Summary
Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.
Abstract
La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L'ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell'obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell'ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell'ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l'ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all'interno dell'ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti adisposti.
Introduction
La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l'omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l'ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l'ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.
Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L'obesità è associata a ipertrofia eccessiva adipocite e ipossidi cellulare, difetti nel metabolismo cellulare adipocitico, e reticolato endoplasmico del tessuto adiposo e stress ossidativo e infiammazione. Anche se poco compresi, questi processi complessi cospirano per compromettere la capacità di tamponamento dei nutrienti del tessuto adiposo, portando a overflow dei nutrienti dal tessuto adiposo, tossicità nei tessuti multipli e malattia metabolica sistemica3,4 ,5. La sequenza di eventi e meccanismi specifici che sono alla base dell'insufficienza del tessuto adiposo sono poco conosciuti, ma sono state implicate alterazioni nel tessuto adiposo ECM. La composizione ECM è alterata all'interno del tessuto adiposo nell'obesità umana e murina, con una maggiore deposizione di proteine ECM insieme a differenze biochimiche e strutturali qualitative nel tessuto adiposo associato alla malattia metabolica umana, tra cui diabete di tipo 2 e iperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Nonostante queste osservazioni, il ruolo del tessuto adiposo ECM nella mediazione della disfunzione del tessuto adiposo non è ben definito. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di modelli sperimentali trattabili che consentono la dissezione dei ruoli specifici dell'ECM e degli adipociti nella regolazione della funzione adiposa finale dei tessuti. La coltura ECM-adipocite simula meglio l'ambiente in vivo del tessuto nativo adiposo in almeno due aspetti. In primo luogo, la coltura ECM fornisce un ambiente molecolare simile al tessuto adiposo nativo, tra cui collageni nativi, elastine e altre proteine matriciali assenti nella coltura 2D standard. In secondo luogo, la coltura sulla plastica 2D ha dimostrato di alterare il metabolismo degli adipociti attraverso effetti meccanici a causa della diminuzione dell'elasticità del substratoplastico 12, che ECM-cultura elimina.
I metodi per progettare scaffold biologici isolando l'ECM dall'adiposi decellularizzato e da altri tessuti sono stati studiati nel contesto della medicina rigenerativa e ricostruttiva e dell'ingegneria tissutale13,14, 15,16,17,18. Abbiamo precedentemente pubblicato una metodologia in cui abbiamo adattato questi metodi per sviluppare un modello in vitro 3D di coltura umana ECM-adipocyte, utilizzando ECM e cellule staminali adipocite (preadipociti) derivate da tessuti adipose viscerali umani11. Nel presente articolo vengono descritti questi metodi in dettaglio. La procedura di decellularizzazione per il tessuto adiposo umano è un processo di quattro giorni che prevede trattamenti meccanici ed enzimatici per rimuovere cellule e lipidi, lasciando uno scaffold biologico che mantiene le caratteristiche del tessuto da cui è derivato. L'ECM decellularizzato supporta la differenziazione adipogenica dei preadipociti umani e, se ricostituita con adipociti, mantiene la microarchitettura e le caratteristiche biochimiche e specifiche della malattia del tessuto adiposo intatto e si impegna in funzioni caratteristiche del tessuto adiposo nativo. Questa matrice può essere studiata da sola o reseeded con le cellule, permettendo lo studio delle interazioni e crosstalk tra i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto adiposo.
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Protocol
Tessuti adiposi sono acquistati da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica elettiva sotto l'approvazione del comitato di revisione istituzionale.
1. Isolamento dei preadipociti e preparazione del reagente culturale
- Preparare il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x soluzione salina tamponata da fosfato (PBS). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare collagenasi di tipo II: 2 mg/mL nel 2% BSA in 1x PBS. Preparare immediatamente prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lisiera deionizzata del Red Blood Cell (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in acqua deionizzata (DI/H2O). Conservare a 4 gradi centigradi. Preparare 1x RBC Lysing Solution da 10x soluzione stock in DI/H2O immediatamente prima dell'uso.
- Preparare growth Media: 15% siero bovino fetale (FBS), 1% soluzione antibiotico-antimicotico (ABAM) nell'Aquila media modificata di Dulbecco: miscela nutritiva F-12 (DMEM/F12). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione di congelamento preadipocito: 10% di zolfo dimetile, 15% FBS nei media DMEM/F12. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare i supporti di differenziazione: 10 mg/L transferrin, 33 - soluzione di biotina M, 0,5 M soluzione di insulina umana, 17 sale acido acido pantotnico di emicalcio, 100 nM dexamethasone, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironine sale di sodio (T3), 1M ciglitizone, 540- Isobutyl-1-metilxanthine (IBMX), 1% ABAM in DMEM/F12. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione del reagente ECM
- Preparare la soluzione del buffer di congelamento: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenilmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) in DI/H2O. Stir soluzione per sciogliere EDTA. Regolare il pH a 8,0 con HCl o NaOH.Store a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Preparare la soluzione ezimatica #1: 1% ABAM in 0.25% trypsin-EDTA. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Preparare la soluzione del buffer di risciacquo: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF in died/H2O. Stir per sciogliere i sali. Regolare pH a 8.0 con HCl o NaOH. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
- Preparare la soluzione enzymatic#2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4x 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Memorizzare 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi. Mescolare per sciogliere i sali. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 80 lipasi U/mL dal pancreas di porcina, tipo VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I dal pancreas bovino, tipo II-S; e 100 ribonuclease A g/mL dal pancreas bovino, tipo III-A.
- Preparare la soluzione di estrazione del solvente polare: 1% ABAM, 1% PMSF in isopropanolo.
AVVISO: l'isopropanolo è infiammabile; intratto relerabile in un armadietto a 25 gradi centigradi e smaltire i rifiuti infiammabili. - Preparare 70% etanolo, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Aggiungere ABAM e PMSF appena prima dell'uso.
AVVISO: l'etanolo è infiammabile; intratto relerabile in un armadietto a 25 gradi centigradi e smaltire i rifiuti infiammabili. - Preparare la soluzione di storage: 1% ABAM, 1% PMSF in 1x PBS. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
3. Preparazione del reagente di fenotipizzazione metabolica
- Assorbimento del glucosio
- Preparare siero starvation Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi
- Preparare 200 nM soluzione di insulina umana in 1x PBS immediatamente prima dell'uso.
- Preparare 200 nM di insulina umana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucose, 1 -Ci/well Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3 H(N)]-, in 1x PBS. Preparare immediatamente prima dell'uso.
- Lipolisi
- Preparare Isoproterenol diluito in PBS: soluzione di 3 mM. Diluire fino a lavorare la concentrazione di 3 M per il saggio.
- Colorazione olio rosso-o
- Preparare il 4% di formalina in DI/H2O. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di lavoro dell'olio Red-O. Diluire Olio Red-O Solution (ORO) con DI/H2O in un rapporto 3:2 (ORO:DI/H2O). Preparare immediatamente prima dell'uso. Filtrare la carta filtro (Tabella dei materiali).
4. Adiposo acquisto di tessuti
NOTA: Il tessuto adiposo viscerale (IVA) viene raccolto dal maggiore omentum all'inizio dell'operazione dal chirurgo e trasportato al laboratorio sul ghiaccio per la lavorazione immediata. Precauzioni universali devono essere utilizzate quando si maneggiano tutti i tessuti umani e reagenti caustici, compresa l'esecuzione di tutto il lavoro in una cappa a flusso laminare, utilizzando l'usura completa di sicurezza di laboratorio e nessuna ricapitolazione degli aghi.
- Aggiungere 5-10 g di IVA intatta a 15-25 mL di Soluzione buffer di congelamento in un tubo conico da 50 mL per immergere il campione di tessuto. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino alla decellularizzazione, fino a 1 mese.
- Utilizzare un campione fresco separato di IVA per l'isolamento preadipocito come descritto nella sezione 5.
5. Isolamento dei preadipociti
- Mettere 2 g di IVA intatta in 20 mL del collagenasi, tipo II, soluzione in un tubo conico da 50 mL. Quindi macinare accuratamente inserendo forbici sterili nel tubo conico e macinando il tessuto all'interno del tubo. Una volta completamente ammattato a un liquame fine, incubare il tessuto nella soluzione di collagenae su uno shaker orbitale a 130 giri/m e 37 gradi centigradi per 60 min.
- Filtrare il digerito risultante attraverso una rete di nylon da 100 m in un nuovo tubo conico da 50 mL versando il digestate da un tubo conico attraverso un pezzo di rete piegato sopra la parte superiore di un tubo conico fresco. Il digeststate a questo punto dovrebbe essere un liquido giallo-arancio con viscosità moderata, con piccole quantità di fili residui di tessuto fibroso non digerito. La mesh dovrebbe catturare pezzi più grandi di tessuto non digerito, che vengono scartati.
- Centrifugare il campione a 270 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di 1x RBC Lysing Solution con una pipetta.
- Incubare per 1 min a 25 gradi centigradi e quindi aggiungere 10 mL del 15% FBS-DMEM/F12. Centrifuga a 270 x g per 10 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL del 15% FBS-DMEM/F12 con una pipetta. Trasferire la sospensione cellulare a 100 mm piatto Petri con una pipetta e incubare a 37 c e 5% CO2, fino a quando le cellule raggiungono 80-100% confluenza, in genere 2-6 giorni. Cambiare i media ogni 2-3 giorni.
- Staccare e lavare le cellule.
- Rimuovere i supporti con una pipetta e applicare 4 mL di 0,25% trypsin-EDTA alle cellule aderenti. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min, ruotando periodicamente la piastra delicatamente per staccare le cellule.
- Aggiungere 20 mL di 15% FBS-DMEM/F12 e risospendere le celle staccate in questo supporto con una pipetta. Quindi trasferire in un tubo conico fresco 50 mL e centrifugare 270 x g per 10 min.
- Rimuovere il super-atuante e scartare. Lavare il pellet cellulare una volta in 1x PBS, quindi risospendere il pellet cellulare in 20 mL di fresco 15% FBS-DMEM/F12 con una pipetta. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura T-150.
- Cellule di coltura a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Suddividere ed espandere le cellule ogni 2-3 giorni mentre raggiungono l'80-100% di confluenza applicando 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA, espandendosi da un flacone a 8 fiasche.
NOTA: Questo richiede in genere 3-4 passaggi, che consente un'espansione appropriata e mantiene il potenziale adipogenico e i fenotipi metabolici cellulari specifici del paziente e del deposito. Il passaggio dei preadipociti superiori a 4-5 passaggi porta alla perdita del potenziale adipogenico. - Staccare le cellule in 8 flaconi con 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA per fiaschetta come descritto sopra, e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
- Aggiungere 8 mL di 15% FBS-DMEM/F12 per fiaschetta e rimettere in sospensione le celle staccate con una pipetta. Trasferire l'intera sospensione cellulare divisa uniformemente in tre tubi conici da 50 mL e centrifugare a 270 x g per 10 min.
- Risospendere i pellet cellulari risultanti in 5 mL di 15% FBS-DMEM/F12 in un tubo conico da 15 mL e celle di conteggio utilizzando il contatore cellulare e Trypan blu.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 270 x g per 10 min. Quindi risospendere quindi il pellet cellulare in Preadipocyte Freezing Solution a una concentrazione finale di cellule di 1 x 106/ mL e 1 mL di sospensione cellulare per tubo crioviale da 1,5 mL.
- Conservare le cellule in criovial per 1 giorni a -80 gradi centigradi. Quindi trasferire i crioviali in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine per 3-6 mesi.
- Quando è pronto per l'uso, scongelare un crioviale in un bagno d'acqua a 37 gradi per 3-5 min. Risospendere le cellule in 20 mL del 15% FBS-DMEM/F12 e centrifugare a 270 x g per 10 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 20 mL del 15% FBS-DMEM/F12, pipetta in un singolo flacone T-150, per poi crescere fino all'80% di confluenza in 2-3 giorni a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
- Scollegare le cellule con 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA per fiaschetta come descritto sopra nel passaggio 5.6. Risospendere a 3 milioni di celle per mL (ad esempio, 6 x 104 celle per 20 - L) nel 15% FBS-DMEM/F12 e utilizzarla come descritto di seguito (sezione 7, passaggio 7.4).
6. Preparazione ECM del tessuto adiposo
- Giorno 1: digestione congelata ed ezimatica #1
- Congelare i campioni di IVA precedentemente congelati (passaggio 4.2) memorizzati nella Soluzione buffer di congelamento in tubi conici da 50 mL da -80 a 37 gradi in un bagno d'acqua preriscaldato, incubando 20 min con delicata agitazione manuale periodica. Una volta scongelato, ritrasferirsi a -80 gradi centigradi e incubare 20 min. Ripetere il congelo 3x, terminando con lo scongelamento dei campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Utilizzando pinze sterili, trasferire i campioni di IVA a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di soluzione enzimatica #1, assicurando che i campioni di IVA siano completamente immersi. Poi incubare durante la notte su uno shaker orbitale (130 giri/min, 37 gradi centigradi).
- Giorno 2: digestione ezimatica #2
- Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio). Versare la soluzione Rinsing Buffer dopo ogni lavaggio.
- Trasferire campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di soluzione enzimatica #2 e incubare su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, durante la notte).
- Giorno 3: Delipidazione
- Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio). Versare la soluzione Rinsing Buffer dopo ogni lavaggio.
- Trasferire campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Polar Solvent Extraction Solution e incubare su uno shaker orbitale (130 giri/m, 25 gradi centigradi, durante la notte). Dopo questo passaggio, la maggior parte del lipido deve essere rimosso e i campioni devono essere di colore bianco o traslucido.
AVVISO: La soluzione di estrazione dei solventi polari è infiammabile e deve essere immagazzinata e utilizzata a 25 gradi centigradi.
- Giorno 4: Lavaggio e stoccaggio
- Trasferire i campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution. Lavare i campioni 3x su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio).
- Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di 70% di etanolo su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 c, 20 min ogni lavaggio) versando la soluzione di etanolo del 70% dopo ogni lavaggio.
- Lavare i campioni una volta con Storage Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio).
- Utilizzando pinze sterili, trasferire i campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Storage Solution. Assicurarsi che venga utilizzata una soluzione di archiviazione sufficiente per immergere completamente i campioni. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
7. Preparazione ECM-adipocyit
- Trasferire i frammenti ECM immagazzinati su singoli pozzi di piastra di 24 pozzetti utilizzando pinze sterili. Aggiungere tutti i frammenti ECM in altrettanti pozzi necessari per il test a valle pianificato (ad esempio, assorbimento del glucosio o lipolisi, vedi sotto), compresi i duplicati o triplicati. Lavare con 500 luna di 70% di etanolo 3x su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 c, 20 min ogni lavaggio).
- Reidratare l'ECM lavando 3x in sterile 1x PBS su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 , 20 min ogni lavaggio).
- Utilizzando forbici sterili, tagliare e pesare ECM in 100 frammenti di mg. Utilizzando pinze sterili, posizionare un frammento di 100 mg in ogni pozzo di una piastra di 24 pozzetti. Incubare a 25 gradi centigradi per 15 min per consentire l'estrusione di PBS in eccesso dai frammenti. Rimuovere con cautela l'eventualità in eccesso di PBS con una pipetta.
- Seme ogni 100 mg frammento ECM con 20 litri di sospensione cellulare preadipocito (3 milioni di cellule per mL, 6 x 104 celle per 20 l, in 15% FBS-DMEM/F12, dal passo 5.10). Pipette le cellule direttamente nell'ECM posizionando la punta della pipetta nell'ECM ed espellendo delicatamente la sospensione cellulare al centro della matrice, facendo attenzione che la sospensione cellulare non si trasripare e finisca sul fondo del pozzo.
- Se la sospensione cellulare sta traboccando dall'ECM in cui è stata posizionata la punta della pipetta, rimuovere la punta da tale posizione e inserirla in un altro punto dell'ECM. Incubare semi ECM per 40 min a 37 .
NOTA: per l'estrazione dell'RNA per qrtPCR, si estorcere ogni 500 mg di frammenti ECM con 3 x 105 celle in 100 (3 milioni di cellule per mL, vale a dire 3 x 105 cellule per 100L, in 15% FBS-DMEM/F12).
- Se la sospensione cellulare sta traboccando dall'ECM in cui è stata posizionata la punta della pipetta, rimuovere la punta da tale posizione e inserirla in un altro punto dell'ECM. Incubare semi ECM per 40 min a 37 .
- Riempire ogni pozzetto della piastra di 24 pozzetti con 500 gradi di supporti di crescita per coprire i frammenti ECM di semi. Coltura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 72 h.
- Dopo 72 h, aspirare con attenzione 15% FBS-DMEM/F12, inclinando leggermente la piastra per consentire al supporto di poolsotto frammento, e posizionando la punta pipetta appena adiacente al frammento ECM senza disturbarlo. Dopo aver aspirato, aggiungere 500 l of Differentiation Media, cambiando i media ogni 2-3 giorni utilizzando una tecnica simile, per un periodo culturale totale di 14 giorni.
- Verificare la differenziazione con microscopia leggera: le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore giallo-marrone e di forma più sferica.
NOTA: Matrici di semi possono essere utilizzate per test metabolici (ad esempio, analisi dell'assorbimento del glucosio, analisi della lipolisi, ORO), istologica o immunohistochimica (IHC) o imaging di tessuto standard. Per la colorazione e l'imaging ORO a tessuto fisso, congelare i campioni ECM-adipocyte in azoto liquido.
- Verificare la differenziazione con microscopia leggera: le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore giallo-marrone e di forma più sferica.
8. Fenotipizzazione metabolica
- Microscopia elettronica a scansione
- Fissare i campioni in glutaraldeide 2,5% nel buffer di fosfato di Sorensen a 25 gradi centigradi per 12 h. Postfix in 1% di tetrossido di osmio nel buffer fosfato di Sorensen a 4 gradi centigradi per 1 h.
- Campioni disidratati serialmente in etanolo. Lavare in hexamethyldisalizane e asciugare all'aria. Quindi montare su uno stub di microscopia elettronica a scansione con grafite colloidale. Secco, e sputter-coat con oro.
- Acquisire immagini con un microscopio elettronico a scansione.
- Colorazione olio rosso-o
- Tessuto vivo: soluzione oil Red-O
- Aspirare con cura i media dai pozzi con una pipetta. Quindi lavare i campioni una volta con 500 , l.l di 1x PBS per pozzo.
- Fissare i campioni con 200 - L del 4% di formalina in sterile deionizzato H2O a 25 gradi centigradi per 15 min.
- Aggiungete 200 di 60% di campioni di isopropanolo a 25 gradi centigradi per 5 min. Aspirate 60% isopropanolo con una pipetta.
- Campioni di macchia con soluzione di lavoro Olio Red-O a 25 gradi centigradi per 5 min. Aspirate Oolio con una pipetta e quindi lavare i campioni 3x con 1x PBS (500 . Quindi immagine con un microscopio ottico.
- Tessuto fisso: Kit macchia oil Red-O
- Campioni ECM-adipociti congelano in flash-congelare il composto e la sezione (5 m) su un criostato.
- Posizionare il vetrino in glicole propilene dell'85% in DI/H2O per 2 min.
- Posizionare la diapositiva nell'Ematossialina di Modified Mayer dal kit di colorazione Oil Red-O per 1 min. Sciacquare due volte con DI/H2O.
- Montare la vela utilizzando un supporto di montaggio acquoso e l'immagine su un microscopio.
- Estrazione di RNA da ECM per qrtPCR
NOTA: Per massimizzare la resa dell'RNA, utilizzare 500 mg frammenti ECM seminato con 3 x 105 preadipociti in 100 L e differenziare come sopra in 6-well piastre in 3 mL di supporti di differenziazione per bene.- Una volta differenziato, trasferire ogni singolo campione di ECM-adipocyte in un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio utilizzando pinze sterili.
- Lavare bene vuoto con 500 l di Buffer RLT. Aggiungere buffer RLT a 50 mL tubo conico con il campione ECM-adipocyte corrispondente.
- Utilizzando forbici sterili, tritare finemente ogni campione di ECM-adipocyte all'interno del tubo conico da 50 mL, tenendo il tubo sul ghiaccio, inserendo le forbici nel tubo conico per tritare il tessuto.
- Congelare e scongelare completamente i tubi conici da -80 a 37 c 3x.
- Centrifuga tubi conici a 500 x g e 4 gradi centigradi per 10 min.
- Rimuovere con attenzione il supernatante con una pipetta e utilizzare per l'estrazione dell'RNA con un kit di estrazione RNA del tessuto fibroso (Tabella dei materiali).
- Tessuto vivo: soluzione oil Red-O
- Saggio di assorbimento del glucosio
- Differenziare 6 x 104 preadipociti in frammenti ECM da 100 mg in 0,5 mL di mezzo di differenziazione in piastre 24-well come descritto sopra (sezione 5).
- Dopo 14 giorni di differenziazione, rimuovere il mezzo e lavare ECM-adipociti una volta con 1x PBS. Aggiungere 0,5 mL/pozzo Serum Starvation Medium e cultura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 12 h.
- Rimuovere le cellule medie e di lavaggio due volte con 1x PBS. Aggiungere 0,5 mL/po' 2% BSA in PBS e cultura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 2 h.
- Lavare le cellule una volta con 1x PBS, aggiungere 0,5 mL/po1x PBS con o senza 200 nM di insulina e incubare a 37 gradi centigradi per 40 min.
- Aspirati 1x PBS, aggiungere 0,5 mL/po1X PBS con 0,1 mM 2-deossiosa-D-glucosio, 2 s.l.ml deossiosa-D-glucosio, 2- [1,2-3H(N)], con o senza 200 nM di insulina, e incubare a 37 C e 5% CO2 per 40 m. reagenti radioattivi e rifiuti, come richiesto dagli statuti normativi istituzionali locali.
- Rimuovere il mezzo con una pipetta e lavare le cellule 3x con 1x PBS. Aggiungere 420 -L di 1% soluzione SDS in DI/H2O, e le cellule di lise con pipettaggio vigoroso. Incubare 25 gradi centigradi per 10 min.
- Raccogliere 5 l da ogni pozzo per l'andetto proteico di Bradford. Trasferire 400 luna di lisa cellulare rimanente in 2 mL di liquido scintillante in una fiala scintillante. Contare 3Attività H-2DG sul contatore scintillazione. Analizzare i dati come conteggi al minuto normalizzati alle proteine, mg/mL.
- Saggio di Lipolisi
- Differenziare 6 x 104 preadipociti in frammenti ECM da 100 mg in 0,5 mL di mezzo di differenziazione umana in piastre 24-well come descritto sopra (sezione 5).
- Dopo 14 giorni di differenziazione, rimuovere le cellule medie e di lavaggio due volte con 1x PBS caldo. Aggiungere 0,5 mL di mezzo di fame del siero (senza insulina) con o senza 3 isoproterenolo, e adipociti della coltura a 37 e 5% di CO2 per 72 h.
- Raccogliere i supernatanti di coltura, che possono essere conservati a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per il saggio. Raccogliere l'ECM in tubi di microcentrismo per la quantificazione del DNA per la normalizzazione dei dati.
- Pipet 2 - L di ogni supernatant in una micropiastra da 96 pozzetti. Riserva pozzi per spazi vuoti (distillato H2O) e soluzione standard glicerolo fornita in Trigliceride Determination Kit.
- Aggiungere 270 ll di reagente di glicerolo libero dal Kit di determinazione del triglicerido ad ogni pozzo, pipetta da mescolare. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5 min.
- Misurare l'assorbimento a 540 nm su uno spettrometro a microplacca.
- Calcolare la concentrazione di glicerolo e normalizzare con il DNA di ECM:
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Representative Results
Preparazione del tessuto adiposo, semina con preadipociti e differenziazione in vitro in adipociti maturi provocano chiari cambiamenti morfologici sequenziali nel tessuto che consente la valutazione visiva del progresso in tutto il protocollo (Figura 1) . I preadipociti utilizzati per il seeding dell'ECM sono isolati utilizzando la digestione del collagene e da campioni separati di IVA (Figura 2). La microscopia elettronica a scansione dei costrutti ECM-adipocite in ogni fase dell'elaborazione rivela la decellularizzazione dell'ECM e la successiva ricapitolazione degli adipociti contenenti lipidi al risemestre e alla differenziazione (Figura 3). Il collagene 1-specific immunohistochemistry of decellularized ECM rivela la manutenzione della microarchitettura del collagene, mentre la colorazione olio rosso-o dei costrutti 3D ECM-adipocite vivi e fissi rivela costrutti di adipociti contenenti lipidi (Figura 4 A). qrtPCR da adipociti differenziati in ECM dimostra una marcata upregolazione dei geni adipogenici rispetto ai preadipoti indifferenziati coltivati in ECM (Figura 4B). La fenotipizzazione metabolica dei costrutti ECM-adipocite che studiano tutte le combinazioni di ECM e adipociti da soggetti diabetici (DM) e non diabetici (NDM) rivela alterate attività di glucosio e lipolitiche nei costrutti ECM-adipocite da DM relativo a NDM tessuti, ricapitolando i difetti metabolici specifici del DM che abbiamo precedentemente segnalato negli adipociti umani nella cultura 2D standard11. È importante sottolineare che l'NDM ECM salva l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e la capacità lipolitica negli adipociti DM (Figura 4C)11. Insieme, questi dati dimostrano la regolazione specifica della malattia del metabolismo cellulare degli adipociti da parte dell'ECM. Ulteriori dettagli sono riportati in Baker etal.
Figura 1: flusso di lavoro per la preparazione ECM-adipocyte. Giorno 1: I campioni interi di tessuto adiposo viscerale subiscono tre cicli di congelamento-disgelo seguiti da incubazione notturna con soluzione di digestione enzimatica #1. Giorno 2: Dopo la digestione con soluzione etcistica #1, i campioni vengono digeriti durante la notte con la soluzione di digestione etmatica #2. A questo punto, i campioni saranno parzialmente delipidati. Giorno 3: Dopo la digestione ezimatica #2, i campioni subiscono incubazione durante la notte con soluzione di estrazione del solvente polare, che completerà la delipidazione. Dopo il giorno 3, i campioni devono essere completamente delipidati e di colore bianco/traslucido. I campioni vengono lavati accuratamente con la soluzione tampone di risciacquo, quindi con il 70% di etanolo e conservati in una soluzione di stoccaggio a 40 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per il reseeding con preadipociti. Giorno 4: I preadipociti vengono semiati in IVA decellularizzata seguita da differenziazione adipogenica per 14 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: flusso di lavoro per l'isolamento preadipocito. L'IVA viene macinata, digerita con collagenasi, filtrata, centrifugata e il pellet delle cellule stromovascolari risultante placcato e coltivato per espandere i preadipociti. Vedere Baker et al. 201721 per ulteriori dettagli sull'isolamento dei preadipociti umani e sulla cultura degli adipociti 2D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Scansione di immagini di microscopia elettronica. Tessuto adiposo intatto, decellularizzato il tessuto adiposo, e decellularizzato il tessuto adiposo ripopolato con preadipociti e differenziato in media adipogenici per 14 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione degli adipociti in ECM. (A) Il tessuto adiposo decellularizzato ECM mantiene la microarchitettura e supporta la differenziazione degli adipociti: Top: Collagen 1 immunohistochimica dell'intera IVA umana prima e dopo la decellularizzazione dimostrando il mantenimento della microarchitettura; centro: fotomicrografie confocali 3D di adipociti umani vivi all'interno di ECM; intatta IVA umana decellularizzata macchiata con olio rosso-O prima di reseeding con preadipociti, 4 giorni dopo la semina, e 14 giorni dopo la semina con preadipociti seguiti da differenziazione adipogenica; blu: colorazione DAPI dei nuclei cellulari; rosso: colorazione olio rosso-o del lipido intracellulare; in basso: Formalin-fixed, paraffina-embedded, 5 m sezionato, IVA umana macchiata di olio rosso-O prima della decellularizzazione, subito dopo la decellularizzazione, e dopo la decellularizzazione, preadipocite-seeding, e 14 giorni di differenziazione adipogenica, che manifestano l'accumulo di lipidi citoplasmici negli adipociti all'interno dell'ECM. (B) Adipociti in ECM upregulate adipogenic espressione genica: analisi qrtPCR confrontando i livelli di trascrizione genica adipogenici in RNA da adipociti IVA umana differenziati in IVA ECM per 14 giorni rispetto a preadipoti indifferenziati in IVA ECM coltivato per 72 h in media non adipogenici. I dati sono medi : SEM. ACLY: ATP citrato lyase, ATGL: adiposo triglicerio lipase, FASN: sintetetica acido grasso, PPARg: gamma di recettore attivato perossisoico; coordinata: differenza di piegatura nel livello di trascrizione negli adipociti maturi rispetto al referente preadipocito indifferenziato 1; tutte le differenze di piegatura significative (p<0.001, t-test accoppiato); ECM da 10 soggetti, preadipociti/adipociti da n. 11 soggetti. (C) ECM regola il metabolismo degli adipociti in modo specifico del DM: 3D-ECM da soggetti DM o NDM seminati con preadipociti da soggetti DM o NDM, differenziati in adipociti e studiati con fenotipizzazione metabolica. Barre dei dati etichettate con fonte di paziente (NDM, DM) di ECM e adipociti (ECM/AD); ad esempio, NDM/NDM indica sia ECM che preadipociti derivati da pazienti NDM, mentre NDM/DM denota ECM da pazienti NDM combinati con preadipociti di pazienti affetti da DM. I dati sono medi: SEM. Ordinate: assorbimento di glucosio (cpm), normalizzato alla concentrazione di proteine lisa eCM/cellule (mg/mL); lipolisi: concentrazione di glicerolo sovrinnovante coltura (mg/mL) normalizzata in ECM/cellula lysatiro concentrazione di DNA(ng/mL); Il confronto tra il punto dati indicato e il punto dati indicato è indicato al punto dati indicato (basale o insulino-stimolato per l'assorbimento del glucosio, basale o isoproterenol per la lipolisi) nel braccio DM/DM, utilizzando l'analisi del modello misto per la regolazione ripetuta del modello misure; ECM a partire da n.9 NDM, 8 soggetti DM, preadipociti da 10 NDM, 9 soggetti DM per l'assorbimento del glucosio; ECM da 6 NDM, 6 soggetti DM, preadipociti da 6 NDM, 6 soggetti DM per la lipolisi. Questa cifra è stata adattata da O'Rourke e Lumeng11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell'ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell'estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, mentre la matrice dovrebbe passare da un colore giallo-arancio caratteristico del tessuto adiposo intatto a bianco (Figura 1). Se questi cambiamenti di colore non si verificano, è probabile che la delipidazione non sia completa. La variabilità inter-paziente nell'efficienza delipidazione è comune, ma ad oggi non abbiamo osservato alcuna correlazione di efficienza della delipidazione con lo stato DM soggetto, età, BMI, o altre variabili cliniche. I campioni di grandi dimensioni (maggiori di 20 g) non subiranno un delipidazione efficiente; l'elaborazione di campioni <20 g può evitare questo problema. Se un campione non appare completamente delipidato dopo il giorno 3, dividerlo a metà con le forbici sterili, quindi trasferire i campioni a i 15-20 mL di Polar Solvent Extraction Solution e posizionarli su uno shaker orbitale per 3-5 h. Alcuni campioni potrebbero non decellularizzare completamente dopo aver ripetuto la fase di estrazione del solvente polare. Se la maggior parte del campione è decellularizzato, è possibile ritagliare le sezioni contenenti lipidi prima di utilizzare il campione negli esperimenti.
La contaminazione può verificarsi se la sterilità non viene mantenuta diligentemente durante tutto il processo. Tutto il lavoro deve essere eseguito in una cappa di flusso laminare utilizzando precauzioni standard per la coltura cellulare. In genere immagazziniamo l'ECM per un massimo di 3 mesi a 4 gradi centigradi, e i preadipociti per un massimo di 6 mesi in azoto liquido. La conservazione della biofunzionalità e delle proprietà specifiche delle malattie e dei depositi oltre questo periodo non è stata testata.
La microscopia confocale consente la visualizzazione di adipociti maturi all'interno dell'ECM, che possono essere migliorati con la colorazione Oil Red-O. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce anche un metodo non quantitativo per visualizzare gli adipociti all'interno di ECM. Da notare che seM e olio Red-O colorazione suggeriscono adipociti uniculari nei costrutti ECM-adipociti, una morfologia che è simile agli adipociti in vivo e in contrasto con i tipici adipociti multiloculari osservati quando i preadipociti subiscono adipogenici differenziazione su plastica 2D (Figura 3, Figura 4A). Questa osservazione suggerisce che l'ECM fornisce un ambiente più fisiologico per la differenziazione adipogenica rispetto alla coltura tissutale standard sulla plastica. La fissazione e il sezionamento dei costrutti ECM-adipocyte possono essere difficili, poiché i costrutti incorporati negli OGM sono fragili e non si seziono facilmente. Sezionamento tessuti incorporati immediatamente dopo la rimozione dallo stoccaggio dal congelatore -80 gradi c ed esecuzione di sezionamento in una cella frigorifera (4 gradi centigradi) su un criostato pre-freddo rende possibile il sezionamento.
La coltura ECM-adipocite fornisce un ambiente fisiologico che approssima l'ambiente tissutale in vivo e fornisce un ambiente sostenibile per la crescita e la differenziazione delle cellule staminali preadiciti, come dimostra l'upregolazione dei geni adipogenici nella cultura 3D-ECM-adipocyit. Le colture ECM-adipocite si impegnano anche in funzioni metaboliche adipocite, tra cui l'assorbimento di glucosio e lipolisi8. Riportiamo l'assorbimento del glucosio come cpm normalizzato a proteine totali estratte da colture ECM-adipociti misurate con un saggio Bradford, o al contenuto di DNA misurato con un kit di analisi del DNA, e abbiamo osservato risultati simili con entrambi i metodi. Allo stesso modo, riportiamo la lipolisi come mg/mL del rilascio di glicerolo normalizzato a proteine o DNA, anche con risultati simili ottenuti con entrambi i metodi di normalizzazione. Altri suggeriscono di normalizzare i dati metabolici adipociti al contenuto di lipidi, ma ad oggi i nostri tentativi di estrarre in modo affidabile il lipido dai costrutti ECM non hanno avuto successo. Segnalare il tasso di assorbimento del glucosio come talpe di glucosio per unità di tempo e lipolisi come talpe di glicerolo/acido grasso libero per unità di tempo può consentire confronti più accurati tra esperimenti separati. L'isolamento dell'RNA da ECM per l'analisi qrtPCR è caratterizzato da rese inferiori rispetto alle cellule nella coltura 2D, ma la preparazione di frammenti ECM più grandi seminato con più cellule supera questo problema, come descritto al punto 8.3.1. Abbiamo incontrato difficoltà nell'isolare quantità adeguate di proteine non degradate con fosforoeine intatte per l'analisi western blot, che rappresenta una limitazione del modello.
Una metodologia simile per isolare l'ECM dal tessuto adiposo e la seminazione con i preadipociti è stata pubblicata in precedenza, con prove che suggeriscono che l'ECM può promuovere la differenziazione adipogenica assente dai classici mediatori adipogenici, tra cui gli agonisti cAMP, insulina, e PPAR-agonisti12,14. I nostri dati sono i primi a dimostrare la regolazione specifica del metabolismo cellulare da parte dell'ECM nel tessuto adiposo, utilizzando metodi in cui gli adipociti vengono stimolati con i classici fattori di differenziazione adipogenici11; studi simili in assenza di stimoli adipogeni sono un obiettivo della ricerca futura. Altri hanno dimostrato un incrocio a cellule ECM specifico della malattia simile utilizzando ECM e cellule isolate dal tessuto polmonare19,20. Sono state impiegate anche strategie alternative, tra cui la creazione di matrici mescolando tessuti adiposi omogeneizzati ECM preparati in idrogel peptidi12.
Mentre la variabilità inter-paziente nel metabolismo cellulare degli adipociti umani è osservata sia nella cultura 2D-plastica che in quella 3D-ECM, se analizzate in forma aggregata, queste cellule manifestano differenze tra malattie, depositi e sesso nel metabolismo cellulare, il nostro gruppo e altri11,21,22,23,24, convalidando l'utilità e generalizzabilità di questi modelli di coltura per lo studio del metabolismo cellulare adipocitico. Abbiamo dimostrato che gli adipociti differenziati nell'ECM con corrispondenza con malattia (cioè gli adipociti NDM in NDM ECM, DM adipocites in DM ECM) ricapitolano i fenotipi metabolici degli NDM isolati e degli adipociti DM nella cultura 2D standard, supportando la cultura ECM-apocite come un modello per studiare le alterazioni specifiche della malattia nel metabolismo cellulare adipocito in un ambiente più fisiologico. Non abbiamo osservato differenze nella grandezza o nella direzione delle funzioni metaboliche, compreso l'assorbimento di glucosio o la lipolisi, quando vengono studiati ECM e adipociti provenienti da donatori uguali o diversi. In entrambi i casi, i costrutti ECM-adipocyte manifestano il fenotipo metabolico specifico del DM (ad esempio, una diminuzione della GU in DM/DM rispetto ai costrutti NDM/NDM), senza alcuna differenza chiara quando si confrontano costrutti composti da ECM e adipociti provenienti da donatori uguali o diversi .
La coltura ECM-adipocite consente di studiare combinazioni di ECM e preadipociti da popolazioni di pazienti e depositi di tessuti distinti, permettendo l'analisi dei contributi specifici di ECM e delle malattie e dei depositi per Fenotipo. Dimostrando questa forza del modello di coltura ECM-adipocyte, abbiamo dimostrato che ECM dal tessuto NDM ha la capacità di salvare i difetti metabolici in adipociti DM (Figura 4C)11. I dati preliminari nei tessuti adipose viscerali e sottocutanei morinosi suggeriscono che murino ECM regola il metabolismo murino adipocite allo stesso modo in modo specifico del deposito (dati inediti, O'Rourke RW, 2019), suggerendo che questo sistema modello può essere utilizzato per studiare Incrocio ECM-adipocyte sia nel sistema murino che in quello umano. Inoltre, questo modello consente di studiare la manipolazione isolata dell'ECM come mezzo per regolare il fenotipo del tessuto adiposo. Lo studio preliminare dell'ECM trattato in condizioni che inducono la glicazione specificamente mirata all'ECM, ad esempio, suggeriscono che queste modifiche regolano il fenotipo metabolico cellulare delle cellule successivamente semiate in ECM trattati (dati inediti, O'Rourke RW, 2019), fornendo un modello per lo studio degli effetti della manipolazione mirata dell'ECM sul fenotipo adipocite.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi contrastanti.
Acknowledgments
Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l'assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall'Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figura 4 di questo manoscritto è stata originariamente pubblicata in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, ed è stato riprodotto su autorizzazione della Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Per il permesso di riutilizzare questo materiale, si prega di visitare http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
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