, puis rincer le gel avec de l'eau déionisée (DI).
      2. Répétez avec des solutions de taches B (0,05 g/L de colorant triphenylmethane, 10% v/v acide acétique, 10% d'isopropanol), C (0,02 g/L de colorant triphenylmethane, 10% v/v acide acétique), et D (10% v/v acide acétique), séquentiellement. Incuber et bercer le gel dans l'eau DI pendant la nuit.
    5. Scanne zetle le gel. Convertissez l'image de gel à une image à l'échelle grise, suivie d'une inversion noir et blanc et d'une amélioration du contraste pour révéler des bandes de protéines brillantes sur le fond noir.
    6. Mesurez la luminosité de chaque bande en résumant les valeurs de pixels. Appliquer l'ajustement linéaire C ' aB 'b, où B est la luminosité d'une bande de tubuline, C est la concentration correspondante, et a et b sont des paramètres de montage. Déterminer la concentration de kinésie Ck en utilisant la luminosité de la bande de kinésie Bk pour calculer l'équation linéaire: Ck ' aBk 'b.
  4. Regroupez les moteurs de kinésie.
    1. Mélanger 1,5 M kinesin (étape 2.2.8) avec 120 M DTT et 120 nM streptavidin. Incuber sur glace pendant 30 min.
    2. Conserver à -80 oC.

3. Préparer des lames et des couvercles en verre recouverts de polyacrylamide (modifiés à partir de Lau et al.,45)

  1. Chargez de nouvelles lames en verre et des couvercles en verre dans des contenants correspondants. Immerger les lames et les couvercles dans un détergent v/v de 1 % dans de l'eau DI, puis faire bouillir l'eau au micro-ondes.
  2. Sonicate les diapositives et les couvercles pendant 5 min, puis rincer à l'eau DI pour enlever le détergent.
  3. Immerger et sonicate les glissières et les couvercles en éthanol pendant 5 min. Rincer à l'eau DI.
  4. Immerger et sonicate les lames et les couvercles dans 100 mM d'hydroxyde de potassium (KOH) pendant 5 min. Rincer à l'eau DI.
  5. Incuber les lames et les couvercles dans une solution sinétique (1% d'acide acétique et 0,5% 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate dans l'éthanol) pendant 15 min, puis rincer avec de l'eau DI.
  6. Incuber les diapositives et les couvercles dans la solution d'acrylamide (2% w/w acrylamide, 0.7 mg/mL de persulfate d'ammonium, et 0.0035% v/v tetramethylethylenediamine dans l'eau de DI) pendant 3 h.
  7. Conservez les diapositives et les couvertures dans la solution acrylamide.

4. Préparer des fluides actifs à base de kinésie, à base de MT

  1. Préparer les fluides actifs (modifiés à partir de Sanchez et coll.19).
    REMARQUE : Les étapes suivantes démontrent le processus de préparation de 100 L d'un fluide actif à l'aide d'exemples de stocks. Le volume final est évolutif, et les concentrations des stocks d'exemple peuvent être ajustées tant que la concentration finale de chaque composant est maintenue.
    1. Mélanger 16,7 ML de 8 mg/mL De TM (étape 1,4,4) avec 6,7 l de grappes motrices kinesinM (étape 2,4,2), et 1,1 l de 500 mL de MTT en M2B à haute teneur en sel (M2B - 3,9 mM MgCl2).
    2. Regroupez les MT en ajoutant 11,4 L de 7 % w/w de polyéthylène glycol (PEG).
    3. Activez les moteurs de kinésie en ajoutant 2,8 L de 50 mM ATP.
    4. Maintenir les concentrations d'ATP en ajoutant 2,8 l de pyruvate de stock kinase/lactate dehydrogenase (PK/LDH) et 13,3 'L de 200 mM de pyruvate phosphénol (PEP).
    5. Réduire l'effet de photoblanchiment en ajoutant 10 'L de 20 mM Trolox, 1,1 'L de 3,5 mg/mL de catalase, 1,1 'L de 20 mg/mL de glucose oxidase, et 1,1 'L de 300 mg/mL de glucose.
    6. Suivez le mouvement du fluide en ajoutant 1,6 L de 0,025 % v/v particules traceurs.
    7. Ajouter le M2B à haute teneur en sel pour atteindre un volume total de 100 L.
      REMARQUE : Les ordres de mélange dans les étapes 4.1.1-4.1.6 sont interchangeables. Cependant, une fois que l'ATP, les MT et les moteurs sont mélangés, les moteurs commencent à consommer de l'ATP tout en marchant le long des MT. L'échantillon est activé avec une durée de vie limitée en raison des carburants limités (ATP et PEP), de sorte que l'expérience doit être commencée rapidement. Le liquide actif final doit contenir 1,3 mg/mL MT, 120 nM clusters moteurs kinesin, 5,5 mM DTT, 0,8 % w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8 % v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glucose oxidase, 3,3 mg/mL de glucose, et 0,0004% v/v colloid en m2B.
  2. Préparer un échantillon dans un canal d'écoulement (modifié à partir de Chandrakar etal.46):
    1. Rincer un toboggan en verre recouvert de polyacrylamide et un bordereau (étape 3.7) avec de l'eau DI. Séchez les verres avec de l'air sous pression. Placer sur une surface propre et plane.
    2. Couper deux bandes de films de cire d'une largeur de 3 mm et de la même longueur que la feuille de verre (20 mm). Insérez les bandes entre la glissière et la glissière de couverture comme espaceurs de canal.
    3. Adhérer le verre à l'épile de cire en plaçant le complexe de cire de verre sur une plaque chaude de 80 oC pour faire fondre la cire. Pendant la fonte, appuyez doucement sur la couverture avec une pointe de pipette pour adhérer uniformément le film de cire aux surfaces en verre. Après l'adhérence, refroidir le complexe de verre à température ambiante.
    4. Chargez les fluides actifs (étape 4.1) vers le canal d'écoulement. Sceller le canal avec de la colle UV.

5. Contrôler la température de l'échantillon

  1. Construire une configuration de contrôle de la température (modifiée à partir de dessins dans Lowensohn et al. et Wu etal. 47,48,49).
    1. Préparer un bloc de refroidissement en aluminium.
      1. Moudre une plaque d'aluminium d'une capacité d'environ 30 mm et 30 mm et 5 mm.
      2. Percer un canal interne à travers la plaque (Figure 3A) et installer des raccords de tuyau aux extrémités du chenal.
      3. Accrochez chaque raccord à un tube d'eau.
      4. Connectez un tube à une pompe de réservoir de poisson dans un réservoir d'eau tout en étendant l'autre tube au réservoir.
        REMARQUE : La pompe fera circuler l'eau du réservoir à travers les canaux internes en aluminium pour maintenir la température du bloc à environ la température ambiante.
    2. Filez un refroidisseur thermoélectrique (TEC) et un thermocapteur à un contrôleur de température. Connectez le contrôleur à un ordinateur à l'aide d'un port USB (Figure 3B).
    3. Câblez le contrôleur de température à une alimentation à courant direct (DC). Allumez le contrôleur en branchant l'alimentation électrique à une prise électrique.
    4. Effectuer la mise en place initiale du TEC suivant le guide du contrôleur du fabricant. Testez la sortie TEC. Il est recommandé de contrôler le contrôleur de température via un logiciel fourni par le fabricant, permettant l'enregistrement des données thermocapteurs et une manipulation plus facile du contrôleur de température.
    5. Identifiez les côtés chauffants et de refroidissement du TEC.
    6. Fixez le côté de refroidissement du TEC sur le bloc de refroidissement (étape 5.1.1) à l'aide de pâte thermique.
    7. Fixez un disque de saphir au côté chauffant du TEC à l'aide de pâte thermique.
    8. La configuration est terminée. La surface du saphir et le thermocapteur peuvent entrer en contact avec un échantillon pour refroidir et chauffer l'échantillon en fonction de sa température et de sa température cible.
      REMARQUE : Il est recommandé que le TEC et le bloc de refroidissement aient un trou central aligné pour l'imagerie des échantillons à l'aide d'une microscopie à champ lumineux(figure 3C).
  2. Utilisez la configuration de contrôle de la température pour contrôler la température de l'échantillon33.
    1. Montez l'échantillon jusqu'à la configuration.
      1. Placez l'échantillon de liquide actif (étape 4.2.4) sur la surface du saphir avec le côté de la glissière qui entre en contact avec la surface.
      2. Fixer la glissière en verre avec du ruban adhésif en papier.
      3. Fixez le thermocapteur à la surface de la couverture à l'aide de ruban adhésif en cuivre.
    2. Monter la configuration sur une scène de microscope avec le côté de couverture faisant face vers les objectifs. Par exemple, sur un microscope inversé, le côté de la couverture doit faire face vers le bas. Fixez la configuration avec du ruban adhésif en papier et les pinces à aiguilles de stade de microscope, le cas échéant.
      REMARQUE : L'étape de température présentée devrait fonctionner avec les microscopes communs qui sont inversés ou droits. Pour s'assurer que le stade de température n'est pas déplacé pendant l'expérience, il est préférable de fixer le stade de température à l'étape du microscope avec du ruban adhésif.
    3. Contrôlez la température de l'échantillon.
      1. Allumez le contrôleur de température et la pompe de réservoir de poisson.
      2. Suivez le guide du fabricant pour définir la température cible et permettre le contrôle de la température. Le contrôleur ajustera la puissance de chauffage ou de refroidissement en fonction de la température cible et de la température de l'échantillon, tel qu'évalué par le thermocapteur.
    4. Enregistrez les températures de l'échantillon.
      1. Suivez le guide du fabricant pour enregistrer les données sur la température des thermocapteurs pendant l'expérience.
        REMARQUE : La température de l'échantillon doit maintenant être contrôlée par le contrôleur et enregistrée par l'ordinateur(figure 3D).

6. Caractériser l'activité active du fluide (modifiée à partir de méthodes par Henkin et al. et Wu etal. 20,27)

REMARQUE : Les sections précédentes sont utilisées pour préparer des échantillons de fluides actifs (sections 1 à 4) et contrôler leur température (section 5). Démontrer l'utilisation de la température pour contrôler l'activité active des fluides, observer les comportements fluides, analyser leurs activités et caractériser leur réponse à la température.

  1. Surveillez les traceurs.
    1. Imagez l'échantillon à l'aide d'une fluorescence à partir de protéines fluorescentes vertes (GFP) pour capturer le mouvement des particules du traceur.
      REMARQUE :Il faut choisir le mouvement du traceur pour permettre le suivi du mouvement du traceur. Les grandes valeurst, telles que les 100 s, entraînent la perte des trajectoires du traceur, tandis que les valeurs courtest, telles que 0,1 s, empêchent l'algorithme de suivi de détecter le mouvement du traceur entre les images. Un t de travaildoit permettre au déplacement du traceur entre les images d'être à moins de 9 pixels. Pour les traceurs d'imagerie se déplaçant à 10 m/s à l'aide d'un objectif 4x, let est recommandé d'être de 1 à 5 s.
    2. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIFF, nommez les fichiers en fonction du numéro d'image et stockez-les dans un dossier séparé. Ces processus sont nécessaires pour s'assurer que les images acquises seront correctement analysées avec le script MATLAB fourni (étape 6.2.2).
  2. Traceurs adoptant le logiciel de suivi développé par Ouellette et coll.50,51):
    1. Téléchargez le logiciel de suivi de l'Environmental Complexity Laboratory de l'Université Stanford (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Assurez-vous que chaque fichier MATLAB est dans le même dossier.
    2. Traceurs de piste à l'aide d'un script MATLAB personnalisé : particle_tracking.m. Le script lit des images traceurs (étape 6.1) et suit le mouvement des traceurs à l'aide du logiciel de Ouellette et coll.50,51. Il produit deux fichiers : 1) background.tif, représentant le fond de l'image, et 2) Tracking.mat, contenant les trajectoires et les vitesses des particules dans chaque image (Figure 4A).
  3. Analyser les vitesses moyennes du traceur à l'aide d'un script MATLAB personnalisé : analysis.m. Le script lit le fichier de suivi (Tracking.mat) et produit la vitesse moyenne des traceurs par rapport au temps, ainsi qu'une vitesse moyenne dans le temps avec des fenêtres moyennes spécifiées (Figure 4B)33.
  4. Enregistrez la vitesse moyenne dans le temps.
  5. Mesurez la vitesse moyenne dans le temps en répétant l'expérience (étapes 4, 5,2 et 6,1-6,4) à 10 à 40 oC. Utilisez les vitesses moyennes enregistrées pour tracer la vitesse moyenne par rapport à la température (Figure 4C)33.

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Representative Results

La préparation des fluides actifs à base de kinésie, à base de MT, nécessite à la fois de la kinésie et des TM. Les TM ont été polymérisés à partir de tubulines étiquetées (étapes 1.3 et 1.4) qui ont été purifiées à partir de cerveaux bovins (étape 1.1, Figure 2A),suivies du recyclage pour améliorer la pureté (étape 1.2, Figure 2B). Les protéines motrices kinesin ont été exprimées et purifiées à partir de E. coli (étapes 2.1 et 2.2, Figure 2B)41,52. La concentration du stock de kinésie préparée a été mesurée à l'aide d'un gel SDS en comparant la luminosité de la bande principale à celle des tubulines recyclées avec des concentrations connues (étape 2.3, figure 2B enset). Les valeurs de luminosité des bandes de tubuline (B) étaient linéairement adaptées à leur concentration correspondante (C) en utilisant l'équation C - aB , donnant un 3,1 - 10-2 mg/mL et 8,7 - 10- 4 mg/mL (Figure 2C). L'équation ajustée a été utilisée pour déterminer la concentration d'une bande de kinésie en appliquant la luminosité mesurée de la bande, Bk - 1 060, donnant une concentration de kinésie de Ck 0,95 mg/mL. Des échantillons de MT et de kinésie avec des concentrations connues ont été utilisés pour préparer des échantillons de fluideactif. Les fluides actifs ont été synthétisés, chargés dans une cellule d'écoulement enduite de polyacrylamide, et la cellule a été scellée avec de la colle UV (sections 3 et 4)46.

Pour démontrer le contrôle de l'activité active du fluide avec la température, l'échantillon de liquide actif a été monté sur l'étape de température maison (étape 5.2, Figure 3A-C). La température de l'échantillon a été surveillée et contrôlée par le contrôleur selon un algorithme proportionnel-dérivé dérivé (PID)53. Les échantillons contrôlés à 10 oC, 20 oC, 30 oC et 40 oC semblaient fluctuer dans la température à un taux de 0,1 à 0,3 oC pendant 4 h, ce qui démontre la stabilité et la fiabilité de cette configuration de contrôle de la température(figure 3D).

Pour observer l'échantillon, la configuration a été montée sur un microscope d'épifluorescence. L'échantillon a été dopé avec des traceurs étiquetés Alexa 488, qui ont été photographiés avec la microscopie de fluorescence par l'intermédiaire d'un canal de GFP (étape 6.1). Les traceurs ont été photographiés tous les't '2 s. Les images séquentielles ont permis de suivre les trajectoires des traceurs ri, où je représente l'indice traceur (étape 6.2, Figure 4A). Les trajectoires ont révélé une vitesse moyenne v(t) ri(t) - ri(t-t) /t't 'gt;I (étape 6.3). Les vitesses moyennes mesurées à 20 à 36 oC semblaient presque indépendantes du temps à t ' 0'2 h, tandis qu'à 10 oC et 40 oC, les vitesses moyennes se sont rapidement détériorées (figure 4B). La désintégration à 10 oC a été causée par une dépolymérisation mT inférieure à 16 oC. La décomposition à 40 oC était due à un mauvais fonctionnement des grappes de kinésie au-dessus de 36 oC. D'après nos études précédentes, ces amas moteurs de kinésie perdent la capacité de conduire des paires de MT après la préincubation à 36 oC33. Pour caractériser les vitesses moyennes pour chaque température tout en reflétant la décomposition induite par ces facteurs, les vitesses moyennes ont été moyennes entre t ' 1 '2 h (étapes 6.3 et 6.4)33. Les vitesses moyennes moyennes dans le temps ont été mesurées entre 10 oC et 40 oC (étape 6,5, figure 4C). En dessous de 16 oC et au-dessus de 36 oC, les vitesses moyennes se sont rapidement détérquées en raison de la dépolymérisation du MT et des grappes de kinésiedéfectueuses 33, tandis que l'augmentation des températures de 16 à 36 oC a accéléré les vitesses moyennes de 4 à 8 m/s, ce qui démontre la faisabilité d'un aperçu de la vitesse moyenne d'un flux de fluide actif à l'aide de la température. Pour démontrer davantage la capacité du contrôle de la température, les températures du système ont été alternées entre 20 et 30 oC toutes les 30 min. Les vitesses moyennes des fluides actifs n'ont pas seulement accéléré et décéléré en conséquence, mais ils ont également répondu au changement de température dans les 10 s (figure 5). Une telle réponse réversible et rapide du fluide actif démontre la faisabilité d'utiliser la température pour contrôler dynamiquement les activités des fluides.

Figure 1
Figure 1 : Introduction de fluides actifs 3D à base de kinésie, mT. (A) Schémas de glissement d'interfilament. Des paires de MT antiparallèles ont été regroupées par des appauvrisseurs et séparées par des groupes moteurs. (B) Les groupes moteurs ont conduit collectivement des paires de MT, ce qui a conduit les faisceaux MT à s'étendre. (C) Les faisceaux extensiles constituaient un gel actif à base de MT (vert) qui agitait le liquide environnant pour induire un flux. Pour suivre le débit, le liquide a été dopé avec des traceurs (rouge). Ce chiffre a été adapté de Bate et coll.33. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images de gels SDS provenant des purifications de la tubuline et de la kinésie. (A) Image d'un gel SDS de tubuline purifiée. (B) Image d'un gel SDS de tubuline recyclée et de kinésie purifiée. Les voies de gauche à droite étaient des normes protéiques, vides, 1,25-0,25 mg/mL de tubuline recyclée, blanc, et le stock de kinésie. (C) La concentration de kinésie purifiée a été déterminée en comparant la luminosité de la bande avec les bandes séquentielles des tubulines avec des concentrations mesurées (rectangles pointillés rouges et bleus en enset). La luminosité de chaque bande a été mesurée en résumant les valeurs de pixels dans une image de bande recadrée. Pour réduire le bruit de fond, avant de recadrer l'image de gel a été transféré à l'échelle grise, noir et blanc inversé, puis contrasté-amélioré pour révéler un fond noir (enset). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Configuration de contrôle de température. (A) Schémas du bloc d'aluminium pour la configuration de contrôle de température. Le bloc contient un canal interne pour que l'eau s'écoule à travers elle et emporte la chaleur générée par le TEC. Le trou central permet à l'échantillon d'être éclairé par microscopie de champ lumineux d'un côté et représenté avec un objectif de l'autre côté. (B) Schémas de la configuration de contrôle de la température. La pâte thermique de silicium est appliquée entre le bloc de refroidissement en aluminium et le TEC et entre le TEC et le disque de saphir. (C) Image d'un échantillon monté sur la scène à température contrôlée. Les tubes d'eau sont reliés à une pompe immergée dans un réservoir d'eau. (D) Températures de l'échantillon enregistrées par rapport au temps pour les températures cibles de 10 oC, 20 oC, 30 oC et 40 oC, respectivement. Les températures de l'échantillon ont été maintenues à des températures avec une fluctuation de 0,1 à 0,3 oC. B et D ont été adaptés de Bate et coll.33. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Le débit de fluide actif de mise au implage par la température. (A) Les traceurs d'imagerie (points blancs) ont permis de suivre les trajectoires d'écoulement de façon séquentielle (courbes colorées diverses). Les traceurs étaient surveillés tous les 5 s (àla température ambiante de 5 s) à la température ambiante. (B) Tracer moyenne de vitesse par rapport au temps à 10 oC, 20 oC, 30 oC, 36 oC et 40 oC, respectivement. (C) Tracer moyenne de vitesse vs température. Chaque point représente la vitesse moyenne du traceur pendant les première et deuxième heures. En dessous de 16 oC, les MT dépolymisés et au-dessus de 36 oC, les grappes de kinésie ont mal fonctionné. Par conséquent, la température de travail se situe entre 16 et 36 oC, où les vitesses moyennes variaient de 4 à 8 m/s. Les barres d'erreur représentent l'écart standard des vitesses moyennes moyennes dans le temps. B et C ont été adaptés de Bate et coll.33. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Alterner la vitesse d'écoulement des fluides actifs en alternant périodiquement la température du système. Changer la température entre 20 et 30 oC toutes les 30 min accélérait et décélémait les vitesses d'écoulement à plusieurs reprises, démontrant le contrôle local des activités actives de fluide avec la température. Ce chiffre a été adapté de Bate et coll.33. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le contrôle de la matière active in situ ouvre la porte à l'auto-organisation dirigée de la matière active4,5,24,28,54. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l'utilisation de la température pour contrôler la kinésine, à base de MT fluides actifs in situ, basé sur la caractéristique Arrhenius du système29,30,31. Étant donné que le système est à base de protéines, le maintien de la fonctionnalité protéique tout au long de l'expérience est essentiel pour réussir l'application du protocole. Les principales protéines du système sont les tM et les amas de kinésie. Le premier dépolymériserence en dessous de 16 oC et le second dysfonctionnement au-dessus de 36 oC33. Le maintien de la température du système entre 16 et 36 oC est donc essentiel pour que les fluides actifs développent une dynamique stable et permettent à leur réponse à la température de façon réversible(figure 4 et figure 5). Cependant, la température est contrôlée sur la base d'un algorithme PID, qui a tendance à dépasser la température cible53. Pour réduire ce dépassement, nous vous recommandons de fixer plusieurs températures cibles intermédiaires avant de fixer la température cible finale. Par exemple, pour réchauffer l'échantillon de la température ambiante (environ 20 oC) à 35 oC, plutôt que de fixer la température cible directement à 35 oC, nous recommandons une température cible intermédiaire de 30 oC afin de réduire le risque que la température dépasse 36 oC, ce qui endommagerait de façon irréversible les protéines33. De même, lors du refroidissement de l'échantillon de la température ambiante à 16 oC, il est recommandé de fixer une température cible intermédiaire de 18 oC, car avant d'atteindre un état stable, le PID peut refroidir l'échantillon en dessous de 16 oC, dépolymérisant les MT33.

La méthode de contrôle de la température présentée repose sur le refroidissement et le chauffage à l'aide d'un TEC. L'utilisation du TEC garantit que l'échantillon atteint la température cible en quelques secondes, alors qu'une configuration conventionnelle de contrôle de la température à l'aide d'un bain d'eau à température contrôlée prend quelques minutes pour atteindre la température désirée (figure 5)55. Le TEC génère une chaleur nette non nulle qui est dissipée par un système interne de circulation de l'eau en aluminium. Cependant, l'eau permet à la moisissure de croître, qui finira par obstruer le canal56. Un chenal obstrué inhibe le débit d'eau, et la chaleur s'accumulera dans le bloc d'aluminium, faisant éventuellement fondre les tubes d'eau. Les tubes fondus font déborder l'eau sur le microscope et la caméra, endommageant les instruments électroniques. Par conséquent, pour adopter la configuration présentée de contrôle de température, nous recommandons d'ajouter 0.1% de peroxyde d'hydrogène à l'eau pour inhiber la croissance de moule57,58,59. Nous nous attendons à ce que cette étape permette de s'assurer que le canal interne en aluminium demeure exempt d'engorgement et d'éviter les dommages causés par l'eau aux appareils électroniques à proximité.

La manipulation de la température, l'enrobage des surfaces des cellules d'écoulement avec du polyacrylamide et la synthèse des fluides actifs sont trois étapes essentielles pour réaliser ce fluide actif contrôlé in situ. Cependant, cette maniabilité est limitée à la plage de température où les protéines impliquées peuvent fonctionner normalement. Dans le système de fluide actif, les protéines primaires sont les tmet et les amas de kinésie, qui fonctionnent normalement entre 16 et 36 oC33. Dans cette plage de température, les fluides actifs varient leurs vitesses d'écoulement moyennes de 4 à 8 m/s(figure 4C). Les vitesses moyennes en dehors de cette plage dépassent la limite de la méthode de contrôle présentée. En revanche, Ross et coll. ont signalé une solution de rechange qui permet d'activer et d'éteindre les activités actives de fluide à l'aide de la lumière28. Le contrôle de la lumière permet également d'activer les fluides actifs dans une échelle de 50 m de limite optiquement définie. Cependant, une telle alternative exige de modifier la structure de la kinésie ainsi que l'accord d'un chemin optique dans un microscope. En comparaison, les avantages de l'adoption de la méthode présentée dans cet article sont 1) les fluides actifs n'ont pas besoin d'être redessinés, 2) les microscopes n'ont pas besoin d'être modifiés, 3) la configuration de contrôle de la température est faible et facile à utiliser, et 4) la méthode est transférable à d'autres systèmes dépendants de la température tels que l'essai de glisse29,30,31,32 ou plus généralement des systèmes enzymatiques60. Nous nous attendons également à ce que la méthode présentée ouvre la porte à la conception de systèmes microfluidiques où les flux de canaux sont contrôlés localement sans vannes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 était un cadeau du Dr Zvonimir Dogic. Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage du Dr Kun-Ta Wu à l'Institut polytechnique de Worcester. Nous remercions le Dr Zvonimir Dogic pour les protocoles visant à purifier et à étiqueter la tubuline et à synthétiser les fluides actifs. Nous sommes reconnaissants au Dr Marc Ridilla pour son expertise dans l'expression et la purification des protéines. Nous remercions le Dr William Benjamin Roger de nous avoir aidés à construire la scène à température contrôlée. Nous reconnaissons Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) pour l'utilisation de la Facilité des matériaux biologiques (BMF). Nous remercions la Royal Society of Chemistry d'avoir adapté les chiffres de Bate et coll. sur Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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Ingénierie Numéro 153 biophysique kinésie microtubule fluides actifs auto-organisation température droit Arrhenius
Contrôle des vitesses de débit des fluides actifs 3D à base de microtubules à l'aide de la température
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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