Summary
我们描述了一个3D人类细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，它允许解剖基质和脂肪细胞的作用，促进脂肪组织代谢表型。
Abstract
细胞外基质（ECM）在调节组织平衡、与细胞进行串扰和调节细胞功能的多个方面方面发挥着核心作用。ECM在肥胖的脂肪组织功能中起着特别重要的作用，脂肪组织ECM沉积和成分的变化与小鼠和人类的代谢疾病有关。允许解剖ECM和细胞在促成全球组织表型中的作用的可移植体外模型是稀疏的。我们描述了人类ECM-脂肪细胞培养的一个新的3D体外模型，它允许研究ECM和脂肪细胞在调节脂肪组织代谢表型方面的具体作用。人体脂肪组织脱细胞以分离ECM，随后重新填充了板细胞，然后在ECM中分化成成熟的脂肪细胞。此方法创建代谢活性的 ECM-脂肪细胞结构，并保留组织和患者的特征，从中派生它们。我们用这个系统来演示人类脂肪组织中疾病特异性的ECM-脂肪细胞串扰。此培养模型提供了一个工具，用于解剖 ECM 和脂肪细胞在促进全球脂肪组织代谢表型中的作用，并允许研究 ECM 在调节脂肪组织平衡中的作用。
Introduction
细胞外基质（ECM）不仅为组织提供机械支架，而且与驻留在细胞中的细胞进行复杂的串扰，调节组织平衡所需的各种过程，包括细胞增殖，分化、信令和代谢1.虽然健康的ECM在维持正常组织功能中起着至关重要的作用，但功能失调的ECM与多种疾病有牵连2。
脂肪组织在代谢性疾病的发病机制中起着重要的作用。肥胖与过度的脂肪细胞肥大和细胞缺氧、脂肪细胞细胞代谢缺陷、脂肪组织内质视网膜和氧化应激和炎症有关。虽然了解不足，但这些复杂的过程合谋损害脂肪组织营养缓冲能力，导致脂肪组织营养溢出，多组织毒性，以及系统性代谢疾病3，4， 5.脂肪组织衰竭的先后事件和具体机制被人们难以理解，但脂肪组织ECM的改变被牵连其中。ECM组合物在人类和小鼠肥胖的脂肪组织内发生改变，ECM蛋白的沉积增加，脂肪组织ECM中与人类代谢疾病相关的定性生化和结构差异，包括2型糖尿病和高脂血症6，7，8，9，10，11。
尽管有这些观察，脂肪组织ECM在调解脂肪组织功能障碍中的作用没有明确界定。部分原因在于缺乏可处理的实验模型，允许解剖ECM和脂肪细胞在调节最终脂肪组织功能方面的具体作用。ECM-脂肪培养至少在两个方面更好地模拟了原生脂肪组织的体内环境。首先，ECM培养提供了类似于原生脂肪组织的分子环境，包括原生胶原蛋白、乙基蛋白和标准二维培养中不存在的其他基质蛋白。其次，由于塑料基板12的弹性降低，二维塑料的培养物通过机械效应改变脂肪细胞代谢，ECM培养消除这种作用。
在再生和重建医学和组织工程13、14中研究了通过分离ECM从脱细胞脂肪和其他组织分离来设计生物支架的方法。15，16，17，18.我们之前已经发表了方法，其中我们调整这些方法，以开发一个体外3D模型的人ECM-脂肪细胞培养，使用ECM和脂肪细胞干细胞（preadipo细胞）派生自人类内脏脂肪组织11。在本文中，我们将详细介绍这些方法。人体脂肪组织的去细胞化过程是一个为期四天的过程，涉及机械和酶处理，以去除细胞和脂质，留下一个生物支架，保持其衍生组织的特征。去细胞化ECM支持人类单体细胞的增生分化，当用脂肪细胞重组时，保持完整脂肪组织的微结构、生化和疾病特异性特性，并参与代谢原生脂肪组织的功能特征。这种基质可以单独研究或与细胞重新播种，允许研究脂肪组织的细胞和细胞外成分之间的相互作用和串扰。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
脂肪组织是从接受选择性减肥手术的人体受试者获得，经机构审查委员会批准。
1. 皮里泊细胞分离和培养试剂制备
- 在1x磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中制备2%牛血清白蛋白（BSA）。过滤消毒，并储存在4°C。
- 制备II型胶原酶：2mg/mL，在2%BSA中，在1xPBS中。使用前立即做好准备。
- 制备红血球 （RBC） 莱氨酸溶液： 1.5M NH4Cl， 100 mM NaHCO3， 10 mM 二钠 EDTA 在去离子水 （DI/H2O）.储存在4°C。在使用前立即从 DI/H2O 中的 10 倍库存溶液制备 1x RBC 莱放溶液。
- 准备生长培养基：15%胎儿牛血清（FBS），1%抗生素抗霉菌溶液（ABAM）在Dulbecco的改性鹰培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12）。过滤消毒，并储存在4°C。
- 制备Preadipo细胞冷冻溶液：10%二甲基二氧化硫，15%FBS在DMEM/F12介质中。过滤消毒，并储存在4°C。
- 制备分化介质：10mg/L转移素，33 μM生物素，0.5 μM人胰岛素溶液，17 μM D-泛酸血酸，100 nM 地塞米松，2 nM 3，3'，5-Triiodo-L-甲状腺酸钠盐（T3），1 μM 西格利酮，540 μM 3-在 DMEM/F12 中，Isobutyl-1-甲基烷基 （IBMX），1% ABAM。过滤消毒，并储存在4°C。
2. ECM试剂制备
- 制备冷冻缓冲液溶液：10 mM Tris 碱基、5 mM EDTA、1% ABAM、1% 苯基甲基硫磷基 （PMSF）中的 DI/H2O. 搅拌溶液，以溶解 EDTA。使用 HCl 或 NaOH.在 4°C 下将 pH 值调整到 8.0，最多 3 个月。
- 制备酶溶液#1：1%ABAM在0.25%胰蛋白酶-EDTA中。储存在4°C下长达3个月。
- 制备核化缓冲液溶液：137 mM NaCl，2.68 mM KCl，7 mM Na2HPO4， 1.5 mM KH2PO4， 1% ABAM， 1% PMSF 在灭菌的 DI/H2O. 搅拌中溶解盐.使用 HCl 或 NaOH 将 pHH 调整为 8.0。储存在4°C下长达3个月。
- 制备酶溶液#2： 55 mM Na2HPO4， 17 mM KH2PO4， 4.9 mM MgSO4+7H2O， 1% ABAM， 1% PMSF 在 DI/H2O. 存储 4 °C 长达 3 个月.搅拌溶解盐。在使用前，从猪胰腺中加入80U/mL脂肪酶，类型为VI-S型;160 U/mL 脱氧核糖核酸I从牛胰腺，II-S型;和100 μg/mL从牛胰腺的核糖酸酶A，III-A型。
- 制备极性溶剂萃取溶液：1%ABAM，1%异丙醇中PMSF。
注意：异丙醇是易燃的;存放在25°C的易燃柜中，并处理易燃废物。 - 在DI/H2O中制备70%乙醇、1%ABAM、1%PMSF。
注意：乙醇是易燃的;存放在25°C的易燃柜中，并处理易燃废物。 - 准备存储解决方案：1% ABAM，1% PMSF，在 1x PBS 中。储存在4°C下长达3个月。
3. 代谢性配色试剂制剂
- 葡萄糖摄入量
- 准备血清饥饿介质：DMEM/F12，1%ABAM。过滤灭菌，并储存在4°C
- 在使用前立即在1xPBS中制备200 nM人胰岛素溶液。
- 制备 200 nM 人胰岛素，0.1 mM 2-脱氧-D-葡萄糖，1 μCi/井脱氧-D-葡萄糖，2-[1，2-3H（N）]-，在1x PBS中。使用前立即做好准备。
- 利波利斯
- 准备在PBS中稀释的异丙酮醇：3 mM库存溶液。稀释至工作浓度为3 μM进行测定。
- 油红-O染色
- 在室温下在DI/H2O.储存中制备4%的甲色。
- 准备油红-O工作解决方案。稀释油红-O溶液（ORO），DI/H2O，比例为3：2（ORO：DI/H2O）。使用前立即做好准备。过滤通过滤纸 （材料表）.
4. 脂肪组织采购
注：内脏脂肪组织（VAT）由外科医生在手术开始时从大眼周收集，并运回冰上实验室进行立即处理。在处理所有人体组织和腐蚀性试剂时，应采用通用预防措施，包括在层流罩中执行所有工作，使用完整的实验室安全磨损，并且不重新封顶针头。
- 在 50 mL 锥形管中加入 5-10 g 的完整 VAT 到 15-25 mL 冷冻缓冲液溶液中，以浸入组织样品中。将样品储存在-80°C，直到脱细胞化，长达1个月。
- 如第 5 节所述，使用单独的增值税新样本进行单板细胞隔离。
5. 皮里波波细胞隔离
- 将2克完好的增值税放入20 mL的胶原酶中，II型溶液放入50 mL锥形管中。然后，通过将无菌剪刀插入锥形管并切碎管内的组织，彻底切碎。完全切碎到细浆中后，在轨道摇床上以130转/130和37°C孵育胶原酶溶液中的组织60分钟。
- 通过 100 μm 尼龙网将由此产生的挖土工过滤到新鲜的 50 mL 锥形管中，将挖土管从一根锥形管中倒入一块折叠在新鲜锥形管顶部的网。此时的挖掘区应该是一种黄橙色液体，具有中等粘度，有少量未消化的纤维组织残余链。网格应捕获被丢弃的较大未消化组织。
- 将样品在270 x g下离心10分钟，取出上清液，用移液器将细胞颗粒重新悬浮在2 mL的1xRBC莱沙溶液中。
- 在 25°C 下孵育 1 分钟，然后加入 10 mL 的 15% FBS-DMEM/F12。在 270 x g下离心 10 分钟。
- 取出上清液，用移液器将细胞颗粒重新悬浮在 10 mL 的 15% FBS-DMEM/F12 中。将细胞悬浮液转移到100毫米培养皿，用移液器孵育，在37°C和5%CO2下孵育，直到细胞达到80-100%汇合，通常为2-6天。每 2-3 天更改一次介质。
- 分离和洗涤细胞。
- 用移液器去除介质，并将4 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA涂抹在粘附细胞上。在37°C孵育10分钟，周期性地旋转板轻轻地分离细胞。
- 添加 20 mL 的 15% FBS-DMEM/F12，并用移液器重新挂起此介质中分离的单元。然后转移到新鲜的50 mL锥形管和离心机270 x g 10分钟。
- 拆下上清液并丢弃。在 1x PBS 中清洗一次细胞颗粒，然后用移液器将细胞颗粒重新悬浮在 20 mL 的新鲜 15% FBS-DMEM/F12 中。将细胞悬架转移到T-150培养瓶。
- 培养细胞在37°C和5%CO2。每2-3天分裂和扩张细胞，当它们达到80-100%汇合时，通过应用7 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，从一个烧瓶扩展到8个烧瓶。
注：这通常需要3-4个通道，这允许适当的扩张，并保留增生潜力和患者和仓库特定的细胞代谢表型。超过4-5个通道的传阅式细胞会导致破坏潜力的丧失。 - 按照上述情况，在8个烧瓶中分离细胞，每瓶7mL为0.25%的胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育10分钟。
- 每瓶添加 8 mL 的 15% FBS-DMEM/F12，然后用移液器重新悬挂分离的电池。将整个细胞悬浮液均匀地分成三个50 mL锥形管，以270 x g离心10分钟。
- 在 15 mL 锥形管中重新悬浮 5 mL 的 15% FBS-DMEM/F12 中产生的细胞颗粒，并使用细胞计数器和 Trypan 蓝色计数细胞。
- 将细胞悬浮液在270 x g下离心10分钟。然后，在Preadipo细胞冷冻溶液中重新悬浮细胞颗粒，最终细胞浓度为1 x 106/mL，每1.5 mL冷冻管的细胞悬浮液1mL。
- 在-80°C下将细胞储存在冷冻室1天。然后将冷冻液转移到液氮中，长期储存3-6个月。
- 准备使用时，在37°C水浴中解冻一个冷冻液3-5分钟。在20mL的15%FBS-DMEM/F12中重新悬浮细胞，并在270 x g下离心10分钟。
- 将细胞颗粒重新悬浮在20 mL的15%FBS-DMEM/F12中，将移液器放入单个T-150烧瓶中，然后在37°C和5%CO2下在2-3天内生长到80%的汇合。
- 按照步骤 5.6 中所述，每瓶瓶分离 7 mL 为 0.25% 的胰蛋白酶-EDTA 的细胞。在 15% FBS-DMEM/F12 中，以每 mL 300 万个细胞（即每 20 μL 6 x 104个细胞）重新悬浮，并使用如下所述（第 7 节，步骤 7.4）。
6. 脂肪组织ECM制剂
- 第1天：冷冻解冻和酶消化#1
- 冷冻解冻先前冻结（步骤4.2）的VAT样品存储在冷冻缓冲液溶液中的50 mL锥形管中，从-80°C到37°C在预热的水浴中，在温和的周期性手动搅拌下孵育20分钟。解冻后，传回-80°C，孵育20分钟，重复冷冻解冻3倍，在37°C水浴中解冻样品结束。
- 使用无菌钳子，将增值税样品转移到含有15-25 mL酶溶液#1的新鲜50 mL锥形管中，确保增值税样品完全浸没。然后在轨道摇床（130 rpm，37 °C）上孵育过夜。
- 第2天：酶消化#2
- 在轨道摇床上用15-25 mL的冲洗缓冲液清洗样品3倍（130 rpm，37 °C，每次洗涤20分钟）。每次洗涤后，倒出冲洗缓冲液溶液。
- 将样品转移到含有15-25 mL酶溶液的新鲜50 mL锥形管中，#2并在轨道摇床（130 rpm，37°C，过夜）上孵育。
- 第3天：降脂
- 在轨道摇床上用15-25 mL的冲洗缓冲液清洗样品3倍（130 rpm，37 °C，每次洗涤20分钟）。每次洗涤后，倒出冲洗缓冲液溶液。
- 将样品转移到含有15-25 mL Polar溶剂萃取溶液的新鲜50 mL锥形管中，并在轨道摇床（130 rpm，25°C，过夜）上孵育。在此步骤后，应去除大部分脂质，样品应为白色或半透明色。
注意：极性溶剂萃取溶液易燃，应在25°C下储存和使用。
- 第4天：清洗和储存
- 将样品转移到含有15-25 mL的林辛缓冲液的新鲜50 mL锥形管中。在轨道摇床上清洗样品 3 倍（130 rpm，37 °C，每次洗涤 20 分钟）。
- 在轨道摇床（130 rpm，37 °C，每次洗涤20分钟）上用15-25 mL 70%乙醇清洗样品3倍，每次洗涤后从70%乙醇溶液中浇注。
- 在轨道摇床上使用存储溶液清洗样品一次（130 rpm，37 °C，每次清洗 20 分钟）。
- 使用无菌钳子，将样品转移到含有15-25 mL储存溶液的新鲜50 mL锥形管中。确保有足够的存储解决方案用于完全浸没样品。在 4°C 下存放长达 1 个月。
7. ECM-脂肪细胞制备
- 使用无菌钳将存储的 ECM 片段转移到 24 孔板的单个孔中。将尽可能多的 ECM 片段添加到计划下游测定所需的尽可能多的井中（例如，葡萄糖的获取或脂质分裂，见下文），包括重复或三胞胎。在轨道摇床上用 500 μL 的 70% 乙醇 3x 清洗（130 rpm，37 °C，每次洗涤 20 分钟）。
- 通过在轨道摇床上清洗 3x 无菌 1x PBS（130 rpm，37 °C，每次洗涤 20 分钟）来补充 ECM。
- 使用无菌剪刀，切割和称重ECM成100毫克碎片。使用无菌钳子，在24孔板的每个孔中放置一个100毫克的碎片。在25°C孵育15分钟，使多余的PBS从碎片中挤出。用移液器小心地去除多余的 PBS。
- 种子每个100毫克ECM片段与20μL的preadipo细胞悬浮液（300万个细胞每mL，6 x 104细胞每20μL，在15%FBS-DMEM/F12，从步骤5.10）。将移液器尖端置于 ECM 中，将细胞悬浮液轻轻排入基质中心，将细胞悬浮液直接移入 ECM 中，注意细胞悬架不会溢出并最终位于井底。
- 如果电池悬架从放置移液器尖端的 ECM 溢出，请从该位置拆下吸头，并插入 ECM 中的其他位置。在 37°C 下孵育 ECM 40 分钟。
注：对于qrtPCR的RNA提取，在100μL（每mL300万个细胞，即每100μL3x105个细胞，15%FBS-DMEM/F12）中，每500mg ECM片段种子3×105个细胞。
- 如果电池悬架从放置移液器尖端的 ECM 溢出，请从该位置拆下吸头，并插入 ECM 中的其他位置。在 37°C 下孵育 ECM 40 分钟。
- 用 500 μL 的生长介质填充 24 孔板的每个孔，以覆盖种子 ECM 片段。在 37°C 和 5% CO2下培养 72 小时。
- 72 小时后，小心吸出 15% FBS-DMEM/F12，稍微倾斜板，让介质池在碎片下方，并将移液器尖端放在 ECM 片段旁边，而不会干扰它。吸气后，添加500 μL的分化介质，使用类似的技术每2-3天更换一次介质，总培养期为14天。
- 使用光显微镜检查分化：细胞会积累脂质，变成棕黄色，形状更球形。
注：种子基质可用于代谢测试（例如，葡萄糖吸收测定、脂质测定、ORO）、组织学或免疫组织化学（IHC）或标准组织成像。对于固定组织ORO染色和成像，在液氮中冷冻ECM-脂肪细胞样品。
- 使用光显微镜检查分化：细胞会积累脂质，变成棕黄色，形状更球形。
8. 代谢性象周
- 扫描电子显微镜
- 将索伦森磷酸盐缓冲液中2.5%谷氨酸中的样品固定在25°C12h。在索伦森磷酸盐缓冲液中将1%的四氧化二氮在4°C下固定1小时。
- 乙醇中连续脱水样品。用六甲基二甲苯清洗，并风干。然后用胶体石墨安装在扫描电子显微镜存根上。干燥，溅射涂层与黄金。
- 使用扫描电子显微镜捕捉图像。
- 油红-O染色
- 活组织：油红-O溶液
- 用移液器小心地吸气管介质。然后用每口500μL的1xPBS清洗样品一次。
- 在25°C下用200μL的4%形式素将样品固定在无菌脱碘H2O中15分钟。 用移液器吸气形式素，用1xPBS（每次洗涤500μL）清洗样品两次。
- 在25°C下加入200μL的60%异丙醇样品5分钟。用移液器吸气60%异丙醇。
- 在 25°C 下用油红-O 工作溶液染色样品 5 分钟。 用移液器吸脂油红-O，然后用 1x PBS（每次洗涤 500 μL）清洗样品 3 倍。然后用光学显微镜成像。
- 固定组织：油红-O染色套件
- 闪冻 ECM-腺细胞样品在最佳切削温度 （OCT） 化合物和节 （5 μm） 上的低温。
- 将幻灯片放入DI/H2O中的85%丙二醇中2分钟，将幻灯片置于ORO染色60°C6分钟。将石质利德置于DI/H2O中的85%丙二醇中1分钟，用DI/H2O冲洗幻灯片两次。
- 将幻灯片放入油红-O染色套件的改性迈尔血氧林中 1 分钟，用自来水冲洗幻灯片两次。用 DI/H2O 冲洗幻灯片两次。
- 使用水性安装介质和图像在显微镜上安装盖玻片。
- 从ECM提取用于qrtPCR的RNA
注：为了最大限度地提高RNA产量，使用500mg ECM片段，在100μL中用3个x105型细胞播种，并在每孔3mL的分化介质中区分6孔板中上述。- 一旦区分，使用无菌钳子将每个单独的ECM-脂肪细胞样品转移到冰上50 mL锥形管中。
- 用 500 μL 的缓冲液 RLT 洗空。将缓冲液 RLT 添加到 50 mL 锥形管中，具有匹配的 ECM-脂肪细胞样本。
- 使用无菌剪刀，在 50 mL 锥形管内精细切碎每个 ECM-脂肪细胞样品，同时将管放在冰上，将剪刀插入锥形管中，将组织切碎。
- 完全冻结和解冻锥形管从-80°C到37°C 3x。
- 在500 x g和4°C下离心锥管10分钟。
- 用移液器小心地去除上清液，并使用纤维组织RNA提取试剂盒（材料表）提取RNA。
- 活组织：油红-O溶液
- 葡萄糖摄入测定
- 在24孔板中，在0.5 mL的分化介质中区分100mg ECM片段中的6个x104型细胞（第5节）。
- 经过14天的分化后，取出介质，用1x PBS洗涤ECM-脂肪细胞一次。在37°C下加入0.5 mL/井血清饥饿介质和培养，在12小时内加入5%的CO2。
- 使用 1x PBS 取出培养基并洗涤细胞两次。在 37°C 下在 PBS 和培养中加入 0.5 mL/well 2% BSA，在 2 小时内加入 5% CO2。
- 用1x PBS清洗细胞一次，加入0.5 mL/well 1x PBS，带或不带200 nM胰岛素，并在37°C孵育40分钟。
- 吸气1xPBS，加入0.5 mL/well 1X PBS，带0.1 mM 2-脱氧-D-葡萄糖，2[Ci/mL脱氧-D-葡萄糖，2-[1，2-3 H（N）]，带或不带200 nM胰岛素，并在37°C和5%CO2孵育40分钟。放射性试剂和废物，由地方机构监管法规规定。
- 用移液器去除介质，用 1x PBS 清洗细胞 3 倍。在DI/H2O中加入420μL的1%SDS溶液，并加入带强力移液的酶细胞。孵育25°C10分钟。
- 从每个井中收集5μL，用于布拉德福德蛋白测定。将400 μL的剩余细胞流化液转移到闪烁小瓶中的2 mL闪烁液中。计数3H-2DG 在闪烁计数器上的活性。分析数据，按每分钟归化为蛋白质，mg/mL的计数。
- 利波西斯测定
- 在24孔板中，在0.5 mL的人类分化介质中，在100mg ECM片段中区分6个x104型细胞（第5节）。
- 经过14天的分化后，用温暖的1x PBS去除培养基并洗涤细胞两次。加入0.5 mL血清饥饿介质（不含胰岛素），带或不带3μM异丙酮醇，在37°C和5%CO2培养增生细胞72小时。
- 收集培养物，可储存在-80°C，直到准备进行测定。在微离心管中收集ECM，用于DNA定量，实现数据规范化。
- 将每个上清液的 2 μL 移入 96 孔微孔板中。为甘油三酯测定试剂盒中提供的空白（蒸馏H2O）和甘油标准溶液预留井。
- 从甘油三酯测定试剂盒中加入270 μL的免费甘油试剂，将液器混合。在37°C下孵育板5分钟。
- 在微板分光光度计上测量 540 nm 的吸光度。
- 计算甘油的浓度，并与ECM的DNA正常化：
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
脂肪组织ECM的制备，用板菌细胞播种，以及体外分化成成熟的脂肪细胞，导致组织中清晰的顺序形态变化，从而能够对整个方案的进展进行视觉评估（图1）.用于播种ECM的Preadipo细胞使用胶原酶从单独的VAT样品中分离（图2）。在加工的每个阶段扫描ECM-脂肪细胞结构的电子显微镜显示ECM的去细胞化，以及随后重新播种和分化时含脂脂细胞的重述（图3）。胶原蛋白 1 特异性免疫组织化学的去细胞化 ECM 揭示了胶原蛋白微结构的维护，而油红-O 染色活和固定/切片 3D ECM-脂肪细胞结构揭示了含脂脂的脂肪细胞 （图 4A.. qrtPCR 从 ECM 中分化的脂肪细胞中表明，相对于 ECM 中培养的未分化的 preadipo 细胞，腺体基因的显著上升调控（图 4B）。ECM-脂肪细胞的代谢附型结构研究来自糖尿病 （DM） 和非糖尿病 （NDM） 受试者的所有 ECM 和脂肪细胞组合，揭示了从 DM 到 NDM 的 ECM-脂肪细胞结构中葡萄糖摄取和脂质功能受损组织，重述DM特异性代谢缺陷，我们之前在标准2D培养11中报告在人类脂肪细胞中。重要的是，NDM ECM可挽救DM脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄入量和脂质容量（图4C）11。这些数据共同展示了ECM对脂肪细胞代谢的疾病特异性调节。更多细节见贝克等人11日。
图1：ECM-脂肪细胞制备的工作流。第1天：整个内脏脂肪组织样本经历三个冷冻解冻周期，然后用酶消化溶液#1过夜孵育。第2天：在消化酶溶液#1后，样品在一夜之间用酶消化溶液#2消化。此时，样品将部分降脂。第3天：在酶消化#2后，样品通过极性溶剂萃取溶液进行过夜孵育，完成降脂。第3天后，样品应完全降脂，颜色为白色/半透明。样品用冲洗缓冲液彻底洗涤，然后70%乙醇，储存在40°C的储存溶液中，直到准备好用preadipo细胞重新播种。第4天：将细胞种子放入去细胞化增值税中，然后进行14天的增生分化。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：用于板蛋白细胞隔离的工作流。增值税被切碎，用胶原酶消化，过滤，离心，并由此产生的频闪血管细胞颗粒镀和培养，以扩大柏皮细胞。见 Baker等人 201721，了解有关人类皮立细胞分离和二维脂肪细胞培养的进一步详情。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：扫描电子显微镜图像。完整的脂肪组织、去细胞化的脂肪组织和脱细胞的脂肪组织重新填充了preadipo细胞，并在腺化培养基中分化了14天。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：ECM中脂肪细胞的特征。（A） 去细胞化脂肪组织 ECM 保持微结构并支持脂肪细胞分化： 顶部： 胶原蛋白 1 免疫组织化学的整个人类 VAT 之前和之后的去细胞化证明维护微观架构;中间：ECM内活人类腺细胞的3D共聚焦显微照片;完整的去细胞化人类VAT沾染油红-O，然后重新播种与柏皮细胞，播种后4天，播种后14天与柏皮细胞，然后增加分化;蓝色：细胞核的DAPI染色;红色：细胞内脂质的油红-O染色;底部：形式固定，石蜡嵌入，5μm切片，油红-O染色人体增值税在去细胞化之前，立即在去细胞化后，在去细胞化后，板化细胞播种，和14天的腺分化，证明ECM内脂肪细胞中的细胞质脂质积累。（B） ECM 中腺细胞向上调节异基因基因表达： qrtPCR 分析比较在 VAT ECM 中区分的人类 VAT 脂肪细胞中 RNA 中腺基因转录水平相对于 VAT ECM 中的未分化的 preadipo 细胞在非培养介质中培养72小时。数据是均值 = SEM. ACLY： ATP 锡酸盐酸化酶， ATGL： 脂肪甘油三酯脂肪酶， FASN： 脂肪酸合成酶， PPARg：过氧体增殖活性受体伽玛;坐标：成熟脂肪细胞的转录水平相对于未分化的preadipo细胞参照物的折数差异=1;所有折叠差异显著（p<0.001，成对 t 检验）;ECM 从 10 个受试者， preadipo 细胞/脂肪细胞从 n=11 受试者.（C） ECM 以 DM 特定的方式调节脂肪细胞代谢：DM 或 NDM 受试者的 3D-ECM，该受试者用 DM 或 NDM 受试者的板状细胞种子，分化成脂肪细胞，并研究代谢型型。标有ECM和脂肪细胞（ECM/AD）患者源（NDM、DM）的数据栏;例如，NDM/NDM 表示从 NDM 患者中提取的 ECM 和 preadipo 细胞，而 NDM/DM 表示来自 NDM 患者的 ECM 与 DM 患者的 preadipo 细胞结合。数据为均值 = SEM. 坐标：葡萄糖摄入量 （cpm），归一化为 ECM/细胞莱沙蛋白浓度 （mg/mL）;脂质：培养上清甘油浓度（mg/mL），归化为ECM/细胞解液DNA浓度（ng/mL）;_p_lt;0.050，[p_lt;0.100]将指示的数据点与DM/DM臂中相应的数据点（葡萄糖获取的基础或胰岛素刺激，基底或异丙酮醇刺激的利多利症）进行比较，使用混合模型分析进行调整，以进行重复措施;N=9 NDM 的 ECM，8 个 DM 受试者，10 NDM 中的柏细胞，9 个葡萄糖摄取 DM 受试者;ECM 从 6 NDM， 6 DM 受试者， 从 6 NDM 的柏皮细胞， 6 DM 科目的脂肪。这个数字是从奥鲁克和卢门11改编而成的。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM-脂肪培养模型为剖析ECM和细胞在听写最终组织表型中的个体作用提供了宝贵的工具。ECM 隔离协议相当可重复，但可以观察到脱细胞化过程中的变异性。第 3 天降脂步骤是协议中的一个关键点。在一夜之间提取时，基质的降脂应用极性溶剂溶液变黄来证明，而基质应从完整脂肪组织的黄橙色特征过渡到半透明/白色 （图 1）。如果这些颜色没有变化，则脱脂可能不完整。降脂效率的住院间变异性很常见，但迄今为止，我们尚未观察到降脂效率与受试者DM状态、年龄、BMI或其他临床变量有任何相关性。大样本（大于20克）不会进行有效的降脂;处理样品 <20 g 可以防止此问题。如果样品在第3天之后未出现完全降脂，用无菌剪刀将样品分成两半，然后将样品转移到新鲜的15-20 mL Polar溶剂萃取溶液中，并放置在轨道摇摇器上3-5小时。重复极性溶剂萃取步骤后，某些样品可能无法完全去细胞化。如果大部分样品是脱细胞的，在实验中使用样品之前，可以切掉含有脂质的部分。
如果在整个过程中不努力地保持无菌，则可能发生污染。所有工作都应使用标准细胞培养预防措施在层流罩中进行。我们通常将ECM在4°C下储存长达3个月，在液氮中储存6个月。超过这个时间，生物功能和疾病和仓库特定特性的保留尚未经过测试。
共聚焦显微镜允许在ECM中可视化成熟的脂肪细胞，这可以通过油红-O染色增强。扫描电子显微镜（SEM）也提供了一种非定量方法，用于可视化ECM中的脂肪细胞。值得注意的是，SEM 和油红-O 染色表明 ECM-腹膜细胞构造中的未异位腺化细胞，这种形态类似于体内的腹膜细胞，与在 Preadipo 细胞发生增生时观察到的典型多眼腹膜细胞形成对比二维塑料的差别化（图3，图4A）。这一观察表明，ECM比塑料上的标准组织培养为增增分化提供了一个更为生理的环境。ECM-脂肪结构的固定和剖面可能很困难，因为OCT嵌入式结构是脆弱的，不容易分割。从 -80°C 冷冻室中取出嵌入组织并立即从 -80°C 冷冻室中取出，并在冷室 （4 °C） 上在预冷却的低温室中进行切片，使切片成为可能。
ECM-脂肪细胞培养提供了一个接近体内脂肪组织环境的生理环境，并为preadipo细胞干细胞的生长和分化提供了一个可持续的环境，这从对增生基因的调节就证明了这一点。在3D-ECM-脂肪培养中。ECM-脂肪细胞培养也参与脂肪细胞代谢功能，包括葡萄糖的摄入和脂质酶8。我们报告葡萄糖吸收为cpm归化为从ECM-脂肪细胞培养物中提取的总蛋白质，或用布拉德福德测定试剂盒测量的DNA含量，并观察到与这两种方法类似的结果。同样，我们报告脂质酶为甘油释放的mg/mL归化为蛋白质或DNA，也获得类似的结果与两种规范化方法。其他人建议将脂肪细胞代谢数据归化为脂质含量，但到目前为止，我们尝试从ECM结构中可靠地提取脂质，但一直没有成功。报告葡萄糖吸收率为每单位时间的葡萄糖摩尔和每单位时间的甘油/游离脂肪酸摩尔的脂质化，可以允许在单独的实验之间进行更准确的比较。QRPCR 分析的RNA从ECM分离的特点是与二维培养中的细胞相比产量较低，但用更多细胞播种的较大ECM片段的制备克服了这一问题，如步骤8.3.1所述。在在西方斑点分析中，我们遇到了分离足够数量的未降解蛋白质的困难，而磷化物完好无损，这代表了模型的局限性。
以前已经发表了类似的方法，将ECM从脂肪组织和用preadipo细胞播种，有证据表明，如果没有包括cAMP激动剂在内的经典腺化介质，ECM可能会促进腺体分化，胰岛素，和PPAR-β激动剂12，14。我们的数据是第一个证明疾病特异性调节细胞代谢由ECM在脂肪组织，使用的方法，其中腺细胞刺激与经典的腺体分化因子11;在缺乏刺激作用的情况下进行类似的研究是未来研究的目标。其他人已经使用ECM和从肺组织分离出的细胞19、20展示了类似的疾病特异性ECM细胞串扰。还采用了替代策略，包括通过在肽水凝胶12中混合均质脂肪组织ECM制剂来创建基质。
虽然在2D-塑料和3D-ECM培养中观察到人类脂肪细胞代谢的住院期间变异性，但综合分析时，这些细胞在细胞代谢中表现出疾病、仓库和性别特异性差异，如我们小组和其他人11，21，22，23，24，验证这些文化模型的效用和通用性，用于研究脂肪细胞代谢。我们已经证明，在疾病匹配的ECM中分化的腺细胞（即NDM ECM中的NDM脂肪细胞，DM ECM中的DM脂肪细胞）在标准2D培养中重述分离NDM和DM腺细胞的代谢表型，支持ECM-腺细胞培养一种模型，用于在更生理的环境中研究在脂肪细胞代谢中疾病特异性变化。当研究来自相同或不同捐赠者的ECM和脂肪细胞时，我们未观察到代谢功能的大小或方向的差异，包括葡萄糖的摄入或脂质。在这两种情况下，ECM-脂肪细胞构造都表现出DM特异性代谢表型（例如，DM/DM相对于NDM/NDM结构的GU减少），在比较由来自相同或不同捐赠者的ECM和脂肪细胞组成的构造时，没有明显的差异.
ECM-脂肪细胞培养允许研究不同患者群体和组织库的ECM和preadipo细胞的组合，允许分析ECM和脂肪细胞对最终脂肪组织代谢的病和库特定贡献表。在演示ECM-脂肪细胞培养模型的这种强度时，我们已经表明，NDM组织的ECM具有挽救DM脂肪细胞代谢缺陷的能力（图4C）11。在鼠内脏和皮下脂肪组织的初步数据表明，鼠ECM以仓库特定的方式同样调节鼠卵脂肪代谢（未公开的数据，O'Rourke RW，2019），表明该模型系统可用于研究ECM-脂肪细胞串扰在鼠和人体系统中。此外，该模型允许研究ECM的分离操作作为调节脂肪组织表型的手段。例如，对在诱导专门针对ECM的糖化条件下治疗的ECM的初步研究表明，这些修饰调节随后种子到经处理的ECM中的细胞代谢表型（未公布的数据，O'Rourke RW， 2019）， 为研究有针对性地操纵 ECM 对脂肪细胞表型的影响提供了一个模型.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢丹妮尔·伯杰、玛丽莲·伍德拉夫、西蒙娜·科雷亚和雷莎·盖斯协助学习协调工作。SEM由密歇根大学显微镜和图像分析实验室生物医学研究核心设施执行。该项目由NIH赠款R01DK097449（RWO），R01DK115190（RWO，CNL），R01DK090262（CNL），退伍军人事务功绩补助金I01CX001811（RWO），密歇根州糖尿病研究中心试点和可行性赠款（NIH资助P30-DK020572（RWO），退伍军人管理局 VISN 10 SPARK 试点赠款 （RWO）。扫描电子显微镜由密歇根大学显微镜和图像分析实验室生物医学研究核心设施执行。本手稿图 4 最初发表在贝克等人，J 克林恩多·梅塔布2017;3月1;102 （3）， 1032-1043.doi： 10.1210/jc.2016-2915，经牛津大学出版社许可[https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]转载。有关重复使用此材料的权限，请访问http://global.oup.com/academic/rights。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
