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Engineering

तापमान का उपयोग करमाइक्रोट्यूबल-आधारित 3डी सक्रिय तरल पदार्थ की गति को नियंत्रित करना

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य तीन आयामी सक्रिय तरल पदार्थ ों के प्रवाह की गति को नियंत्रित करने के लिए तापमान का उपयोग करना है। इस विधि का लाभ न केवल सीटू में प्रवाह गति को विनियमित करने की अनुमति देता है बल्कि गतिशील नियंत्रण को भी सक्षम बनाता है, जैसे कि समय-समय पर ट्यूनिंग प्रवाह गति ऊपर और नीचे।

Abstract

हम किनेसिन-चालित, माइक्रोट्यूबबुल-आधारित त्रि-आयामी (3 डी) सक्रिय तरल पदार्थ ों के प्रवाह की गति को ट्यून करने के लिए तापमान का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि विभिन्न वांछित गति तक पहुंचने के लिए नए नमूनों का निर्माण करने की आवश्यकता के बिना सीटू में गति ट्यूनिंग के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, यह विधि गति के गतिशील नियंत्रण को सक्षम बनाती है। तापमान साइकिल चालन तरल पदार्थ तेजी से और धीमी गति से, समय-समय पर प्रवाह करने के लिए जाता है। यह नियंत्रणता किनेसिन-माइक्रोट्यूबबुल प्रतिक्रिया की एरेहेनियस विशेषता पर आधारित है, जो 4-8 माइक्रोन/एस की नियंत्रित औसत प्रवाह गति सीमा का प्रदर्शन करती है। प्रस्तुत विधि माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों के डिजाइन के लिए दरवाजा खोल देगी जहां चैनल में प्रवाह दर वाल्व की आवश्यकता के बिना स्थानीय रूप से tunable हैं।

Introduction

रासायनिक ऊर्जा को यांत्रिक कार्य में बदलने की क्षमता के कारण सक्रिय पदार्थ पारंपरिक निष्क्रिय पदार्थ से अलग होता है। ऐसी क्षमता रखने वाली सामग्री में जीवित या गैर-जीवित संस्थाएं शामिल हो सकती हैं जैसे बैक्टीरिया, कीड़े, कोलॉयड, अनाज और साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स1,2,3,4,5,6,7,8,9,10। ये भौतिक संस्थाएं अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत करती हैं। बड़े पैमाने पर, वे अशांत रूप से अशांत-जैसे वोर्टिस (सक्रिय अशांति) में आत्म-व्यवस्थित होते हैं या सामग्रीप्रवाह 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20। सक्रिय मामले के आत्म-संगठन की समझ ने आणविक शटल, ऑप्टिकल उपकरणों और समानांतर गणना21,22,23में विभिन्न अनुप्रयोगों का नेतृत्व किया है। अगले स्तर तक आवेदन लाने के लिए आत्म संगठन से परे नियंत्रण की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, पलासी एट अल ने एक हेमेट-समझाया हुआ कोलॉयड विकसित किया जो मैन्युअल रूप से नियंत्रित नीली रोशनी के संपर्क में आने पर ही स्वयं को प्रेरित करता है, जिसके कारण जीवित क्रिस्टल24का उद्भव हुआ। मोइन एट अल ने एक tunable बाहरी बिजली के क्षेत्र का उपयोग करके रोलिंग क्विंके कोलाइड्स के नियंत्रण की स्थापना की, जिसके परिणामस्वरूप एक रेसट्रैक जैसे चैनल25में कोलाइडल आते हैं। ये पिछले कार्य अनुप्रयोगों में स्थानीय नियंत्रण की भूमिका को प्रदर्शित करते हैं और सक्रिय मामले के ज्ञान आधार को आगे बढ़ाते हैं।

इस लेख में, हम किनेसिन-चालित, माइक्रोट्यूबबुल (एमटी) -आधारित 3डी सक्रिय तरल पदार्थ की नियंत्रणक्षमता पर ध्यान केंद्रित करते हैं। तरल पदार्थ ों में तीन मुख्य घटक होते हैं: एमटी, किनेसिन आणविक मोटर्स और कमी। कमी एमटी को बंडल करने के लिए एक कमी बल को प्रेरित करती है, जिसे बाद में मोटर समूहों द्वारा पाट दिया जाता है। ये मोटर्स प्लस एंड के साथ-साथ चलते हैं। जब ब्रिज्ड एमटीसिस एंटीसमान की एक जोड़ी, इसी मोटर्स विपरीत दिशाओं में चलते हैं । हालांकि, मोटर्स एक क्लस्टर में बंधे हुए हैं और अलग चलने में असमर्थ हैं, इसलिए वे सहकारी रूप से एमटी (इंटरफिलामेंट स्लाइडिंग, चित्रा 1ए)के जोड़े को स्लाइड करते हैं। ये स्लाइडिंग गतिशीलता जमा होती है, जिससे एमटीस्टो के बंडल उनके बकलिंग अस्थिरता बिंदु तक पहुंचने तक विस्तारित होते हैं और तोड़ते हैं (एक्सटेंसिल बंडल, चित्रा 1बी)26। टूटे हुए बंडलों को कमी बल द्वारा एनील किया जाता है, जो बाद में फिर से फैली हुई है, और गतिशीलता दोहराती है। दोहराने की गतिशीलता की प्रक्रिया के दौरान, बंडल आंदोलन पास के तरल को हिलाते हैं, प्रवाह को प्रेरित करते हैं जिन्हें माइक्रोन-स्केल ट्रेसर(चित्रा 1सी)के साथ डोपिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है। सांचेज एट अल और हेनकिन एट अल ने ट्रेसर्स की औसत गति की विशेषता है, यह पाते हुए कि एडेनोसाइन त्रिपोस्फेट (एटीपी), कमी, मोटर क्लस्टर और एमटीएस19,27की सांद्रता को अलग करके गति को असमर्थ किया गया था। हालांकि, इस तरह के ट्यूनेबिलिटी केवल सक्रिय द्रव संश्लेषण से पहले मौजूद थे। संश्लेषण के बाद, ट्यूनेबिलिटी खो गई थी, और तरल पदार्थ स्वयं अपने तरीके से आयोजित किया गया था। संश्लेषण के बाद सक्रिय द्रव गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए, Ross.et अल मोटर प्रोटीन के प्रकाश सक्रिय डामरीकरण का उपयोग करएक विधि की सूचना दी, जिससे तरल गतिविधि को प्रकाश28का उपयोग करके देखते और बंद करने की अनुमति दी गई। जबकि प्रकाश नियंत्रण स्थानीय रूप से तरल पदार्थ को सक्रिय करने के मामले में सुविधाजनक है, विधि मोटर प्रोटीन की संरचनाओं को फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता है, साथ ही एक माइक्रोस्कोप में ऑप्टिकल रास्तों को संशोधित करने के साथ । यहां, हम मोटर संरचना को बरकरार रखते हुए माइक्रोस्कोप संशोधन के बिना स्थानीय रूप से तरल पदार्थ प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए एक आसान उपयोग विधि प्रदान करते हैं।

स्थानीय स्तर पर सक्रिय द्रव प्रवाह ट्यूनिंग की हमारी विधि अर्हेनियस कानून पर आधारित है क्योंकि किनेसिन-एमटी प्रतिक्रिया में तापमान29, 30 ,31,32के साथ बढ़ने की सूचना मिली है । हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक सक्रिय तरल पदार्थ के प्रवाह की औसत गति की तापमान निर्भरता Arrhenius समीकरण के बाद: v = एक exp(-ईएक/आरटी),जहां एक पूर्व घातीय कारक है, आर गैस स्थिर है, ईएक सक्रियण ऊर्जा है, और टी प्रणाली तापमान३३है । इसलिए, तरल पदार्थ गतिविधि तापमान वातावरण के प्रति संवेदनशील है, और सिस्टम के तापमान को मोटर प्रदर्शन को स्थिर करने के लिए सुसंगत होने की आवश्यकता होती है, और नतीजतन, तरल पदार्थ प्रवाह गति34। इस लेख में, हम सिस्टम के तापमान को समायोजित करके सक्रिय तरल पदार्थों के प्रवाह की गति को लगातार ट्यून करने के लिए मोटर के तापमान निर्भरता के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। हम एक सक्रिय तरल पदार्थ के नमूने की तैयारी को भी प्रदर्शित करते हैं, जिसके बाद एक माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना बढ़ते हैं जिसका तापमान कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस से बढ़ाकर 36 डिग्री सेल्सियस करने से मतलब प्रवाह की गति 4 से 8 माइक्रोन/एस तक बढ़ जाती है। इसके अतिरिक्त, ट्यूनेबिलिटी उलटा है: तापमान में बार-बार वृद्धि और गिरावट से प्रवाह में तेजी आती है और गिरावट आती है। प्रदर्शित विधि प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है जहां मुख्य प्रतिक्रियाएं एरेहेनियस कानून का पालन करती हैं, जैसे एमटी ग्लाइडिंग परख29,30 ,31,32।

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Protocol

1. एमटी की तैयारी

सावधानी: इस चरण में हम गोजातीय मस्तिष्क के ऊतकों से ट्यूबलिन को शुद्ध करते हैं। गोजातीय मस्तिष्क संस्करण Creutzfeldt-जैकब रोग (vCJD)३५का कारण बन सकता है । इसलिए, मस्तिष्क अपशिष्ट और संबंधित समाधान, बोतलें और पिपेट युक्तियों को बायोवेस्ट बैग में एकत्र किया जाना चाहिए और संस्था के नियमों के अनुसार बायोखतरनाक अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाना चाहिए।

  1. गोजातीय मस्तिष्क से ट्यूबलिन को शुद्ध करें (कैस्ल्डी एट अल.36से संशोधित)।
    1. एक स्थानीय कसाईघर से एक विश्वविद्यालय के ठंडे कमरे में लगभग १.५ किलो ताजा गोजातीय दिमाग परिवहन । परिवहन के दौरान, बर्फ पर फॉस्फेट बफर (20 एमएम एनएएच2पीओ4,150 एमएम एनएसीएल, पीएच 7.2) में दिमाग स्टोर करें।
      नोट: ट्यूबलिन की अंतिम उपज को अधिकतम करने के लिए, ताजा मस्तिष्क के ऊतकों में कार्यात्मक ट्यूबलिन की प्रारंभिक मात्रा महत्वपूर्ण है। फ्रेशर दिमाग में अधिक कार्यात्मक ट्यूबलिन होते हैं। कसाईघर से सबसे ताजा दिमाग प्राप्त करने के लिए, हम कसाई पूछने के लिए सबसे हाल ही में बलि गायों से दिमाग प्रदान करने की सलाह देते हैं । प्रक्रिया शुरू करते समय दिमाग 3 एच से पुराना नहीं होना चाहिए, क्योंकि वध और प्रक्रिया शुरू के बीच समय को कम करने से बेहतर पैदावार होगी।
    2. मस्तिष्क को समरूप और स्पष्ट करें।
      1. रक्त वाहिकाओं और संयोजी ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटकर और उन्हें हाथ से मस्तिष्क से निकालने के लिए स्केलपेल का उपयोग करके मस्तिष्क को साफ करें।
        नोट: साफ दिमाग गुलाबी होना चाहिए।
      2. डीपॉलीमराइजेशन बफर (डीबी: 50 एमएम 2-(एन-मॉर्फोलिनिक एसिड, 1 एमएम सीएसीएल2,पीएच 6.6) प्रति किलोग्राम मस्तिष्क के 1 एल में साफ मस्तिष्क ऊतक विसर्जित करें।
      3. एक रसोई ब्लेंडर के साथ दिमाग को समरूप बनाना।
      4. 10,000 x ग्राम और 150 00 00 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समरूप मस्तिष्क समाधान को केंद्रीकृत किया जाए।
    3. पॉलीमरेज एमटी (पहला बहुलीकरण)।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस पर निम्नलिखित समाधानों की बराबर मात्रा के साथ अधिरत्न को इकट्ठा करें और मिलाएं: ग्लाइसेरोल, उच्च-मोलरिटी पाइप बफर (एचएमपीबी: 1 एम पाइप, 10 एमएम एमजीसीएल2,20 मीटर एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (-अमीनोहाइल ईथर) एन, एन एन',-टेट्रासिक एसिड [ईजीटीए], पीएच 6.9)
      2. मिश्रण में 1.5 एमएम एटीपी और 0.5 एमएम ग्वानोसिन ट्राइपोस्फेट (जीटीपी) जोड़ें।
      3. मिश्रण को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. एमटीएस (पहला एमटी डिपॉलीमराइजेशन) को डिपॉलीमरेज करें।
      1. पैलेट एमटी 30 मिन के लिए 151,000 x ग्राम और 37 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री द्वारा।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस डीबी के 10 मीटर में प्रत्येक एमटी गोली को छोड़ें और फिर से निलंबित करें।
      3. 30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
      4. मीट्रिक टन तलछट से बचने के लिए एक पिपेट टिप के साथ हर 5 मिन मिश्रण को उत्तेजित करें।
        नोट: मिश्रण 30 min में स्पष्ट हो जाना चाहिए, जो एमटी डिपॉलिमराइजेशन के पूरा होने का संकेत देता है।
    5. पॉलीमरेज एमटी (दूसरा एमटी पॉलीमराइजेशन)।
      1. 30 मिन के लिए 70,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री द्वारा समाधान स्पष्ट करें।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस ग्लाइसेरोल और एचएमपीबी के बराबर वॉल्यूम के साथ सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें और मिलाएं।
      3. मिश्रण में 1.5 एमएम एटीपी और 0.5 एमएम जीटीपी डालें।
      4. मिश्रण को 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. दोहराएं चरण 1.1.4, एचएमपीबी की जगह ब्रिंकले पुनर्असेंबली बफर (बीआरबी) 80 (80 एमएम पाइप, 1 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईटीए, पीएच 6.8) के साथ, इसके बाद 79,000 x ग्राम और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री द्वारा साफ मिश्रण को स्पष्ट किया।
    7. अधिस्थान लीजिए। स्पेक्ट्रोमीटर के साथ 280 एनएम अवशोषक को मापें। बीयर-लैम्बर्ट कानून (ट्यूबलिन के विलुप्त होने के गुणांक: 1.15 (मिलीग्राम/एमएल)-1सेमी-1)37,38का उपयोग करके ट्यूबलिन एकाग्रता निर्धारित करें।
    8. प्रोटीन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रीसायकल ट्यूबलिन (Castoldi एट अल36से संशोधित) ।
    नोट: ट्यूबलिन शुद्धता को बढ़ाने के लिए, शुद्ध ट्यूबलिन को फिर से बहुलीकृत और डिपॉलीमर किया जाता है।
    1. 500 माइक्रोएम डिथिओथ्रिटॉल (डीटीटी) और 20 माइक्रोन जीटीपी के साथ शुद्ध ट्यूबलिन (चरण 1.1.7) को मिलाकर एमटी को पॉलीमर करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन का इन्क्यूबेशन हुआ।
    2. एमटी को गोली।
      1. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे ग्लाइसेरोल कुशन (80 एमएम पाइप, 1 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईटीए, 60% v/v ग्लाइसेरोल, पीएच 6.8) का लोड 1 एमएल।
      2. तकिया के शीर्ष पर बहुलीकृत एमटी बिछाएं।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिन के लिए 172,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    3. एमटी को डिपॉलीमरेज करें।
      1. अधिसंचलक और तकिया निकालें।
      2. प्रत्येक मीट्रिक टन गोली को 4 डिग्री सेल्सियस मीट्रिक टन बफर (एम 2 बी: 80 मीटर पाइप, 2 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईसीटी, पीएच 6.8) के 150 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
      3. मिश्रण को बर्फ पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
      4. मिश्रण को हर 5 मिन में एक पिपेट टिप के साथ उत्तेजित करें। मिश्रण स्पष्ट हो जाना चाहिए।
    4. मिश्रण को 30 मिन के लिए 172,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित करके स्पष्ट करें।
    5. अधिस्थान लीजिए। प्रोटीन एकाग्रता को मापें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. फ्लोरोसेंट डाये39के साथ ट्यूबलिन लेबल ।
    1. एमटी को बहुलीकृत करें। 500 माइक्रोएम डीटीटी और 16.7 माइक्रोएम जीटीपी के साथ शुद्ध ट्यूबलिन (चरण 1.1.7) मिलाएं, और मिश्रण को 30 मीटर के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एमटी को गोली।
      1. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस हाई-पीएच कुशन (0.1 एम नाहेप्स, 1 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईसीटीए, 60% v/v ग्लाइसेरोल, पीएच 8.6) का 1 एमएल रखें।
      2. तकिया पर बहुलित एमटी बिछाएं।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिन के लिए 327,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    3. लेबल ट्यूबलिन।
      1. प्रत्येक एमटी पैलेट को 37 डिग्री सेल्सियस लेबलिंग बफर (0.1 एम नाहेप्स, 1 एमएम एमजीसीएल2,1 एमएम ईसीटी, 40% v/v ग्लाइसेरोल, पीएच 8.6) के 700 माइक्रोन के साथ फिर से निलंबित करें।
      2. एक संक्षिप्त ियद एस्टर के साथ कार्यात्मक दूर-लाल फ्लोरोसेंट रंग से 10-20 मोलर अतिरिक्त के साथ निलंबन मिलाएं।
      3. मिश्रण को अंधेरे में 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि एमटी फ्लोरोसेंट डाये के एस्टर के साथ प्रतिक्रिया कर सके।
      4. 50 एमएम कश्मीर-ग्लूटामेट के साथ निलंबित रंग के एस्टर को संतृप्त करके लेबलिंग प्रतिक्रिया को रोकें, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
    4. लेबल MTs गोलीबारी: दोहराने कदम १.३.२, कम पीएच तकिया (८० mM पाइप, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, ६०% v/v glycerol, पीएच ६.८) के साथ उच्च पीएच तकिया की जगह ।
    5. एमटीएस को डिपॉलीमरेज करें।
      1. अधिसंचलक और तकिया त्यागें।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस M2B के 700 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।
      3. बर्फ पर निलंबन को इनक्यूबेट।
      4. समाधान स्पष्ट होने तक एक पिपेट टिप के साथ हर 5 मिन को उत्तेजित करें।
    6. 35 मिन के लिए 184,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री द्वारा स्पष्ट समाधान स्पष्ट करें।
    7. 1.2.1-1.2.4 चरणों को दोहराकर लेबल ट्यूबलिन समाधान की शुद्धता बढ़ाएं।
    8. प्रोटीन और फ्लोरोसेंट डाइट की एकाग्रता को मापें। ट्यूबलिन एकाग्रता और लेबल ट्यूबलिन के अंशों को निर्धारित करने के लिए इन मापों का उपयोग करें, जो ट्यूबलिन के लिए फ्लोरोसेंट रंग की सांद्रता के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है।
    9. लेबल वाले ट्यूबलिन सॉल्यूशन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एमटीएस को बहुलित करें (सांचेज एट अल19से अपनाया गया):
    1. एक अनुपात है कि एक 3% ट्यूबलिन अंश लेबल पैदावार में लेबल ट्यूबलिन (चरण 1.3.9) के साथ पुनर्नवीनीकरण ट्यूबलिन (चरण 1.2.5) मिलाएं।
    2. 8 मिलीग्राम/mL ट्यूबलिन मिश्रण को 1 एमएम डीटीटी और 0.6 एमएम ग्वानोसिन-5'[(α, - मिथिलिनो] ट्राइफॉस्फेट (जीएमपीसीपीपी) के साथ मिलाएं, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन का इन्क्यूबेशन करें।
    3. ऊष्मायन के बाद, 6 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर एमटी एनियल।
    4. अलीकोट और स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर।

2. संश्लेषण किनेसिन समूह

नोट: बैक्टीरिया सर्वव्यापी रूप से मौजूद हैं और मीडिया में बढ़ सकते हैं और तैयारी की प्रक्रिया को दूषित कर सकते हैं। संदूषण को रोकने के लिए, कोशिका संस्कृतियों (जैसे, पाइपटिंग) के साथ संपर्क से जुड़े कार्यों को एक लौ के पास किया जाना चाहिए। फ्लास्क, पिपेट, पिपेट टिप्स, मीडिया और प्लेट्स जैसे उपकरणों को उपयोग से पहले स्वचालित किया जाना चाहिए।

  1. एस्चेरिचिया कोलाई40में एक्सप्रेस किनेसिन मोटर्स ।
    1. कोशिकाओं को बदलें।
      1. सक्षम कोशिकाओं के 10 माइक्रोन में K401-BCCP-H6 प्लाज्मिड के पिपेट 1 μL।
      2. 5 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
      3. 45 एस के लिए 42.5 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी का झटका।
      4. वसूली की अनुमति देने के लिए 2 मिन के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      5. एंटीबायोटिक मुक्त 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L खमीर निकालने, 16 ग्राम/एल ट्राइप्टोन) के ३०० μL के साथ कोशिकाओं को मिलाएं ।
      6. कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: जब तक निर्दिष्ट नहीं, ऊष्मायन के दौरान सेल विकास की निगरानी की आवश्यकता नहीं है।
    2. टीका प्लेट मीडिया।
      1. सेल कल्चर को 2XYT प्लेट (10 जी/एल एनसीएल, 5 जी/एल येस्ट एक्सट्रैक्ट, 10 जी/एल ट्राइप्टोन, 15 जी/एल एगर, १०० μg/mL ampicillin, 25 μg/mL क्लोरम्फेनिकोल) पर फैलाएं ।
      2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को उल्टा इनक्यूबेट करें।
    3. तरल मीडिया को टीका लगाया।
      1. रात भर की थाली से, एक पिपेट टिप के साथ एक अलग कॉलोनी फसल।
      2. टिप को 2XYT के 50 mL वाले फ्लास्क में निकालें।
      3. इनक्यूबेट और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर संस्कृति मीडिया हिला।
    4. कोशिकाओं का विस्तार करें।
      1. 2XYT के 500 मिलील में सेल संस्कृति के 2.5 मिलील मिलाएं।
      2. इनक्यूबेट और 3-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर 500 मीटर संस्कृति हिला।
    5. प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करते हैं।
      1. ऊष्मायन के दौरान, संदर्भ के रूप में 2XYT का उपयोग करके, 600 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा सेल विकास की निगरानी करें। हर 60 मिन को अवशोषित करें, जब तक कि यह ओडी600 = 0.3 तक न पहुंच जाता है। फिर हर 30 सीन को अवशोषित करें जब तक यह 0.5-0.6 तक न पहुंच जाता।
      2. कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि अवशोषक ओडी600 = 0.5-0.6 तक न पहुंच जाता है
      3. सेल कल्चर में 24 माइक्रोजी/एमएल बायोटिन और 1 एमएम आइसोप्रोपिल-डी-1-थिओगलकटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़ें ।
        नोट: आईपीटीजी का उपयोग किनेसिन मोटर्स की प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, जिसे बायोटिन कार्बोसिल कैरियर प्रोटीन (बीसीपी) और छह हिस्टिडीन (एच6) के साथ टैग किया जाता है। H6 टैग शुद्धिकरण प्रक्रिया (चरण 2.2) में प्रयोग किया जाता है, जबकि बीसीपी व्यक्त किनेसिन मोटर्स को बायोटिनेट करने के लिए अतिरिक्त बायोटिन अणुओं से बांधता है।
      4. इनक्यूबेट और 12-20 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर सेल कल्चर हिलाएं।
    6. 10 000 x ग्राम और 10 00 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित करके कोशिकाओं को काटें। सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. किनेसिन मोटर प्रोटीन को शुद्ध करें (Spriestersbach एट अल.41से संशोधित):
    1. लेसिस बफर (50 मीटर पाइप) की बराबर मात्रा के साथ सेल पैलेट (चरण 2.1.6) को निलंबित करें, 4 एमएम एमजीसीएल2,50 माइक्रोएम एटीपी, 10 एमएम 2-मर्काप्टोथेनॉल (एमईएम), 20 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.2), इसके बाद प्रोटीज अवरोधक का एक टैबलेट, 2 मिलीग्राम फिनाइलमेथाइल सल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ), और 2 मिलीग्राम लिसोज़िमे।
    2. तरल नाइट्रोजन (एलएन) 3x में फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा कोशिकाओं को लायसे और सेल मिश्रण को विगलन करें।
      नोट: लाइसेइंग के बाद, मिश्रण चिपचिपा हो जाना चाहिए।
    3. लाइसेड सेल मिश्रण को 30 मिन के लिए 230,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री बनाकर स्पष्ट करें।
    4. अधिनेता को एकत्र करें और इसे गुरुत्वाकर्षण स्तंभ के माध्यम से प्रवाहित करें, इसके बाद कॉलम को लिसिस बफर के 10 मिलील से धोना।
      नोट: एक H6 टैग के साथ प्रोटीन, जैसे किनेसिन K401-BCCP-H6, कॉलम में रहना चाहिए ।
    5. एल्यूट बफर (50 एमएम पाइप, 4 एमएम एमजीसीएल2,50 माइक्रोएम एटीपी, 500 एमएम इमिडाजोल, पीएच 7.2) के साथ टैग किए गए प्रोटीन का उत्सर्जन करते हैं। प्रवाह के माध्यम से क्रमिक रूप से 1 एमएल अंशों में ले लीजिए। प्रोटीन युक्त अंशों को निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक अंश के 3 माइक्रोन को त्रिफेनाइलमीथेन डाये के 100 माइक्रोन के साथ मिलाएं। प्रोटीन युक्त अंश नीले रंग की बारी चाहिए। इन अंशों को मिलाकर 5x से पतला करें।
    6. प्रोटीन समाधान को केंद्रित करें।
      1. एक अपकेंद्रित्र फिल्टर ट्यूब में समाधान लोड करें।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
      3. ट्यूब को धीरे से हिलाएं और फिर से अपकेंद्री न डालें जब तक कि समाधान की मात्रा <3 mL न हो जाए।
    7. एक स्पेक्ट्रोमीटर (विलुप्त होने गुणांक: 0.549 (मिलीग्राम/mL)-1सेमी-1)42,43के साथ प्रोटीन एकाग्रता को मापें। प्रोटीन को 35% w/v सुक्रोज जोड़ते हुए 1 मिलीग्राम/मीटर तक पतला करें।
    8. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल (टेलर एट अल44से संशोधित) के साथ किनेसिन सांद्रता को मापें।
    नोट: इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल के साथ किनेसिन एकाग्रता को मापने के लिए, ट्यूबलिन एक आदर्श एकाग्रता सीढ़ी है क्योंकि इसकी उच्च शुद्धता और स्पेक्ट्रोमीटर के माध्यम से इसकी औसत दर्जे की एकाग्रता(चित्रा 2ए)36।
    1. 0.25, 0.5, 0.75, 1.00 और 1.25 मिलीग्राम/mL की सांद्रता के साथ ट्यूबलिन नमूने तैयार करें। प्रत्येक ट्यूबलिन नमूना और किनेसिन नमूना (चरण 2.2.8) के 15 माइक्रोन अलग-अलग नमूना बफर (200 मीटर ट्रिस-एचसीएल, 8% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 400 मीटर डीटीटी, 0.2% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 40% ग्लाइसेरोल, पीएच 6.8) और इनक्यूबेट के 15 माइक्रोन मिलाएं।
    2. इलेक्ट्रोफोरेसिस तैयार करें।
      1. एक इलेक्ट्रोफोरेसिस जेल को जेल बॉक्स में लॉक करें।
      2. बॉक्स को रनिंग बफर (50 एमएम एमओपीएस, 50 एमएम ट्रिस बेस, 0.1% एसडीएस, 1 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्रेटिक एसिड (ईटीए), पीएच 7.7) के साथ भरें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि बफर स्तर जेल के शीर्ष उद्घाटन से ऊपर है।
    3. प्रोटीन मानक सीढ़ी, ट्यूबलिन नमूने, और किनेसिन नमूने के 10 μL को अलग कुओं में लोड करें और 45 मिन के लिए जेल के पार 200 वी लागू करें।
    4. जेल धुंधला।
      1. इनक्यूबेट और रॉक जेल को उबला हुआ (लगभग 95 डिग्री सेल्सियस) दाग समाधान ए (0.5 ग्राम/एल ट्रिप्फेनाइलेथेन डाइ, 10% v/v एसीटिक एसिड, 25% आइसोप्रोपेनॉल) 5 मिन के लिए, फिर जेल को डिओनाइज्ड (डीआई) पानी से कुल्ला करें।
      2. दाग समाधान बी (०.०५ ग्राम/एल त्रिफेनिलमीथेन डाये, 10% v/v एसीटिक एसिड, 10% आइसोप्रोपेनॉल), सी (०.०२ ग्राम/एल ट्रिप्फेनाइलेथेन डाये, 10% v/v एसीटिक एसिड), और डी (10% v/v acetic एसिड), क्रमिक रूप से दोहराएं । इनक्यूबेट और रात भर DI पानी में जेल रॉक।
    5. जेल को स्कैन करें। जेल छवि को ग्रेस्केल छवि में परिवर्तित करें, जिसके बाद काले और सफेद उलटा और काले पृष्ठभूमि में उज्ज्वल प्रोटीन बैंड प्रकट करने के लिए कंट्रास्ट वृद्धि होती है।
    6. पिक्सेल मूल्यों को संक्षेप करके प्रत्येक बैंड की चमक को मापें। रैखिक फिट सी = एबी + बीलागू करें, जहां बी एक ट्यूबलिन बैंड की चमक है, सी इसी एकाग्रता है, और ए और बी फिटिंग पैरामीटर हैं। रैखिक समीकरण की गणना करने के लिए किनेसिन बैंड बीके की चमक का उपयोग करके किनेसिन सीके की एकाग्रता निर्धारित करें: सीके = एबीके + बी।
  4. किनेसिन मोटर्स क्लस्टर।
    1. 1.5 माइक्रोन किनेसिन (चरण 2.2.8) को 120 माइक्रोन डीटीटी और 120 एनएम स्ट्रेप्टाविडिन के साथ मिलाएं। 30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. पॉलीएक्रिलैमाइड-कोटेड ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप तैयार करें (लाउ एट अलसेसंशोधित)

  1. इसी कंटेनर में नई ग्लास स्लाइड और ग्लास कवरस्लिप लोड करें। स्लाइड्स और कवरस्लिप को डीआई वॉटर में 1% v/v डिटर्जेंट में जलमग्न करें और फिर पानी को माइक्रोवेव में उबाल लें ।
  2. 5 मिन के लिए स्लाइड और कवरस्लिप और फिर डिटर्जेंट को हटाने के लिए डीआई पानी से कुल्ला करें।
  3. 5 मिन के लिए इथेनॉल में जलमग्न और सोनिकेट और कवरस्लिप। DI पानी से कुल्ला करें।
  4. 5 मिन के लिए 100 मीटर पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) में स्लाइड और कवरस्लिप को जलमग्न और कवरस्लिप में जलमग्न और समेटना। DI पानी के साथ कुल्ला।
  5. स्लाइड्स में इनक्यूबेट और कवरस्लिप को साइलेन सॉल्यूशन (1% एसिटिक एसिड और 0.5% 3-(ट्राइमेथॉक्सीसिल) प्रोपिल मेथक्रिलेट इन इथेनॉल में) 15 मिन के लिए और फिर डीआई वॉटर के साथ कुल्ला करें।
  6. स्लाइड्स और आक्रिलैमाइड समाधान (2% w/w एक्रिलैमाइड, 0.7 मिलीग्राम/एमएल अमोनियम persulfate, और 0.0035% v/v tetramethylethylenediamine में 3 घंटे के लिए) में स्लाइड और कवरस्लिप इनक्यूबेट ।
  7. स्लाइड्स और कवरस्लिप को एक्रिलैमाइड सॉल्यूशन में स्टोर करें।

4. किनेसिन-चालित, एमटी-आधारित सक्रिय तरल पदार्थ तैयार करें

  1. सक्रिय तरल पदार्थ तैयार करें (सांचेज एट अल19से संशोधित)।
    नोट: निम्नलिखित कदम उदाहरण स्टॉक का उपयोग करके सक्रिय तरल पदार्थ के 100 माइक्रोन तैयार करने की प्रक्रिया प्रदर्शित करते हैं। अंतिम मात्रा स्केलेबल है, और उदाहरण स्टॉक की सांद्रता को तब तक समायोजित किया जा सकता है जब तक कि प्रत्येक घटक की अंतिम एकाग्रता बनाए रखी जाती है।
    1. 1.8 माइक्रोन किनेसिन मोटर क्लस्टर (चरण 2.4.2) के 6.7 माइक्रोन के साथ 8 मिलीग्राम/एमएल एमटी (चरण 1.4.4) के 16.7 माइक्रोन मिलाएं और उच्च नमक M2B (M2B + 3.9 mMMgCl2)में 500 मीटर डीटीटी का 1.1 माइक्रोन।
    2. 7% w/w पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के 11.4 माइक्रोन जोड़कर बंडल एमटी।
    3. 50 एमएम एटीपी के 2.8 माइक्रोन जोड़कर किनेसिन मोटर्स को सक्रिय करें।
    4. स्टॉक पायरुवेट किनेज/लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (पीके/एलडीएच) के 2.8 माइक्रोन जोड़कर एटीपी सांद्रता बनाए रखें और 200 मीटर फॉस्फेनोल पायरुवेट (पीईपी) के 13.3 माइक्रोन लंकेश।
    5. 20 एमएम ट्रॉलोक्स के 10 माइक्रोन, 3.5 मिलीग्राम/एमएल कैटालास के 1.1 माइक्रोन, 20 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस के 1.1 माइक्रोन और 300 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज के 1.1 माइक्रोन जोड़कर फोटोब्लीचिंग प्रभाव को कम करें।
    6. 0.025% v/v ट्रेसर कणों के 1.6 माइक्रोन जोड़कर तरल पदार्थ की गति को ट्रैक करें।
    7. 100 माइक्रोन की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए उच्च नमक M2B जोड़ें।
      नोट: चरण 4.1.1-4.1.6 में मिश्रण आदेश विनिमेय हैं। हालांकि, एक बार एटीपी, एमटीऔर मोटर्स मिला-जुला होने के बाद मोटर्स एमटीके साथ कदम रखते हुए एटीपी की खपत शुरू कर देते हैं। नमूना सीमित ईंधन (एटीपी और पीईपी) के कारण एक परिमित जीवनकाल के साथ सक्रिय है, इसलिए प्रयोग तुरंत शुरू किया जाना चाहिए। अंतिम सक्रिय तरल पदार्थ में 1.3 मिलीग्राम/एमएल मीट्रिक टन, 120 एनएम किनेसिन मोटर क्लस्टर, 5.5 एमएम डीटीटी होना चाहिए, 0.8% w/w खूंटी, 1.4 एमएम एटीपी, 2.8% v/v पीके/एलडीएच, 27 एमएम पीईपी, 2 एमएम ट्रॉलोक्स, 0.038 मिलीग्राम/एमएल कैटालास, 0.22 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस, 3.3 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज, और उच्च-नमक में 0.0004% v/v कोलाइड
  2. एक प्रवाह चैनल में एक नमूना तैयार करें (चंद्राकर एट अल46से संशोधित):
    1. डीआई पानी के साथ पॉलीएक्रिलैमाइड-कोटेड ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप (चरण 3.7) कुल्ला करें। दबाव वाली हवा के साथ चश्मा सुखालें। एक साफ, सपाट सतह पर रखें।
    2. 3 मिमी चौड़ाई वाली मोम फिल्मों की दो स्ट्रिप्स काटें और ग्लास कवरस्लिप (20 मिमी) के समान लंबाई। स्लाइड और चैनल स्पेसर्स के रूप में कवरस्लिप के बीच स्ट्रिप्स डालें।
    3. मोम को पिघलाने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस हॉट प्लेट पर ग्लास-वैक्स कॉम्प्लेक्स रखकर वैक्स फिल्म में ग्लास का पालन करें। पिघलने के दौरान, कांच की सतहों के लिए मोम फिल्म का समान रूप से पालन करने के लिए एक पिपेट टिप के साथ धीरे से कवरस्लिप दबाएं। आसंजन के बाद, कांच के परिसर को कमरे के तापमान में ठंडा करें।
    4. प्रवाह चैनल पर सक्रिय तरल पदार्थ (चरण 4.1) लोड करें। यूवी गोंद के साथ चैनल सील।

5. नमूना तापमान को नियंत्रित करें

  1. एक तापमान नियंत्रण सेटअप बनाएं (लोवेनसोहन एट अल और वू एट अल में डिजाइनों से संशोधित।47,48,49)।
    1. एल्यूमीनियम कूलिंग ब्लॉक तैयार करें।
      1. लगभग 30 मिमी × 30 मिमी × 5 मिमी के आयामों के साथ एक एल्यूमीनियम प्लेट मिल।
      2. प्लेट(चित्रा 3ए)के माध्यम से एक आंतरिक चैनल ड्रिल करें और चैनल के सिरों पर नली फिटिंग स्थापित करें।
      3. एक पानी ट्यूब के लिए प्रत्येक फिटिंग हुक।
      4. जलाशय में दूसरी ट्यूब का विस्तार करते हुए एक ट्यूब को पानी के जलाशय में मछली टैंक पंप से जोड़ें।
        नोट: पंप लगभग कमरे के तापमान पर ब्लॉक तापमान बनाए रखने के लिए एल्यूमीनियम आंतरिक चैनलों के माध्यम से जलाशय पानी प्रसारित करेगा ।
    2. एक थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर (TEC) और एक तापमान नियंत्रक के लिए एक थर्मोसेंसर तार। यूएसबी पोर्ट(चित्रा 3बी)का उपयोग करके नियंत्रक को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    3. तापमान नियंत्रक को सीधे वर्तमान (डीसी) बिजली आपूर्ति के लिए तार करें। एक विद्युत आउटलेट के लिए बिजली की आपूर्ति को प्लग करके नियंत्रक चालू करें।
    4. नियंत्रक निर्माता गाइड के बाद टीईसी के प्रारंभिक सेट अप करें। टीईसी आउटपुट का परीक्षण करलें। निर्माता-प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के माध्यम से तापमान नियंत्रक को नियंत्रित करने की सिफारिश की जाती है, जिससे थर्मोसेंसर डेटा रिकॉर्डिंग और तापमान नियंत्रक के आसान हेरफेर की अनुमति होती है।
    5. टीईसी के हीटिंग और कूलिंग साइड्स की पहचान करें।
    6. थर्मल पेस्ट का उपयोग करके कूलिंग ब्लॉक (चरण 5.1.1) पर टीईसी के कूलिंग साइड को संलग्न करें।
    7. थर्मल पेस्ट का उपयोग करके टीईसी के हीटिंग साइड में नीलम डिस्क संलग्न करें।
    8. सेटअप पूरा हो गया है। नीलम की सतह और थर्मोसेंसर अपने तापमान और लक्ष्य तापमान के आधार पर नमूने को ठंडा और गर्म करने के लिए एक नमूने से संपर्क कर सकते हैं।
      नोट: यह सिफारिश की जाती है कि टीईसी और कूलिंग ब्लॉक में उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3सी)का उपयोग करके नमूनों को इमेजिंग करने के लिए एक गठबंधन केंद्रीय छेद है।
  2. नमूना तापमान33को नियंत्रित करने के लिए तापमान नियंत्रण सेटअप का उपयोग करें।
    1. नमूना सेटअप करने के लिए माउंट।
      1. सतह से संपर्क करने वाली स्लाइड साइड के साथ नीलम की सतह पर सक्रिय तरल पदार्थ का नमूना (चरण 4.2.4) रखें।
      2. पेपर टेप के साथ ग्लास स्लाइड सुरक्षित करें।
      3. तार्मससेंसर को कॉपर टेप का उपयोग करके कवरस्लिप सतह पर संलग्न करें।
    2. उद्देश्यों की ओर सामना कर रहे कवरस्लिप पक्ष के साथ एक माइक्रोस्कोप चरण पर सेटअप माउंट। उदाहरण के लिए, उल्टे माइक्रोस्कोप पर, कवरस्लिप साइड को नीचे का सामना करना चाहिए। यदि लागू हो तो पेपर टेप और माइक्रोस्कोप स्टेज सुई क्लैंप के साथ सेटअप सुरक्षित करें।
      नोट: प्रस्तुत तापमान चरण आम माइक्रोस्कोप के साथ काम करना चाहिए जो या तो उल्टे या ईमानदार हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग के दौरान तापमान चरण स्थानांतरित न किया जाए, टेप के साथ माइक्रोस्कोप चरण में तापमान चरण को सुरक्षित करना सबसे अच्छा है।
    3. सैंपल तापमान को नियंत्रित करें।
      1. तापमान नियंत्रक और मछली टैंक पंप चालू करें।
      2. लक्ष्य तापमान निर्धारित करने और तापमान नियंत्रण सक्षम करने के लिए निर्माता के गाइड का पालन करें। नियंत्रक थर्मोसेंसर द्वारा मूल्यांकन के अनुसार लक्ष्य तापमान और नमूना तापमान के आधार पर हीटिंग या कूलिंग पावर को समायोजित करेगा।
    4. रिकॉर्ड नमूना तापमान।
      1. प्रयोग के दौरान थर्मोसेंसर तापमान डेटा रिकॉर्ड करने के लिए निर्माता की गाइड का पालन करें।
        नोट: नमूना तापमान अब नियंत्रक द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए और कंप्यूटर द्वारा दर्ज की गई(चित्रा 3डी)।

6. सक्रिय द्रव गतिविधि की विशेषता (हेनकिन एट अल और वू एट अल द्वारा तरीकों से संशोधित20,27)

नोट: पिछले वर्गों का उपयोग सक्रिय तरल पदार्थ के नमूने (धारा 1-4) तैयार करने और उनके तापमान (धारा 5) को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। सक्रिय तरल पदार्थ गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए तापमान के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, तरल पदार्थ व्यवहार का निरीक्षण करने, उनकी गतिविधियों का विश्लेषण करें, और तापमान के प्रति उनकी प्रतिक्रिया की विशेषता है।

  1. ट्रेसर की निगरानी करते हैं।
    1. ट्रेसर कणों के आंदोलन को पकड़ने के लिए ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) फ्लोरेसेंसका उपयोग करके लगातार अंतराल के साथ नमूना देखें।
      नोट: ट्रेसर आंदोलन को ट्रैक करने की अनुमति देने के लिएटी को चुना जाना चाहिए। 100 एस जैसे बड़ेटी मान, ट्रेसर प्रक्षेप पथ खोने में परिणाम देते हैं, जबकि 0.1 एस जैसे छोटेमूल्य, ट्रैकिंग एल्गोरिदम को फ्रेम के बीच ट्रेसर आंदोलन का पता लगाने से रोकते हैं। एक कामकाजीटी को फ्रेम के बीच ट्रेसर विस्थापन को ~ 9 पिक्सल के भीतर होने की अनुमति देनी चाहिए। इमेजिंग ट्रेसर के लिए 4x उद्देश्य का उपयोग करके 10 माइक्रोन/एस पर जाने के लिए,टी 1-5 एस होने की सिफारिश की जाती है।
    2. छवियों को झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजें, फ्रेम नंबर के आधार पर फ़ाइलों का नाम दें, और उन्हें एक अलग फ़ोल्डर में स्टोर करें। ये प्रक्रियाएं यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं कि अधिग्रहीत छवियों का सही ढंग से सुनिश्चित किया गया है (चरण 6.2.2)।
  2. Ouellette एट अल.50,51द्वारा विकसित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर को अपनाने वाले ट्रैक ट्रेसर):
    1. पर्यावरण जटिलता प्रयोगशाला, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml) से ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक MATLAB फ़ाइल एक ही फ़ोल्डर में है।
    2. एक कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग कर ट्रेसर ट्रैक: particle_tracking स्क्रिप्ट ट्रेसर छवियों (चरण 6.1) पढ़ता है और Ouellette एट अल50,51के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्रेसर आंदोलन पटरियों. यह दो फ़ाइलों को आउटपुट करता है: 1) पृष्ठभूमि.टिफ, छवि पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है, और 2) ट्रैकिंग.चटाई, जिसमें प्रत्येक फ्रेम में कण प्रक्षेप पथ और वेग(चित्र4ए)होते हैं।
  3. एक कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग कर ट्रेसर मतलब गति का विश्लेषण: analysis.m स्क्रिप्ट ट्रैकिंग फ़ाइल (Tracking.mat) पढ़ता है और एक समय के साथ-साथ निर्दिष्ट औसत खिड़कियों(चित्रा 4बी)३३के साथ एक समय औसत मतलब गति के साथ, ट्रेसर बनाम समय की औसत गति आउटपुट ।
  4. समय-औसत औसत गति रिकॉर्ड करें।
  5. प्रयोग (चरण 4, 5.2 और 6.1-6.4) को 10-40 डिग्री सेल्सियस पर दोहराकर समय-औसत औसत औसत गति को मापें। तापमान बनाम मतलब गति साजिश करने के लिए दर्ज की गई मतलब गति का उपयोग करें(चित्र4सी)33।

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Representative Results

किनेसिन-चालित, एमटी आधारित सक्रिय तरल पदार्थ तैयार करने के लिए किनेसिन और एमटी दोनों की आवश्यकता होती है। एमटी को लेबल किए गए ट्यूबलिन (चरण 1.3 और 1.4) से बहुलीकृत किया गया था जिन्हें गोजातीय दिमाग (चरण 1.1, चित्रा 2ए)से शुद्ध किया गया था, जिसके बाद शुद्धता बढ़ाने के लिए रीसाइक्लिंग (चरण 1.2, चित्रा 2बी)। किनेसिन मोटर प्रोटीन में व्यक्त किया गया और ई. कोलाई से शुद्ध (कदम २.१ और २.२, चित्रा 2बी)४१,५२। तैयार किनेसिन स्टॉक की एकाग्रता को ज्ञात सांद्रता (चरण 2.3, चित्रा 2बी इनसेट)के साथ पुनर्नवीनीकरण ट्यूबलिन के साथ मुख्य बैंड चमक की तुलना करके एक एसडीएस जेल के साथ मापा गया था। ट्यूबलिन बैंड(बी)की चमक मूल्य समीकरण सी = एबी + ε का उपयोग करके उनकी इसी एकाग्रता(सी)के लिए फिट थे, जो = 3.1 × 10-2 मिलीग्राम/एमएल और ε = 8.7 × 10-4 मिलीग्राम/एमएल(चित्रा 2सी)का उपयोग कर रहे थे। फिट समीकरण मापा बैंड चमक, बीके = 1,060 लागू करके एक kinesin बैंड की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, सीके = 0.95 मिलीग्राम/ ज्ञात सांद्रता के साथ मीट्रिक टन और kinesin नमूनों का उपयोग सक्रिय तरल पदार्थ के नमूने तैयार करने के लिए किया जाता था। सक्रिय तरल पदार्थ संश्लेषित किए गए थे, जो पॉलीएक्रिलामाइड-कोटेड प्रवाह कोशिका में भरे हुए थे, और सेल को यूवी गोंद (सेक्शन 3 और 4)46के साथ सील कर दिया गया था।

तापमान के साथ सक्रिय तरल पदार्थ गतिविधि के नियंत्रण को प्रदर्शित करने के लिए, सक्रिय तरल पदार्थ का नमूना घर का बना तापमान चरण (चरण 5.2, चित्रा 3ए-सी)पर रखा गया था। नमूना तापमान की निगरानी की और एक आनुपातिक अभिन्न व्युत्पन्न (PID) एल्गोरिथ्म५३के अनुसार नियंत्रक द्वारा नियंत्रित किया गया था । 10 डिग्री सेल्सियस, 20 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रित नमूनों में 4 घंटे के लिए 0.1-0.3 डिग्री सेल्सियस के भीतर तापमान में उतार-चढ़ाव दिखाई दिया, इस तापमान नियंत्रण सेटअप की स्थिरता और विश्वसनीयता का प्रदर्शन(चित्रा 3डी)।

नमूने का निरीक्षण करने के लिए, सेटअप एक एपीफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर रखा गया था । नमूना एलेक्सा ४८८ लेबल ट्रेसर, जो एक GFP चैनल (चरण ६.१) के माध्यम से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ छवि थे के साथ doped था । ट्रेसर हर एकटी = 2 एस छवि थे। अनुक्रमिक छवियों ट्रेसर प्रक्षेप पथ आरमैं,जहां मैं ट्रेसर सूचकांक का प्रतिनिधित्व करता है ट्रैकिंग के लिए अनुमति दी (कदम 6.2, चित्र4ए)। प्रक्षेप पथ एक मतलब गति v(टी)का पता चला ; आरआई(टी)-आर आई(टी-टी)।/टी एंड जीटी;आई (स्टेप ६.३) । 20-36 डिग्री सेल्सियस पर मापा गया औसत गति टी = 0-2 घंटे में लगभग समय-स्वतंत्र दिखाई दिया, जबकि 10 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस पर मतलब गति जल्दी क्षय हो गई(चित्र4बी)। 10 डिग्री सेल्सियस पर क्षय 16 डिग्री सेल्सियस से नीचे एमटी डिपॉलिमराइजेशन के कारण हुआ था। 40 डिग्री सेल्सियस पर क्षय 36 डिग्री सेल्सियस से ऊपर खराब होने वाले किनेसिन क्लस्टरों के कारण हुआ। हमारे पिछले अध्ययनों के अनुसार ये किनेसिन मोटर क्लस्टर 36 डिग्री सेल्सियस33पर प्रीइनक्यूमिनेशन के बाद एमटी के जोड़े को चलाने की क्षमता खो देते हैं। इन कारकों द्वारा प्रेरित क्षय को प्रतिबिंबित करते हुए प्रत्येक तापमान के लिए औसत गति की विशेषता के लिए, औसत गति टी = 1-2 घंटे (चरण 6.3 और 6.4)33के बीच औसत थी। समय-औसत औसत गति 10 डिग्री सेल्सियस-40 डिग्री सेल्सियस (चरण 6.5, चित्रा 4सी)के बीच मापा गया था। 16 डिग्री सेल्सियस से नीचे और 36 डिग्री सेल्सियस से ऊपर एमटी डिपॉलिमराइजेशन और खराब किनेसिन क्लस्टर33के कारण औसत गति जल्दी सड़ गई, जबकि 16 डिग्री सेल्सियस से 36 डिग्री सेल्सियस तक तापमान बढ़ने से औसत गति 4 से 8 माइक्रोग्राम/एस तक त्वरित हो गई, जिससे तापमान का उपयोग करके सक्रिय तरल प्रवाह की औसत गति को ट्यूनिंग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन हुआ। तापमान नियंत्रण की क्षमता को और प्रदर्शित करने के लिए, सिस्टम तापमान को हर 30 न्यूनतम 20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच वैकल्पिक किया गया था। सक्रिय तरल पदार्थों की औसत गति ने न केवल तदनुसार तेजी और गिरावट की, बल्कि उन्होंने 10 एस(चित्रा 5)के भीतर तापमान परिवर्तन का भी जवाब दिया। सक्रिय तरल पदार्थ की ऐसी प्रतिवर्ती और त्वरित प्रतिक्रिया तरल पदार्थ गतिविधियों को गतिशील रूप से नियंत्रित करने के लिए तापमान का उपयोग करने की कार्यक्षमता को दर्शाती है।

Figure 1
चित्रा 1: किनेसिन-चालित, एमटी-आधारित 3डी सक्रिय तरल पदार्थ का परिचय। (A)इंटरफिलामेंट स्लाइडिंग की योजनाबद्ध। एंटीसमान एमटी के जोड़े को कमी से बंडल किया गया और मोटर समूहों द्वारा अलग किया गया। (ख)मोटर समूहों ने सामूहिक रूप से एमटी के जोड़े को खदेड़ दिया, जिससे एमटी बंडलों का विस्तार होता है । (ग)एक्सटेंसिल बंडलों ने एक एमटी आधारित सक्रिय जेल (ग्रीन) का गठन किया जिसने आसपास के तरल को प्रवाह को प्रेरित करने के लिए उभारा । प्रवाह को ट्रैक करने के लिए, तरल ट्रेसर (लाल) के साथ doped था। यह आंकड़ा पीटा एट अल३३से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र ा2: ट्यूबलिन और किनेसिन शुद्धिकरण से एसडीएस जैल की छवियां। (A)शुद्ध ट्यूबलिन के एक एसडीएस जेल की छवि। (ख)पुनर्नवीनीकरण ट्यूबलिन और शुद्ध किनेसिन के एसडीएस जेल की छवि। बाएं से दाएं लेन प्रोटीन मानक, खाली, 1.25-0.25 मिलीग्राम/mL पुनर्नवीनीकरण ट्यूबलिन, खाली, और kinesin स्टॉक थे । (ग)शुद्ध किनेसिन की एकाग्रता का निर्धारण बैंड की चमक की तुलना टम्बलिन के अनुक्रमिक बैंड के साथ मापा सांद्रता (इनसेट में लाल और नीले रंग के धराशायी आयत) के साथ किया गया था। प्रत्येक बैंड की चमक एक फसली बैंड छवि के भीतर पिक्सेल मूल्यों संक्षेप द्वारा मापा गया था । पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए, जेल छवि को क्रॉप करने से पहले ग्रेस्केल, काले और सफेद उलटा, और फिर काले रंग की पृष्ठभूमि (इनसेट) प्रकट करने के लिए इसके विपरीत-बढ़ाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तापमान नियंत्रण सेटअप। (ए)तापमान नियंत्रण सेटअप के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉक की योजनाबद्ध । ब्लॉक में पानी के माध्यम से बहने और TEC-जनित गर्मी को दूर ले जाने के लिए एक आंतरिक चैनल होता है। केंद्रीय छेद नमूना एक तरफ उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रकाशित करने के लिए और दूसरी तरफ एक उद्देश्य के साथ छवि की अनुमति देता है । (ख)तापमान नियंत्रण सेटअप की योजनाबद्ध । सिलिकॉन थर्मल पेस्ट एल्यूमीनियम कूलिंग ब्लॉक और TEC और TEC और नीलम डिस्क के बीच लागू होता है। (ग)तापमान नियंत्रित चरण पर चढ़कर नमूने की छवि। पानी की नलियां एक पानी जलाशय में डूबे पंप से जुड़ी होती हैं। (घ)लक्ष्य तापमान के लिए समय बनाम नमूना तापमान दर्ज किया गया क्रमशः 10 डिग्री सेल्सियस, 20 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस। 0.1-0.3 डिग्री सेल्सियस के उतार-चढ़ाव के साथ तापमान पर नमूना तापमान बनाए रखा गया था। बी और डी को बैट एट अल३३से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्यूनिंग सक्रिय तरल पदार्थ तापमान के माध्यम से बहती है। (A)इमेजिंग ट्रेसर (सफेद डॉट्स) क्रमिक रूप से (विविध रंग घटता) प्रवाह प्रक्षेप पथ पर नज़र रखने के लिए अनुमति दी। ट्रेसर कमरे के तापमान (~ 20 डिग्री सेल्सियस) पर हर 5 एस(5 एस) पर नजर रखी गई थी। (ख)ट्रेसर का मतलब स्पीड बनाम टाइम क्रमशः 10 डिग्री सेल्सियस, 20 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस, 36 डिग्री सेल्सियस और 40 डिग्री सेल्सियस पर। (ग)ट्रेसर मतलब स्पीड बनाम तापमान। प्रत्येक बिंदु पहले और दूसरे घंटे के दौरान औसत ट्रेसर मतलब गति का प्रतिनिधित्व करता है। 16 डिग्री सेल्सियस से नीचे एमटी ्स डिपॉलीमरकिया गया, और 36 डिग्री सेल्सियस से ऊपर, किनेसिन क्लस्टर खराब हो गए। इसलिए, कामकाजी तापमान 16-36 डिग्री सेल्सियस के बीच है, जहां मतलब गति 4-8 माइक्रोन/एस से भिन्न होती है। त्रुटि सलाखों के समय औसत मतलब गति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । बी और सी को बैट एट अल३३से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: समय-समय पर सिस्टम के तापमान को बारी-बारी से सक्रिय तरल पदार्थों की प्रवाह गति को बारी-बारी से बदलना। तापमान को तापमान के साथ सक्रिय तरल पदार्थ गतिविधियों के स्थानीय नियंत्रण का प्रदर्शन करते हुए, 20 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान को बदलना हर 30 न्यूनतम त्वरित और गिरावट प्रवाह गति बार-बार होती है। यह आंकड़ा पीटा एट अल३३से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीटू में सक्रिय मामले को नियंत्रित करने से सक्रियमामले4,5,24 ,28,54के स्व- संगठन का निर्देश देने का दरवाजा खुल जाता है . इस लेख में, हम सिस्टम29,30,31की एरेहेनियस विशेषता के आधार पर सीटू में किनेसिन-चालित, एमटी-आधारित सक्रिय तरल पदार्थों को नियंत्रित करने के लिए तापमान का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। क्योंकि प्रणाली प्रोटीन आधारित है, प्रयोग भर में प्रोटीन कार्यक्षमता को बनाए रखने के सफलतापूर्वक प्रोटोकॉल लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है । सिस्टम में मुख्य प्रोटीन एमटी और किनेसिन क्लस्टर हैं। पूर्व 16 डिग्री सेल्सियस से नीचे और बाद की खराबी 36 डिग्री सेल्सियस33से ऊपर है । इसलिए 16-36 डिग्री सेल्सियस के बीच सिस्टम के तापमान को बनाए रखना सक्रिय तरल पदार्थों के लिए स्थिर गतिशीलता विकसित करने और तापमान के प्रति उनकी प्रतिक्रिया को उलटा सक्षम करने के लिए महत्वपूर्ण है(चित्रा 4 और चित्रा 5)। हालांकि, तापमान को पीआईडी एल्गोरिदम के आधार पर नियंत्रित किया जाता है, जो लक्ष्य तापमान53को ओवरशूट करता है। इस ओवरशूटिंग को कम करने के लिए, हम अंतिम लक्ष्य तापमान निर्धारित करने से पहले कई मध्यवर्ती लक्ष्य तापमान निर्धारित करने की सलाह देते हैं। उदाहरण के लिए, कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) से 35 डिग्री सेल्सियस तक के नमूने को गर्म करने के लिए, लक्ष्य तापमान को सीधे 35 डिग्री सेल्सियस पर सेट करने के बजाय, हम इस संभावना को कम करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस के मध्यवर्ती लक्ष्य तापमान की सलाह देते हैं कि तापमान 36 डिग्री सेल्सियस से ऊपर बढ़ जाता है, जो अपरिवर्तनीय रूप से प्रोटीन33को नुकसान पहुंचाएगा। इसी तरह, कमरे के तापमान से ~ 16 डिग्री सेल्सियस तक नमूना ठंडा करते समय, 18 डिग्री सेल्सियस का मध्यवर्ती लक्ष्य तापमान निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि स्थिर स्थिति तक पहुंचने से पहले, पीआईडी 16 डिग्री सेल्सियस से नीचे के नमूने को ठंडा कर सकता है, एमटी एस33को डिपॉलीमर कर सकता है।

प्रस्तुत तापमान नियंत्रण विधि एक TEC का उपयोग कर ठंडा और हीटिंग पर निर्भर करता है। TEC का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि नमूना सेकंड के भीतर लक्ष्य तापमान तक पहुंचता है, जबकि तापमान नियंत्रित पानी स्नान का उपयोग करके एक पारंपरिक तापमान नियंत्रण सेटअप वांछित तापमान तक पहुंचने में मिनट लगते हैं(चित्र5)55। टीईसी नॉनजीरो नेट हीट उत्पन्न करता है जो एल्यूमीनियम आंतरिक जल परिसंचरण प्रणाली से नष्ट हो जाता है। हालांकि, पानी मोल्ड को बढ़ने की अनुमति देता है, जो अंततः चैनल56को रोक देगा। एक भरा हुआ चैनल पानी के प्रवाह को रोकता है, और गर्मी एल्यूमीनियम ब्लॉक में जमा हो जाएगा, अंततः पानी ट्यूबपिघल । पिघली हुई ट्यूबों के कारण पानी माइक्रोस्कोप और कैमरे के ऊपर फैल जाता है, जिससे इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों को नुकसान पहुंचता है । इसलिए, प्रस्तुत तापमान नियंत्रण सेटअप को अपनाने के लिए, हम मोल्ड विकास57,58,59को बाधित करने के लिए पानी में 0.1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने की सलाह देते हैं। हम उम्मीद करते हैं कि यह कदम यह सुनिश्चित करेगा कि एल्यूमीनियम आंतरिक चैनल रोकना मुक्त रहता है और आसपास के इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों को पानी के नुकसान को रोकता है।

तापमान में हेरफेर, पॉलीएक्रिलामाइड के साथ प्रवाह कोशिका सतहों को कोटिंग, और सक्रिय तरल पदार्थ संश्लेषण सीटू नियंत्रित सक्रिय तरल पदार्थ में इसे साकार करने के लिए तीन महत्वपूर्ण कदम हैं। हालांकि, यह नियंत्रणता तापमान सीमा तक सीमित है जहां शामिल प्रोटीन सामान्य रूप से कार्य कर सकते हैं। सक्रिय द्रव प्रणाली में, प्राथमिक प्रोटीन एमटी और किनेसिन क्लस्टर हैं, जो सामान्य रूप से 16-36 डिग्री सेल्सियस33के बीच कार्य करते हैं। इस तापमान सीमा के भीतर, सक्रिय तरल पदार्थ 4-8 μm/s(चित्रा 4सी)से उनके मतलब प्रवाह गति बदलती हैं । इस सीमा के बाहर मतलब गति प्रस्तुत नियंत्रण विधि की सीमा से परे हैं। इसके विपरीत, रॉस एट अल एक विकल्प है कि सक्रिय तरल पदार्थ गतिविधियों पर और प्रकाश28का उपयोग कर बंद करने के लिए अनुमति देता है की सूचना दी । प्रकाश नियंत्रण 50 माइक्रोन स्केल ऑप्टिकल-परिभाषित सीमा में सक्रिय तरल पदार्थों को सक्रिय करने की अनुमति देता है। हालांकि, इस तरह के विकल्प के लिए माइक्रोस्कोप में ऑप्टिकल पथ ट्यूनिंग के साथ किनेसिन संरचना को संशोधित करने की आवश्यकता होती है। इसकी तुलना में, इस लेख में प्रस्तुत विधि को अपनाने के फायदे 1) सक्रिय तरल पदार्थों को फिर से डिजाइन करने की आवश्यकता नहीं है, 2) माइक्रोस्कोप को संशोधित करने की आवश्यकता नहीं है, 3) तापमान नियंत्रण सेटअप कम लागत वाला और उपयोग करने में आसान है, और 4) विधि अन्य तापमान-निर्भर प्रणालियों जैसे ग्लाइडिंग परख29,30,31,32 या अधिक सामान्य रूप से एंजाइम-आधारितप्रणालियोंमें स्थानांतरित होती है। हम यह भी उम्मीद करते हैं कि प्रस्तुत विधि माइक्रोफ्लूइडिक सिस्टम को डिजाइन करने के लिए दरवाजा खोलेगी जहां चैनल प्रवाह वाल्व के बिना स्थानीय रूप से नियंत्रित होते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

प्लाज्मिड K401-BCCP-H6 डॉ Zvonimir Dogic से एक उपहार था । इस शोध को वॉरसेस्टर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट में डॉ कुन-टीए वू के स्टार्ट-अप फंड ने सपोर्ट किया । हम प्रोटोकॉल को शुद्ध करने और ट्यूबलिन लेबल करने और सक्रिय तरल पदार्थ ों को संश्लेषित करने के लिए डॉ Zvonimir Dogic का शुक्रिया अदा करते हैं । हम प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि में अपनी विशेषज्ञता के लिए डॉ मार्क रिडिला के आभारी हैं । हम तापमान नियंत्रित मंच के निर्माण के साथ हमारी सहायता के लिए डॉ विलियम बेंजामिन रोजर का शुक्रिया अदा करते हैं । हम जैविक सामग्री सुविधा (बीएमएफ) के उपयोग के लिए ब्रैंडिस एमआरएसईसी (एनएसएफ-एमआरएसईसी-1420382) को स्वीकार करते हैं। हम सॉफ्ट मैटर३३पर बैट एट अल से आंकड़ों को ढालने के लिए रॉयल सोसायटी ऑफ केमिस्ट्री को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

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इंजीनियरिंग अंक 153 बायोफिजिक्स किनेसिन माइक्रोट्यूब्यूल सक्रिय तरल पदार्थ आत्म-संगठन तापमान एरेहेनियस कानून
तापमान का उपयोग करमाइक्रोट्यूबल-आधारित 3डी सक्रिय तरल पदार्थ की गति को नियंत्रित करना
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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