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Engineering

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.

Abstract

우리는 온도를 사용하여 키네신 구동, 미세 소관 기반 의 3 차원 (3D) 활성 유체의 유속을 조정하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 원하는 다른 속도에 도달하기 위해 새로운 샘플을 제조할 필요 없이 도면의 속도를 조정할 수 있습니다. 또한,이 방법은 속도의 동적 제어를 할 수 있습니다. 온도를 순환하면 유체가 주기적으로 빠르고 느리게 흐릅니다. 이 제어성은 키네신-미세소관 반응의 아레니우스 특성을 기반으로 하며, 4-8 μm/s의 제어된 평균 유속 범위를 보여줍니다. 제시된 방법은 밸브없이 채널의 유량이 국부적으로 튜닝 할 수있는 미세 유체 장치의 설계에 문을 엽니 다.

Introduction

활성 물질은 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환하는 능력으로 인해 기존의 수동 물질과 차별화됩니다. 그러한 능력을 가진 물질은 박테리아, 곤충, 콜로이드, 곡물 및 세포골격 필라멘트1,2,3,4,5,6,7,8,9,10과같은 살아 있거나 비생물성 존재체로 구성될 수 있다. 이러한 재질 개체는 이웃과 상호 작용합니다. 더 큰 규모에서, 그들은 난류와 같은 vortices (활성 난류) 또는 물질 흐름11,12,13,14,15,16,17,18,19,20으로스스로 구성한다. 활성 물질의 자기 조직에 대한 이해는 분자 셔틀, 광학 장치 및 병렬 계산21,22,23에서다양한 응용 으로 이어졌습니다. 응용 프로그램을 다음 단계로 끌어올리려면 자체 조직 이상의 제어가 필요합니다. 예를 들어, Palacci 등은 수동으로 제어되는 청색광에 노출되었을 때만 자체 추진되는 헤마타이트 캡슐화 콜로이드를 개발하여 살아있는 결정24의출현을 이끌었다. Morin 등은 튜닝 가능한 외부 전기장을 사용하여 Quincke 콜로이드를 압연하는 제어를 확립하여 경마장과 같은 채널25에서콜로이드 무리를 일으킵니다. 이 전작들은 응용 프로그램에서 로컬 제어의 역할을 보여주고 활성 물질의 지식 기반을 발전시고 있습니다.

이 기사에서는 키네신 구동, 미세 소관 (MT) 기반 3D 활성 유체의 제어성에 중점을 둡니다. 유체는 3개의 주요 분대로 이루어져 있습니다: MTs, 키네신 분자 모터 및 고갈제. 고갈제는 나중에 모터 클러스터에 의해 브리지되는 MT를 번들로 묶는 고갈력을 유도합니다. 이 모터는 더하기 끝에 있는 MTs를 따라 걷습니다. 한 쌍의 브리지 MTsis 반평행이면 해당 모터가 반대 방향으로 걷습니다. 그러나 모터는 클러스터에 바인딩되어 떨어져 걸을 수 없으므로 MT 쌍(인터필라멘트 슬라이딩, 그림 1A)을협조적으로 미끄러뜨습니다. 이러한 슬라이딩 역학이 축적되어, MTsto의 번들이 그들의 좌굴 불안정 지점에 도달할 때까지 연장된다(확장 번들, 도 1B)26. 깨진 번들은 고갈력에 의해 어닐링되어, 이어서 다시 연장되고 역학이 반복됩니다. 반복 역학의 과정에서 번들 움직임은 근처의 액체를 교반하여 미크론 스케일 추적기로 도핑하여 시각화 할 수있는 흐름을 유도합니다(그림 1C). 산체스 외 및 헨킨 외. 추적자의 평균 속도를 특징으로, 속도는 아데노신 삼인산의 농도를 변화시킴으로써 조정되었다는 것을 발견 (ATP), 고갈제, 모터 클러스터, 및 MTs19,27. 그러나, 이러한 튜닝성은 활성 유체 합성 이전에만 존재하였다. 합성 후, 튜닝성이 손실되고, 유체는 자신의 방식으로 자체 조직. 합성 후 활성 유체 활성을 조절하기 위해, Ross.et al.은 모터 단백질의 광 활성화 이각을 이용하여 유체 활성을 광28을사용하여 온/오프로 조절할 수 있는 방법을 보고했다. 빛 제어는 유체를 국소적으로 활성화하는 측면에서 편리하지만, 이 방법은 현미경으로 광학 경로를 수정하는 것과 함께 모터 단백질의 구조를 재설계해야 합니다. 여기서, 우리는 모터 구조를 그대로 유지하면서 현미경 수정없이 유체 흐름을 국부적으로 제어하는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.

우리의 국소적인 활성 유체 흐름을 조정하는 방법은 키네신-MT 반응이 온도29,30,31,32와함께 증가하는 것으로 보고되었기 때문에 아레니우스 법칙에 기초한다. 우리의 이전 연구는 활성 유체 흐름의 평균 속도의 온도 의존성이 아레니우스 방정식을 따랐다는 것을 보여주었다: v = exp (-A/RT), 여기서 A는 사전 지수 인자, R은 기체 상수, E는활성화 에너지, 및 T는 시스템온도(33)이다. 따라서, 유체 활성은 온도 환경에 민감하고, 시스템 온도는 모터 성능을 안정화하기 위해 일관되어야 하며, 결과적으로, 유체 유동속도(34)가된다. 이 문서에서는 모터의 온도 의존성을 사용하여 시스템 온도를 조정하여 활성 유체의 유속을 지속적으로 조정하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 온도가 제어되는 현미경 단계에 샘플을 장착한 다음 활성 유체 샘플의 준비를 시연합니다. 온도를 16°C에서 36°C로 증가시키면 평균 유속이 4~8μm/s로 빨라지며, 또한 해석성은 가역적입니다: 반복적으로 온도를 증가시키고 감소시키면 순차적으로 가속화되고 감속됩니다. 입증된 방법은 MT 글라이딩 분석법29,30,31,32와같은 주요 반응이 아레니우스 법칙을 준수하는 광범위한 시스템에 적용가능하다.

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Protocol

1. T의 준비

주의: 이 단계에서 우리는 소의 뇌 조직에서 수관을 정화합니다. 소 뇌는 변이체 크로이츠펠트 야콥 질환 (vCJD)35를일으킬 수 있습니다. 따라서, 뇌 폐기물 및 관련 솔루션, 병 및 파이펫 팁은 바이오 폐기물 봉투에 수거하여 기관의 규칙에 따라 생체 유해 폐기물로 폐기되어야 합니다.

  1. 소 뇌에서 튜불린을 정화 (카스놀디 등에서 수정36).
    1. 지역 도축장에서 대학 냉장실로 약 1.5kg의 신선한 소 뇌를 운반합니다. 수송 하는 동안, 인산 염 버퍼에 두뇌를 저장 (20 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 7.2) 얼음에.
      참고 : Tubulin의 최종 수율을 극대화하려면 신선한 뇌 조직에서 기능성 tubulin의 초기 양이 중요합니다. 신선한 두뇌는 더 많은 기능성 튜불린을 함유하고 있습니다. 도축장에서 가장 신선한 두뇌를 얻으려면, 우리는 가장 최근에 도살 된 소에서 뇌를 제공하기 위해 정육점을 요청하는 것이 좋습니다. 도살과 절차 시작 사이의 시간을 줄이면 더 나은 수율을 생성하기 때문에 뇌는 절차를 시작할 때 3 시간 보다 더 오래되어서는 안됩니다.
    2. 균질화하고 뇌를 명확히.
      1. 메스를 사용하여 혈관과 결합 조직을 더 작은 조각으로 자르고 손으로 뇌에서 제거하여 뇌를 청소하십시오.
        참고: 청소된 뇌는 분홍색이어야 합니다.
      2. 정제된 뇌 조직을 1킬로그램의 비중합체 완충제(DB: 50 mM2-(N-morpholino) 에탄설포닉산, 1 mMCaCl2,pH 6.6)에 담급니다.
      3. 주방 블렌더로 뇌를 균질화합니다.
      4. 10,000 x g 및 4°C에서 150분 동안 균질화된 뇌 용액을 원심분리기.
    3. 중합 MTs (첫 번째 중합).
      1. Collect and mix the supernatant with equal volumes of the following solutions at 37 °C: glycerol, high-molarity PIPES buffer (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM ethylene glycol-bis(β-aminoehyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid [EGTA], pH 6.9)
      2. 혼합물에 1.5 mM ATP 및 0.5 mM 구아노신 삼인산 (GTP)을 추가합니다.
      3. 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
    4. MT(첫 번째 MT 탈중합)를 중합합니다.
      1. 펠렛 MT를 151,000 x g 및 37°C에서 30분 동안 원심분리하였다.
      2. 상급을 버리고 4 °C DB의 10 mL에서 각 MT 펠릿을 다시 중단하십시오.
      3. 얼음에 30분 동안 배양합니다.
      4. MT 침전을 피하기 위해 파이펫 팁으로 5 분마다 혼합물을 교반하십시오.
        참고 : 혼합물은 MT 탈중합의 완료를 나타내는 30 분 안에 선명해야합니다.
    5. 중합 MTs (두 번째 MT 중합).
      1. 70,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 용액을 명확히하십시오.
      2. 37°C 글리세롤 및 HMPB의 동일한 부피로 상급체를 수집하고 혼합합니다.
      3. 혼합물에 1.5 mM ATP 및 0.5 mM GTP를 추가합니다.
      4. 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한다.
    6. 반복 단계 1.1.4, 브링클리 재조립 버퍼 (BRB) 80 (80 mM 파이프, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8)로 HMPB를 대체 한 다음 79,000 x g 및 30 분 동안 4 °C에서 원심 분리하여 클리어 된 혼합물을 명확히합니다.
    7. 상급을 수집합니다. 분광계로 280 nm 의 흡광도를 측정합니다. 맥주 램버트 법칙 (수관의 소멸 계수 : 1.15 (mg / mL)-1cm-1)37,38을사용하여 튜불린 농도를 결정합니다.
    8. 단백질을 -80°C에 보관하십시오.
  2. 회생 튜불린 (카스놀디 등에서 수정36).
    참고: 튜불린 순도를 향상시키기 위해 정제된 튜불린을 중합하고 다시 중합합니다.
    1. 정제된 투불린(단계 1.1.7)을 500 μM 디티오트레이톨(DTT) 및 20 μM GTP와 혼합한 다음 37°C에서 30분 의 배양물을 혼합하여 MT를 중합하였다.
    2. 펠트 는 MTs.
      1. 원심 분리기 튜브 의 바닥에 글리세롤 쿠션 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60 % v / v 글리세롤, pH 6.8)의 1 mL을로드합니다.
      2. 중합형 MT를 쿠션 위에 놓습니다.
      3. 37 °C에서 90 분 동안 172,000 x g의 원심 분리기.
    3. MT를 중합합니다.
      1. 상급 쿠션을 제거합니다.
      2. 4 °C MT 버퍼의 150 μL에서 각 MT 펠릿을 다시 일시 중단하십시오 (M2B : 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. 혼합물을 얼음에 30 분 동안 배양합니다.
      4. 5분마다 파이펫 팁으로 혼합물을 교반합니다. 혼합물은 분명해져야 합니다.
    4. 172,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 혼합물을 명확히합니다.
    5. 상급을 수집합니다. 단백질 농도를 측정합니다. -80 °C에서 보관하십시오.
  3. 형광 염료39와함께 tubulin를 레이블.
    1. MTs.를 중합. 정제된 투불린(단계 1.1.7)을 500 μM DTT 및 16.7 μM GTP와 혼합하고, 37°C에서 30분 동안 혼합물을 배양한다.
    2. 펠트 는 MTs.
      1. 37°C 고pH 쿠션 1mL(0.1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v 글리세롤, pH 8.6)를 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      2. 중합된 TT를 쿠션 위에 놓습니다.
      3. 37 °C에서 50 분 동안 327,000 x g의 원심 분리기.
    3. 라벨 튜불린.
      1. 37°C 라벨링 버퍼의 700 μL로 각 MT 펠릿을 다시 일시 중단합니다(0.1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 40% v/v 글리세롤, pH 8.6).
      2. 서 스 펜 션을 혼합 10-20 멀리 빨간 형 광 염료의 초과 와 succinimidyl 에스테 르와 기능.
      3. MT가 형광 염료의 에스테 르와 반응할 수 있도록 어둠 속에서 30 분 동안 37 °C에서 혼합물을 배양.
      4. 50 mM K-글루타메이트로 현탁 염료의 에스테르를 포화시키고 37°C에서 5분 동안 배양하여 라벨링 반응을 중단한다.
    4. 라벨이 붙은 MTs: 반복 단계 1.3.2, 낮은 pH 쿠션으로 높은 pH 쿠션을 대체 (80 mM 파이프, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v 글리세롤, pH 6.8).
    5. MT를 중합합니다.
      1. 상급과 쿠션을 버리십시오.
      2. 펠렛을 4°C M2B의 700 μL로 다시 놓습니다.
      3. 얼음에 현탁액을 배양.
      4. 용액이 명확해질 때까지 파이펫 팁으로 5분마다 교반합니다.
    6. 184,000 x g 및 4 °C에서 35 분 동안 원심 분리하여 제거 된 용액을 명확히하십시오.
    7. 1.2.1-1.2.4 단계를 반복하여 표지된 튜불린 용액의 순도를 향상시킵니다.
    8. 단백질과 형광 염료의 농도를 측정합니다. 이러한 측정을 사용하여 형광 염료와 관불린의 농도 비율로 정의된 수관 농도와 표지된 수관의 분율을 결정합니다.
    9. 표지된 튜불린 용액을 -80°C에 보관하십시오.
  4. MT를 중합 (산체스 외 에서 채택19):
    1. 재활용 된 tubulin (단계 1.2.5)을 라벨이 붙은 튜불린 (단계 1.3.9)과 3 % 라벨이 붙은 튜눌린 분획을 생성하는 비율로 혼합하십시오.
    2. 8 mg/mL 튜불린 혼합물을 1 mMM DTT 및 0.6 mM guanosine-5'[(α,β)-메틸레노]트리포스페이트(GMPCPP)와 37°C에서 30분 간 배양합니다.
    3. 배양 후, MTs를 6시간 동안 어둠 속에서 실온에서 어닐린.
    4. 알리쿼트 및 -80 °C에서 저장합니다.

2. 키네신 클러스터 합성

참고 : 박테리아는 유비쿼터스로 존재하고 매체에서 성장하고 준비 과정을 오염 시킬 수 있습니다. 오염을 방지하기 위해, 세포 배양과의 접촉 (예를 들어, 파이펫팅)과 관련된 행동은 화염 근처에서 수행되어야합니다. 플라스크, 파이펫, 파이펫 팁, 매질 및 플레이트와 같은 공구는 사용하기 전에 오토클레이브해야 합니다.

  1. 에스케리치아 대장균40에서키네신 모터를 익스프레스.
    1. 셀을 변환합니다.
      1. K401-BCCP-H6 플라스미드의 피펫 1 μL을 관할 세포의 10 μL내로 하였다.
      2. 얼음에 5분 동안 배양합니다.
      3. 45s에 대한 42.5 °C에서 열 충격.
      4. 세포를 얼음 위에 2분 동안 배양하여 회복을 허용합니다.
      5. 항생제가없는 2XYT (5 g / L NaCl, 10g / L 효모 추출물, 16 g / L 트립톤)의 300 μL과 세포를 섞습니다.
      6. 1 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다.
        참고: 지정하지 않는 한, 인큐베이션 중에 세포 성장을 모니터링할 필요가 없습니다.
    2. 플레이트 미디어를 접종합니다.
      1. 2XYT 플레이트 (10 g / L NaCl, 5 g / L 효모 추출물, 10 g / L 트립톤, 15 g / L 한천, 100 μg / mL 암피실린, 25 μg / mL 클로람페니콜)에 세포 배양을 확산시다.
      2. 밤새 37°C에서 접시를 거꾸로 배양합니다.
    3. 액체 매체를 접종합니다.
      1. 하룻밤 접시에서, 파이펫 팁으로 하나의 고립 된 식민지를 수확.
      2. 팁을 2XYT 50mL가 들어 있는 플라스크에 꺼넣습니다.
      3. 배양하고 12-16 시간 동안 37 °C 및 200 rpm에서 배양 배지를 흔들어.
    4. 셀을 확장합니다.
      1. 2XYT의 500 mL에서 세포 배양의 2.5 mL를 혼합합니다.
      2. 37°C에서 500 mL 배양을 교양하고 3-6시간 동안 250 rpm을 교반한다.
    5. 단백질 발현을 유도합니다.
      1. 인큐베이션 동안, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 성장을 모니터링하고, 2XYT를 기준으로 사용한다. 60분마다 OD600 = 0.3에 도달할 때까지 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 0.5-0.6에 도달할 때까지 30분마다 흡광도를 측정합니다.
      2. 흡광도가 OD600 = 0.5-0.6에 도달할 때까지 세포가 자랄 수 있도록 허용
      3. 세포 배양에 24 μg/mL 비오틴과 1 mMM isopropyl β-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가합니다.
        참고: IPTG는 비오틴 카르복실 담체 단백질(BCCP) 및 6개의 히스티딘(H6)으로 태그가 지정된 키네신 모터의 단백질 발현을 유도하는 데 사용됩니다. H6 태그는 정제 공정(단계 2.2)에 사용되고, BCCP는 첨가된 비오틴 분자에 결합하여 발현된 키네신 모터를 바이오티니레이트한다.
      4. 12-20 시간 동안 20°C 및 250 rpm에서 세포 배양을 배양하고 흔든다.
    6. 5,000 x g 및 4 °C에서 원심분리하여 세포를 10 분 동안 수확하십시오. 세포 펠릿을 -80°C에 보관합니다.
  2. 키네신 모터 단백질을 정화 (Spriestersbach 외 에서 수정41):
    1. 용해 완충액 (50 mM PIPES) 동일한 부피로 세포 펠릿 (단계 2.1.6)을 일시 중단하십시오. 4 mM MgCl2,50 μM ATP, 10 mMM 2-메르카포에탄올 (βME), 20 mM imidazole, pH 7.2), 프로테아제 억제제 1 정, 페닐메틸 설포닐 불소 2 mg (PMSF) 및 리소자이므 2 mg을 추가합니다.
    2. 액체 질소 (LN) 3x에서 플래시 동결하여 세포를 용해시키고 세포 혼합물을 해동합니다.
      참고 : 용해 후, 혼합물은 점성이되어야한다.
    3. 용해 된 세포 혼합물을 230,000 x g 및 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 명확히합니다.
    4. 상한을 수집하고 중력 열을 통해 흐르고 10 mL의 용해 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
      참고: 키네신 K401-BCCP-H6와 같은 H6 태그가 있는 단백질은 열에 남아 있어야 합니다.
    5. 5 mL의 용출 완충액으로 태그된 단백질을 용출(50 mM PIPES, 4 mMMgCl2,50 μM ATP, 500 mM 이미다졸, pH 7.2). 1 mL 분획에서 순차적으로 흐름을 수집합니다. 단백질 함유 분획을 결정하려면 각 분획의 3 μL을 트리페닐메탄 염료 100 μL과 혼합합니다. 단백질 함유 분획은 파란색으로 바뀝니다. 이러한 분획을 결합하고 5배씩 lysis 버퍼로 희석합니다.
    6. 단백질 용액을 농축하십시오.
      1. 용액을 원심 필터 튜브에 적재합니다.
      2. 3,000 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.
      3. 튜브를 부드럽게 흔들고 용액 부피가 <3 mL이 될 때까지 다시 원심 분리기를 합니다.
    7. 분광계 (소멸 계수 : 0.549 (mg / mL)-1cm-1)42,43로단백질 농도를 측정합니다. 단백질을 1 mg/mL로 희석하고 35% w/v 자당을 첨가하십시오.
    8. -80 °C에서 보관하십시오.
  3. 전기 동공 겔로 키네신 농도를 측정합니다 (Taylor et al.44에서변형).
    참고 : 전기 동아용 젤로 키네신 농도를 측정하기 위해, tubulin은 분광계(그림 2A)36을통해 높은 순도와 측정 가능한 농도 때문에 이상적인 농도 사다리입니다.
    1. 0.25, 0.5, 0.75, 1.00 및 1.25 mg/mL의 농도로 튜불린 샘플을 준비합니다. 각 튜불린 시료와 키네신 시료(단계 2.2.8)의 15 μL을 5 μL의 샘플 버퍼(200 mM Tris-HCl, 8% 나트륨 도데실 황산염(SDS), 400 mM DTT, 0.2% 브로모페놀 블루, 40% 글리세롤, pH 6.8및 90°C의 분수로 별도로 혼합합니다.
    2. 전기 동극을 준비하십시오.
      1. 전기 동공 젤을 젤 상자에 잠급기.
      2. 실행 버퍼로 상자를 채웁니다 (50 mM MOPS, 50 mM Tris 염기, 0.1 % SDS, 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA), pH 7.7).
        참고: 버퍼 수준이 젤의 상단 개구부 위에 있는지 확인합니다.
    3. 단백질 표준 사다리, 튜불린 샘플 및 키네신 샘플 10 μL을 별도의 우물에 넣고 젤 전체에 200V를 45분 동안 적용합니다.
    4. 젤 염색.
      1. 끓인 (약 95 °C) 얼룩 액 A (0.5 g / 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산, 25 % 이소 프로판올)를 5 분 동안 배양하고 젤을 탈온화 (DI) 물로 헹구고.
      2. 얼룩 용액 B (0.05 g / L 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산, 10 % 이소 프로판 올), C (0.02 g / L 트리페닐 메탄 염료, 10 % v / v 아세트산), 및 D (10 % v / v 아세트산)를 순차적으로 반복하십시오. 밤새 DI 물에 겔을 인큐베이션하고 바위.
    5. 젤을 스캔합니다. 젤 이미지를 그레이스케일 이미지로 변환한 다음 흑백 반전 및 대비 향상을 통해 검정 색 배경에서 밝은 단백질 밴드를 표시합니다.
    6. 픽셀 값을 합산하여 각 밴드의 밝기를 측정합니다. 선형 맞춤 C = aB + b를적용하면 B는 튜불린 밴드의 밝기이고 C는 해당 농도이고 a와 b는 피팅 매개변수입니다. 키네신 밴드 Bk의 밝기를 이용하여 키네신 Ck의 농도를 결정하여 선형 방정식을 계산한다: Ck = aBk + b.
  4. 키네신 모터를 클러스터합니다.
    1. 1.5 μM 키네신(단계 2.2.8)을 120 μM DTT 및 120 nM 스트렙타비딘과 혼합합니다. 얼음에 30분 동안 배양합니다.
    2. -80 °C에서 보관하십시오.

3. 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드 및 커버슬립 준비 (Lau 등45에서수정)

  1. 새 유리 슬라이드와 유리 커버슬립을 해당 용기에 적재합니다. 슬라이드와 커버슬립을 DI 물에 1% v/v 세제에 담근 다음 전자레인지에서 끓입니다.
  2. 슬라이드와 커버슬립을 5분 동안 초음파 처리한 다음 DI 물로 헹구어 세제를 제거합니다.
  3. 5분 동안 에탄올에 슬라이드와 커버립을 담그고 초음파 처리합니다.
  4. 100 mM의 수산화 칼륨 (KOH)에서 슬라이드와 커버 립을 5 분 동안 침수하고 초음파 처리하십시오.
  5. 슬라이드와 커버슬립을 실란 용액(1% 아세트산 및 0.5% 3-(트리메톡시실릴)에서 에탄올로 15분 동안 인큐베이션한 다음 DI 물로 헹구십시오.
  6. 아크릴아미드 용액에 슬라이드와 커버립을 배양 (2% w / w 아크릴아미드, 0.7 mg / mL 암모늄 황산염, 및 0.0035 % v / v / v TEtramethylethylenediamine DI 물) ≥ 3 시간.
  7. 슬라이드와 커버립을 아크릴아미드 용액에 보관합니다.

4. 키네신 구동, MT 기반 활성 유체 준비

  1. 활성 유체를 준비합니다 (산체스 외19에서수정).
    참고: 다음 단계는 예제 스톡을 사용하여 활성 유체의 100 μL을 준비하는 과정을 보여 줍니다. 최종 부피는 확장 가능하며, 각 성분의 최종 농도가 유지되는 한 예제 스톡의 농도를 조정할 수 있습니다.
    1. 16.7 μL의 8 mg/mL MTs(단계 1.4.4)를 6.7 μL의 1.8 μL의 키네신 모터 클러스터(단계 2.4.2)와 고염 M2B(M2B + 3.9 mM MgCl2)에서500 mM DTT의 1.1 μL을 혼합합니다.
    2. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 w / w 7 %의 11.4 μL을 추가하여 번들 MTs.
    3. 50 mM ATP의 2.8 μL을 추가하여 키네신 모터를 활성화합니다.
    4. 2.8 μL의 스톡 피루바테 키나아제/젖산 탈수소효소(PK/LDH) 및 200 mM 인스페놀 파이루바트(PEP)의 13.3 μL을 첨가하여 ATP 농도를 유지합니다.
    5. 20 mM 트롤록스 10 μL, 3.5 mg/mL 카랄라제 1.1 μL, 20 mg/mL 포도당 산화아제 1.1 μL, 300 mg/mL 포도당의 1.1 μL을 추가하여 광표백 효과를 줄입니다.
    6. 0.025% v/v 트레이서 입자의 1.6 μL을 추가하여 유체의 움직임을 추적합니다.
    7. 고염 M2B를 첨가하여 총 부피가 100 μL입니다.
      참고: 4.1.1-4.1.6 단계의 혼합 주문은 상호 교환이 가능합니다. 그러나 ATP, MT 및 모터가 혼합되면 모터는 ATP를 소모하기 시작하고 MT를 따라 밟습니다. 제한된 연료(ATP 및 PEP)로 인해 샘플이 유한수명으로 활성화되므로 실험을 신속하게 시작해야 합니다. 최종 활성 유체에는 1.3 mg/mL MT, 120 nM 키네신 모터 클러스터, 5.5 mM DTT, 0.8% w/w PEG, 1.4 mM ATP, 2.8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM 트록스, 0.038 mg/mL 카탈라제, 0.22 mg/mL 포도당 산화제, 3.3 mg/mL 포도당, 0.0004% v/v 콜로이드.
  2. 흐름 채널에서 샘플을 준비 (찬드라카르 등에서 수정46):
    1. 폴리아크릴아미드 코팅 유리 슬라이드와 커버슬립(3.7단계)을 DI 물로 헹구십시오. 가압 공기로 안경을 말립니다. 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.
    2. 3mm 너비와 유리 커버 슬립 (20mm)과 동일한 길이로 왁스 필름 두 스트립을 잘라냅니다. 슬라이드와 커버슬립 사이에 스트립을 채널 스페이서로 삽입합니다.
    3. 왁스 필름에 유리를 부착하여 80°C 핫 플레이트에 유리 왁스 복합체를 놓고 왁스를 녹입니다. 녹는 동안 피펫 팁으로 커버슬립을 부드럽게 눌러 왁스 필름을 유리 표면에 균일하게 부착합니다. 접착 후 유리 복합체를 실온으로 식힙니다.
    4. 활성 유체(단계 4.1)를 유동 채널에 로드합니다. UV 접착제로 채널을 밀봉합니다.

5. 제어 샘플 온도

  1. 온도 제어 설정을 구축 (Lowensohn 외 및 우 등47,48,49의설계에서 수정).
    1. 알루미늄 냉각 블록을 준비합니다.
      1. 약 30mm × 30mm × 5mm의 치수로 알루미늄 판을 밀링하십시오.
      2. 플레이트(그림 3A)를통해 내부 채널을 드릴링하고 채널 끝에 호스 피팅을 설치합니다.
      3. 각 피팅을 워터 튜브에 연결합니다.
      4. 한 튜브를 물 저장고의 수조 펌프에 연결하고 다른 튜브를 저수지로 확장합니다.
        참고 : 펌프는 약 실온에서 블록 온도를 유지하기 위해 알루미늄 내부 채널을 통해 저수지 물을 순환합니다.
    2. 열전 냉각기(TEC)와 써모센서를 온도 컨트롤러에 연결합니다. USB 포트를 사용하여 컨트롤러를 컴퓨터에 연결합니다(그림3B).
    3. 온도 컨트롤러를 직접 전류(DC) 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 전기 콘센트에 연결하여 컨트롤러를 켭니다.
    4. 컨트롤러 제조업체 의 가이드에 따라 TEC의 초기 설정을 수행합니다. TEC 출력을 테스트합니다. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어를 통해 온도 컨트롤러를 제어하여 열센서 데이터 기록및 온도 컨트롤러의 조작을 쉽게 할 수 있습니다.
    5. TEC의 가열 및 냉각 측면을 식별합니다.
    6. 열 페이스트를 사용하여 TEC의 냉각 면을 냉각 블록(단계 5.1.1)에 부착합니다.
    7. 열 페이스트를 사용하여 TEC의 가열 면에 사파이어 디스크를 부착합니다.
    8. 설정이 완료되었습니다. 사파이어 표면과 써모센서는 시료에 접촉하여 온도 및 목표 온도에 따라 시료를 냉각및 가열할 수 있습니다.
      참고: TEC 및 냉각 블록에는 밝은 필드 현미경 검사법을 사용하여 샘플을 이미징하기 위한 중앙 구멍이 정렬된 것이좋습니다(그림 3C).
  2. 온도 제어 설정을 사용하여 샘플 온도33을제어합니다.
    1. 샘플을 설정에 장착합니다.
      1. 활성 유체 샘플(4.2.4단계)을 슬라이드 면이 표면에 닿는 사파이어 표면에 놓습니다.
      2. 용지 테이프로 유리 슬라이드를 고정합니다.
      3. 구리 테이프를 사용하여 써모 센서를 커버슬립 표면에 부착합니다.
    2. 커버슬립 면이 목표를 향하도록 현미경 스테이지에 설치를 장착합니다. 예를 들어, 거꾸로 된 현미경에서 커버슬립 면은 아래를 향해야 합니다. 해당하는 경우 종이 테이프와 현미경 스테이지 바늘 클램프로 설정을 고정하십시오.
      참고: 제시된 온도 단계는 반전되거나 똑바로 서 있는 일반적인 현미경으로 작동해야 합니다. 실험 중에 온도 단계가 이동되지 않도록 하려면 테이프로 온도 단계를 현미경 단계로 고정하는 것이 가장 좋습니다.
    3. 샘플 온도를 제어합니다.
      1. 온도 컨트롤러와 어항 펌프를 켭니다.
      2. 제조업체 의 가이드에 따라 목표 온도를 설정하고 온도 제어를 활성화합니다. 컨트롤러는 열센서에 의해 평가된 대로 목표 온도및 샘플 온도에 따라 가열 또는 냉각 전력을 조정합니다.
    4. 샘플 온도를 기록합니다.
      1. 실험 중 열센서 온도 데이터를 기록하려면 제조업체 의 가이드를 따르십시오.
        참고: 이제 샘플 온도는 컨트롤러에 의해 제어되고 컴퓨터에 의해 기록되어야합니다(그림3D).

6. 활성 유체 활성을 특성화 (헨킨 외 및 우 외20,27에의해 방법에서 수정)

참고: 이전 섹션은 활성 유체 샘플(섹션 1-4)을 준비하고 온도를 제어하는 데 사용됩니다(섹션 5). 활성 유체 활동을 제어하기 위해 온도사용을 입증하려면 유체 거동을 관찰하고, 활동을 분석하고, 온도에 대한 반응을 특성화합니다.

  1. 추적자를 모니터링합니다.
    1. 녹색 형광 단백질(GFP) 형광을 사용하여 일정한 간격Δt로 샘플을 이미지화하여 트레이서 입자의 움직임을 포착합니다.
      참고: 추적자 이동을 추적할 수 있도록 Δt를 선택해야 합니다. 100s와 같은 큰 Δt 값은 추적 궤적을 잃게 되는 반면 0.1s와 같은 짧은 Δt 값은 추적 알고리즘이 프레임 간의 추적자 이동을 감지하지 못하게 합니다. 작업 Δt는 프레임 사이의 추적자 변위를 ~9픽셀 이내로 허용해야 합니다. 4x 대물렌즈를 사용하여 10 μm/s로 움직이는 이미징 트레이서의 경우 Δt는 1-5s로 사용하는 것이 좋습니다.
    2. 이미지를 TIFF 파일로 저장하고 프레임 번호를 기반으로 파일이름을 지정하고 별도의 폴더에 저장합니다. 이러한 프로세스는 제공된 MATLAB 스크립트(6.2.2단계)로 획득한 이미지를 올바르게 분석할 수 있도록 하는 데 필요합니다.
  2. Ouellette 등50,51에의해 개발 된 추적 소프트웨어를 채택 추적 추적 :
    1. 스탠포드 대학 (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml)의 환경 복잡성 연구소에서 추적 소프트웨어를 다운로드하십시오. 각 MATLAB 파일이 동일한 폴더에 있는지 확인합니다.
    2. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 추적자를 추적 particle_tracking합니다. 스크립트는 추적자 이미지 (단계 6.1)를 읽고 Ouellette 등50,51의소프트웨어를 사용하여 추적자 움직임을 추적합니다. 1) 이미지 배경을 나타내는 1) background.tif, 2) 각 프레임의 파티클 궤적및 속도를 포함하는 Tracking.mat의 두 파일을 출력합니다(그림4A).
  3. 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 추적기 평균 속도를 분석합니다. 스크립트는 추적 파일(Tracking.mat)을 읽고 추적자 대 시간의 평균 속도를 출력하고 지정된 평균 창(그림 4B)33을사용하여 평균 평균 속도를 출력합니다.
  4. 시간 평균 평균 속도를 기록합니다.
  5. 10-40°C에서 실험(4단계, 5.2단계 및 6.1-6.4단계)을 반복하여 시간 평균 평균 속도를 측정합니다. 기록된 평균 속도를 사용하여 평균 속도 대 온도를 플로팅합니다(그림4C)33.

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Representative Results

키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 준비하려면 키네신과 MT가 모두 필요합니다. MT는 소 뇌로부터 정제된 표지된 tubulins(단계 1.3 및 1.4)로부터 중합되었고(단계 1.1, 도 2A),순도 향상을 위해 재활용(단계 1.2, 도 2B). 키네신 운동 단백질은 대장균(단계 2.1 및 2.2단계, 도 2B)41,52에서발현 및 정제하였다. 제조된 키네신 스톡의 농도는 주요 밴드 밝기와 재활용 된 튜불린의 밝기를 공지된 농도와 비교하여 SDS 겔로 측정하였다(단계 2.3, 도 2B inset). 튜블린밴드(B)의밝기 값은 그들의 상응하는 농도(C)에 선형적으로 맞았고, 수학식 C=aB+θ를 사용하여, 3.1×10-2 mg/mL 및 σ=8.7×10-4 mg/mL(도2C)을산출하였다. 피팅된 방정식은 측정된 밴드 밝기, Bk= 1,060을 적용하여 키네신 밴드의 농도를 결정하기 위해 사용되었고, Ck= 0.95 mg/mL의 키네신 농도를 산출하였다. 공지된 농도를 가진 MT 및 키네신 샘플을 활성 유체 샘플을 준비하기 위해 사용되었다. 활성 유체를 합성하고, 폴리아크릴아미드 코팅 플로우 셀에 적재하고, 셀을 UV 접착제(섹션 3 및4)46으로밀봉하였다.

온도와 함께 활성 유체 활성의 제어를 입증하기 위해, 활성 유체 샘플을 집에서 만든 온도 단계(단계 5.2, 도 3A-C)에장착하였다. 샘플 온도는 비례 적분 유도체(PID)알고리즘(53)에따라 컨트롤러에 의해 모니터링 및 제어되었다. 10°C, 20°C, 30°C 및 40°C에서 제어되는 시료는 4시간 동안 0.1-0.3°C 이내의 온도에서 변동하는 것으로 나타났으며, 이러한 온도 제어 설정의 안정성 및 신뢰성을 입증하였다(그림3D).

샘플을 관찰하기 위해, 설정은 에피플루오레시크 현미경에 장착하였다. 샘플은 GFP 채널을 통해 형광 현미경으로 이미지 된 Alexa 488 표지 추적자를 도핑하였다 (단계 6.1). 트레이서는 모든 Δt = 2s를 이미지화되었다. 추적자 궤적 ri를추적하는 데 허용된 순차적 이미지는 트레이서 인덱스를 나타내며(단계 6.2, 도 4A). 궤도는 평균 속도 v(t) <| ri(t)- ri(t- Δt)|/Δt>I (6.3단계). 20-36°C에서 측정된 평균 속도는 t =0-2h에서 거의 시간 무관한 것으로 나타났으며, 반면 10°C 및 40°C에서는 평균 속도가 빠르게 감소했습니다(그림4B). 10°C에서의 감쇠는 16°C 이하의 MT 탈중합에 의해 야기되었다. 40°C에서의 부패는 36°C 이상으로 오작동하는 키네신 클러스터에 기인하였다. 우리의 이전 연구에 따르면 이 키네신 모터 클러스터는 >36 °C33에서사전 입양후 의 MT쌍을 구동하는 능력을 상실한다. 이러한 요인에 의해 유도된 감쇠를 반영하면서 각 온도에 대한 평균 속도를 특성화하기 위해, 평균 속도는 t=1-2h(단계 6.3 및 6.4 단계)33사이에서 평균화되었다. 시간 평균 평균 속도는 10°C-40°C 사이에서 측정되었다(단계 6.5, 도 4C). 16°C 이하및 36°C 이상에서는 MT 탈중합 및 오작동 키네신클러스터(33)로인해 평균 속도가 빠르게 감소하는 반면, 온도를 16°C에서 36°C로 증가시키면 평균 속도가 4~8μm/s로 가속화되어 온도를 사용하여 활성 유체 흐름의 평균 속도를 조정하는 타당성을 입증했습니다. 온도 제어의 기능을 더욱 입증하기 위해 시스템 온도를 30분마다 20°C및 30°C 사이에서 교대로 하였다. 활성 유체의 평균 속도는 그에 따라 가속 및 감속뿐만 아니라 10 초 이내에 온도 변화에 반응했습니다(그림 5). 이러한 활성 유체의 가역적이고 빠른 반응은 유체 활동을 동적으로 제어하기 위해 온도를 사용하는 작업성을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 키네신 구동 MT 기반 3D 활성 유체의 도입. (A)인터필라멘트 슬라이딩의 회로도. 반병렬 MT 쌍은 고갈제에 의해 번들로 구동되고 모터 클러스터에 의해 떨어져 구동되었다. (B)모터 클러스터는 총2쌍의 MT를 구동하여 MT 번들을 확장합니다. (C)열반 번들은 주변 액체를 교반하여 흐름을 유도하는 MT 계 활성 겔(green)을 구성하였다. 흐름을 추적하기 위해, 액체를 트레이서(빨간색)로 도핑하였다. 이 그림은 Bate 외33에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 튜불린 및 키네신 정제로부터의 SDS 겔의 이미지. (A)정제 된 튜불린의 SDS 젤을 이미지. (B)재활용 된 튜불린 및 정제 된 키네신의 SDS 젤을 이미지화. 왼쪽에서 오른쪽으로 차선은 단백질 표준, 빈, 1.25-0.25 mg/mL 재활용 tubulins, 빈, 그리고 키네신 주식. (C)정제된 키네신의 농도는 대역 밝기를 측정된 농도(인세트내의 적색 및 청색 파선 직사각형)와 튜불린의 순차적 밴드와 비교하여 결정하였다. 각 밴드의 밝기는 잘리고 있는 밴드 이미지 내의 픽셀 값을 합산하여 측정되었습니다. 배경 노이즈를 줄이기 위해 젤 이미지를 자르기 전에 회색조로 전송한 다음 흑백 반전을 한 다음 대비를 강화하여 검정 배경(인세트)을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 온도 제어 설정. (A)온도 조절 설정을 위한 알루미늄 블록의 회로도. 블록에는 물이 이를 통해 흐르고 TEC에서 생성된 열을 운반할 수 있는 내부 채널이 포함되어 있습니다. 중앙 구멍은 한쪽에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 견본을 비추고 반대편에 있는 객관적인 으로 심상하는 것을 허용합니다. (B)온도 조절 설정의 회로도. 실리콘 열 페이스트는 알루미늄 냉각 블록과 TEC 사이에 그리고 TEC와 사파이어 디스크 사이에 적용됩니다. (C)온도 조절 단계에 장착된 시료를 이미지화한다. 물 튜브는 물 저장소에 침지 펌프에 연결됩니다. (D)각각 10°C, 20°C, 30°C 및 40°C의 목표 온도에 대해 시간 대비 샘플 온도를 기록하였다. 샘플 온도는 0.1-0.3°C의 변동을 갖는 온도에서 유지되었다. B와 D는 베이트 외33에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 활성 유체가 온도를 통해 흐릅니다. (A)이미징 트레이서(흰색 점)를 통해 흐름 궤적을 순차적으로 추적할 수 있습니다(기타 색의 곡선). 트레이서는 실온(~20°C)에서 5s(Δt= 5s) 마다 모니터링하였다. (B)트레이서 평균 속도 대 10°C, 20°C, 30°C, 36°C, 40°C, 각각. (C)트레이서 평균 속도 대 온도. 각 점은 첫 번째 및 두 번째 시간 동안의 평균 추적자 평균 속도를 나타냅니다. 16°C 이하의 MTs는 중합을 비중화하고, 36°C 이상, 키네신 클러스터는 오작동하였다. 따라서 작동 온도는 16-36 °C 사이이며 평균 속도는 4-8 μm /s에서 다양합니다. 오류 막대는 시간 평균 평균 속도의 표준 편차를 나타냅니다. B와 C는 베이트 외33에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 주기적으로 시스템 온도를 번갈아 가며 활성 유체의 유속을 번갈아 가며. 30분마다 20°C에서 30°C 사이의 온도를 전환하여 유속을 가속하고 감속하여 온도에 따라 활성 유체 활동을 국부적인 제어로 입증합니다. 이 그림은 Bate 외33에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

장소에서 활성 물질을 제어하는 것은 활성 물질의 지시 자기 조직에 문을 엽니 다4,5,24,28,54. 본 기사에서는, 시스템29,30,31의아레니우스 특성에 기초하여, 온도를 이용하여 키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 동위내로 제어하는 프로토콜을 제시한다. 시스템은 단백질 기반이기 때문에 실험 전반에 걸쳐 단백질 기능을 유지하는 것이 프로토콜을 성공적으로 적용하는 데 중요합니다. 시스템의 주요 단백질은 MTs와 키네신 클러스터입니다. 전자는 16 °C 이하의 중합체화되고 후자는 36 °C33이상의 오작동을 합니다. 따라서 16-36°C 사이의 시스템 온도를 유지하는 것은 활성 유체가 꾸준한 역학을 개발하고 가역적으로 온도에 대한 반응을 가능하게 하는 데 필수적입니다(그림4 및 그림 5). 그러나, 온도는 목표온도(53)를오버슈트하는 경향이 있는 PID 알고리즘에 기초하여 제어된다. 이 오버슈팅을 줄이려면 최종 목표 온도를 설정하기 전에 여러 중간 목표 온도를 설정하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 35°C에서 직접 목표 온도를 설정하는 대신 실온(약 20°C)에서 35°C로 시료를 가열하려면 30°C의 중간 목표 온도를 설정하여 온도가 36°C 이상으로 상승하여 단백질33을돌이킬 수 없게 손상시킬 가능성을 줄이는 것이 좋습니다. 유사하게, 시료를 실온에서 ~16°C로 냉각시킬 때, 정상 상태에 도달하기 전에 PID가 16°C 이하의 시료를 냉각시키고, MTs33을비중화시킬 수 있기 때문에, 18°C의 중간 목표 온도를 설정하는 것이 좋습니다.

제시된 온도 제어 방법은 TEC를 사용하여 냉각 및 가열에 의존합니다. TEC의 사용은 샘플이 몇 초 내에 목표 온도에 도달하는 것을 보장하는 반면, 온도 제어 수조를 이용한 종래의 온도 제어 설정은 원하는 온도에 도달하는 데 몇 분이 걸립니다(도 55)55. TEC는 알루미늄 내부 물 순환 시스템에 의해 방출되는 제로 가용 열을 생성합니다. 그러나, 물은 결국 채널(56)을막히게됩니다 곰팡이가 성장 할 수 있습니다. 막힌 채널은 물 흐름을 억제하고 열은 결국 물 튜브를 녹이는 알루미늄 블록에 축적됩니다. 용융된 튜브는 현미경과 카메라위로 물이 유출되어 전자 기기를 손상시게 합니다. 따라서 제시된 온도 조절 설정을 채택하려면 곰팡이 성장57,58,59를억제하기 위해 물에 0.1 %의 과산화수소를 추가하는 것이 좋습니다. 이 단계를 통해 알루미늄 내부 채널이 막힘 상태로 유지되고 인근 전자 기기의 물 손상을 방지할 수 있을 것으로 기대합니다.

온도를 조작하고, 폴리아크릴아미드로 유동 셀 표면을 코팅하고, 활성 유체를 합성하는 것은 이 것을 실체 제어 활성 유체에서 실현하기 위한 세 가지 중요한 단계입니다. 그러나, 이 통제성은 관련시킨 단백질이 정상적으로 작동할 수 있는 온도 범위로 제한됩니다. 활성 유체 시스템에서, 1 차적인 단백질은 16-36 °C33사이에서 일반적으로 작동하는 MTs및 키네신 군집입니다. 이 온도 범위 내에서 활성 유체는 평균 유속을 4-8 μm/s(그림4C)에서다양합니다. 이 범위를 벗어난 평균 속도는 제시된 제어 방법의 한계를 초과합니다. 대조적으로, Ross et al.은 빛28을사용하여 활성 유체 활동을 켜고 끌 수 있는 대안을 보고했다. 또한 광 제어는 광학적으로 정의된 경계에서 활성 유체를 활성화할 수 있습니다. 그러나, 이러한 대안은 현미경으로 광학 경로를 튜닝과 함께 키네신 구조를 수정해야 합니다. 이에 비해, 본 문서에 제시된 방법을 채택하는 장점은 1) 활성 유체를 재설계할 필요가 없고, 2) 현미경을 수정할 필요가 없으며, 3) 온도 조절 설정은 저렴하고 사용하기 쉬우며, 4) 글라이딩 분석법29,30,31,32 및 62 이상 및 일반적으로60 개 이상의 시스템 과 같은 다른 온도 의존 시스템으로 이송 가능한 방법 우리는 또한 제시된 방법이 채널 흐름이 밸브없이 국부적으로 제어되는 미세 유체 시스템을 설계하는 문을 열 것으로 기대합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

플라스미드 K401-BCCP-H6는 즈보니미르 도딕 박사의 선물이었습니다. 이 연구는 우스터 폴리 테크닉 대학에서 박사 쿤 타 우의 창업 기금에 의해 지원되었다. 우리는 튜불린을 정화하고 라벨링하고 활성 유체를 합성하는 프로토콜에 대한 Zvonimir Dogic 박사에게 감사드립니다. 우리는 단백질 발현 및 정제에 대한 그의 전문 지식에 대한 마크 리딜라 박사에게 감사드립니다. 윌리엄 벤자민 로저 박사님이 온도 조절 스테이지를 구축할 수 있도록 도와주신 것에 대해 감사드립니다. 당사는 생물학적 물질 시설(BMF)의 사용에 대해 Brandeis MRSEC(NSF-MRSEC-1420382)를 인정합니다. 우리는 연약한 물질에베이트 외의 수치를 적응하기위한 화학의 왕립 학회를 인정33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

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