Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

Published: November 7, 2019 doi: 10.3791/60486
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 5, 1,2, 1, 2,3,4, 1,6
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan Medical School, 3Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 4Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Michigan Medical School, 5Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 6Department of Surgery, Ann Arbor Veterans Affairs Healthcare System

Summary

نحن وصف 3D الإنسان مصفوفة خارج الخلية-الخلايا الشحمية في المختبر نظام الثقافة التي تسمح تشريح ادوار المصفوفة والخلايا الشحمية في المساهمة في النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي.

Abstract

المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دورا محوريا في تنظيم التوازن الانسجه ، والانخراط في المتبادل مع الخلايا وتنظيم جوانب متعددة من وظيفة الخلوية. ال ECM يلعب دورا هاما بشكل خاص في وظيفة الانسجه الدهنية في السمنة ، والتعديلات في الانسجه الدهنية ترسب المحتوي والتركيب ترتبط بالامراض الايضيه في الفئران والبشر. النماذج العريكته في المختبر التي تسمح بتشريح ادوار ECM والخلايا في المساهمة في النمط الظاهري للانسجه العالمية هي متفرقة. ونحن نقدم رواية 3D في نموذج المختبر للثقافة البشرية ECM-الخلايا الشحمية التي تسمح بدراسة الأدوار المحددة لل ECM والخلايا الشحمية في تنظيم النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي. الانسجه الدهنية البشرية هي decellularized لعزل ECM ، والتي يتم أعاده ملؤها فيما بعد مع الخلايا الشحمية التي يتم بعد ذلك تمييزها داخل ECM إلى الخلايا الشحمية ناضجه. ينشئ هذا الأسلوب بنيات الخلايا الشحمية التي تعمل بالأيض وتحافظ علي خصائص الانسجه والمرضي الذين يتم اشتقاقهم منها. وقد استخدمنا هذا النظام لإثبات المرض محدده ECM-الخلية الشحمية المتبادلة في الانسجه الدهنية البشرية. يوفر نموذج الثقافة هذا أداه لتشريح ادوار ECM والخلايا الشحمية في المساهمة في النمط الظاهري الأيضي للانسجه الدهنية العالمية ويسمح بدراسة دور ECM في تنظيم توازن الانسجه الدهنية.

Introduction

مصفوفة خارج الخلية (ECM) لا يوفر فقط سقالة ميكانيكيه للانسجه ، ولكن أيضا يشارك في المتبادل معقده مع الخلايا التي تعيش داخلها ، وتنظيم العمليات المختلفة اللازمة للتوازن الانسجه ، بما في ذلك انتشار الخلايا ، التمايز ، والإشارات ، والأيض1. علي الرغم من ان ECM الصحي يلعب دورا أساسيا في الحفاظ علي وظيفة الانسجه الطبيعية ، فقد تورط في امراض متعددة2.

الانسجه الدهنية يلعب دورا هاما في التسبب في الامراض الايضيه. ويرتبط السمنة مع تضخم الخلايا الشحمية المفرطة ونقص الأكسجين الخلوي ، والعيوب في الأيض الخلوية الشحمية ، والانسجه الدهنية الشبكية إندوبلازمي والاكسده والتهاب. في حين سوء فهم, هذه العمليات المعقدة يتامرون لاضعاف المغذيات الانسجه الدهنية القدرة التخزين المؤقت, مما يؤدي إلى تجاوز المغذيات من الانسجه الدهنية, سميه في الانسجه المتعددة, وامراض الأيض الجهازية3,4 ،5. تسلسل الاحداث واليات المحددة التي تكمن وراء فشل الانسجه الدهنية غير مفهومه بشكل سيئ ، ولكن التعديلات في الانسجه الدهنية ECM قد تورطت. يتم تغيير تكوين ECM داخل الانسجه الدهنية في السمنة البشرية والمريدين ، مع زيادة ترسب بروتين ECM جنبا إلى جنب مع الاختلافات النوعية البيوكيميائية والهيكلية في الانسجه الدهنية ECM المرتبطة بالامراض الايضيه البشرية ، بما في ذلك النوع 2 من السكري والدهون6,7,8,9,10,11.

وعلي الرغم من هذه الملاحظات, دور الانسجه الدهنية ECM في التوسط الخلل الوظيفي الانسجه الدهنية ليست محدده جيدا. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج تجريبية عريكة تسمح بتشريح الأدوار المحددة لECM والخلايا الشحمية في تنظيم وظيفة الانسجه الدهنية النهائية. ثقافة ECM-الخلايا الشحمية يحاكي أفضل في بيئة الجسم الطبيعي من الانسجه الدهنية الاصليه في اثنين علي الأقل من النواحي. أولا ، توفر ثقافة ECM بيئة جزيئيه مماثله للانسجه الدهنية الاصليه ، بما في ذلك الانسجه الاصليه ، واللدائن ، وغيرها من البروتينات المصفوفة الغائبة في الثقافة ثنائيه الابعاد القياسية. ثانيا, وقد أظهرت الثقافة علي 2D البلاستيك لتغيير الأيض الخلايا الشحمية عن طريق الآثار الميكانيكية بسبب انخفاض مرونة الركيزة البلاستيك12, الذي ECM-الثقافة يلغي.

وقد درست أساليب لهندسه السقالات البيولوجية عن طريق عزل ECM من الدهون الدهنية وغيرها من الانسجه في سياق الطب التجديدي والترميمي وهندسه الانسجه13،14، 15،16،17،18. وقد نشرنا سابقا المنهجية التي قمنا بتكييف هذه الأساليب لتطوير نموذج 3D في المختبر من ثقافة الإنسان-الخلية الشحمية ، وذلك باستخدام ECM والخلايا الجذعية الخلية الشحمية المستمدة من الانسجه الدهنية البشرية الأحشاء11. في هذه المقالة ، نقوم بوصف هذه الأساليب بالتفصيل. اجراء التقطير للانسجه الدهنية البشرية هو عمليه لمده أربعه أيام التي تنطوي علي العلاجات الميكانيكية والانزيميه لأزاله الخلايا والدهون ، وترك سقالة البيولوجية التي تحافظ علي خصائص الانسجه التي تستمد منها. Decellularized ECM يدعم التمايز اديبوغينيك من الخلايا الشحمية البشرية ، وعند أعاده تشكيلها مع الخلايا الشحمية ، ويحافظ علي الهندسة المجهرية والخصائص البيوكيميائية والامراض الخاصة بالانسجه الدهنية سليمه ويشارك في الأيض وظائف مميزه من الانسجه الدهنية الاصليه. هذه المصفوفة يمكن دراستها وحدها أو أعاده الانفصال مع الخلايا ، والسماح بدراسة التفاعلات والتبادل بين المكونات الخلوية وخارج الخلوية من الانسجه الدهنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم شراء الانسجه الدهنية من الأشخاص الذين يخضعون لجراحه السمنة الاختيارية تحت موافقه مجلس المراجعة المؤسسية.

1. العزل قبل الخلية واعداد كاشف الثقافة

  1. اعداد 2 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) في 1x الفوسفات مخزن محلول ملحي (تلفزيوني). تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  2. اعداد النوع الثاني كولاجيناز: 2 مغ/مل في 2 ٪ بوسني في 1x تلفزيوني. استعد فورا قبل الاستخدام.
  3. اعداد خليه الدم الحمراء (ربك) ليسينج الحل: 1.5 M NH4Cl ، 100 مم ناهكو3، 10 مم الصوديوم أدتا في ديمتاين المياه (دي/ح2س). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. اعداد 1x ربك ليسينج الحل من 10x حل الأسهم في DI/H2O مباشره قبل الاستخدام.
  4. اعداد وسائل الاعلام النمو: 15 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1 ٪ المضادة للمضادات الحيوية الحل (ABAM) في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM/F12). تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  5. اعداد محلول تجميد الخلايا الشحمية المسبقة: 10 ٪ ثنائي ميثيل سولفوكيد ، 15 ٪ في وسائل الاعلام DMEM/F12. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  6. اعداد وسائل الاعلام التمايز: 10 ملغ/لتر transferrin ، 33 μM البيوتين ، 0.5 μM محلول الانسولين البشري ، 17 μM D-الحمض الهيميكالسيوم ملح ، 100 nM ديكساميثازون ، 2 نانومتر 3 ، 3 ' ، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم (T3) ، 1 μM ciglitizone ، 540 μM 3- ايزوبوتيل-1-ميثيلززانيني (IBMX) ، 1 ٪ ABAM في DMEM/F12. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.

2. اعداد كاشف ECM

  1. اعداد تجميد الحل العازلة: 10 ملم تريس قاعده ، 5 مم أدتا ، 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ من فلوريد فينيلميثيل السلفونيل (PMSF) في DI/H2O. يحرك الحل لحل أدتا. ضبط درجه الحموضة إلى 8.0 مع حمض الهيدروكلوريك أو NaOH. يخزن في 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  2. اعداد الحل الانزيمي #1:1 ٪ ABAM في 0.25 ٪ التريبسين-أدتا. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  3. اعداد محلول الشطف العازلة: 137 mM NaCl ، 2.68 mM KCl ، 7 ملليمتر Na2hpo4، 1.5 mm KH2PO4، 1 ٪ abam ، 1 ٪ pmsf في تعقيم دي/ح2س. يحرك لأذابه الأملاح. ضبط درجه الحموضة إلى 8.0 مع HCl أو NaOH. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  4. اعداد الحل الانزيمي #2:55 mM Na2hpo4، 17 مم KH2PO4، 4.9 mm mgso4∙ 7h2o ، 1 ٪ abam ، 1 ٪ Pmsf في دي/ح2س. مخزن 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر. يحرك الخليط لأذابه الأملاح. مباشره قبل الاستخدام ، أضافه 80 U/mL ليباس من البنكرياس الخنازير ، نوع السادس-S. 160 U/mL ديوكسيريبونوكليسي الأول من البنكرياس البقري ، النوع الثاني-S ؛ و 100 ميكروغرام/مليلتر من البنكرياس البقري ، من النوع الثالث-الف.
  5. اعداد حل استخراج المذيبات القطبية: 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في الايزوبروبانول.
    تحذير: ايزوبروبانول قابل للاشتعال. يخزن في خزانه قابله للاشتعال عند درجه حرارة 25 مئوية ويتخلص من النفايات القابلة للاشتعال.
  6. اعداد 70 ٪ الايثانول ، 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في DI/H2O. أضافه abam و pmsf قبل الاستخدام فقط.
    تحذير: الايثانول قابل للاشتعال. يخزن في خزانه قابله للاشتعال عند درجه حرارة 25 مئوية ويتخلص من النفايات القابلة للاشتعال.
  7. اعداد حل التخزين: 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في 1x تلفزيوني. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.

3. اعداد كاشف التنميط الأيضي

  1. امتصاص الجلوكوز
    1. اعداد المصل التجويع وسائل الاعلام: DMEM/F12 ، 1 ٪ ABAM. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية
    2. اعداد 200 nM محلول الانسولين البشري في 1x تلفزيوني علي الفور قبل الاستخدام.
    3. اعداد 200 nM الانسولين البشري ، 0.1 mM 2-ديكسي-د-الجلوكوز ، 1 μCi/بئر ديكسي-د-الجلوكوز ، 2-[1 ، 2-3H (N)]-، في 1X تلفزيوني. استعد فورا قبل الاستخدام.
  2. Lipolysis
    1. اعداد ايزوبروتيرينول المخفف في التخزين التلفزيوني: 3 مم الحل الأسهم. تمييع لتركيز العمل من 3 μM لفحص.
  3. النفط الأحمر-O تلطيخ
    1. اعداد فورالين 4 ٪ في DI/H2س. مخزن في درجه حرارة الغرفة.
    2. اعداد النفط الأحمر-O حل العمل. تمييع النفط الأحمر-O الحل (ORO) مع DI/H2o في نسبه 3:2 (ORO: Di/h2o). استعد فورا قبل الاستخدام. تصفيه من خلال ورقه فلتر (جدول المواد).

4. شراء الانسجه الدهنية

ملاحظه: يتم جمع الانسجه الدهنية الباطنية (VAT) من القدر الأكبر في بداية العملية من قبل الجراح ونقلها مره أخرى إلى المختبر علي الجليد للمعالجة الفورية. يجب استخدام الاحتياطات العالمية عند التعامل مع جميع الانسجه البشرية والمواد الكاشفة الكاوية ، بما في ذلك أداء جميع الاعمال في غطاء التيار الرقائقي ، وذلك باستخدام السلامة المختبرية الكاملة ، وعدم اللف من الابر.

  1. أضافه 5-10 غرام من ضريبة القيمة المضافة سليمه إلى 15-25 مل من محلول التجميد العازلة في أنبوب مخروطي 50 mL لتزج عينه الانسجه. تخزين العينات في-80 درجه مئوية حتى التقطير ، لمده تصل إلى 1 شهر.
  2. استخدم عينه جديده منفصلة من ضريبة القيمة المضافة لعزل الخلايا الشحمية المسبقة كما هو موضح في القسم 5.

5. العزل المسبق للخلية

  1. ضع 2 غرام من ضريبة القيمة المضافة سليمه في 20 مل من كولاجيناز ، النوع الثاني ، الحل في أنبوب مخروطي 50 mL. ثم اللحم المفروم جيدا عن طريق إدخال مقص معقمه في أنبوب مخروطي والفرم الانسجه داخل الأنبوب. مره واحده مفرومه تماما إلى الطين غرامه ، احتضان الانسجه في محلول كولاجيناز علي شاكر المداري في 130 لفه في الدقيقة و 37 درجه مئوية ل 60 دقيقه.
  2. تصفيه digestate الناتجة من خلال شبكه النايلون 100 μm إلى أنبوب مخروطي جديد 50 mL عن طريق سكب digestate من أنبوب مخروطي واحد من خلال قطعه من شبكه مطوية علي الجزء العلوي من أنبوب مخروطي جديد. وينبغي ان يكون digestate في هذه المرحلة السائل الأصفر والبرتقالي مع اللزوجة المعتدلة ، مع كميات صغيره من خيوط المتبقية من الانسجه الليفية غير مهضوم. وينبغي للشبكة التقاط قطع أكبر من الانسجه غير المهضومة ، والتي يتم التخلص منها.
  3. الطرد المركزي العينة في 270 x g لمده 10 دقيقه أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 2 مل من 1x الحل ليسينج مع ماصه.
    1. احتضان لمده 1 دقيقه عند 25 درجه مئوية ومن ثم أضافه 10 مل من 15 ٪ من المعرضين لل-DMEM/F12. الطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  4. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق بيليه الخلية في 10 مل من 15 ٪ منها--dmem/F12 مع ماصه. نقل تعليق الخلية إلى 100 مم طبق بيتري مع ماصه واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، حتى تصل الخلايا 80-100 ٪ التقاء ، عاده 2-6 أيام. تغيير الوسائط كل 2-3 يوما.
  5. افصل الخلايا واغسلها.
    1. أزاله الوسائط مع ماصه وتطبيق 4 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا إلى الخلايا الملتصقة. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، ويحوم بشكل دوري لوحه بلطف لفصل الخلايا.
    2. أضافه 20 مل من 15 ٪-DMEM/F12 وأعاده تعليق الخلايا المنفصلة في هذه الوسائط مع ماصه. ثم نقل إلى جديد 50 mL أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي 270 x g لمده 10 دقيقه.
    3. أزاله ماده طافي وتجاهل. غسل بيليه الخلية مره واحده في 1x تلفزيوني ، ومن ثم أعاده التعليق بيليه الخلية في 20 مل من الطازجة 15 ٪-DMEM/F12 مع ماصه. نقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة T-150.
  6. [كلتثر سل] في 37 [ك] و 5% [كو]2. تقسيم وتوسيع الخلايا كل 2-3 يوما لأنها تصل إلى 80-100 ٪ التقاء عن طريق تطبيق 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، وتوسيع من قارورة واحده إلى 8 قوارير.
    ملاحظه: هذا يتطلب عاده 3-4 الممرات ، والذي يسمح التوسع المناسب ويحتفظ المحتملة اديبوغينيك والمريض ومستودع محدده الظواهر الايضيه الخلوية. يؤدي تجاوز الخلايا الشحمية الزائدة عن 4-5 الممرات إلى فقدان الإمكانيات المحتملة.
  7. فصل الخلايا في 8 قوارير مع 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا للزجاجة الواحدة كما هو موضح أعلاه ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
  8. أضافه 8 مل من 15 ٪ لكل قارورة/F12 للزجاجة الواحدة وأعاده تعليق الخلايا المنفصلة مع ماصه. نقل التعليق الخلية بأكملها مقسمه بالتساوي في أنابيب المخروطية 3 50 mL والطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  9. أعاده التعليق علي الكريات الخلية الناتجة في 5 مل من 15 ٪ من-DMEM/F12 في أنبوب مخروطي 15 مل وعدد الخلايا باستخدام عداد الخلية والأزرق الترلون.
  10. الطرد المركزي تعليق الخلية في 270 x g لمده 10 دقيقه. ثم أعاده تعليق بيليه الخلية في محلول تجميد الخلايا المسبقة لتركيز الخلية النهائية من 1 × 106/مل ، و قسامه 1 مل من تعليق الخلية لكل 1.5 ml أنبوب كريوفيال.
  11. تخزين الخلايا في تخزن لمده 1 أيام في-80 درجه مئوية. ثم نقل تخزن إلى النيتروجين السائل للتخزين علي المدى الطويل لمده 3-6 أشهر.
  12. عندما تكون جاهزه للاستخدام ، ذوبان واحد كريوفيال في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 3-5 دقيقه. أعاده تعليق الخلايا في 20 مل من 15 ٪ من المستوي العام/F12 ، وأجهزه الطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  13. أعاده التعليق علي بيليه الخلية في 20 مل من 15 ٪-DMEM/F12 ، ماصه في قارورة 150 واحده ، ومن ثم تنمو إلى 80 ٪ التقاء أكثر من 2-3 يوما في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  14. فصل الخلايا مع 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا للزجاجة الواحدة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.6. أعاده التعليق عند 3,000,000 خليه لكل مليلتر (اي ، 6 x 104 خلايا لكل 20 μl) في 15% من الخلايا-dmem/F12 ، واستخدامها كما هو موضح أدناه (القسم 7 ، الخطوة 7.4).

6. الانسجه الدهنية اعداد ECM

  1. اليوم الأول: تجميد الذوبان والهضم الانزيمي #1
    1. تجميد-ذوبان الجليد المجمدة سابقا (الخطوة 4.2) عينات ضريبة القيمة المضافة المخزنة في تجميد الحل العازل في أنابيب المخروطية 50 mL من-80 درجه مئوية إلى 37 درجه مئوية في حمام مياه مسخن ، احتضان 20 دقيقه مع التحريض اليدوي الدوري لطيف. مره واحده أذابه ، ونقل مره أخرى إلى-80 درجه مئوية واحتضان 20 دقيقه. كرر تجميد-ذوبان 3x ، تنتهي بالذوبان عينات في 37 درجه مئوية حمام المياه.
    2. باستخدام ملقط معقمه ، نقل عينات ضريبة القيمة المضافة إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من الحل الانزيمي #1 ، وضمان ان العينات ضريبة القيمة المضافة مغمورة تماما. ثم احتضان بين عشيه وضحيها علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية).
  2. اليوم الثاني: الهضم الانزيمي #2
    1. غسل عينات 3x مع 15-25 mL من محلول الشطف العازلة علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل). صب قباله الشطف حل العازلة بعد كل غسل.
    2. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 مل من الحل الانزيمي #2 واحتضان علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، بين عشيه وضحيها).
  3. اليوم الثالث: الدلفين
    1. غسل عينات 3x مع 15-25 mL من محلول الشطف العازلة علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل). صب قباله الشطف حل العازلة بعد كل غسل.
    2. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 مل من الحل استخراج المذيبات القطبية واحتضان علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 25 درجه مئوية ، بين عشيه وضحيها). بعد هذه الخطوة ، يجب أزاله غالبيه الدهون ، وينبغي ان تكون العينات بيضاء أو شفافة في اللون.
      تحذير: حل استخراج المذيبات القطبية قابل للاشتعال ويجب تخزينه واستخدامه عند 25 درجه مئوية.
  4. اليوم الرابع: الغسيل والتخزين
    1. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من محلول الشطف العازلة. غسل عينات 3x علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
    2. غسل عينات 3x مع 15-25 مل من الايثانول 70 ٪ علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل) يصب قباله محلول الايثانول 70 ٪ بعد كل غسل.
    3. غسل عينات مره واحده مع حل التخزين علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
    4. باستخدام ملقط معقمه ، نقل العينات إلى أنابيب المخروطية 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من الحل التخزين. تاكد من استخدام حل التخزين الكافي لغمر العينات بشكل كامل. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى شهر واحد.

7. اعداد الخلايا الشحمية

  1. نقل الشظايا المخزنة ECM إلى الآبار الفردية من 24 بئر لوحه باستخدام ملقط معقمه. أضافه العديد من أجزاء ECM في أكبر عدد من الآبار كما هو مطلوب لفحص المصب المخطط له (علي سبيل المثال ، امتصاص الجلوكوز أو تحلل الدهون ، انظر أدناه) ، بما في ذلك التكرارات أو الثلاثية. يغسل مع 500 μL من 70 ٪ الايثانول 3x علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
  2. أعاده ترطيب ECM عن طريق غسل 3x في العقيمة 1x تلفزيوني علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
  3. باستخدام مقص العقيمة ، وخفض وتزن ECM إلى 100 ملغ شظايا. باستخدام ملقط معقمه ، مكان 1 100 ملغ جزء في كل بئر من لوحه 24 بئر. احتضان في 25 درجه مئوية لمده 15 دقيقه للسماح الزائدة التلفزيونية للبثق من شظايا. بعناية أزاله اي الزائدة التلفزيونية مع ماصه.
  4. بذور كل 100 ملغ ECM جزء مع 20 μL من تعليق خليه الخلايا الشحمية (3,000,000 الخلايا لكل مل ، 6 × 104 خلايا لكل 20 μl ، في 15 ٪ من الدرجة الاولي/F12 ، من الخطوة 5.10). ماصه الخلايا مباشره في ECM عن طريق وضع غيض من ماصه في ECM وطرد بلطف تعليق الخلية في وسط المصفوفة ، مع الحرص علي ان تعليق الخلية لا تجاوز وينتهي في الجزء السفلي من البئر.
    1. إذا كان تعليق الخلية تفيض من نظام ECM حيث تم وضع طرف الماصة ، قم بازاله الطرف من ذلك الموقع وادراجه في مكان آخر في ECM. احتضان المصنفة ECM ل 40 دقيقه في 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: لاستخراج RNA ل qrtPCR ، البذور كل 500 ملغ ECM الشظايا مع 3 × 105 خلايا في 100 μl (3,000,000 خلايا لكل مل ، اي ، 3 × 105 خلايا في 100 μl ، في 15 ٪ ار-dmem/F12).
  5. أملا كل بئر من اللوحة 24 بئر مع 500 μL من وسائط النمو لتغطيه شظايا ECM المصنفة. الثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 72 h.
  6. وبعد 72 ساعة ، يستنشق بعناية 15% من الأجزاء/F12 ، أماله الصفيحة قليلا للسماح للوسائط بالتجمع تحت الجزء الأسفل ، ووضع طرف الماصة بجوار جزء ECM بدون إزعاج. بعد الشفط ، أضافه 500 μL من وسائل الاعلام التمايز ، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 يوما باستخدام تقنيه مماثله ، لفتره الثقافة الاجماليه من 14 يوما.
    1. التحقق من التمايز باستخدام المجهر الضوئي: سوف تتراكم الخلايا الدهون ، وتتحول البني والأصفر في اللون وأكثر كرويه في الشكل.
      ملاحظه: يمكن استخدام المصفوفات المصنفة لاختبار الأيض (علي سبيل المثال ، فحص امتصاص الجلوكوز ، تحليل تحلل الدهون ، ORO) ، علم الانسجه أو مناعي (IHC) ، أو التصوير النسيجي القياسي. لتلطيخ الانسجه الثابتة ORO والتصوير ، تجميد عينات ECM-الخلايا الشحمية في النيتروجين السائل.

8. التنميط الأيضي

  1. فحص المجهر الكتروني
    1. إصلاح العينات في 2.5 ٪ غلوتارالديهيد في المخزن المؤقت الفوسفات سورنسن في 25 درجه مئوية ل 12 h. postfix في 1 ٪ الاوزميوم أكسيد في المخزن المؤقت الفوسفات سورنسن في 4 درجه مئوية ل 1 ساعة.
    2. عينات من الهيدرات المتسلسلة في الايثانول. يغسل في الهواء الجاف. ثم جبل علي المجهر الكترون المسح الضوئي كعب مع الجرافيت الغرويه. الجافة ، ومعطف مع الذهب.
    3. التقاط الصور مع مجهر الكترون المسح الضوئي.
  2. النفط الأحمر-O تلطيخ
    1. الانسجه الحية: النفط الأحمر-O الحل
      1. شفط الوسائط بعناية من الآبار مع ماصه. ثم غسل عينات مره واحده مع 500 μL من 1x تلفزيوني لكل بئر.
      2. إصلاح العينات مع 200 μl من 4 ٪ فورالين في المعقمة منزوعة الأيونات H2في 25 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، الفورمالين مع ماصه ، وغسل عينات مرتين مع 1x تلفزيوني (500 μl كل غسل).
      3. أضافه 200 μL من 60 ٪ الايزوبروبانول عينات في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. الشفط 60 ٪ ايزوبروبانول مع ماصه.
      4. عينات وصمه عار مع النفط الأحمر-O حل العمل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. شفط النفط الأحمر-O مع ماصه ثم غسل عينات 3x مع 1x تلفزيوني (500 μL كل غسل). ثم صوره مع المجهر البصري.
    2. الانسجه الثابتة: النفط الأحمر-O وصمه عار كيت
      1. فلاش تجميد عينات ECM-الخلايا الشحمية في درجه حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) المجمع والقسم (5 μm) علي التبريد.
      2. ضع الشريحة في 85 ٪ البروبيلين غليكول في DI/H2o لمده 2 دقيقه وضع الشريحة في ORO وصمه عار في 60 درجه مئوية لمده 6 دقائق. مكان steh أيد في 85 ٪ البروبيلين غليكول في Di/h2o لمده 1 دقيقه شطف الشريحة مرتين مع di/h2o.
      3. ضع الشريحة في المعدلة ماير الدموية من النفط الأحمر-O تلطيخ عده لمده 1 دقيقه. شطف الشريحة مرتين باستخدام ماء الصنبور. شطف الشريحة مرتين مع DI/H2O.
      4. جبل كوفيرسليب باستخدام المتوسطة تركيب مائي وصوره علي المجهر.
    3. استخراج RNA من ECM لل qrtPCR
      ملاحظه: لتعظيم العائد RNA ، استخدم 500 ملغ ECM شظايا المصنفة مع 3 × 105 الخلايا الشحمية في 100 μl والتفريق علي النحو الوارد أعلاه في لوحات 6-حسنا في 3 مل من وسائل الاعلام التمايز في بئر.
      1. مره واحده المتمايزة, نقل كل الفردية ECM-الخلايا الشحمية عينه في أنبوب مخروطي 50 mL علي الجليد باستخدام ملقط معقمه.
      2. يغسل بشكل جيد مع 500 μL من RLT العازلة. أضافه RLT العازلة إلى 50 mL أنبوب مخروطي مع مطابقه ECM-الخلايا الشحمية عينه.
      3. باستخدام مقص معقم ، المفروم ناعما كل نموذج ECM-الخلايا الشحمية داخل أنبوب مخروطي 50 mL ، في حين عقد أنبوب علي الجليد ، وادراج مقص في أنبوب مخروطي لفرم الانسجه.
      4. تجميد تماما وذوبان الأنابيب المخروطية من-80 درجه مئوية إلى 37 درجه مئوية 3x.
      5. أنابيب مخروطيه الطرد المركزي في 500 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
      6. بعناية أزاله ماده طافي مع ماصه واستخدامها لاستخراج الجيش النيبالي الريبي مع النسيج الليفي rna استخراج كيت (جدول المواد).
  3. فحص امتصاص الجلوكوز
    1. التفريق بين 6 × 104 الخلايا الشحمية المسبقة في 100 ملغ من أجزاء ECM في 0.5 مل من متوسط التمايز في لوحات 24-حسنا علي النحو المبين أعلاه (القسم 5).
    2. بعد 14 يوما من التمايز ، وأزاله المتوسطة وغسل ECM-الخلايا الشحمية مره واحده مع 1x تلفزيوني. أضافه 0.5 mL/well مصل المجاعة المتوسطة والثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 12 ساعة.
    3. أزاله المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 1x تلفزيوني. أضافه 0.5 mL/بئر 2 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية والثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 2 ساعة.
    4. اغسل الخلايا مره واحده مع 1x تلفزيوني ، أضافه 0.5 mL/well 1x تلفزيوني مع أو بدون 200 nM الانسولين ، واحتضان في 37 درجه مئوية ل 40 دقيقه.
    5. يستنشق 1x تلفزيوني ، أضافه 0.5 mL/well 1X تلفزيوني مع 0.1 mM 2-ديكسي-د-الجلوكوز ، 2 μCi/mL ديكسي-د-الجلوكوز ، 2-[1 ، 2-3H (N)] ، مع أو بدون الانسولين 200 nM ، واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 40 min استخدام الاحتياطات القياسية الكواشف والنفايات المشعة ، وفقا للتكليف الصادر عن القوانين التنظيمية المؤسسية المحلية.
    6. أزاله المتوسطة مع ماصه وغسل الخلايا 3x مع 1x تلفزيوني. أضافه 420 μL من محلول SDS 1 ٪ في DI/H2O ، وخلايا lyse مع الأنابيب القوية. احتضان 25 درجه مئوية لمده 10 دقائق.
    7. جمع 5 μL من كل بئر لفحص البروتين برادفورد. نقل 400 μl من الخلايا المتبقية محلله إلى 2 مل من السائل التلالؤ في قارورة التلالؤ. العد 3H-2dg النشاط علي العداد تلالؤ. تحليل البيانات كما تحسب في الدقيقة تطبيع للبروتين ، مغ/مل.
  4. فحص تحلل الدهون
    1. التفريق بين 6 × 104 الخلايا الشحمية المسبقة في 100 ملغ من أجزاء ECM في 0.5 mL من التمايز البشري المتوسطة في لوحات 24-حسنا كما هو موضح أعلاه (القسم 5).
    2. بعد 14 يوما من التمايز ، وأزاله المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 1x الدافئة تلفزيوني. أضافه 0.5 mL من المصل تجويع المتوسطة (بدون الانسولين) مع أو بدون ايزوبروتيرينول μM 3 ، والخلايا الشحمية الثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 72 h.
    3. جمع supernatants الثقافة ، والتي يمكن تخزينها في-80 درجه مئوية حتى تكون جاهزه لفحص. جمع ECM في أنابيب الطرد المركزي للحصول علي كميات الحمض النووي لتطبيع البيانات.
    4. Pipet 2 μl من كل ماده طافي في ميكروبلايت 96 جيدا. الآبار الاحتياطية لفراغات (المقطر H2س) والحل القياسي الجلسرين المقدمة في مجموعه الدهون الثلاثية التحديد.
    5. أضافه 270 μL من كاشف الجلسرين الحرة من مجموعه الدهون الثلاثية تحديد لكل بئر ، ماصه لخلط. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    6. قياس الامتصاص في 540 نانومتر علي مقياس طيفي ميكروبلايت.
    7. حساب تركيز الجلسرين وتطبيع مع الحمض النووي من ECM:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

اعداد الانسجه الدهنية ECM ، البذر مع الخلايا الشحمية ، والتمايز في المختبر في الخلايا الشحمية ناضجه تؤدي إلى تغييرات واضحة متسلسلة في الانسجه التي تسمح التقييم البصري للتقدم في جميع انحاء البروتوكول (الشكل 1) . يتم عزل الخلايا السابقة التي تستخدم لبذر ECM باستخدام الهضم كولاجيناز من عينات ضريبة القيمة المضافة منفصلة (الشكل 2). المسح المجهري الكترون من يبني ECM-الخلايا الشحمية في كل مرحله من مراحل المعالجة يكشف عن التقطير من ECM والتلخيص اللاحق للخلايا الشحمية المحتوية علي الدهون عند أعاده البذر والتمايز (الشكل 3). الكولاجين 1-مناعي المحددة من المحتوي الذي يكشف عن الحفاظ علي البنية المجهرية الكولاجين ، في حين ان النفط الأحمر-O تلطيخ من الحية وثابته/مقسمه علي الخلايا الشحمية-الخلية الدهنية يبني يكشف الدهون التي تحتوي علي البويضات (الشكل 4 ا). qrtpcr من الخلايا الشحمية المتمايزة في ecm يدل علي الحامل المميز للجينات الجينية بالنسبة إلى الخلايا الشحمية غير المتمايزة المستزرعة في ecm (الشكل 4ب). التنميط الأيضي لل ECM-الخلايا الشحمية يبني دراسة جميع تركيبات ECM والخلايا الشحمية من مرض السكري (DM) وغير مرضي السكري (NDM) يكشف عن ضعف امتصاص الجلوكوز ووظيفة الليبوليتيك في يبني ECM-الخلايا الشحمية من DM بالنسبة ل NDM الانسجه ، وتلخيص العيوب الايضيه DM الخاصة التي ذكرناها سابقا في الخلايا الشحمية البشرية في الثقافة 2D القياسية11. الأهم من ذلك, ndm ECM ينقذ امتصاص الجلوكوز تحفيز الانسولين وقدره دهون في الخلايا الشحمية DM (الشكل 4ج)11. معا ، تظهر هذه البيانات تنظيما خاصا بالمرض لاستقلاب الخلايا الشحمية من قبل ECM. ويرد مزيد من التفاصيل في بيكر وآخرون11.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لاعداد الخلايا الشحمية لECM. اليوم 1: عينات الانسجه الدهنية كامله الأحشاء الخضوع لثلاث دورات تجميد الذوبان تليها الحضانة بين عشيه وضحيها مع محلول الهضم الانزيمي #1. اليوم الثاني: بعد الهضم مع المحلول الانزيمي #1 ، يتم هضم العينات بين عشيه وضحيها مع محلول الهضم الانزيمي #2. عند هذه النقطة ، سيتم ديليبيداتيد العينات جزئيا. اليوم الثالث: بعد الهضم الانزيمي #2 ، والعينات الخضوع الحضانة بين عشيه وضحيها مع حل استخراج المذيبات القطبية ، والتي سوف تكمل ديبيشن. بعد اليوم 3 ، يجب ان تكون العينات ديليبيداتيد بالبالكامل وبيضاء/شفافة في اللون. يتم غسل العينات جيدا مع محلول الشطف العازلة ثم 70 ٪ الايثانول وتخزينها في محلول التخزين في 40 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه لأعاده البذر مع الخلايا الشحمية. اليوم الرابع: يتم بذر الخلايا الشحمية في ضريبة القيمة المضافة المكررة متبوعه بالتمايز الجيني لمده 14 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: سير العمل لعزل الخلايا الشحمية المسبقة. الضريبة علي القيمة المضافة هي المفروم ، هضمها مع كولاجيناز ، تصفيتها ، طرد ، والناتجة ستروموفاسكولار خليه بيليه مطلي ومثقف لتوسيع الخلايا الشحمية. انظر بيكر et al. 201721 للحصول علي مزيد من التفاصيل بشان العزلة البشرية قبل الخلايا الشحمية وثقافة الخلايا الشحمية 2d. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مسح صور المجهر الكتروني. الانسجه الدهنية سليمه ، الانسجه الدهنية المكررة ، والانسجه الدهنية المكررة أعيد ملؤها مع الخلايا الشحمية والمتمايزة في وسائل الاعلام اديبويغينيك لمده 14 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف الخلايا الشحمية في ECM. (ا) الانسجه الدهنية المكررة ECM يحافظ علي البنية المجهرية ويدعم تمايز الخلايا الشحمية: الأعلى: الكولاجين 1 مناعي من ضريبة القيمة المضافة البشرية كامله قبل وبعد التقطير مما يدل علي الحفاظ علي مصغر الوسط: ثلاثي الابعاد التنسيق الضوئي من الخلايا الشحمية البشرية الحية داخل ECM ؛ سليمه القيمة المضافة البشرية الملونة مع النفط الأحمر-O قبل بذر مع الخلايا الشحمية ، 4 أيام بعد البذر ، و 14 يوما بعد البذر مع الخلايا الشحمية متبوعا التمايز اديبوغينيك ؛ الأزرق: تلطيخ DAPI من نوى الخلية. الأحمر: النفط الأحمر-O تلطيخ من الدهون داخل الخلايا. أسفل: فورالين-الثابتة ، البارافين-جزءا لا يتجزا ، 5 ميكرون مقسمه ، النفط الأحمر-O-الملون ضريبة القيمة المضافة الإنسان قبل التقطير ، علي الفور بعد التقطير ، وبعد التقطير ، البذر الشحمي ، و 14 يوما من التمايز اديبوغينيك ، إظهار تراكم الدهون السيتوبلازمية في الخلايا الشحمية داخل ECM. (ب) الخلايا الشحمية في التعبير عن الجينات الجينية المولدة لECM: تحليل qrtPCR مقارنه مستويات الجينات الجينية في الحمض الريبي النيبالي من الخلايا الشحمية لضريبة القيمة المضافة التفاضلية في ecm لمده 14 يوما بالنسبة للخلايا غير المتمايزة في ecm مثقف ل 72 h في وسائل الاعلام غير المولدة. البيانات تعني ± SEM. acly: ATP سيترات lyase ، atgl: الدهون الثلاثية الدهنية ليباس ، fasn: synthase الأحماض الدهنية ، pparg: زيادة البيروكسيسوم مستقبلات تنشيط التكاثري غاما ؛ تنسيق: اضعاف الفرق في مستوي النص في الخلايا الشحمية ناضجه بالنسبة إلى غير متمايزة المرجع الخلايا الشحمية = 1; جميع الاختلافات اضعاف كبيره (p < 0.001 ، الاقتران t-اختبار) ؛ ECM من 10 مواضيع ، الخلايا الشحمية المسبقة/الخلايا الشحمية من n = 11 المواضيع. (C) ecm ينظم استقلاب الخلايا الشحمية بطريقه محدده Dm: 3D-ecm من المواضيع DM أو ndm المصنفة مع الخلايا الشحمية من المواد DM أو ndm ، متمايزة في الخلايا الشحمية ، ودرس مع التنميط الأيضي. أشرطه البيانات المسمية مع مصدر المريض (NDM ، DM) من ECM والخلايا الشحمية (ECM/AD) ؛ علي سبيل المثال ، NDM/NDM يدل علي كل من ECM والخلايا المسبقة المستمدة من المرضي NDM ، في حين ان NDM/DM يدل علي ECM من المرضي NDM جنبا إلى جنب مع الخلايا الشحمية من المرضي DM. البيانات تعني ± SEM. إحداثيات: امتصاص الجلوكوز (النسخة التحضيرية) ، تطبيع إلى ECM/خليه محلله تركيز البروتين (مغ/مل) ؛ تحلل الدهون: الثقافة تركيز الجلسرين سوبرناتانت (مغ/مل) تطبيع إلى ECM/خليه محلله تركيز الحمض النووي (ng/ml) ؛ * p < 0.050 ، * * p < 0.100 مقارنه المشار اليها نقطه البيانات إلى نقطه البيانات المقابلة (القاعدية أو الانسولين حفزت لامتصاص الجلوكوز ، القاعدية أو الايزوبروتيرينوله-حفز لتحلل الدهون) في DM/DM الذراع ، وذلك باستخدام النموذج المختلط تحليل تعديل لتكرار تدابير ECM من n = 9 NDM ، 8 DM المواضيع ، الخلايا الشحمية المسبقة من 10 NDM ، 9 المواضيع DM لامتصاص الجلوكوز. ECM من 6 NDM ، 6 DM المواضيع ، الخلايا الشحمية المسبقة من 6 NDM ، 6 DM المواضيع لتحلل الدهون. وقد تم تكييف هذا الرقم من اورورك ولومنغ11. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر نموذج ثقافة ECM-أديب أداه قيمه لتشريح الأدوار الفردية لECM والخلايا في إملاء النمط الظاهري الانسجه النهائية. وبروتوكول العزل الخاص بالنظام قابل للاستنساخ تماما ، ولكن يمكن ملاحظه التباين في عمليه التقطير. تعد خطوه اليوم الثالث الخاصة بالفصل نقطه حرجه في البروتوكول. عند الانتهاء من الاستخراج بين عشيه وضحيها ، يجب ان يكون الدليل علي المصفوفة من الحل المذيبات القطبية تحول الصفراء ، في حين ان المصفوفة ينبغي الانتقال من اللون الأصفر والبرتقالي سمه من الانسجه الدهنية سليمه إلى شفافة/ ابيض (الشكل 1). إذا لم تحدث هذه التغييرات اللونية ، فمن المحتمل الا يكتمل الفصل. التباين بين المرضي في كفاءه الفك هو شائع ، ولكن حتى الآن لم نلاحظ اي ارتباط من كفاءه الفصل مع الموضوع DM الوضع ، العمر ، مؤشر كتله الجسم ، أو غيرها من المتغيرات السريرية. العينات الكبيرة (أكبر من 20 غ) لن تخضع لعمليه التعقيم الفعالة. تجهيز عينات < 20 ز قد منع هذه المشكلة. إذا عينه لا تظهر تماما ديليبيداتيد بعد اليوم 3 ، وتقسيم العينة في نصف مع مقص معقمه ، ثم نقل عينات إلى 15-20 mL الطازجة من الحل استخراج المذيبات القطبية ومكان علي شاكر المدارية ل 3-5 h. بعض العينات قد لا decellularize تماما بعد تكرار خطوه استخراج المذيبات القطبية. إذا كان الجزء الأكبر من العينة هو المكرر ، فمن الممكن لقطع الأجزاء التي تحتوي علي الدهون قبل استخدام العينة في التجارب.

قد يحدث التلوث إذا لم يتم الحفاظ علي العقم بعناية طوال العملية. يجب ان يتم تنفيذ جميع الاعمال في غطاء التيار الصفحي باستخدام الاحتياطات القياسية للثقافة الخلية. نحن عاده تخزين ECM لمده تصل إلى 3 أشهر في 4 درجه مئوية ، والخلايا الشحمية لمده تصل إلى 6 أشهر في النيتروجين السائل. ولم يتم اختبار الاحتفاظ بالخواص البيولوجية والخصائص المحددة للمرض والمستودع بعد هذا الوقت.

المجهر البؤري يسمح التصور من الخلايا الشحمية ناضجه داخل ECM ، والتي يمكن تعزيزها مع تلطيخ النفط الأحمر-O. المسح المجهري الكترون (SEM) كما يوفر طريقه غير كميه لتصور الخلايا الشحمية داخل ECM. من ملاحظه, SEM والنفط الأحمر-O تلطيخ توحي الخلايا الشحمية أحادي في ثوابت ECM-الخلايا الشحمية, الشكل الذي يشبه في الخلايا الشحمية المجرية وعلي النقيض من الخلايا الشحمية النموذجية المتعددة لاحظت عندما الخلايا الشحمية الخضوع اديبوغينيك التمايز علي البلاستيك 2D (الشكل 3، الشكل 4ا). وتشير هذه الملاحظة إلى ان ECM يوفر بيئة فسيولوجية أكثر للتمييز الذي يحدث من الانسجه القياسية علي البلاستيك. قد يكون من الصعب تثبيت وتقسيم ثوابت الخلايا الشحمية لECM ، حيث ان الثوابت المضمنة في OCT تكون هشه ولا يتم تقسيمها بسهوله. الانسجه المضمنة مباشره بعد الازاله من التخزين من-80 درجه مئوية الفريزر وأداء السحب في غرفه الباردة (4 درجه مئوية) علي التبريد قبل المبردة يجعل الأمر ممكنا.

توفر ثقافة الخلية الشحمية بيئة فسيولوجية تقترب من بيئة الانسجه الدهنية الحيوية وتوفر بيئة مستدامه لنمو الخلايا الجذعية الشحمية والتمايز ، كما يتضح من الحاملة للجينات الجينية في ثقافة 3D-ECM-الخلايا الشحمية. الثقافات ECM-الخلايا الشحمية أيضا الانخراط في وظائف الأيض الخلايا الشحمية, بما في ذلك امتصاص الجلوكوز وتحلل الدهون8. ونحن الإبلاغ عن امتصاص الجلوكوز كما تطبيع لكل نسخه لكل من البروتين المستخرج من الثقافات ECM-الخلايا الشحمية تقاس مع فحص برادفورد ، أو إلى محتوي الحمض النووي يقاس مع مجموعه فحص الحمض النووي ، ولاحظت نتائج مماثله مع كلا الأسلوبين. المثل ، فاننا تقرير تحلل الدهون كما ملغ/مل من الإفراج عن الجلسرين تطبيع لأي بروتين أو الحمض النووي ، وأيضا مع نتائج مماثله الحصول عليها مع طريقه التطبيع اما. ويقترح آخرون تطبيع البيانات الايضيه الخلايا الشحمية إلى محتوي الدهون, ولكن حتى الآن محاولاتنا لاستخراج الدهون بشكل موثوق من ثوابت ECM لم تنجح. الإبلاغ عن معدل امتصاص الجلوكوز كما الشامات من الجلوكوز لكل وحده من الوقت وتحلل الدهون كما الشامات من الجلسرين/الأحماض الدهنية الحرة لكل وحده من الوقت قد تسمح مقارنات أكثر دقه بين تجارب منفصلة. عزل الحمض الريبي النيبالي من ECM لتحليل qrtPCR يتميز بانخفاض الغلة مقارنه مع الخلايا في الثقافة 2D ، ولكن اعداد أجزاء أكبر ECM المصنفة مع المزيد من الخلايا يتغلب علي هذه المشكلة ، كما هو موضح في الخطوة 8.3.1. لقد واجهنا صعوبة في عزل كميات كافيه من البروتين غير المتدهور مع الممتلكات الفوسفورية سليمه لتحليل لطخه الغربية ، والذي يمثل تقييدا للنموذج.

وقد نشرت في السابق منهجيه مماثله لعزل ECM من الانسجه الدهنية والبذر مع الخلايا الشحمية ، مع الادله التي تشير إلى ان ECM قد تعزز التمايز اديبوغينيك في غياب وسطاء اديبوغينيك الكلاسيكية بما في ذلك منبات المخيم ، الانسولين ، و ppar-γ يضع12،14. بياناتنا هي الاولي لإثبات التنظيم الخاص بالمرض من الأيض الخلوية من قبل ECM في الانسجه الدهنية ، وذلك باستخدام الأساليب التي يتم تحفيز الخلايا الشحمية مع عوامل التمايز الكلاسيكية اديبوغينيك11؛ دراسات مماثله في غياب المحفزات الجينية هي هدف للبحوث المستقبلية. وقد أظهرت الآخرين مماثله الامراض الخاصة بالخلايا المحتوي علي الخلية المتبادلة باستخدام ecm والخلايا المعزولة من انسجه الرئة19,20. وقد استخدمت أيضا استراتيجيات بديله ، بما في ذلك إنشاء المصفوفات عن طريق خلط المستحضرات المتجانسة الانسجه الدهنية ECM في الببتيد الهيدروجيل12.

وفي حين لوحظ التباين بين المرضي في الأيض الخلوي للخلايا الشحمية البشرية في كل من الثقافة 2D-البلاستيك و 3D-ECM, عند تحليلها في المجموع, هذه الخلايا البيان المرض-, مستودع-والاختلافات بين الجنسين محدده في الأيض الخلوي, كما هو موضح من قبل مجموعتنا وغيرها من11،21،22،23،24، التحقق من فائده والعموميات من هذه النماذج الثقافية لدراسة الأيض الخلوية الخلية الشحمية. وقد أظهرنا ان الخلايا الشحمية المتمايزة في ECM المرضية المتطابقة (اي NDM الخلايا الشحمية في المحتوي NDM ، الخلايا الشحمية DM في DM ECM) تلخص الظواهر الايضيه من الخلايا الشحمية المعزولة NDM و DM في الثقافة 2D القياسية ، دعم ثقافة الخلية نموذجا لدراسة التغيرات الخاصة بالامراض في استقلاب الخلايا الشحمية في بيئة فيزيولوجية أكثر. لم نلاحظ الاختلافات في حجم أو اتجاه وظائف التمثيل الأيضي ، بما في ذلك امتصاص الجلوكوز أو تحلل الدهون ، عندما يتم دراسة ECM والخلايا الشحمية من نفس المتبرعين أو مختلفه. في كلتا الحالتين ، ينشئ ECM-الخلية الشحمية الظاهري النمط الظاهري الايضيه المحددة (علي سبيل المثال ، انخفاض قو في DM/DM بالنسبة إلى ثوابت NDM/NDM) ، مع عدم وجود فرق واضح عند مقارنه يبني تتكون من ECM والخلايا الشحمية من نفس المانحين أو مختلفه .

ثقافة ECM-الخلايا الشحمية يسمح دراسة مجموعات من ECM والخلايا الشحمية من السكان المرضي متميزة ومستودعات الانسجه, السماح تحليل المرض-والمساهمات الخاصة بالمستودع من ECM والخلايا الشحمية إلى الايضيه الانسجه الدهنية في نهاية المطاف الظاهري. مما يدل علي قوه هذا النموذج الثقافة ECM-الخلايا الشحمية, لقد أظهرنا ان ECM من الانسجه NDM لديه القدرة علي إنقاذ العيوب الايضيه في الخلايا الشحمية DM (الشكل 4ج)11. تشير البيانات الاوليه في الانسجه الدهنية الباطنية وتحت الجلد إلى ان murine ECM ينظم استقلاب الخلايا الشحمية الموينيه بطريقه مماثله في المستودع الخاص (البيانات غير المنشورة ، اورورك RW ، 2019) ، مما يوحي بان هذا النظام النموذجي يمكن استخدامه للدراسة التداخل بين الخلايا الشحمية في كل من الانظمه البشرية والmurine. وعلاوة علي ذلك ، يسمح هذا النموذج دراسة التلاعب معزولة من ECM كوسيلة لتنظيم النمط الظاهري الانسجه الدهنية. وتشير الدراسة الاوليه لECM التي عولجت في الظروف التي تحفز الglycation المستهدفة علي وجه التحديد إلى ECM ، علي سبيل المثال ، إلى ان هذه التعديلات تنظم النمط الظاهري الأيضي الخلوي للخلايا المصنفة لاحقا في المحتوي المعالج (البيانات غير المنشورة ، O'rorow RW ، 2019) ، وتوفير نموذج لدراسة اثار التلاعب المستهدفة من ECM علي النمط الظاهري الخلايا الشحمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن تضارب المصالح.

Acknowledgments

نشكر دانييل بيرغر ، مارلين وودروف ، سيمون كوريا ، و Retha Geiss للحصول علي المساعدة في تنسيق الدراسة. وقد تم تنفيذ SEM من قبل جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر الطب الحيوي البحوث الاساسيه مرفق. تم دعم هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01DK097449 (RWO) ، R01DK115190 (RWO ، CNL) ، R01DK090262 (CNL) ، وشؤون قدامي المحاربين منحه الجدارة I01CX001811 (RWO) ، الطيار ومنحه الجدوى من مركز ميشيغان لأبحاث السكري (منحه المعاهد القومية للصحة P30-DK020572) (RWO) ، أداره المحاربين القدماء VISN 10 سبارك التجريبية منحه (RWO). فحص المجهر الكتروني الذي تقوم به جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر البحوث الطبية الحيوية مرفق الاساسيه. وقد نشر الشكل 4 من هذه المخطوطة في الأصل في بيكر وآخرون ، J Clin اندو Metab 2017 ؛ مارس 1 ؛ 102 (3) ، 1032-1043. doi: 10.1210/jc. 2016-2915 ، وقد استنسخ باذن من مطبعة جامعه أكسفورد [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. للحصول علي اذن لأعاده استخدام هذه المواد ، يرجى زيارة http://global.oup.com/academic/rights.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter Corning Inc., Corning, NY, USA Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T6397
24-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I5879
96-well tissue culture plates VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#15240062
Biotin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#A8806
Buffer RLT Qiagen, Hilden, Germany Cat#79216
Ciglitizone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4513
Dexamethasone Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP231 Flammable, caustic
Disodium EDTA Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#11320033
Ethanol Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA Cat#DSP-MD.43 Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#10437028
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#G5882 Caustic
Hexamethyldisalizane Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#440191 Flammable, caustic
Human insulin solution Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#I9278
Isopropanol Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A415 Flammable
Isoproterenol Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#I5627 Flammable
KCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S25484
KH2PO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#L0382
MgSO4*7H2O Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#230391
Na2HPO4 Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S5136
NaCl Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#S3014
NaHCO3 Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#S233
NH4Cl Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO) Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#201030 Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#93482 Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit Qiagen, Hilden, Germany Cat#74704
Scintillation Fluid Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer Benchmark Scientific Cat#D1030
Transferrin Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4% VWR International LLC., Radnor, PA, USA Cat#10027-446
Type II collagenase Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA Cat#WHA5201150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية عدد 153 الخلايا الشحمية الانسجه الدهنية مصفوفة خارج الخلية مرض السكري امتصاص الجلوكوز السمنة
A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flesher, C. G., Baker, N. A.,… More

Flesher, C. G., Baker, N. A., Strieder-Barboza, C., Polsinelli, D., Webster, P. J., Varban, O. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk. J. Vis. Exp. (153), e60486, doi:10.3791/60486 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter