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Engineering

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Temperatur zu verwenden, um die Fließgeschwindigkeiten dreidimensionaler aktiver Flüssigkeiten zu steuern. Der Vorteil dieser Methode ermöglicht nicht nur die Regelung der Durchflussgeschwindigkeiten vor Ort, sondern auch eine dynamische Steuerung, wie z. B. die regelmäßige Abstimmung der Durchflussgeschwindigkeiten nach oben und unten.

Abstract

Wir stellen eine Methode zur Temperaturoptimierung der Fließgeschwindigkeiten von kinesingetriebenen, mikrotubulienbasierten dreidimensionalen (3D) aktiven Flüssigkeiten vor. Diese Methode ermöglicht es, die Geschwindigkeiten vor Ort zu optimieren, ohne dass neue Proben hergestellt werden müssen, um unterschiedliche gewünschte Geschwindigkeiten zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die dynamische Steuerung der Geschwindigkeit. Durch das Radfahren der Temperatur fließen die Flüssigkeiten in regelmäßigen Abständen schnell und langsam. Diese Steuerbarkeit basiert auf der Arrhenius-Eigenschaft der Kinesin-Mikrotubuli-Reaktion, die einen kontrollierten mittleren Durchflussgeschwindigkeitsbereich von 4–8 m/s demonstriert. Die vorgestellte Methode öffnet die Tür zum Design mikrofluidischer Geräte, bei denen die Durchflussraten im Kanal lokal abstimmbar sind, ohne dass ein Ventil erforderlich ist.

Introduction

Aktive Materie unterscheidet sich von konventioneller Passivmaterie aufgrund ihrer Fähigkeit, chemische Energie in mechanische Arbeit umzuwandeln. Ein Material, das eine solche Fähigkeit besitzt, kann aus lebenden oder nicht lebenden Wesen wie Bakterien, Insekten, Kolloiden, Körnern und Zytoskelettfilamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Diese materiellen Entitäten interagieren mit ihren Nachbarn. In größerem Maßstab organisieren sie sich entweder in turbulenten Wirbeln (aktive Turbulenzen) oder Materialflüsse11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein Verständnis der Selbstorganisation von aktiver Materie hat zu verschiedenen Anwendungen in molekularen Shuttles, optischen Geräten und paralleler Berechnung21,22,23geführt. Um Anwendungen auf die nächste Stufe zu bringen, bedarf es einer Kontrolle über die Selbstorganisation hinaus. Zum Beispiel entwickelten Palacci et al. ein Hämatit-verkapseltes Kolloid, das nur selbstgetrieben wurde, wenn es manuell kontrolliertem blauem Licht ausgesetzt wurde, was zur Entstehung lebender Kristalle führte24. Morin et al. etablierten die Steuerung der rollenden Quincke-Kolloide durch die Verwendung eines abstimmbaren externen elektrischen Feldes, was zu kolloidalen Beflockungen in einem Rennstrecken-ähnlichen Kanal25führte. Diese früheren Arbeiten zeigen die Rolle der lokalen Kontrolle in Anwendungen und fördern die Wissensbasis der aktiven Materie.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Steuerbarkeit von kinesingetriebenen, mikrotubuli (MT)-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten. Die Flüssigkeiten bestehen aus drei Hauptkomponenten: MTs, Kinesin-Molekularmotoren und Depletanten. Die Erschöpfungskräfte induzieren eine Erschöpfungskraft, um die MTs zu bündeln, die später durch Motorcluster überbrückt werden. Diese Motoren laufen entlang der MTsgegenüber des Plus-Ends. Wenn ein Paar überbrückte MTsis antiparallel, die entsprechenden Motoren gehen in entgegengesetzte Richtungen. Die Motoren sind jedoch in einem Cluster gebunden und können nicht auseinandergehen, so dass sie kooperative MT-Paare auseinanderschieben (Interfilament-Gleiten, Abbildung 1A). Diese Gleitdynamik akkumuliert, wodurch sich die MTsto-Bündel bis zum Erreichen ihres Knickinstabilitätspunkts ausdehnen und brechen (Extensile-Bündel, Abbildung 1B)26. Die gebrochenen Bündel werden durch die Erschöpfungskraft geglüht, die sich anschließend wieder ausdehnt, und die Dynamik wiederholt sich. Während des Prozesses der sich wiederholenden Dynamik rühren die Bündelbewegungen die nahe flüssigkeitsnahe und induzierenden Ströme, die durch Doping mit Mikron-Tracern visualisiert werden können (Abbildung 1C). Sanchez et al. und Henkin et al. haben die mittleren Geschwindigkeiten von Tracern charakterisiert und festgestellt, dass die Geschwindigkeiten durch Variation der Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP), Depletanten, Motorclustern und MTs19,27abstimmbar waren. Eine solche Tunabilität existierte jedoch erst vor der aktiven Flüssigkeitssynthese. Nach der Synthese ging die Tunability verloren und die Flüssigkeiten selbst organisiert auf ihre eigene Weise. Um die aktive Flüssigkeitsaktivität nach der Synthese zu steuern, berichtete Ross.et al. über eine Methode, bei der die lichtaktivierte Dimerisierung von motorischen Proteinen verwendet wurde, so dass die Flüssigkeitsaktivität mit Licht28ein- und ausgeschaltet werden konnte. Während die Lichtsteuerung in Bezug auf die lokale Aktivierung der Flüssigkeiten praktisch ist, erfordert die Methode eine Neugestaltung der Strukturen von motorischen Proteinen sowie die Änderung der optischen Pfade im Mikroskop. Hier bieten wir eine einfach zu bedienende Methode zur lokalen Steuerung von Flüssigkeitsströmen ohne Mikroskopmodifikation unter Beibehaltung der Motorstruktur.

Unsere Methode der lokalen Abstimmung des aktiven Flüssigkeitsflusses basiert auf dem Arrhenius-Gesetz, da die Kinesin-MT-Reaktion mit der Temperatur29,30,31,32zunimmt. Unsere früheren Studien zeigten, dass die Temperaturabhängigkeit der mittleren Geschwindigkeit eines aktiven Flüssigkeitsflusses der Arrhenius-Gleichung folgte: v = A exp(-Ea/RT), wobei A ein präexponentieller Faktor ist, R die Gaskonstante ist, Ea die Aktivierungsenergie und T die Systemtemperatur33. Daher ist die Flüssigkeitsaktivität empfindlich auf die Temperaturumgebung, und die Systemtemperatur muss konsistent sein, um die Motorleistung und damit die Flüssigkeitsdurchflussgeschwindigkeit34zu stabilisieren. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung der Temperaturabhängigkeit des Motors, um die Fließgeschwindigkeiten von aktiven Flüssigkeiten kontinuierlich zu optimieren, indem die Systemtemperatur eingestellt wird. Wir zeigen auch die Herstellung einer aktiven Flüssigkeitsprobe, gefolgt von der Montage der Probe auf einer Mikroskopstufe, deren Temperatur über Computersoftware gesteuert wird. Die Erhöhung der Temperatur von 16 °C auf 36 °C beschleunigt die mittleren Durchflussgeschwindigkeiten von 4 auf 8 m/s. Zusätzlich ist die Tunbarkeit reversibel: Immer wieder erhöht und verringert die Temperatur sequentiell beschleunigt und verlangsamt den Durchfluss. Die demonstrierte Methode ist auf eine Breite von Systemen anwendbar, bei denen die Hauptreaktionen dem Arrhenius-Gesetz gehorchen, wie z. B. der MT-Gleittest29,30,31,32.

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Protocol

1. Vorbereitung von MTs

VORSICHT: In diesem Schritt reinigen wir Tubuline aus Rinderhirngewebe. Rinderhirn kann Die Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD)verursachen 35. Daher sollten die Hirnabfälle und die damit verbundenen Lösungen, Flaschen und Pipettenspitzen in einem Bioabfallbeutel gesammelt und nach den Regeln der Institution als biogefährlicher Abfall entsorgt werden.

  1. Reinigen Sie Tubuline aus dem Rinderhirn (modifiziert von Castoldi et al.36).
    1. Transportieren Sie etwa 1,5 kg frische Rinderhirne von einem örtlichen Schlachthof in einen Universitäts-Kühlraum. Während des Transports die Gehirne im Phosphatpuffer (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2) auf Eis lagern.
      HINWEIS: Um die endliche Ausbeute von Tubulin zu maximieren, ist die anfängliche Menge an funktionellem Tubulin im frischen Hirngewebe der Schlüssel. Frischere Gehirne enthalten mehr funktionelles Tubulin. Um die frischesten Gehirne aus dem Schlachthof zu erhalten, empfehlen wir, den Metzger zu bitten, Gehirne von den zuletzt geschlachteten Kühen zur Verfügung zu stellen. Gehirne sollten nicht älter als 3 h sein, wenn das Verfahren begonnen wird, da die Verkürzung der Zeit zwischen Schlachtung und Beginn des Verfahrens zu besseren Erträgen führt.
    2. Homogenisieren und klären Sie die Gehirne.
      1. Reinigen Sie das Gehirn, indem Sie Skalpelle verwenden, um Blutgefäße und Bindegewebe in kleinere Stücke zu schneiden und sie von Hand aus dem Gehirn zu entfernen.
        HINWEIS: Die gereinigten Gehirne sollten rosa sein.
      2. Tauchen Sie das gereinigte Hirngewebe in 1 L Depolymerisationspuffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) Ethansäure, 1 mM CaCl2, pH 6,6) pro Kilogramm Gehirn ein.
      3. Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem Küchenmixer.
      4. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Hirnlösung bei 10.000 x g und 4 °C für 150 min.
    3. Polymerisieren Sie MTs (erste Polymerisation).
      1. Sammeln und mischen Sie den Überstand mit gleichen Volumina der folgenden Lösungen bei 37 °C: Glycerin, hochmolareren PIPES-Puffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM Ethylenglykol-Bis(-Aminoehylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure [EGTA], pH 6.9)
      2. 1,5 mM ATP und 0,5 mM Guanosintriphosphat (GTP) in die Mischung geben.
      3. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 1 h.
    4. Depolymerisieren Sie MTs (erste MT-Depolymerisation).
      1. Pellet MT durch Zentrifugieren bei 151.000 x g und 37 °C für 30 min.
      2. Überstand entsorgen und jedes MT-Pellet in 10 ml 4 °C DB wieder aufhängen.
      3. 30 min auf Eis bebrüten.
      4. Rühren Sie die Mischung alle 5 min mit einer Pipettenspitze, um MT Sedimentation zu vermeiden.
        HINWEIS: Die Mischung sollte sich in 30 min klar machen, was auf den Abschluss der MT-Depolymerisation hinweist.
    5. Polymerisieren Sie MTs (zweite MT-Polymerisation).
      1. Klären Sie die Lösung durch Zentrifugieren bei 70.000 x g und 4 °C für 30 min.
      2. Sammeln und mischen Sie den Überstand mit gleichen Volumina von 37 °C Glycerin und HMPB.
      3. 1,5 mM ATP und 0,5 mM GTP in die Mischung geben.
      4. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min.
    6. Wiederholen Sie Schritt 1.1.4, ersetzen Sie HMPB durch Brinkley Reassembly Buffer (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8), gefolgt von der Klärung der geclearten Mischung durch Zentrifugieren bei 79.000 x g und 4 °C für 30 min.
    7. Sammeln Sie den Überstand. Messen Sie die 280 nm Absorption mit einem Spektrometer. Bestimmen Sie die Tubulinkonzentration nach dem Beer-Lambert-Gesetz (Aussterbekoeffizient von Tubulin: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Bewahren Sie das Protein bei -80 °C auf.
  2. Recycling-Tubuline (modifiziert von Castoldi et al.36).
    HINWEIS: Um die Tubulinrität zu verbessern, wird das gereinigte Tubulin wieder polymerisiert und depolymerisiert.
    1. Polymerisieren Sie die MTs, indem Sie das gereinigte Tubulin (Schritt 1.1.7) mit 500 'M Dithiothreitol (DTT) und 20 'M GTP mischen, gefolgt von 30 min Inkubation bei 37 °C.
    2. Pellet die MTs.
      1. 1 ml Glycerinkissen (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 6.8) in den Boden eines Zentrifugenrohrs geben.
      2. Legen Sie die polymerisierten MTs auf das Kissen.
      3. Zentrifuge bei 172.000 x g für 90 min bei 37 °C.
    3. Depolymerisieren Sie die MTs.
      1. Entfernen Sie den Überstand und Kissen.
      2. Setzen Sie jedes MT-Pellet in 150 l mit 4 °C MT-Puffer (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8) wieder auf.
      3. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 min.
      4. Rühren Sie die Mischung mit einer Pipettenspitze alle 5 min. Die Mischung sollte klar werden.
    4. Klären Sie die Mischung durch Zentrifugieren bei 172.000 x g und 4 °C für 30 min.
    5. Sammeln Sie den Überstand. Messen Sie die Proteinkonzentration. Bei -80 °C lagern.
  3. Beschriften Sie das Tubulin mit fluoreszierendem Farbstoff39.
    1. Polymerisieren Sie die MTs. Mischen Sie das gereinigte Tubulin (Schritt 1.1.7) mit 500 M DTT und 16,7 M GTP, und brüten Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min.
    2. Pellet die MTs.
      1. 1 ml 37 °C High-pH-Kissen (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 8,6) in ein Zentrifugenrohr geben.
      2. Legen Sie die polymerisierten MTs auf das Kissen.
      3. Zentrifuge bei 327.000 x g für 50 min bei 37 °C.
    3. Label Tubulin.
      1. Setzen Sie jedes MT-Pellet mit 700 l 37 °C-Etikettierpuffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40% v/v Glycerin, pH 8,6) wieder auf.
      2. Mischen Sie die Suspension mit einem 10-20 MolarenÜberschuss an weitrotem Fluoreszenzfarbstoff funktionalisiert mit einem Succinimidylester.
      3. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 30 min im Dunkeln, damit die MTs mit dem Ester des Fluoreszenzfarbstoffs reagieren können.
      4. Beenden Sie die Etikettierungsreaktion, indem Sie den Ester des aufhängenden Farbstoffs mit 50 mM K-Glutamat sättigen und 5 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Pellet die beschrifteten MTs: Wiederholen Sie Schritt 1.3.2, ersetzen Sie das High-pH-Kissen durch Low-pH-Kissen (80 mM Rohre, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v Glycerin, pH 6.8).
    5. Depolymerisieren Sie MTs.
      1. Entsorgen Sie den Überstand und das Kissen.
      2. Das Pellet in 700 l mit 4 °C M2B wieder aufhängen.
      3. Inkubieren Sie die Suspension auf Eis.
      4. Alle 5 min mit einer Pipettenspitze aufräumen, bis die Lösung klar ist.
    6. Klären Sie die geklärte Lösung durch Zentrifugieren bei 184.000 x g und 4 °C für 35 min.
    7. Verbessern Sie die Reinheit der beschrifteten Tubulinlösung, indem Sie die Schritte 1.2.1–1.2.4 wiederholen.
    8. Messen Sie die Konzentration von Proteinen und Fluoreszenzfarbstoffen. Verwenden Sie diese Messungen, um die Tubulinkonzentration und die Fraktionen von markiertem Tubulin zu bestimmen, definiert als das Verhältnis der Konzentrationen von Fluoreszenzfarbstoff zu Tubulin.
    9. Bewahren Sie die beschriftete Tubulinlösung bei -80 °C auf.
  4. Polymerisieren Sie die MTs (angenommen von Sanchez et al.19):
    1. Mischen Sie das recycelte Tubulin (Schritt 1.2.5) mit beschriftetem Tubulin (Schritt 1.3.9) in einem Verhältnis, das eine 3% markierte Tubulinfraktion ergibt.
    2. Mischen Sie die 8 mg/ml Tubulin-Mischung mit 1 mM DTT und 0,6 mM Guanosin-5'[()-Methyleno]triphosphat (GMPCPP), gefolgt von 30 min Inkubation bei 37 °C.
    3. Nach der Inkubation die MTs bei Raumtemperatur im Dunkeln für 6 h annealieren.
    4. Aliquot und lagern bei -80 °C.

2. Synthetisieren von Kinesin-Clustern

HINWEIS: Bakterien existieren allgegenwärtig und können in den Medien wachsen und den Herstellungsprozess kontaminieren. Um eine Kontamination zu verhindern, müssen Aktionen mit Kontakt mit den Zellkulturen (z. B. Pipettierung) in der Nähe einer Flamme durchgeführt werden. Werkzeuge wie Kolben, Pipetten, Pipettenspitzen, Medien und Platten MÜSSEN vor der Verwendung autoklaviert werden.

  1. Express-Kinesinmotoren in Escherichia coli40.
    1. Transformieren Sie die Zellen.
      1. Pipette 1 l des K401-BCCP-H6-Plasmids in 10 l kompetente Zellen.
      2. 5 min auf Eis bebrüten.
      3. Hitzeschock bei 42,5 °C für 45 s.
      4. Inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 2 min, um eine Erholung zu ermöglichen.
      5. Mischen Sie die Zellen mit 300 l antibiotikafreiem 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L Hefeextrakt, 16 g/L Trypton).
      6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 1 h.
        HINWEIS: Sofern nicht angegeben, ist eine Überwachung des Zellwachstums während der Inkubation nicht erforderlich.
    2. Inokulatierte Plattenmedien.
      1. Die Zellkultur auf einer 2XYT-Platte (10 g/L NaCl, 5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Trypton, 15 g/L Agar, 100 g/ml Ampicillin, 25 g/ml Chloramphenicol) verteilen.
      2. Die Platte über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen.
    3. Flüssige Medien impfen.
      1. Von der Nachtplatte eine isolierte Kolonie mit einer Pipettenspitze ernten.
      2. Die Spitze in einen Kolben mit 50 ml 2XYT auswerfen.
      3. Bebrüte und schütteln Sie die Kulturmedien bei 37 °C und 200 Umdrehungen von 12 bis 16 Stunden.
    4. Erweitern Sie die Zellen.
      1. Mischen Sie 2,5 ml der Zellkultur in 500 ml 2XYT.
      2. Die 500 ml-Kultur bei 37 °C und 250 Umdrehungen von 1/min für 3–6 h bebrüten und schütteln.
    5. Induzieren Sie die Proteinexpression.
      1. Überwachen Sie während der Inkubation das Zellwachstum, indem Sie die Absorption bei 600 nm messen, indem Sie 2XYT als Referenz verwenden. Messen Sie die Absorption alle 60 min, bis sie OD600 = 0,3 erreicht. Messen Sie dann die Absorption alle 30 min, bis sie 0,5–0,6 erreicht.
      2. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis die Absorption OD600 = 0,5–0,6 erreicht.
      3. Fügen Sie der Zellkultur 24 g/ml Biotin und 1 mM Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) hinzu.
        HINWEIS: IPTG wird verwendet, um die Proteinexpression der Kinesinmotoren zu induzieren, die mit Biotin-Carboxylträgerprotein (BCCP) und sechs Histiminien (H6) markiert sind. Das H6-Tag wird im Reinigungsprozess (Schritt 2.2) verwendet, während BCCP an die zugesetzten Biotinmoleküle bindet, um die exprimierten Kinesinmotoren zu biotinylatieren.
      4. Die Zellkultur bei 20 °C und 250 Umdrehungen von 12 bis 20 H bebrüten und schütteln.
    6. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 x g und 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand. Bewahren Sie die Zellpellets bei -80 °C auf.
  2. Reinigen Sie das Kinesin-Motorprotein (modifiziert von Spriestersbach et al.41):
    1. Setzen Sie das Zellpellet (Schritt 2.1.6) mit einem gleichen Volumen von Lysepuffer (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 m ATP, 10 mM 2-Mercaptoethanol (ME), 20 mM Imidazol, pH 7,2), gefolgt von einer Tablette Proteasehemmer, 2 mg Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 2 mg Lysozyzym.
    2. Lyse die Zellen durch Blitz einfrieren in flüssigem Stickstoff (LN) 3x und auftauen die Zellmischung.
      HINWEIS: Nach dem Lysing sollte die Mischung zähflüssig werden.
    3. Klären Sie das lysierte Zellgemisch durch Zentrifugieren bei 230.000 x g und 4 °C für 30 min.
    4. Sammeln Sie den Überstand und fließen Sie ihn durch eine Gravitationssäule, gefolgt vom Waschen der Säule mit 10 ml Lysepuffer.
      HINWEIS: Proteine mit einem H6-Tag, wie Kinesin K401-BCCP-H6, sollten in der Spalte verbleiben.
    5. Eluieren Sie das markierte Protein mit 5 ml Elutionspuffer (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 'M ATP, 500 mM Imidazol, pH 7.2). Sammeln Sie den Durchfluss sequenziell in 1 ml-Fraktionen. Um die proteinhaltigen Fraktionen zu bestimmen, mischen Sie 3 l jeder Fraktion mit 100 l Triphenylmethanfarbstoff. Die proteinhaltigen Fraktionen sollten blau werden. Kombinieren Sie diese Fraktionen und verdünnen Sie durch 5x mit Lysepuffer.
    6. Konzentrieren Sie die Proteinlösung.
      1. Laden Sie die Lösung in ein Zentrifugalfilterrohr.
      2. Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C.
      3. Das Rohr vorsichtig schütteln und zentrieren, bis das Lösungsvolumen <3 ml beträgt.
    7. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Spektrometer (Aussterbekoeffizient: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Verdünnen Sie das Protein auf 1 mg/ml, während Sie 35% w/v Saccharose hinzufügen.
    8. Bei -80 °C lagern.
  3. Messen Sie die Kinesinkonzentrationen mit einem Elektrophorese-Gel (modifiziert von Taylor et al.44).
    HINWEIS: Um die Kinesinkonzentration mit einem Elektrophorese-Gel zu messen, ist Tubulin aufgrund seiner hohen Reinheit und seiner messbaren Konzentration über ein Spektrometer (Abbildung 2A)36eine ideale Konzentrationsleiter.
    1. Bereiten Sie Tubulinproben mit Konzentrationen von 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 und 1,25 mg/ml vor. Mischen Sie 15 l jeder Tubulin-Probe und Kinesinprobe (Schritt 2.2.8) getrennt mit 5 l Probenpuffer (200 mM Tris-HCl, 8% Natriumdodecylsulfat (SDS), 400 mM DTT, 0,2% Bromphenolblau, 40% Glycerin, pH 6,8) und inkubieren bei 90 °C für 3 min.
    2. Bereiten Sie die Elektrophorese vor.
      1. Verriegeln Sie ein Elektrophorese-Gel in die Gelbox.
      2. Füllen Sie die Box mit Laufpuffer (50 mM MOPS, 50 mM Tris Basis, 0,1% SDS, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,7).
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Pufferebene über der oberen Öffnung des Gels befindet.
    3. 10 L Protein-Standardleiter, Tubulinproben und Kinesinproben in separate Brunnen laden und 45 min 200 V über das Gel auftragen.
    4. Gel färbung.
      1. Das Gel mit gekochter (ca. 95 °C) Fleckenlösung A (0,5 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10% v/v Essigsäure, 25% Isopropanol) für 5 min inkubieren und gestein, dann das Gel mit deionisiertem (DI) Wasser abspülen.
      2. Wiederholen Sie dies mit den Farblösungen B (0,05 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10 % v/v Essigsäure, 10 % Isopropanol), C (0,02 g/L Triphenylmethanfarbstoff, 10 % v/v Essigsäure) und D (10 % v/v Essigsäure) nacheinander. Das Gel über Nacht in DI-Wasser brüten und schaukeln.
    5. Scannen Sie das Gel. Konvertieren Sie das Gelbild in ein Graustufenbild, gefolgt von einer Schwarzweiß-Inversion und Kontrastverbesserung, um helle Proteinbänder im schwarzen Hintergrund anzuzeigen.
    6. Messen Sie die Helligkeit jedes Bandes, indem Sie die Pixelwerte summieren. Wenden Sie die lineare Passung C = aB + ban, wobei B die Helligkeit eines Tubulinbandes, C die entsprechende Konzentration und a und b passende Parameter sind. Bestimmen Sie die Konzentration von Kinesin Ck, indem Sie die Helligkeit des Kinesinbandes Bk verwenden, um die lineare Gleichung zu berechnen: Ck = aBk + b.
  4. Clustern Sie die Kinesinmotoren.
    1. Mischen Sie 1,5 m Kinesin (Schritt 2.2.8) mit 120 M DTT und 120 nM Streptavidin. 30 min auf Eis bebrüten.
    2. Bei -80 °C lagern.

3. Bereiten Sie polyacrylamidbeschichtete Glasglyse und Abdeckungen (modifiziert von Lau et al.45)

  1. Laden Sie neue Glasschieber und Glasabdeckungen in entsprechende Behälter. Die Rutschen und Deckelinlagen in 1% v/v Waschmittel in DI-Wasser untertauchen und dann das Wasser in einer Mikrowelle kochen.
  2. Beschallen Sie die Rutschen und Abdeckungen für 5 min und spülen Sie dann mit DI-Wasser, um Reinigungsmittel zu entfernen.
  3. Untertauchen und beschallen Sie die Rutschen und Deckellipsen in Ethanol für 5 min. Spülen Sie mit DI-Wasser.
  4. Untertauchen und beschallen Sie die Dias und Abdeckungen in 100 mM Kaliumhydroxid (KOH) für 5 min. Mit DI-Wasser abspülen.
  5. Die Dias und Deckelinlipse in einer Silanlösung (1% Essigsäure und 0,5% 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in Ethanol) 15 min inkubieren und dann mit DI-Wasser abspülen.
  6. Inkubieren Sie die Dias und Abdeckungen in Acrylamidlösung (2% w/w Acrylamid, 0,7 mg/ml Ammoniumpersulfat und 0,0035% v/v Tetramethylethylendiamin in DI-Wasser) für 3 h.
  7. Bewahren Sie die Dias und Abdeckungen in der Acrylamidlösung auf.

4. Bereiten Sie kinesingetriebene, MT-basierte Aktive Flüssigkeiten vor

  1. Bereiten Sie aktive Flüssigkeiten (modifiziert von Sanchez et al.19).
    HINWEIS: Die folgenden Schritte veranschaulichen den Prozess der Herstellung von 100 l einer aktiven Flüssigkeit anhand von Beispielbeständen. Das Endvolumen ist skalierbar, und die Konzentrationen der Beispielbestände können angepasst werden, solange die Endkonzentration der einzelnen Komponenten beibehalten wird.
    1. Mischen Sie 16,7 l mit 8 mg/ml MTs (Schritt 1,4,4) mit 6,7 l mit 1,8 -M-Kinesin-Motorclustern (Schritt 2,4,2) und 1,1 l mit 500 mM DTT in Hochsalz-M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bündeln Sie MTs durch Zugabe von 11,4 l 7% w/w Polyethylenglykol (PEG).
    3. Aktivieren Sie Kinesinmotoren, indem Sie 2,8 l von 50 mM ATP hinzufügen.
    4. Halten Sie die ATP-Konzentrationen aufrecht, indem Sie 2,8 l Pyruvatkinase/Laktatdehydrogenase (PK/LDH) und 13,3 l von 200 ml Phosphenolpyruvat (PEP) hinzufügen.
    5. Reduzieren Sie die Photobleichwirkung, indem Sie 10 l von 20 mM Trolox, 1,1 l 3,5 mg/ml Kataalase, 1,1 l mit 20 mg/ml Glukoseoxidase und 1,1 l 300 mg/ml Glukose hinzufügen.
    6. Verfolgen Sie die Bewegung der Flüssigkeit, indem Sie 1,6 l von 0,025 % v/v Tracerpartikeln hinzufügen.
    7. Fügen Sie Hochsalz-M2B hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 l zu erreichen.
      HINWEIS: Die Mischaufträge in den Schritten 4.1.1–4.1.6 sind austauschbar. Sobald jedoch ATP, MTs und die Motoren gemischt sind, beginnen die Motoren, ATP zu verbrauchen, während sie die MTs entlang treten. Die Probe wird aufgrund der begrenzten Kraftstoffe (ATP und PEP) mit einer begrenzten Lebensdauer aktiviert, daher sollte das Experiment umgehend gestartet werden. Die endgültige Aktive Flüssigkeit sollte 1,3 mg/ml MT, 120 nM Kinesin-Motorcluster, 5,5 mM DTT, 0,8 % mit PEG, 1,4 mM ATP, 2,8 % v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/ml Kataalase, 0,22 mg/ml Glukoseoxidase, 3,3 mg/ml Glukose und 0,0004 % v/void in Salz-M2B.
  2. Bereiten Sie eine Probe in einem Strömungskanal vor (modifiziert von Chandrakar et al.46):
    1. Spülen Sie einen polyacrylamidbeschichteten Glasschlitten und Einen Deckelschlupf (Schritt 3.7) mit DI-Wasser. Trocknen Sie die Gläser mit Druckluft. Auf eine saubere, flache Oberfläche stellen.
    2. Schneiden Sie zwei Streifen von Wachsfolien mit einer Breite von 3 mm und der gleichen Länge wie der Glasdeckel (20 mm). Legen Sie die Streifen als Kanalabstandhalter zwischen dem Schieberegler und dem Coverslip ein.
    3. Das Glas an der Wachsfolie anbringen, indem Sie den Glaswachskomplex auf eine 80 °C-Kochplatte legen, um das Wachs zu schmelzen. Während des Schmelzens den Deckelrutsch vorsichtig mit einer Pipettenspitze drücken, um den Wachsfilm gleichmäßig an den Glasoberflächen zu befestigen. Nach der Haftung den Glaskomplex auf Raumtemperatur abkühlen.
    4. Laden Sie die aktiven Flüssigkeiten (Schritt 4.1) in den Strömungskanal. Versiegeln Sie den Kanal mit UV-Kleber.

5. Kontrolle der Probentemperatur

  1. Erstellen Sie eine Temperaturregelung (modifiziert von Designs in Lowensohn et al. und Wu et al.47,48,49).
    1. Bereiten Sie einen Aluminium-Kühlblock vor.
      1. Fräsen Sie eine Aluminiumplatte mit Abmessungen von ca. 30 mm x 30 mm x 5 mm.
      2. Bohren Sie einen internen Kanal durch die Platte (Abbildung 3A) und installieren Sie Schlaucharmaturen an den Kanalenden.
      3. Haken Sie jede Anbringung an ein Wasserrohr.
      4. Schließen Sie ein Rohr an eine Fischtankpumpe in einem Wasserreservoir an, während Sie das andere Rohr zum Reservoir verlängern.
        HINWEIS: Die Pumpe zirkuliert Reservoirwasser durch die Aluminium-Innenkanäle, um die Blocktemperatur bei etwa Raumtemperatur zu halten.
    2. Verdrahten Sie einen thermoelektrischen Kühler (TEC) und einen Thermosensor mit einem Temperaturregler. Schließen Sie den Controller über einen USB-Anschluss an einen Computer an (Abbildung 3B).
    3. Verdrahten Sie den Temperaturregler mit einem Gleichstrom-Netzteil ( DC). Schalten Sie den Controller ein, indem Sie das Netzteil an eine Steckdose anschließen.
    4. Führen Sie die Ersteinrichtung des TEC nach der Anleitung des Controllerherstellers durch. Testen Sie den TEC-Ausgang. Es wird empfohlen, den Temperaturregler über eine vom Hersteller bereitgestellte Software zu steuern, was die Aufzeichnung von thermosensorischen Daten und eine einfachere Manipulation des Temperaturreglers ermöglicht.
    5. Identifizieren Sie die Heiz- und Kühlseiten des TEC.
    6. Befestigen Sie die Kühlseite des TEC mit Thermopaste am Kühlblock (Schritt 5.1.1).
    7. Befestigen Sie eine Saphirscheibe mit Thermopaste an der Wärmeseite des TEC.
    8. Die Einrichtung ist abgeschlossen. Die Saphiroberfläche und der Thermosensor können eine Probe kontaktieren, um die Probe basierend auf ihrer Temperatur und Zieltemperatur abzukühlen und zu erwärmen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass der TEC und der Kühlblock eine ausgerichtete zentrale Bohrung für die Abbildung der Proben mittels Hellfeldmikroskopie haben (Abbildung 3C).
  2. Verwenden Sie das Temperaturregelungs-Setup, um die Probentemperatur33zu steuern.
    1. Montieren Sie das Beispiel am Setup.
      1. Legen Sie die aktive Flüssigkeitsprobe (Schritt 4.2.4) auf die Saphiroberfläche, wobei die Gleitseite die Oberfläche ankortiert.
      2. Sichern Sie die Glasfolie mit Papierband.
      3. Befestigen Sie den Thermosensor mit Kupferband an der Deckbedeckungsoberfläche.
    2. Montieren Sie das Setup auf einer Mikroskopbühne mit der abdeckungsrutschigen Seite, die den Zielen zugewandt ist. Bei einem invertierten Mikroskop sollte beispielsweise die Abdeckungsrutschseite nach unten. Sichern Sie das Setup ggf. mit Papierband und den Mikroskop-Stufennadelklemmen.
      HINWEIS: Die vorgestellte Temperaturstufe sollte mit gängigen Mikroskopen arbeiten, die entweder invertiert oder aufrecht sind. Um sicherzustellen, dass die Temperaturstufe während des Experiments nicht bewegt wird, ist es am besten, die Temperaturstufe mit Klebeband auf die Mikroskopstufe zu befestsichern.
    3. Steuern Sie die Probentemperatur.
      1. Schalten Sie den Temperaturregler und die Fischtankpumpe ein.
      2. Folgen Sie der Anleitung des Herstellers, um die Zieltemperatur einzustellen und die Temperaturregelung zu aktivieren. Der Regler passt die Vom Thermosensor ermittelte Heiz- oder Kühlleistung basierend auf der Zieltemperatur und der Probentemperatur an.
    4. Zeichnen Sie Probentemperaturen auf.
      1. Folgen Sie dem Leitfaden des Herstellers, um Thermosensor-Temperaturdaten während des Experiments aufzuzeichnen.
        ANMERKUNG: Die Probentemperatur sollte nun vom Controller gesteuert und vom Computer aufgezeichnet werden (Abbildung 3D).

6. Charakterisieren Sie die aktive Flüssigkeitsaktivität (modifiziert von Methoden von Henkin et al. und Wu et al.20,27)

HINWEIS: Die vorherigen Abschnitte werden verwendet, um aktive Flüssigkeitsproben zu erstellen (Abschnitte 1–4) und deren Temperatur zu steuern (Abschnitt 5). Um die Verwendung von Temperatur zur Steuerung der aktiven Flüssigkeitsaktivität zu demonstrieren, beobachten Sie das Flüssigkeitsverhalten, analysieren sie ihre Aktivitäten und charakterisieren sie ihre Reaktion auf die Temperatur.

  1. Überwachen Sie Tracer.
    1. Stellen Sie die Probe mit einem konstanten Intervallmit Hilfe der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) dar, um die Bewegung der Tracerpartikel zu erfassen.
      ANMERKUNG:Es sollte so gewählt werden, dass die Tracerbewegung verfolgt werden kann. Große Werte, z.B. 100 s, führen zum Verlust der Tracer-Trajektorien, während kurzeWerte, z. B. 0,1 s, verhindern, dass der Tracking-Algorithmus die Tracerbewegung zwischen Frames erkennt. Ein arbeitendest sollte es ermöglichen, dass die Tracerverschiebung zwischen Frames innerhalb von 9 Pixeln liegt. Für bildgebende Tracer, die sich mit einem 4x Objektiv bei 10 'm/s bewegen,wird empfohlen, 1–5 s zu sein.
    2. Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien, benennen Sie die Dateien basierend auf der Framenummer, und speichern Sie sie in einem separaten Ordner. Diese Prozesse sind notwendig, um sicherzustellen, dass die erfassten Bilder mit dem bereitgestellten MATLAB-Skript korrekt analysiert werden (Schritt 6.2.2).
  2. Track Tracer unter Annahme der Tracking-Software von Ouellette et al.50,51entwickelt ):
    1. Laden Sie die Tracking-Software vom Environmental Complexity Laboratory der Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml) herunter. Stellen Sie sicher, dass sich jede MATLAB-Datei im selben Ordner befindet.
    2. Verfolgen Sie Tracer mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript: particle_tracking.m. Das Skript liest Tracer-Bilder (Schritt 6.1) und verfolgt Tracer-Bewegungen mit der Software von Ouellette et al.50,51. Es gibt zwei Dateien aus: 1) background.tif, die den Bildhintergrund darstellen, und 2) Tracking.mat, die die Partikelbahnen und Geschwindigkeiten in jedem Frame enthalten (Abbildung 4A).
  3. Analysieren Sie die Mittelwertgeschwindigkeiten des Tracers mithilfe eines benutzerdefinierten MATLAB-Skripts: analysis.m. Das Skript liest die Tracking-Datei (Tracking.mat) und gibt die mittlere Geschwindigkeit von Tracern im Vergleich zur Zeit aus, zusammen mit einer zeitgemittelten Mittleren Geschwindigkeit mit angegebenen Mittelungsfenstern (Abbildung 4B)33.
  4. Zeichnen Sie die zeitgemittelte Mittlere Geschwindigkeit auf.
  5. Messen Sie die zeitgemittelte Mittlere Geschwindigkeit, indem Sie das Experiment (Schritte 4, 5.2 und 6.1–6.4) bei 10–40 °C wiederholen. Verwenden Sie die aufgezeichneten mittleren Geschwindigkeiten, um die mittlere Geschwindigkeit vs. Temperatur zu zeichnen (Abbildung 4C)33.

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Representative Results

Die Vorbereitung der kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten erfordert sowohl Kinesin als auch MTs. Die MTs wurden aus markierten Tubulinen (Schritte 1.3 und 1.4) polymerisiert, die von Rinderhirnen gereinigt wurden (Schritt 1.1, Abbildung 2A), gefolgt von Recycling zur Verbesserung der Reinheit (Schritt 1.2, Abbildung 2B). Die Kinesin-Motorproteine wurden in E. coli exprimiert und gereinigt (Schritte 2.1 und 2.2, Abbildung 2B)41,52. Die Konzentration des hergestellten Kinesinbestandes wurde mit einem SDS-Gel gemessen, indem die Helligkeit des Hauptbandes mit der von recycelten Tubulinen mit bekannten Konzentrationen verglichen wurde (Schritt 2.3, Abbildung 2B inset). Die Helligkeitswerte der Tubulinbänder (B) wurden linear an die entsprechende Konzentration (C) mit der Gleichung C = aB + b , ergibt a = 3,1 x 10-2 mg/ml und n = 8,7 x 10-4 mg/ml (Abbildung 2C). Die angepasste Gleichung wurde verwendet, um die Konzentration eines Kinesinbandes zu bestimmen, indem die gemessene Bandhelligkeit Bk = 1.060 angewendet wurde, was eine Kinesinkonzentration von Ck = 0,95 mg/ml ergab. MT- und Kinesinproben mit bekannten Konzentrationen wurden zur Herstellung von aktiven Flüssigkeitsproben verwendet. Die aktiven Flüssigkeiten wurden synthetisiert, in eine polyacrylamidbeschichtete Durchflusszelle geladen und die Zelle mit UV-Kleber versiegelt (Abschnitte 3 und 4)46.

Um die Steuerung der aktiven Flüssigkeitsaktivität mit der Temperatur zu demonstrieren, wurde die aktive Flüssigkeitsprobe auf der hausgemachten Temperaturstufe montiert (Schritt 5.2, Abbildung 3A-C). Die Probentemperatur wurde vom Regler nach einem Proportional-Integral-Derivat-Algorithmus(PID) 53überwacht und gesteuert. Die bei 10 °C, 20 °C, 30 °C und 40 °C kontrollierten Proben schwankten bei Temperaturen innerhalb von 0,1–0,3 °C für 4 h, was die Stabilität und Zuverlässigkeit dieses Temperaturregelungsaufbaus demonstrierte (Abbildung 3D).

Um die Probe zu beobachten, wurde das Setup auf ein Epifluoreszenzmikroskop montiert. Die Probe wurde mit Alexa 488-markierten Tracern dotiert, die mit Fluoreszenzmikroskopie über einen GFP-Kanal (Schritt 6.1) abgebildet wurden. Die Tracer wurden jeweils mitt = 2 s abgebildet. Die sequenziellen Bilder, die für die Verfolgung von Tracer-Trajekrien rizulässig sind, wobei i den Tracer-Index darstellt (Schritt 6.2, Abbildung 4A). Die Flugbahnen ergaben eine mittlere Geschwindigkeit v(t) ri(t) - ri(t-t)|/t>I (Schritt 6.3). Die bei 20–36 °C gemessenen mittleren Geschwindigkeiten schienen bei t = 0–2 h nahezu zeitunabhängig zu sein, während bei 10 °C und 40 °C die mittleren Geschwindigkeiten schnell abfielen(Abbildung 4B). Der Zerfall bei 10 °C wurde durch MT-Depolymerisation unter 16 °C verursacht. Der Zerfall bei 40 °C war auf die Überfunktion der Kinesin-Cluster über 36 °C zurückzuführen. Nach unseren bisherigen Studien verlieren diese Kinesin-Motor-Cluster die Fähigkeit, MT-Paare nach der Vorinkubation bei >36 °C33zu fahren. Um die mittleren Geschwindigkeiten für jede Temperatur zu charakterisieren und gleichzeitig den durch diese Faktoren induzierten Zerfall widerzuspiegeln, wurden die mittleren Geschwindigkeiten zwischen t = 1–2 h (Schritte 6.3 und 6.4)33gemittelt. Die zeitgemittelten Durchschnittsgeschwindigkeiten wurden zwischen 10 °C und 40 °C gemessen (Schritt 6.5, Abbildung 4C). Unter 16 °C und über 36 °C verfielen die mittleren Geschwindigkeiten aufgrund der MT-Depolymerisation und der fehlerhaften Kinesin-Cluster33schnell, während steigende Temperaturen von 16 °C auf 36 °C die mittleren Geschwindigkeiten von 4 bis 8 m/s beschleunigten und die Machbarkeit einer Abstimmung der mittleren Geschwindigkeit eines aktiven Flüssigkeitsflusses mit Dertemperatur demonstrierten. Um die Leistungsfähigkeit der Temperaturregelung weiter zu demonstrieren, wurden die Systemtemperaturen alle 30 min zwischen 20 °C und 30 °C abgewechselt. Die mittleren Geschwindigkeiten der aktiven Flüssigkeiten beschleunigten und verlangsamten sich nicht nur entsprechend, sondern sie reagierten auch auf die Temperaturänderung innerhalb von 10 s (Abbildung 5). Eine solche reversible und schnelle Reaktion der aktiven Flüssigkeit zeigt die Durchführbarkeit der Verwendung von Temperatur zur dynamischen Steuerung von Flüssigkeitsaktivitäten.

Figure 1
Abbildung 1: Einführung von kinesingetriebenen, MT-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten. (A) Schaltpläne des Interfilamentgleitens. Paare von antiparallelen MTs wurden von Depletanten gebündelt und von Motorclustern auseinander getrieben. (B) Motorcluster trieben zusammen MT-Paare an, wodurch MT-Bundles erweitert wurden. (C) Die Extensile-Bündel bildeten ein MT-basiertes aktives Gel (grün), das die umgebende Flüssigkeit rührte, um einen Fluss zu induzieren. Um den Fluss zu verfolgen, wurde die Flüssigkeit mit Tracern gedopt (rot). Diese Figur wurde von Bate et al.33adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bilder von SDS-Gelen aus den Tubulin- und Kinesin-Reinigungen. (A) Bild eines SDS-Gels von gereinigtem Tubulin. (B) Bild eines SDS-Gels aus recycelten Tubulinen und gereinigtem Kinesin. Die Bahnen von links nach rechts waren Proteinstandards, roh, 1,25–0,25 mg/ml recycelte Tubuline, Rohlinge und Kinesinbestände. (C) Die Konzentration von gereinigtem Kinesin wurde durch den Vergleich der Bandhelligkeit mit den sequenziellen Bändern von Tubuli mit gemessenen Konzentrationen (rote und blaue gestrichelte Rechtecke im Einbau) bestimmt. Die Helligkeit jedes Bandes wurde gemessen, indem die Pixelwerte innerhalb eines zugeschnittenen Bandbildes summiert wurden. Um das Hintergrundrauschen zu reduzieren, wurde das Gelbild vor dem Zuschneiden in Graustufen übertragen, Schwarzweiß invertiert und dann kontrastreich, um einen schwarzen Hintergrund (Einset) anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Einrichtung der Temperaturregelung. (A) Schaltpläne des Aluminiumblocks für die Temperaturregelungseinrichtung. Der Block enthält einen internen Kanal, damit Wasser durch ihn fließt und die vom TEC erzeugte Wärme abführt. Das zentrale Loch ermöglicht es, die Probe durch helle Feldmikroskopie auf der einen Seite zu beleuchten und mit einem Objektiv auf der anderen Seite abgebildet zu werden. (B) Schemata der Temperaturregelungseinrichtung. Die thermische Siliziumpaste wird zwischen dem Aluminiumkühlblock und dem TEC sowie zwischen dem TEC und der Saphirscheibe aufgebracht. (C) Bild einer Probe, die auf der temperaturgeregelten Stufe montiert ist. Wasserrohre sind mit einer Pumpe verbunden, die in ein Wasserreservoir eingetaucht ist. (D) Aufgezeichnete Probentemperaturen vs. Zeit für Zieltemperaturen 10 °C, 20 °C, 30 °C bzw. 40 °C. Die Probentemperaturen wurden bei Temperaturen mit einer Schwankung summierung von 0,1 bis 0,3 °C gehalten. B und D wurden von Bate et al.33adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Abstimmung der aktiven Flüssigkeitsströme über die Temperatur. (A) Imaging Tracer (weiße Punkte) erlaubt für die Verfolgung der Strömungsbahnen sequenziell (verschiedene farbige Kurven). Die Tracer wurden alle 5 s bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) überwacht. (B) Tracer-Mittelgeschwindigkeit vs. Zeit bei 10 °C, 20 °C, 30 °C, 36 °C bzw. 40 °C. (C) Tracer mittlere Geschwindigkeit vs. Temperatur. Jeder Punkt stellt die durchschnittliche Tracer-Durchschnittsgeschwindigkeit während der ersten und zweiten Stunde dar. Unter 16 °C depolymerisierten die MTs und oberhalb von 36 °C Verfehlungen von Kinesinclustern. Daher liegt die Arbeitstemperatur zwischen 16 und 36 °C, wobei die Mittlerengeschwindigkeiten zwischen 4 und 8 m/s schwankten. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der zeitgemittelten mittleren Geschwindigkeiten dar. B und C wurden von Bate et al.33adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Wechseln der Fließgeschwindigkeit von aktiven Flüssigkeiten durch periodische Wechsel der Systemtemperatur. Das Schalten der Temperatur zwischen 20 °C und 30 °C alle 30 min beschleunigte und verlangsamte die Durchflussgeschwindigkeiten wiederholt, wodurch die lokale Kontrolle der aktiven Flüssigkeitsaktivitäten mit der Temperatur demonstriert wurde. Diese Figur wurde von Bate et al.33adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Kontrolle der aktiven Materie vor Ort öffnet die Tür zur gerichteten Selbstorganisation der aktiven Materie4,5,24,28,54. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Temperatur zur Steuerung von kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten vor Ort vor, basierend auf der Arrhenius-Kennlinie des Systems29,30,31. Da das System proteinbasiert ist, ist die Aufrechterhaltung der Proteinfunktionalität während des gesamten Experiments der Schlüssel zur erfolgreichen Anwendung des Protokolls. Die wichtigsten Proteine im System sind MTs und Kinesin-Cluster. Die erstere depolymerisieren unter 16 °C und letztere Fehlfunktion über 36 °C33. Die Aufrechterhaltung der Systemtemperatur zwischen 16 und 36 °C ist daher für aktive Flüssigkeiten von entscheidender Bedeutung, um eine stetige Dynamik zu entwickeln und ihre Reaktion auf die Temperatur reversibel zu ermöglichen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die Temperatur wird jedoch auf der Grundlage eines PID-Algorithmus gesteuert, der dazu neigt, die Zieltemperatur53zu überschießen. Um diese Überung zu reduzieren, empfehlen wir, mehrere Zwischenzieltemperaturen festzulegen, bevor die endgültige Zieltemperatur gesetzt wird. Um beispielsweise die Probe von Raumtemperatur (ca. 20 °C) auf 35 °C zu erwärmen, anstatt die Zieltemperatur direkt auf 35 °C einzustellen, empfehlen wir eine Zwischenzieltemperatur von 30 °C, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass die Temperatur über 36 °C ansteigt, was die Proteine irreversibel schädigen würde33. Ebenso wird empfohlen, beim Abkühlen der Probe von Raumtemperatur auf 16 °C eine Zwischenzieltemperatur von 18 °C festzulegen, da die PID vor Erreichen eines stabilen Zustands die Probe unter 16 °C abkühlen und die MTs33depolymerisieren kann.

Die vorgestellte Temperaturregelungsmethode beruht auf Kühlung und Heizung mit einem TEC. Der Einsatz des TEC stellt sicher, dass die Probe innerhalb von Sekunden die Zieltemperatur erreicht, während eine herkömmliche Temperaturregelungseinrichtung mit einem temperaturgeregelten Wasserbad Minuten braucht, um die gewünschte Temperatur zu erreichen (Abbildung 5)55. Der TEC erzeugt ungleich Null Nettowärme, die durch ein Aluminium-Internes Wasserkreislaufsystem abgeführt wird. Das Wasser lässt jedoch Schimmel wachsen, was schließlich den Kanal56verstopfen wird. Ein verstopfter Kanal hemmt den Wasserfluss, und die Wärme sammelt sich im Aluminiumblock an und schmilzt schließlich die Wasserrohre. Die geschmolzenen Rohre führen dazu, dass Wasser über das Mikroskop und die Kamera überschwappt und die elektronischen Instrumente beschädigt. Daher empfehlen wir, um die vorgestellte Temperaturregelung sanieren, 0,1% Wasserstoffperoxid in das Wasser zu geben, um das Schimmelwachstum zu hemmen57,58,59. Wir erwarten, dass dieser Schritt sicherstellt, dass der Aluminium-Innenkanal verstopft bleibt und Wasserschäden an nahe gelegenen elektronischen Geräten verhindert.

Die Temperaturbearbeitung, die Beschichtung der Durchflusszelloberflächen mit Polyacrylamid und die Synthese von aktiven Flüssigkeiten sind drei entscheidende Schritte, um diese in situgesteuerte Aktivflüssigkeit zu realisieren. Diese Steuerbarkeit ist jedoch auf den Temperaturbereich beschränkt, in dem die beteiligten Proteine normal funktionieren können. Im aktiven Flüssigkeitssystem sind die Primärproteine MTs und Kinesin-Cluster, die normalerweise zwischen 16–36 °C33funktionieren. Innerhalb dieses Temperaturbereichs variieren aktive Flüssigkeiten ihre mittleren Durchflussgeschwindigkeiten von 4 bis 8 m/s(Abbildung 4C). Mittlere Geschwindigkeiten außerhalb dieses Bereichs liegen über der Grenze der dargestellten Kontrollmethode. Im Gegensatz dazu berichteten Ross et al. von einer Alternative, die es ermöglicht, die aktiven Flüssigkeitsaktivitäten mit Licht28ein- und auszuschalten. Die Lichtsteuerung ermöglicht auch die Aktivierung von Aktivenflüssigkeiten in einer optisch definierten Grenze von 50 m. Eine solche Alternative erfordert jedoch eine Änderung der Kinesinstruktur zusammen mit der Abstimmung eines optischen Pfades im Mikroskop. Im Vergleich dazu sind die Vorteile der Anwendung der in diesem Artikel vorgestellten Methode 1) die aktiven Flüssigkeiten müssen nicht neu gestaltet werden, 2) die Mikroskope müssen nicht modifiziert werden, 3) die Temperaturregelungseinrichtung ist kostengünstig und einfach zu bedienen, und 4) die Methode ist auf andere temperaturabhängige Systeme wie den Gleittest29,30,31,32 oder allgemeiner enzymbasierte Systemeübertragen. Wir erwarten auch, dass die vorgestellte Methode die Tür zur Entwicklung mikrofluidischer Systeme öffnen wird, bei denen Kanalflüsse lokal ohne Ventile gesteuert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 war ein Geschenk von Dr. Zvonimir Dogic. Diese Forschung wurde vom Start-up-Fonds von Dr. Kun-Ta Wu im Worcester Polytechnic Institute unterstützt. Wir danken Dr. Zvonimir Dogic für die Protokolle zur Reinigung und Kennzeichnung von Tubulin und zur Synthese von Aktivenflüssigkeiten. Wir danken Dr. Marc Ridilla für seine Expertise in der Proteinexpression und -reinigung. Wir danken Dr. William Benjamin Roger für die Unterstützung beim Bau der temperaturgeregelten Bühne. Wir würdigen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) für die Nutzung der Biological Materials Facility (BMF). Wir würdigen die Royal Society of Chemistry für die Anpassung der Figuren von Bate et al. auf Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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