Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

שליטה במהירויות זרימה של נוזלים פעילים תלת-ממדיים מבוססי מיקרוכדורית באמצעות טמפרטורה

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בטמפרטורה כדי לשלוט על מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים תלת ממדיים. היתרון של שיטה זו לא רק מאפשר להסדיר מהירויות זרימה באתרו, אלא גם מאפשר בקרה דינמית, כגון מהירויות זרימה מעת לעת כוונון מעלה ומתחת.

Abstract

אנו מציגים שיטה לשימוש בטמפרטורה כדי לכוונן את מהירויות הזרימה של הנוזלים הפעילים, תלת-ממדיים המבוססים על מיקרו-מימדי (3D). שיטה זו מאפשרת כוונון המהירויות באתרו ללא צורך לייצר דגימות חדשות כדי להגיע למהירויות רצויות שונות. כמו-כן, שיטה זו מאפשרת שליטה דינמית במהירות. רכיבה על הטמפרטורה מובילה את הנוזלים לזרום מהר ואיטי, מדי פעם. הישור הזאת מבוססת על המאפיין ארניוס של התגובה המיקרוכימית, הממחיש טווח מהירות מבוקר של זרימה של 4 – 8 μm/s. השיטה המוצגת תפתח את הדלת לעיצוב של התקנים microflu, היכן שקצבי הזרימה בערוץ מסוגלים להיות מקומיים ללא צורך בשסתום.

Introduction

חומר פעיל מובחנים מחומר פסיבי קונבנציונאלי בשל יכולתה להמיר אנרגיה כימית לעבודה מכנית. חומר שבעל יכולת כזו יכול להיות מורכב מגופים חיים או שאינם חיים, כגון חיידקים, חרקים, colloids, דגנים, וחוטי ציטולדים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. הישויות החומריות האלה. מאינטראקציה עם השכנים שלהם בקנה מידה גדול יותר, הם מסדרים את עצמם לתוך או מערבולות כמו הסוערת (מערבולת פעילה) או חומר זורם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. הבנה של ארגון עצמי של חומר פעיל הובילה ליישומים שונים במעבורות מולקולריות, במכשירים אופטיים ובחישוב מקבילי21,22,23. כדי להביא את היישומים לרמה הבאה יש צורך בשליטה מעבר לארגון העצמי. לדוגמה, פאלאצ'י ואח ' פיתח קולואיד ממטיט שהיה ממונע עצמית רק כאשר הוא נחשף לאור כחול בשליטה ידנית, מה שהוביל להופעת קריסטלים חיים24. מורין ואח ' הקימה את השליטה בגלגול הcolloids של קוויק באמצעות שדה חשמלי חיצוני, והתוצאה היא שנוהרים לכאן בערוץ מסלול המרוצים, כמו25. עבודות קודמות אלה מדגימות את התפקיד של השליטה המקומית ביישומים ומקדמות את בסיס הידע של החומר הפעיל.

במאמר זה, אנו מתמקדים ישור של kinesin מונחה, מיקרוטוכדורית (MT) מבוססי נוזלים פעילים תלת-ממד. הנוזלים מורכבים משלושה מרכיבים עיקריים: MTs, מנועים מולקולריים ומתכלים. מרוקן לגרום כוח מחסור לצרור MTs, אשר מאוחר יותר מגשר על ידי אשכולות מנוע. המנועים האלה הולכים. לאורך הקצה החיובי כאשר זוג מגשר מ, המנועים המקבילים מסתובבים בכיוונים מנוגדים. עם זאת, המנועים מאוגדים באשכול ואינם יכולים להתפרק, ולכן הם בשיתוף זוגות בנפרד של MTs (הזזה בין פילמנט, איור 1א). אלה הדינמיקה הזזה להצטבר, גרימת צרורות של MTsto להאריך עד להגיע אי-יציבות הקריסה שלהם נקודה ושבור (extensile צרורות, איור 1B)26. הצרורות השבורים מופרים על ידי כוח המחסור, המשתרע לאחר מכן, והדינמיקה חוזרת. במהלך תהליך הדינמיקה החוזרת, תנועות הצרור מעוררות את הנוזל הסמוך, גורם לזרמים שניתן לדמיין באמצעות מטים מיקרון בקנה מידה (איור 1ג). סאנצ'ס ואח ' והנקין אל. אפיינו את מהירויות המשמעות של המשדרים, מציאת כי המהירויות היו שונות על ידי שינוי ריכוזי אדנוזין טריפוספט (ATP), מרוקן, אשכולות מנוע, ו MTs19,27. עם זאת, היכולת הזאת קיימת רק לפני סינתזה נוזל פעיל. לאחר הסינתזה, היכולת הייתה לאבד והנוזלים המאורגנים בדרכם. כדי לשלוט על פעילות הנוזל הפעיל לאחר סינתזה, Ross.et al. דיווחו על שיטה באמצעות הפעלת האור המופעל של חלבונים מוטוריים, המאפשר פעילות נוזלים להיות מכוון ולכבות באמצעות אור28. בעוד שבקרת האור נוחה במונחים של הפעלת הנוזלים באופן מקומי, השיטה מחייבת לעצב מראש את המבנים של החלבונים המוטוריים, יחד עם שינוי הנתיבים האופטיים במיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים שיטה קלה לשימוש עבור שליטה מקומית זורם נוזלים ללא שינוי מיקרוסקופ תוך שמירה על מבנה המנוע ללא פגע.

השיטה שלנו לכוונון מקומי זרימה נוזל פעיל מבוסס על חוק arrhenius כי התגובה kinesin-MT כבר דווח להגדיל עם טמפרטורה29,30,31,32. מחקרים קודמים שלנו הראו כי התלות בטמפרטורה של מהירות ממוצע של זרימת נוזל פעיל עקב משוואת Arrhenius: v = exp (-EA/RT), כאשר הוא גורם טרום מעריכי , R הוא קבוע הגז , Ea היא אנרגיית ההפעלה, ו T היא טמפרטורת המערכת33. לכן, פעילות הנוזלים רגישה לסביבת הטמפרטורה, וטמפרטורת המערכת צריכה להיות עקבית כדי לייצב את הביצועים המוטוריים, וכתוצאה מכך מהירות זרימת הנוזלים34. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בתלות הטמפרטורה של המנוע כדי לכוונן ברציפות את מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים על-ידי התאמת טמפרטורת המערכת. אנו גם להדגים את ההכנה של דגימת נוזל פעיל, ואחריו לעלות את המדגם על הבמה מיקרוסקופ אשר הטמפרטורה נשלטת באמצעות תוכנת מחשב. הגדלת הטמפרטורה מ -16 ° c עד 36 ° c מאיץ את מהירויות הזרימה הממוצע בין 4 ל-8 μm/s. בנוסף, יכולת התנועה הפיכה: הגדלה והקטנה של הטמפרטורה ברצף מאיצה ומאטה את הזרימה. השיטה שהוראתה מתאימה למגוון רחב של מערכות בהן התגובות העיקריות מצייתות לחוק ארניוס, כגון שיטת הר הדאייה29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת MTs

התראה: בשלב זה אנו מטהרו את הטובולים מרקמת מוח של שור. המוח של שור עלול לגרום מחלה של הגרסה Creutzfeldt-יאקוב (vCJD)35. לכן יש לאסוף את החומרים הקשורים לפסולת המוח והפתרונות הנלווים, הבקבוקים והפיפטה בשקית biowaste ולהיפטר מפסולת ביולוגית בהתאם לכללי המוסד.

  1. לטהר טובולים ממוח של שור (השתנה מקאזולדי36ואח ').
    1. הובלה של כ 1.5 ק ג של מוחות מבית מטבחיים מקומי לחדר קר באוניברסיטה. במהלך התחבורה, לאחסן את המוח במאגר פוספט (20 מ"מ מילימטר2PO4, 150 מ"מ הנאל, pH 7.2) על הקרח.
      הערה: כדי למקסם את התשואה הסופית של טובולין, הכמות הראשונית של טובולין פונקציונלי ברקמת המוח הטרייה היא המפתח. מוחות טריים מכילים טובולין פונקציונלי יותר. כדי להשיג את המוחות הטריים ביותר מהמטבחיים, אנו ממליצים לבקש מהקצב לספק מוחות מהפרות האחרונות שנשחטו לאחרונה. המוח לא צריך להיות מבוגר יותר 3 h כאשר מתחילים את ההליך, כי הפחתת הזמן בין השחיטה וההליך להתחיל יפיק תשואות טובות יותר.
    2. הומוגון ובירור המוח.
      1. נקו את המוח באמצעות אזמלים כדי לגזור כלי דם ורקמת חיבור לחתיכות קטנות יותר ולהסיר אותם מהמוח ביד.
        הערה: המוח הנקי צריך להיות ורוד.
      2. לטבול את רקמת המוח ניקה 1 L של פלמור מאגר (DB: 50 mM 2-(N-שורגולינו) חומצה אתאנסולפונית, 1 מ"מ cacl2, pH 6.6) לכל קילוגרם של המוח.
      3. המגון המוח עם בלנדר מטבח.
      4. צנטריפוגה את הפתרון המוח הומוגניים ב 10,000 x g ו 4 ° צ' עבור 150 דקות.
    3. פולימור MTs (ראשון פלמור).
      1. לאסוף ולערבב את הסופרנטנט עם כמויות שוות של הפתרונות הבאים ב 37 ° c: גליצרול, מאגר צינורות גבוה מאוד (HMPB: 1 M צינורות, 10 מ"מ MgCl2, 20 מ"מ אתילן גליקול-bis (β-עמינח ehyl אתר)-n, N, n, n'-הטטראצטט חומצה [egta], pH 6.9)
      2. הוסף 1.5 mm ATP ו 0.5 mm guanosine טריפוספט (gtp) לתערובת.
      3. מודג את התערובת ב 37 ° c עבור 1 h.
    4. דפולימור MTs (הר הדפלזציה הראשון).
      1. גלולה MT על ידי תפרידו ב 151,000 x g ו 37 ° צ' עבור 30 דקות.
      2. מחיקת supernatant ולהשעות מחדש כל הגלולה MT ב 10 מ ל של 4 ° צ' DB.
      3. . מודקון על קרח במשך 30 דקות
      4. מתפרעים את התערובת כל 5 דקות עם טיפ פיפטה כדי למנוע משקעי MT.
        הערה: התערובת צריכה לפנות בעוד 30 דקות, ולציין את השלמת הר דפלוניזציה.
    5. פולימור MTs (MT השני).
      1. הבהרת הפתרון על-ידי תפרידו ב-70,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
      2. לאסוף ולערבב את סופרנטנט עם כרכים שווים של 37 ° צ' גליצרול ו HMPB.
      3. הוסף 1.5 mM ATP ו 0.5 mM GTP לתערובת.
      4. מודקון את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    6. חזור על שלב 1.1.4, החלפת HMPB באמצעות מאגר הרכבה ברינקלי (BRB) 80 (80 מ"מ צינורות, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ Egta, pH 6.8), ואחריו הבהרת התערובת הנקיה על ידי תפרידו ב 79,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    7. . תאסוף את הסופרנטאנט למדוד את הספיגה 280 ננומטר עם ספקטרומטר. לקבוע את הריכוז טובולין באמצעות חוק בירה-למברט (מקדם הכחדה של טובולין: 1.15 (mg/mL)-1ס"מ-1)37,38.
    8. אחסן את החלבון ב-80 ° c.
  2. מיחזור מחזור (השתנה מקאזולדי ואח '36).
    הערה: כדי לשפר את הטוהר הטובולין, הטובולין הטהורה הינה פולימנית ומדהרת שוב.
    1. פולימלזציה MTs על ידי ערבוב טובולין מטוהרים (שלב 1.1.7) עם 500 μM dithio, (DTT) ו 20 μM GTP, ואחריו 30 דקות של דגירה ב 37 ° c.
    2. לסדר את התחת של MTs.
      1. טען 1 מ ל של כרית גליצרול (80 מ"מ צינורות, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v הגליצרול, pH 6.8) בחלק התחתון של צינורית צנטריפוגה.
      2. הניחו את ה-MTs הפולימריות על גבי הכרית.
      3. צנטריפוגה ב 172,000 x g עבור 90 דקות ב 37 ° c.
    3. . בסדר.
      1. . הסר את הסופרנטאנט ואת הכרית
      2. השהה מחדש כל גלולה MT ב-150 μL של 4 מאגר מעלות צלזיוס (M2B: 80 מ"מ צינורות, 2 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ Egta, pH 6.8).
      3. מודקון את התערובת על הקרח 30 דקות.
      4. מתפרעים את התערובת עם טיפ פיפטה כל 5 דקות. . התערובת אמורה לפנות
    4. הבהרת התערובת על-ידי תפרידו ב-172,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    5. . תאסוף את הסופרנטאנט למדוד את ריכוז החלבון. חנות ב-80 ° c.
  3. סמן את הטובולין עם צבע פלורסנט39.
    1. לערבב את MTs. מערבבים את טובולין מטוהרים (צעד 1.1.7) עם 500 μM DTT ו 16.7 μM GTP, ו מודרט את התערובת ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
    2. לסדר את התחת של MTs.
      1. מקום 1 מ ל של 37 ° c כרית גבוה pH (0.1 M NaHEPES, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v הגליצרול, pH 8.6) לתוך צינור צנטריפוגה.
      2. הניחו את ה-MTs הפילמור על הכרית.
      3. צנטריפוגה ב 327,000 x g עבור 50 דקות ב 37 ° c.
    3. . טובולין תווית
      1. השהה מחדש כל גלולה MT עם 700 μL של 37 מאגר תיוג ° c (0.1 M NaHEPES, 1 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 40% v/v הגליצרול, pH 8.6).
      2. מערבבים את ההשעיה עם 10 – 20 העודפים טוחנת של צבע פלורסנט הרחוק-אדום מתפקד עם אסתר סוכות.
      3. מודאת התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות בחושך כדי לאפשר MTs להגיב עם אסתר של צבע פלורסנט.
      4. הפסיקו את תגובת התיוג על ידי השבת אסתר של הצבע השעיית עם 50 mM K-גלוטמט, המסטורסת עבור 5 דקות ב 37 ° c.
    4. גלולה MTs שכותרתו: חזור על השלב 1.3.2, החלפת כרית גבוהה pH עם כרית נמוכה pH (80 מ"מ צינורות, 2 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ egta, 60% v/v גליצרול, pH 6.8).
    5. . הוראות מסוימות
      1. השמט את הסופרנטאנט ואת הכרית.
      2. השהה מחדש את הגלולה ב-700 μL של 4 ° c M2B.
      3. . שמתי את ההשעיה על הקרח
      4. מתפרעים כל 5 דקות עם טיפ פיפטה עד הפתרון ברור.
    6. להבהיר את הפתרון הנקי על ידי תפרידו ב 184,000 x g ו 4 ° צ' עבור 35 min.
    7. שפר את הטוהר של פתרון טובולין שכותרתו באמצעות שלבים חוזרים 1.2.1 – 1.2.4.
    8. למדוד את הריכוז של חלבונים וצבען פלורסנט. השתמש במידות אלה כדי לקבוע את הריכוז הטובולין והשברים של טובולין המסומנות בתווית, המוגדרים כיחס של ריכוזים של צבע פלורסנט לטובולין.
    9. אחסן את הפתרון הטובולין בתווית ב-80 ° c.
  4. פולימל MTs (אומץ מתוך סאנצ'ס ואח '19):
    1. לערבב את טובולין ממוחזר (צעד 1.2.5) עם התווית טובולין (צעד 1.3.9) ביחס התשואות 3% התווית טובולין שבר.
    2. לערבב את 8 מ"ג/mL טובולין תערובת עם 1 מ"מ DTT ו 0.6 mM guanosine-5 ' [(α, β)-מתיונין] triphosphate (GMPCPP), ואחריו 30 דקות של דגירה ב 37 ° c.
    3. לאחר הדגירה, לספח את MTs בטמפרטורת החדר בחושך עבור 6 ה.
    4. מחלקים ומאחסנים ב80 ° c.

2. סנתז קיסין אשכולות

הערה: חיידקים קיימים אוביקווינביים ויכולים לצמוח בתקשורת ולזהם את תהליך ההכנה. כדי למנוע זיהום, פעולות הקשורות במגע עם תרביות תאים (למשל, ליטוף) חייב להתבצע ליד להבה. כלים כגון מבחנות, פיפטות, טיפים, מדיה, וצלחות חייב להיות באופן אוטומטי לפני השימוש.

  1. מנועי אקספרס מוטורס. באסאנכיה קולי40
    1. . הפוך את התאים
      1. פיפטה 1 μL של K401-BCCP-בH6 פלבאמצע לתוך 10 μL של תאים המוסמכים.
      2. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.
      3. הלם חום ב 42.5 ° c עבור 45 s.
      4. דגירה את התאים על הקרח עבור 2 דקות כדי לאפשר התאוששות.
      5. מערבבים את התאים עם 300 μL של אנטיביוטיקה חינם 2XYT (5 g/L ' ליטר, 10 g/L לחלץ שמרים, 16 g/L טריטונה).
      6. מודג את התאים בשעה 37 ° צלזיוס בשביל 1 h.
        הערה: אם לא צוין, מעקב אחר צמיחת התאים אינו נדרש במהלך הדגירה.
    2. . מדיית לוחית רישוי
      1. הפיצו את תרבות התא על צלחת 2XYT (10 גרם/L, 5 g/L לחלץ שמרים, 10 גרם/L טריטונה, 15 g/L אגר, 100 μg/mL אמפיצילין, 25 μg/mL כלוראמננול).
      2. מודקת את הצלחת הפוך ב 37 ° c בלילה.
    3. . לחסן מדיה נוזלית
      1. מלוחית הלילה, בציר מושבה מבודדת אחת עם טיפ של פיפטה.
      2. הוצא את הקצה לתוך בקבוקון המכיל 50 mL של 2XYT.
      3. דגירה ולנער את התקשורת התרבותית ב 37 ° c ו 200 סל ד עבור 12 – 16 h.
    4. הרחיבו את התאים.
      1. מערבבים 2.5 mL של תרבות התא ב 500 מ ל 2XYT.
      2. דגירה ולנער את התרבות 500 mL ב 37 ° צ' ו 250 rpm עבור 3 – 6 h.
    5. . לגרום לביטוי חלבון
      1. במהלך הדגירה, לפקח על צמיחת התאים על ידי מדידת ספיגה ב 600 ננומטר, באמצעות 2XYT כהפניה. למדוד את ספיגת כל 60 דקות, עד שהוא מגיע OD600 = 0.3. ואז למדוד את ספיגת כל 30 דקות עד שהוא מגיע 0.5 – 0.6.
      2. הניחו לתאים לצמוח עד שהספיגה תגיע ל-OD600 = 0.5 – 0.6
      3. הוסף 24 μg/mL ביוטין ו 1 מ"מ איזופרופיל β-D-1-הביויוגלפיטוןסייד (iptg) לתרבות התא.
        הערה: iptg משמש כדי לגרום חלבון ביטוי של מנועי קינזין, אשר מתויגים עם ביוטין קרבוקסילי הנושא חלבון (bccp) ו שישה היסטיסיזה (H6). תג H6 משמש בתהליך הטיהור (שלב 2.2), בעוד BCCP ס נקשר למולקולות הביוטין שנוספו לbiotinylate שעה מנועים מבוטא.
      4. דגירה ולנער את תרבות התא ב 20 ° צ' ו 250 סל ד עבור 12 – 20 h.
    6. לקצור את התאים על ידי תפרידו ב 5,000 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. אחסן את כדורי התא ב-80 ° c.
  2. לטהר את החלבון המוטורי (השתנה מ-מספרינאסטסבאך ואח '41):
    1. להשעות את הגלולה תא (שלב 2.1.6) עם נפח שווה של מאגר הליזה (50 מ"מ צינורות, 4 מ"מ MgCl2, 50 ΜM ATP, 10 מ"מ 2-mercaptoethanol (βME), 20 מ"מ סרפידול, pH 7.2), ואחריו הוספת טבליה אחת של פרוטאז מעכבי, 2 מ ג של פנילמתיל פקסיל פלווריד (PMSF), ו 2 מ ג של lysozyme.
    2. Lyse את התאים על ידי הקפאת פלאש בחנקן נוזלי (LN) 3x ולהתאים את תערובת התא.
      הערה: לאחר הלישר, התערובת צריכה להיות צמיגה.
    3. הבהרת תערובת התאים התפרידו ב-230,000 x g ו-4 ° צ' עבור 30 דקות.
    4. לאסוף את הסופרנטאנט ולהזרים אותו דרך עמוד הכבידה, ואחריו שטיפת הטור עם 10 מ ל של מאגר לפירוק.
      הערה: חלבונים בעלי תג H6, כגון קינזין K401-bccp-H6, צריכים להישאר בטור.
    5. להתחמק חלבון מתויג עם 5 מ ל של מאגר הימנעות (50 מ"מ צינורות, 4 מ"מ MgCl2, 50 ΜM ATP, 500 מ"מ ושנדוראזול, pH 7.2). לאסוף את הזרימה ברציפות בשברים 1 mL. כדי לקבוע את החלבון המכיל שברים, לערבב 3 μL של כל שבר עם 100 μL של צבע triphenylmethane. השברים המכילים חלבונים אמורים להפוך לכחולים. לשלב שברים אלה לדלל ידי 5x עם מאגר לפירוק.
    6. . רכזו את פתרון החלבון
      1. טען את הפתרון בשפופרת מסנן צנטריפוגלי.
      2. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
      3. טלטל את השפופרת בעדינות והצנטריפוגה שוב עד שנפח הפתרון הוא < 3 מ ל.
    7. למדוד את ריכוז החלבון עם ספקטרומטר (מקדם הכחדה: 0.549 (mg/mL)-1ס"מ-1)42,43. לדלל את החלבון 1 מ"ג/mL תוך הוספת 35% w/v סוכרוז.
    8. חנות ב-80 ° c.
  3. למדוד את הריכוזים של קינסין עם ג'ל אלקטרופורזה (שונה מטיילור ואח '.44).
    הערה: כדי למדוד את הריכוז של קינאסין עם ג'ל לאלקטרופורזה, טובולין הוא סולם ריכוז אידיאלי בשל הטוהר הגבוה שלה והריכוז המדידה שלה באמצעות ספקטרומטר (איור 2א)36.
    1. להכין דגימות טובולין עם ריכוזים של 0.25, 0.5, 0.75, 1.00, ו 1.25 mg/mL. מערבבים 15 μl של כל מדגם טובולין ו קינזין מדגם (שלב 2.2.8) בנפרד עם 5 μl של מאגר לדוגמה (200 mm טריס-HCl, 8% נתרן dodecyl סולפט (sds), 400 mm dtt, 0.2% ברומאופנול כחול, 40% גליצרול, pH 6.8) ו-דגירה ב 90 ° c עבור 3 דקות
    2. . הכן את האלקטרופורזה
      1. לנעול ג'ל אלקטרופורזה לתוך תיבת ג'ל.
      2. למלא את התיבה עם הפעלת מאגר (50 מ"מ מגבים, 50 mM בסיס טריס, 0.1% SDS, 1 מ"מ מילימטר החומצה (EDTA), pH 7.7).
        הערה: ודא שרמת המאגר מעל הפתיחה העליונה של הג.
    3. טען 10 μl של סולם סטנדרטי חלבון, דגימות טובולין, ו קינזין לדוגמה לתוך בארות נפרדות ולהחיל 200 V על פני ג'ל עבור 45 דקות.
    4. . מכתים ג'ל
      1. דגירה וסלע ג'ל עם מבושלים (כ 95 ° c) פתרון כתם A (0.5 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v חומצה אצטית, 25% איזופנול) עבור 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הג'ל עם מים מאוהים (DI).
      2. חזור עם פתרונות הכתם B (0.05 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v מתאן חומצה אצטית, 10% איזופנול), C (0.02 g/L triphenylmethane לצבוע, 10% v/v חומצה אצטית), ו D (10% v/v חומצה אצטית), ברצף. ומטלטל את הג. במים בלילה
    5. . תסרוק את הג המירו את תמונת הג לתמונה בגווני אפור, ואחריה היפוך שחור-לבן ושיפור ניגודיות לחשיפת להקות חלבון בהירות ברקע השחור.
    6. למדוד את הבהירות של כל רצועה על-ידי סיכום ערכי הפיקסלים. החל את ההתאמה הליניארית C = aB + b, כאשר b הוא הבהירות של להקה טובולין, C היא הריכוז המתאים, ו-b ו- ב' הם פרמטרים מתאימים . לקבוע את הריכוז של קינסין Ck באמצעות בהירות של קינזין להקה Bk כדי לחשב את המשוואה הלינארית: Ck = aBk + B.
  4. מקבץ את מנועי מנועים.
    1. מערבבים 1.5 μm קינזין (שלב 2.2.8) עם 120 μm dtt ו 120 ננומטר streptavidin. . מודקון על קרח במשך 30 דקות
    2. חנות ב-80 ° c.

3. הכנת מגלשות זכוכית מצופות פוליאקרילאמיד וכיסוי (השתנה מלאו ואח '45)

  1. טען שקופיות זכוכית חדשות ושמיכות זכוכית במיכלים המתאימים. יש לטבול את השקופיות והכיסויים בתכשיר ניקוי של 1% v/v במים די ולאחר מכן להרתיח את המים במיקרוגל.
  2. Sonicate את השקופיות ואת coverslips עבור 5 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים DI כדי להסיר כביסה.
  3. לטבול ולsonicate את השקופיות ואת coverslips באתנול עבור 5 דקות. לשטוף עם מים DI.
  4. לטבול ולsonicate את השקופיות ואת coverslips ב 100 מ"מ אשלגן הידרוקסיד (KOH) עבור 5 דקות. לשטוף עם מים DI.
  5. מארג השקופיות ואת coverslips פתרון silane (1% חומצה אצטית ו 0.5% 3-(trimethoxysilyl) פרופיל מתיונין ב אתנול) עבור 15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם די מים.
  6. מודדאת השקופיות והכיסויים בתמיסה אקרילאמיד (2% w/w אקרילאמיד, 0.7 mg/mL אמוניום פרסולפט, ו 0.0035% v/v הטטרמתילתיפילואמין ב די מים) עבור ≥ 3 h.
  7. אחסן את השקופיות והכיסויים בתמיסה האקרילמיד.

4. מכינים בעלי נוזלים פעילים מבוססי MT

  1. הכינו נוזלים פעילים (ששונו מ-סאנצ'ס et al.19).
    הערה: השלבים הבאים מדגימים את התהליך של הכנת 100 μL של נוזל פעיל באמצעות מניות לדוגמה. אמצעי האחסון הסופי מדרגי, והריכוזים של המניות לדוגמה ניתנים להתאמה כל עוד הריכוז הסופי של כל רכיב נשמר.
    1. מערבבים 16.7 μL של 8 מ"ג/mL MTs (שלב 1.4.4) עם 6.7 μL של 1.8 μM קיסין אשכולות מוטוריים (שלב 2.4.2), ו1.1 μL של 500 mM DTT ב-high-salt M2B (M2B + 3.9 mM MgCl2).
    2. צרור MTs על ידי הוספת 11.4 μL של 7% w/w פוליאתילן גליקול (פג).
    3. הפעל מנועי קינזין על ידי הוספת 2.8 μl של 50 mM ATP.
    4. שמור על ריכוזי ה-ATP על ידי הוספת 2.8 μL של פירובט במלאי קינאז/לקטט דהידרוגנאז (PK/LDH) ו 13.3 μL של 200 mM פוספנול פירובט (פפ).
    5. להפחית את האפקט photobleaching לבנת ידי הוספת 10 μL של 20 מ"מ טרולקס, 1.1 μL של 3.5 mg/mL קטלאז, 1.1 μL של 20 מ"ג/mL גלוקוז אוקסידאז, ו1.1 μL של 300 mg/mL גלוקוז.
    6. מעקב אחר התנועה של הנוזל על ידי הוספת 1.6 μL של 0.025% v/v חלקיקים מעקב.
    7. הוסף גבוהה-M2B מלח כדי להשיג נפח כולל של 100 μL.
      הערה: הזמנות ערבוב בשלבים 4.1.1 – 4.1.6 הם להחלפה. עם זאת, פעם ATP, MTs, ואת המנועים מעורבים, המנועים מתחילים לצרוך ATP תוך כדי צועד לאורך MTs. המדגם מופעל עם חיים סופיים בשל דלקים מוגבלים (ATP ו-פפ), כך הניסוי צריך להיות החל מיד. הנוזל הפעיל הסופי צריך להכיל 1.3 mg/mL MT, 120 ננומטר קינב אשכולות מוטוריים, 5.5 mM DTT, 0.8% w/w פג, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM פפ, 2 מ"מ טרולקס, 0.038 mg/mL, 0.22 mg/mL גלוקוז אוקסידאז, 3.3 mg/ml גלוקוז, ו 0.0004% v/v קולואיד ב גבוהה מלח M2B.
  2. הכינו דוגמא בערוץ זרימה (השתנה מצ'נדקאר ואח '46):
    1. לשטוף שקופית זכוכית פוליאקרילמיד-מצופה כיסוי (שלב 3.7) עם מים DI. . ייבש את המשקפיים באוויר מניחים על משטח נקי ושטוח.
    2. חותכים שתי רצועות של סרטי שעווה עם רוחב 3 מ"מ באותו אורך כמו שמיכות זכוכית (20 מ"מ). הכנס את הרצועות בין השקופית לבין הכיסויים כמרחב הערוצים.
    3. לדבוק את הזכוכית לסרט שעווה על ידי הצבת מתחם שעווה זכוכית על 80 ° c הצלחת חם כדי להמיס את השעווה. במהלך ההיתוך, לחץ על הcoverslip בעדינות עם קצה הפיפטה כדי לדבוק בצורה אחידה את סרט השעווה למשטח הזכוכית. לאחר הדבקה, מצננים את מתחם הזכוכית לטמפרטורת החדר.
    4. טען את הנוזלים הפעילים (שלב 4.1) לערוץ הזרימה. . אטום את הערוץ עם דבק אולטרא-סגול

5. שליטה בטמפרטורה לדוגמה

  1. לבנות התקנה בקרת טמפרטורה (שונה מעיצובים ב lowensohn ואח ' ו-Wu et al.47,48,49).
    1. הכן בלוק קירור מאלומיניום.
      1. מיל צלחת אלומיניום עם מימדים של כ 30 מ"מ × 30 מ"מ × 5 מ"מ.
      2. מקדחה ערוץ פנימי דרך הצלחת (איור 3A) ולהתקין אביזרי צינור בקצוות הערוץ.
      3. . התחברו כל התאמה לצינור מים
      4. חבר צינורית אחת למיכל דגים במיכל מים תוך הארכת הצינור השני אל המאגר.
        הערה: המשאבה להפיץ את המים במאגר דרך הצינורות הפנימיים אלומיניום כדי לשמור על טמפרטורת הבלוק בערך בטמפרטורת החדר.
    2. האזנה לצידנית תרמואלקטריים (TEC) וחיישן תרמואלקטרי לבקר טמפרטורה. חבר את הבקר למחשב באמצעות יציאת USB (איור 3ב).
    3. הגדר את בקר הטמפרטורה לספק כוח נוכחי (DC) ישיר. הפעל את הבקר על-ידי חיבור ספק הזרם לשקע חשמל.
    4. בצע את ההגדרה הראשונית של ה-TEC לאחר המדריך של יצרן הקונטרולר. בדוק את פלט ה-TEC. מומלץ לשלוט בבקר הטמפרטורה באמצעות תוכנה שסופקו על-ידי יצרן, המאפשר הקלטת נתונים תרמוחיישן ומניפולציה קלה יותר של בקר הטמפרטורה.
    5. זהה את צדי החימום והקירור של ה-TEC.
    6. חבר את צד הקירור של TEC אל בלוק הקירור (שלב 5.1.1) באמצעות הדבקה תרמית.
    7. הצמד דיסק ספיר לצד החימום של TEC באמצעות הדבקה תרמית.
    8. . הכיוונון הושלם משטח ספיר ו תרמוחיישן יכול ליצור קשר עם מדגם להתקרר ולחמם את המדגם בהתבסס על הטמפרטורה שלה ואת טמפרטורת היעד.
      הערה: מומלץ לחסום את ה-TEC והקירור באמצעות חור מרכזי מיושר לדימות הדגימות בעזרת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 3ג).
  2. השתמש בכיוונון בקרת הטמפרטורה כדי לשלוט בטמפרטורת המדגם33.
    1. הבהר את המדגם לכיוונון.
      1. מניחים את מדגם הנוזל הפעיל (שלב 4.2.4) על משטח הספיר עם צד השקופית פונה למשטח.
      2. אבטחו את מגלשת הזכוכית. עם נייר דבק
      3. הצמד את החיישן התרמותרמי למשטח הכיסויים באמצעות קלטת נחושת.
    2. הר הכיוונון על במת מיקרוסקופ עם צד שמיכות פונה לעבר היעדים. לדוגמה, על מיקרוסקופ הפוך, הצד שמיכות צריך להתמודד כלפי מטה. אבטח את ההתקנה בנייר דבק ומהדק מיקרוסקופ בשלב המחט אם ישים.
      הערה: שלב הטמפרטורה המוצגת אמור לעבוד עם מיקרוסקופים נפוצים הפוכים או ישרים. כדי להבטיח ששלב הטמפרטורה לא יועבר במהלך הניסוי, מוטב לאבטח את שלב הטמפרטורה לשלב המיקרוסקופ עם הקלטת.
    3. שלוט בטמפרטורת המדגם.
      1. הפעל את בקר הטמפרטורה ואת משאבת טנק הדגים.
      2. בצע את המדריך של היצרן כדי להגדיר את טמפרטורת היעד ולאפשר בקרת טמפרטורה. הבקר יתאים את כוח החימום או קירור המבוסס על טמפרטורת היעד והטמפרטורה לדוגמה, כפי שמוערך על ידי החיישן התרמותרמי.
    4. הקלט טמפרטורות לדוגמה.
      1. בצע את המדריך של היצרן כדי להקליט נתוני טמפרטורה תרמית במהלך הניסוי.
        הערה: הטמפרטורה המדגם צריכה להיות נשלטת על ידי הבקר ונרשם על ידי המחשב (איור 3ד).

6. אפיון פעילות הנוזלים הפעילה (השונה מהשיטות של חנקין ואח ' ו-וו et al.20,27)

הערה: הסעיפים הקודמים משמשים להכנת דגימות נוזל פעילות (סעיפים 1 – 4) ושליטה בטמפרטורה שלהם (סעיף 5). כדי להדגים את השימוש בטמפרטורה כדי לשלוט בפעילות הנוזלית הפעילה, להתבונן בהתנהגויות הנוזלים, לנתח את פעילותם ולאפיין את התגובה שלהם לטמפרטורה.

  1. . מפקחים על המעקב
    1. תמונה המדגם עם מרווח קבוע Δt באמצעות חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ניאון כדי ללכוד את התנועה של חלקיקי מעקב.
      הערה: Δt יש לבחור כדי לאפשר מעקב אחר תנועת המעקב. ערכי Δt גדולים, כגון 100 s, מאבדים את מסלולי המעקב, ואילו ערכי Δt קצרים, כגון 0.1 s, מונעים מאלגוריתם המעקב לזהות את תנועת המעקב בין מסגרות. Δt עובד צריך לאפשר הזחה מעקב בין מסגרות להיות בתוך ~ 9 פיקסלים. עבור מנותבים הדמיה נע ב 10 μm/s באמצעות מטרה 4x, Δt מומלץ להיות 1 – 5 s.
    2. שמרו את התמונות כקובצי TIFF, קראו לקבצים המבוססים על מספר המסגרת ואחסנו אותם בתיקייה נפרדת. תהליכים אלה נחוצים כדי להבטיח כי התמונות שנרכשו ינותחו כראוי עם הסקריפט MATLAB שסופקו (שלב 6.2.2).
  2. מעקב אחר עוקבים אחר תוכנות המעקב שפותחו על ידי ouellette ואח '50,51):
    1. הורד את תוכנת המעקב של המעבדה למורכבות סביבתית, אוניברסיטת סטנפורד (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). ודא שכל קובץ MATLAB נמצא באותה תיקיה.
    2. עקוב אחר מעוקבים באמצעות קובץ script MATLAB מותאם אישית: particle_tracking. m. הסקריפט קורא תמונות מעקב (שלב 6.1) ועוקבת אחר תנועת המעקב באמצעות התוכנה של ouellette ואח '50,51. היא מפלטי שני קבצים: 1) רקע. tif, המייצג את רקע התמונה ו-2. מעקב. mat, המכיל את מסלולי החלקיקים והמהירויות בכל מסגרת (איור 4א).
  3. ניתוח מהירויות מעקב אחר המעקב באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית: ניתוח. m. ה-script קורא את קובץ המעקב (מעקב. mat) ומפיק הפלט של המהירות הממוצע של מאתר המשדרים לעומת הזמן, יחד עם מהירות ממוצע של זמן בממוצע עם ממוצע של windows (איור 4ב)33.
  4. הקלט את מהירות ממוצע הזמן בממוצע.
  5. מדידת מהירות ממוצע הזמן בממוצע על-ידי חזרה על הניסוי (שלבים 4, 5.2 ו-6.1 – 6.4) ב-10 – 40 ° c. להשתמש במהירויות ממוצע מוקלט להתוות את מהירות ממוצע לעומת טמפרטורה (איור 4ג)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנת מונחה-בסיס, MT מבוססי נוזלים פעילים מחייב הן קינזין ו MTs. MTs היו פולימנים מן הטובולים שכותרתו (שלבים 1.3 ו 1.4) כי היו מטוהרים מן המוח שור (שלב 1.1, איור 2א), ואחריו מיחזור כדי לשפר את טוהר (שלב 1.2, איור 2ב). החלבונים המוטוריים של קינסין הביעו ביטוי וטוהר מ -E. coli (שלבים 2.1 ו 2.2, איור 2B)41,52. הריכוז של מניות קינזין מוכן נמדד עם ג'ל sds על ידי השוואת בהירות הלהקה הראשי עם זה של tubulins ממוחזר עם ריכוזים ידועים (שלב 2.3, איור 2B הזחה). ערכי הבהירות של להקות טובולין (ב) היו מתאימים בצורה לינארית לריכוז המקביל שלהם (c) באמצעות המשוואה C = aB + ε, מניב = 3.1 × 10-2 מ"ג/ml ו ε = 8.7 × 10-4 מ"ג/ml (איור 2ג). המשוואה הותאמה שימש כדי לקבוע את הריכוז של הלהקה קינזין על ידי החלת בהירות הלהקה נמדד, Bk = 1,060, מניב כגון ריכוז של Ck = 0.95 mg/mL. MT ו קינסין דגימות עם ריכוזים ידועים שימשו כדי להכין דגימות נוזל פעיל. הנוזלים הפעילים היו מסונתז, נטען לתוך תא זרימה פוליאקרילמיד-מצופה, והתא נאטם עם דבק UV (סעיפים 3 ו-4)46.

כדי להדגים את השליטה בפעילות הנוזלית הפעילה עם הטמפרטורה, מדגם הנוזלים הפעיל הותקן בשלב הטמפרטורה התוצרת-בית (שלב 5.2, איור 3א-ג). הטמפרטורה לדוגמה היה תחת פיקוח ונשלט על ידי הבקר על פי האלגוריתם מידתית-נגזרים (PID)53. דגימות שנשלטות ב -10 ° c, 20 ° צ', 30 ° צ', ו-40 ° c הופיעו בטמפרטורה ברדיוס של 0.1 – 0.3 ° c עבור 4 שעות, הפגנת היציבות והאמינות של הגדרת בקרת טמפרטורה זו (איור 3ד).

כדי להתבונן במדגם, ההתקנה נטענה על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית. המדגם היה מסומם עם אלקסה 488 המסומנים מסומנים, אשר התמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית דרך ערוץ GFP (שלב 6.1). המשדרים הללו התמונות כל Δt = 2 s. התמונות הרציפות המותרות למעקב אחר מעקב אחר מעוקבים ri, כאשר אני מייצג את אינדקס המעקב (שלב 6.2, איור 4א). הסלולים חשפו vמהירות מרושעת≡ < | ri(t)- rאני(t-Δt) |/Δt>i (שלב 6.3). המהירויות הגבוהות שנמדדות ב-20 – 36 ° c נראו כמעט בלתי תלויות ב- t = 0-2 h, ואילו ב -10 ° c ו-40 ° c מהירויות הממוצע התפורר (איור 4ב'). הדעיכה ב -10 ° c נגרמה על ידי הר פלפלוניזציה מתחת ל -16 ° c. הדעיכה ב-40 מעלות צלזיוס הייתה בשל האשכולות בעלי התקלה מעל 36 ° c. על פי המחקרים הקודמים שלנו אלה קיסין אשכולות מוטוריים לאבד את היכולת לנהוג זוגות של MTs לאחר טרום הדגירה ב > 36 ° c33. כדי לאפיין את המהירויות ממוצע עבור כל טמפרטורה תוך המשקף את הריקבון הנגרמת על ידי גורמים אלה, מהירויות ממוצע הממוצע בין t = 1-2 h (שלבים 6.3 ו 6.4)33. מהירויות ממוצע הזמן נמדד בין 10 ° צ'-40 ° צ' (שלב 6.5, איור 4ג). מתחת ל -16 ° c ומעלה 36 ° c מהירויות הממוצע התפורר במהירות בגלל MT דפלמור וללא מתפקד באשכולות33, בעוד הגדלת טמפרטורות מ -16 ° c עד 36 ° c האיץ את מהירויות ממוצע של 4 עד 8 μm/s, הוכחת את הכדאיות של כוונון מהירות ממוצע של זרימת נוזל פעיל כדי להדגים עוד יותר את היכולת של בקרת הטמפרטורה, טמפרטורת המערכת היתה לסירוגין בין 20 ° c ל -30 ° c כל 30 דקות. מהירויות הרשע של הנוזלים הפעילים לא רק להאיץ ולהאט בהתאם, אבל הם גם הגיבו לשינוי טמפרטורה בתוך 10 (איור 5). תגובה כזו הפיך ומהירה של הנוזל הפעיל מדגים את היכולת של שימוש בטמפרטורה לשלוט באופן דינאמי בפעילות הנוזלים.

Figure 1
איור 1: מבוא של מונחה מחשב מונע, MT מבוססי תלת-ממד נוזלי פעיל. (א) תרשים של פילמנט הזזה. זוגות של MTs antiparallel היו ארוזות על ידי מרוקן ומונע לגזרים על ידי אשכולות מוטוריים. (ב) אשכולות מוטוריים ביחד זוגות הסיע MTs, מובילים צרורות MT להאריך. (ג) הextensile צרורות היוו ג'ל פעיל מבוסס MT (ירוק) שהניע את הנוזל שמסביב כדי לגרום לזרימה. כדי לעקוב אחר הזרם, הנוזל היה מסומם באמצעות מנותבים (אדום). דמות זו הותאמה מ Bate ואח '.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות של SDS ג ' לים מן הטובולין ו קינסין. (א) דמות ג'ל של טובולין מטוהרים. (ב) דמות של מסכת שיניים ממוחזרת ומטותחת מטוהרים. הנתיבים משמאל לימין היו בסטנדרטים של חלבונים, ריקים, 1.25 – 0.25 מ"ג/mL ממוחזר ממוחזרים, ריק, ו קינסין מניות. (ג) הריכוז של קינסין הטהורה נקבע על ידי השוואת בהירות הלהקה עם הפסים הרציפים של הטובולים עם ריכוזים מדודים (מלבנים מקווקווים אדומים וכחולים בתוך הזחה). הבהירות של כל רצועה נמדדה על-ידי סיכום ערכי הפיקסלים בתוך תמונת פס חתוכה. כדי להקטין את רעשי הרקע, לפני חיתוך תמונת הג הועברה לגווני אפור, שחור-לבן הפוך, ולאחר מכן שופרה בחדות כדי לחשוף רקע שחור (הזחה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הגדרת בקרת טמפרטורה. (א) שרטוט של בלוק האלומיניום עבור הגדרת בקרת הטמפרטורה. הבלוק מכיל ערוץ פנימי להזרמת מים ולנשיאת החום שנוצר באמצעות TEC. החור המרכזי מאפשר למדגם להיות מואר על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר בצד אחד והתמונה עם מטרה בצד השני. (ב) תרשימים של הגדרת בקרת הטמפרטורה. ממרח סיליקון תרמי מוחל בין גוש קירור האלומיניום לבין ה-TEC ובין ה-TEC לבין הספיר. (ג) תמונה של מדגם הרכוב על הבמה בשליטת הטמפרטורה. צינורות מים מחוברים למשאבה שקוע במיכל מים. (ד) הוקלט לדוגמה טמפרטורות לעומת הזמן לטמפרטורת היעד 10 ° c, 20 ° c, 30 ° צ', ו 40 ° c, בהתאמה. הטמפרטורות לדוגמה נשמרות בטמפרטורות בעלות תנודות של 0.1 – 0.3 ° c. B ו -D הותאמו מ Bate et al.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כוונון נוזל פעיל זורם דרך הטמפרטורה. (א) מאתר הדמיה (נקודות לבנות) מותר לעקוב אחר מסלולי הזרימה ברצף (עקומות צבעוניות miscellaneously). המשדרים עקבו אחר כל 5 s (Δt = 5 s) בטמפרטורת החדר (~ 20 ° c). (ב) המעקב מתכוון מהירות לעומת זמן ב 10 ° c, 20 ° צ', 30 ° צ', 36 ° c, ו 40 ° c, בהתאמה. (ג) מעקב ממוצע מהירות לעומת טמפרטורה. כל נקודה מייצגת את מהירות המעקב הממוצעת בשעות הראשונות והשניות. מתחת ל-16 ° c מדובר ב-MTs, ומעל 36 ° c, אשכולות בעלי מפעל. לכן, טמפרטורת העבודה היא בין 16 – 36 ° c, שם מהירות ממוצע מגוון בין 4 – 8 μm/s. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של מהירויות ממוצע הזמן בממוצע. B ו- C הותאמו מ Bate et al.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: לסירוגין את מהירות הזרימה של נוזלים פעילים באופן תקופתי לסירוגין את טמפרטורת המערכת. החלפת הטמפרטורה בין 20 ° צ' לבין 30 ° צ' בכל 30 מהירויות הזרימה המואצת והאטה חוזרות ונשנות, תוך הפגנת שליטה מקומית בפעילות הנוזלים הפעילה עם הטמפרטורה. דמות זו הותאמה מ Bate ואח '.33. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שליטה על החומר הפעיל באתרו פותח את הדלת כדי לביים ארגון עצמי של חומר פעיל4,5,24,28,54. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש בטמפרטורה כדי לשלוט kinesin מונחה, MT מבוססי נוזלים פעילים באתרו, מבוסס על המאפיין arrhenius של המערכת29,30,31. מכיוון שהמערכת מבוססת על חלבונים, שמירה על פונקציונליות החלבונים במהלך הניסוי היא המפתח להחלת הפרוטוקול בהצלחה. החלבונים העיקריים במערכת הם MTs ו קינסין אשכולות. המקרה הראשון של הצבא מתחת לגיל 16 ° c ותקלה האחרונה מעל 36 ° c33. שמירה על טמפרטורת המערכת בין 16 ל-36 ° c חיונית אפוא לנוזלים פעילים כדי לפתח דינמיקה קבועה ולאפשר את התגובה שלהם לטמפרטורה הפיכה (איור 4 ואיור 5). עם זאת, הטמפרטורה נשלטת על בסיס אלגוריתם PID, אשר נוטה לירות יתר על טמפרטורת היעד53. כדי להקטין את הירי, אנו ממליצים להגדיר טמפרטורות יעד ביניים מרובות לפני הגדרת טמפרטורת היעד הסופית. לדוגמה, כדי לחמם את המדגם מטמפרטורת החדר (כ-20 ° c) עד 35 ° c, במקום לקבוע את טמפרטורת היעד ישירות ב-35 ° c, אנו ממליצים על טמפרטורת יעד ביניים של 30 ° צ' כדי להפחית את הסיכוי שהטמפרטורה עולה מעל 36 ° c, אשר הייתה מפחיתה את הנזקשב33חלבונים. באופן דומה, כאשר קירור המדגם מטמפרטורת החדר ל ~ 16 ° c, מומלץ לקבוע טמפרטורת יעד ביניים של 18 ° c, כי לפני שהגיע למצב קבוע, ה-PID עשוי לצנן את המדגם מתחת ל -16 ° c, לפזר את MTs33.

שיטת השליטה בטמפרטורה המוצגת מסתמכת על קירור וחימום באמצעות TEC. השימוש ב-TEC מבטיח כי המדגם מגיע לטמפרטורת היעד בתוך שניות, בעוד התקנה רגילה בקרת טמפרטורה באמצעות אמבט מים מבוקר טמפרטורה לוקח דקות כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה (איור 5)55. ה-TEC מייצר חום נטו שאינו אפס, אשר מתפוגג על ידי מערכת מחזור מים מאלומיניום פנימי. עם זאת, המים מאפשר עובש לצמוח, אשר בסופו של דבר לסתום את הערוץ56. ערוץ סתום מעכב את זרימת המים, והחום יצטבר בבלוק האלומיניום ובסופו של דבר נמס את צינורות המים. הצינורות נמס לגרום למים לשפוך על מיקרוסקופ ומצלמה, פגיעה במכשירים אלקטרוניים. לכן, כדי לאמץ את הגדרת בקרת הטמפרטורה המוצגת, מומלץ להוסיף 0.1% חמצן מימן למים כדי לעכב את הצמיחה עובש57,58,59. אנו מצפים כי צעד זה יבטיח כי ערוץ האלומיניום הפנימי יישאר ללא שסתום וימנע נזק למים למכשירים אלקטרוניים סמוכים.

מניפולציה את הטמפרטורה, ציפוי משטחי התא הזורם עם polyacrylamide, ו סינתזה נוזלים פעילים הם שלושה צעדים קריטיים כדי להבין את זה נוזל פעיל מבוקרת באתרו. עם זאת, ישור זה מוגבל לטווח טמפרטורות שבו חלבונים מעורבים יכולים לתפקד כרגיל. במערכת הנוזלים הפעילה, החלבונים העיקריים הם מערך MTs וקיסין אשכולות, הפועלים בדרך כלל בין 16 ל-36 ° c33. בטווח טמפרטורות זה, נוזלים פעילים משתנים מהירויות זרימה ממוצע שלהם מ-4-8 μm/s (איור 4ג). מהירויות משמעות מחוץ לטווח זה הן מעבר למגבלת שיטת הבקרה המוצגת. לעומת זאת, רוס ואח ' דיווח על חלופה המאפשרת פעילות הנוזלים הפעילה להיות מופעלת ומבוטלת באמצעות אור28. בקרת האור מאפשרת גם להפעיל נוזלים פעילים ב-50 יקרומטר סולם מוגדר בצורה אופטית. עם זאת, חלופה כזו דורשת שינוי מבנה הקינסין יחד עם כוונון שביל אופטי במיקרוסקופ. בהשוואה, היתרונות של אימוץ השיטה המוצגת במאמר זה הם 1) אין צורך לחדש את הנוזלים הפעילים, 2) מיקרוסקופ לא צריך להיות שונה, 3) ההתקנה בקרת הטמפרטורה היא בעלות נמוכה וקלה לשימוש, ו 4) השיטה מועבר למערכות תלויות אחרות בטמפרטורה כגון שיטת הגלישה29,30,31,32 או באופן כללי יותר מערכות מבוססות אנזימים60. אנו גם מצפים כי השיטה המוצגת תפתח את הדלת כדי לעצב מערכות microfluidic שבו זרימות הערוץ נשלטות באופן מקומי ללא שסתומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

פלאממיד K401-בH6-במק הייתה מתנה מדוקטור זוונמיר דוכולינ. מחקר זה נתמך על ידי קרן ההפעלה של ד ר קון-טה וו במכון הפוליטכני של ווסטר. אנו מודים לד ר זוונמיר דויד עבור הפרוטוקולים לטיהור ולטובולין תוויות ולסנתז נוזלים פעילים. אנו אסירי תודה לד ר מארק ריגילה על המומחיות שלו בביטוי חלבונים וטיהור. אנו מודים לד ר ויליאם בנימין רוג'ר על שעזר לנו בבניית הבמה הנשלטת על-ידי טמפרטורה. אנו מכירים את ברנדייס MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) לשימוש במתקן החומרים הביולוגיים (BMF). אנו מכירים את האגודה המלכותית לכימיה על התאמת הנתונים מ Bate ואח '. על חומר רך33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

הנדסה סוגיה 153 ביופיזיקה קינסין מיקרוכדורית נוזלים פעילים ארגון עצמי טמפרטורה משפט ארניוס
שליטה במהירויות זרימה של נוזלים פעילים תלת-ממדיים מבוססי מיקרוכדורית באמצעות טמפרטורה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter