Summary
Vi beskriver en 3D mänskliga extracellulära matrix-adipocyte in vitro kultur system som tillåter dissektion av rollerna i matrisen och adipocyter bidra till fettvävnad metabolisk fenotyp.
Abstract
Den extracellulära matrix (ECM) spelar en central roll i regleringen av vävnad homeostas, engagera sig i överhörning med celler och reglera flera aspekter av cellulära funktion. ECM spelar en särskilt viktig roll i fettvävnad funktion i fetma, och förändringar i fettvävnad ECM deposition och sammansättning är förknippade med metabolisk sjukdom hos möss och människor. Tractable in vitro-modeller som tillåter dissektion av rollerna av ECM och celler för att bidra till den globala vävnaden fenotyp är glesa. Vi beskriver en roman 3D in vitro-modell av mänskliga ECM-adipocyte kultur som tillåter studier av de specifika rollerna för ECM och adipocyter i regleringen fettvävnad metabolisk fenotyp. Human fettvävnad är decellularized att isolera ECM, som därefter återbefolkas med Preadipocyter som sedan differentieras inom ECM till mogna adipocyter. Denna metod skapar ECM-adipocyte konstruktioner som är metaboliskt aktiva och behåller egenskaperna hos de vävnader och patienter från vilka de härleds. Vi har använt detta system för att demonstrera sjukdomsspecifik ECM-adipocyte överhörning i human fettvävnad. Denna kultur modell ger ett verktyg för dissekera rollerna för ECM och adipocyter i att bidra till globala fettvävnad metabolisk fenotyp och tillstånd studie av den roll som ECM i regleringen fettvävnad homeostas.
Introduction
Den extracellulära matrix (ECM) ger inte bara en mekanisk byggnadsställning för vävnader, men också engagerar sig i komplexa överhörning med celler som bor i den, reglerar olika processer som är nödvändiga för vävnad homeostas, inklusive cellproliferation, differentiering, signalering och metabolism1. Medan friska ECM spelar en viktig roll upprätthållandet av normal vävnad funktion, dysfunktionella ECM har varit inblandad i flera sjukdomar2.
Fettvävnad spelar en viktig roll i patogenesen av metabolisk sjukdom. Fetma är förknippad med överdriven fettceller hypertrofi och cellulära hypoxi, defekter i fettceller cellulära metabolism, och fettvävnad endoplasmatiska nätmagen och oxidativ stress och inflammation. Även dåligt förstått, dessa komplexa processer samverkar för att försämra fettvävnad näringsämnen buffring kapacitet, vilket leder till näringsämne overflow från fettvävnad, toxicitet i flera vävnader, och systemisk metabolisk sjukdom3,4 ,5. Sekvensen av händelser och specifika mekanismer som ligger bakom fettvävnad misslyckande är dåligt förstådd, men förändringar i fettvävnad ECM har varit inblandade. ECM sammansättningen ändras inom fettvävnad i human och murin fetma, med ökad deposition av ECM-protein tillsammans med kvalitativa biokemiska och strukturella skillnader i fettvävnad ECM i samband med mänsklig metabolisk sjukdom, inklusive typ 2-diabetes och hyperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Trots dessa observationer, är den roll som fettvävnad ECM i medla fettvävnad dysfunktion inte väldefinierad. Detta är delvis på grund av en brist på tractable experimentella modeller som tillåter dissektion av de specifika rollerna av ECM och adipocyter i regleringen ultimata fettvävnad funktion. ECM-adipocyte kultur simulerar bättre in vivo miljön av infödda fettvävnad i minst två avseenden. För det första, ECM kultur ger en molekylär miljö som liknar infödda fettvävnad, inklusive infödda collagena, elastiner, och andra matris proteiner frånvarande i standard 2D-kultur. För det andra har kulturen på 2D-plast visat sig förändra fettceller metabolism via mekaniska effekter på grund av minskad elasticitet av plast substrat12, som ECM-kulturen eliminerar.
Metoder för att konstruera biologiska ställningar genom isolering av ECM från decellularized fett och andra vävnader har studerats i samband med regenerativ och rekonstruktiv medicin och vävnadsteknik13,14, 15,16,17,18. Vi har tidigare publicerat metodik där vi anpassat dessa metoder för att utveckla en in vitro-3D-modell av Human ECM-fettceller-kultur, med hjälp av ECM-och fettceller-stamceller (Preadipocyter) härledda från humana visceral fettvävnader11. I denna artikel, beskriver vi dessa metoder i detalj. Den decellularization förfarande för Human fettvävnad är en fyra dagars process som innebär mekaniska och enzymatiska behandlingar för att ta bort celler och lipid, lämnar en biologisk ställningen som upprätthåller egenskaperna hos den vävnad från vilken den härleds. Decellularized ECM stöder adipogen differentiering av humana Preadipocyter, och när de bereds med adipocyter, upprätthåller mikroarkitektur och biokemiska och sjukdomsspecifika egenskaper intakt fettvävnad och engagerar i metaboliska funktioner karakteristiska för infödda fettvävnad. Denna matris kan studeras ensamt eller reseeded med celler, tillåter studier av interaktioner och överhörning mellan cellulära och extra-cellulära komponenter av fettvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fettvävnader upphandlas från försökspersoner som genomgår elektiv Bariatric kirurgi under institutionell översyn styrelse godkännande.
1. preadipocyte-isolering och odlings REAGENSBEREDNING
- Förbered 2% bovint serumalbumin (BSA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtersterilisera och förvara vid 4 ° c.
- Bered typ II-kollagenas: 2 mg/mL i 2% BSA i 1x PBS. Förbered dig omedelbart före användning.
- Förbered röda blodkroppar (RBC) lysing lösning: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm dinatriumeedta i avjoniserat vatten (di/H2O). Förvaras vid 4 ° c. Förbered 1x RBC lysing lösning från 10X stamlösning i DI/H2O omedelbart före användning.
- Förbered tillväxt medier: 15% foster bovint serum (FBS), 1% antibiotika-antimykotisk lösning (ABAM) i Dulbecco modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F-12 (DMEM/F12). Filtersterilisera och förvara vid 4 ° c.
- Förbered Preadipocyte frys lösning: 10% dimetylsulfoxid, 15% FBS i DMEM/F12 media. Filtersterilisera och förvara vid 4 ° c.
- Förbered differentiering media: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotin, 0,5 μM humant insulin lösning, 17 μM D-pantotensyra hemikalciumsalt, 100 nM dexametason, 2 nM 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt (T3), 1 μM ciglitizone, 540 μM 3- Isobutyl-1-metylxinin (IBMX), 1% ABAM i DMEM/F12. Filtersterilisera och förvara vid 4 ° c.
2. ECM-preparat för reagens
- Förbered frysnings buffertlösning: 10 mM Tris bas, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i DI/H2O. rör lösning för att lösa upp EDTA. Justera pH till 8,0 med HCl eller NaOH. Förvara vid 4 ° c i upp till 3 månader.
- Bered enzymatisk lösning #1:1% ABAM i 0,25% trypsin-EDTA. Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
- Förbered Sköljbuffertlösning: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM na2HPO4, 1,5 mm KH2Po4, 1% Abam, 1% PMSF i steriliserad di/H2O. rör om för att lösa upp salter. Justera pH till 8,0 med HCl eller NaOH. Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
- Förbered enzymatisk lösning #2:55 mM na2HPO4, 17 mm KH2Po4, 4,9 mm MgSO4∙ 7h2o, 1% Abam, 1% PMSF i di/H2O. Förvara 4 ° c i upp till 3 månader. Rör om för att lösa upp salter. Omedelbart före användning, tillsätt 80 U/mL lipas från svin bukspottkörteln, typ VI-S; 160 U/mL deoxyribonukleas I från bukspottkörteln, typ II-S; och 100 μg/ml ribonukleas A från nötkreatur, bukspottkörteln, typ III-a.
- Bered Polar lösning för lösningsmedels extraktion: 1% ABAM, 1% PMSF i isopropanol.
FÖRSIKTIGHET: isopropanol är brandfarlig; Förvara i ett brännbart skåp vid 25 ° c och kassera i brandfarligt avfall. - Förbered 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF i DI/H2O. Tillsätt Abam och PMSF strax före användning.
FÖRSIKTIGHET: etanol är brandfarligt; Förvara i ett brännbart skåp vid 25 ° c och kassera i brandfarligt avfall. - Förbered lagringslösning: 1% ABAM, 1% PMSF i 1x PBS. Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader.
3. beredning av metabolisk fenotypreagens
- Glukosupptag
- Förbered serum svält media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtersterilisera och förvara vid 4 ° c
- Bered 200 nM humaninsulin lösning i 1x PBS omedelbart före användning.
- Förbered 200 nM humaninsulin, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glukos, 1 μCi/väl Deoxy-D-glukos, 2-[1,2-3H (N)]-, i 1x PBS. Förbered dig omedelbart före användning.
- Lipolys
- Förbered isoproterenol utspädd i PBS: 3 mM stamlösning. Späd till en arbets koncentration på 3 μM för analys.
- Olja röd-O färgning
- Förbered 4% formalin i DI/H2O. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered olja röd-O arbetslösning. Utspädd olja röd-O-lösning (ORO) med DI/H2o i förhållandet 3:2 (oro: di/h2o). Förbered dig omedelbart före användning. Filtrera genom filterpapper (tabell över material).
4. fettvävnad upphandling
Anmärkning: visceral fettvävnad (VAT) samlas in från större omentum i början av operationen av kirurgen och transporteras tillbaka till laboratoriet på is för omedelbar bearbetning. Universella försiktighetsåtgärder bör användas vid hantering av alla mänskliga vävnader och frätande reagenser, inklusive att utföra allt arbete i ett laminärt flöde huva, med hjälp av komplett laboratoriesäkerhet slitage, och ingen regummering av nålar.
- Tillsätt 5-10 g intakt moms till 15-25 mL Frysbuffertlösning i ett 50 mL koniskt rör för att doppa vävnadsprovet. Förvara proverna vid-80 ° c tills decellularization, för upp till 1 månad.
- Använd ett separat färskt prov av moms för isolering av preadipocyte enligt beskrivningen i avsnitt 5.
5. preadipocyte-isolering
- Placera 2 g intakt moms i 20 mL kollagenase, typ II, lösning i ett 50 mL koniskt rör. Sedan färs grundligt genom att infoga steril sax i det koniska röret och malning vävnaden i röret. När den är helt hackad till en fin slurry, inkubera vävnaden i kollagenaslösningen på en orbitalshaker vid 130 rpm och 37 ° c för 60 min.
- Filtrera den resulterande rötrest genom ett 100 μm nylonnät till ett nytt 50 mL koniskt rör genom att hälla rötrets från ett koniskt rör genom en bit av mesh som viks över toppen av ett nytt koniskt rör. Den rötrester på denna punkt bör vara en gul-orange vätska med måttlig viskositet, med små mängder av resterande delar av osmält fibrös vävnad. Nätet bör fånga större bitar av osmält vävnad, som kasseras.
- Centrifugera provet på 270 x g i 10 min. ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 2 ml 1x RBC lysing-lösning med en pipett.
- Inkubera i 1 min vid 25 ° c och tillsätt sedan 10 mL 15% FBS-DMEM/F12. Centrifugera vid 270 x g i 10 min.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 med en pipett. Överför cellsuspensionen till 100 mm petriskål med en pipett och inkubera vid 37 ° c och 5% CO2, tills cellerna når 80-100% Confluence, typiskt 2-6 dagar. Ändra Media varje 2-3 dagar.
- Lossa och tvätta celler.
- Ta bort media med en pipett och applicera 4 mL 0,25% trypsin-EDTA på anhängare av celler. Inkubera vid 37 ° c i 10 min, regelbundet snurra plattan försiktigt för att lossa cellerna.
- Tillsätt 20 mL 15% FBS-DMEM/F12 och Omsuspendera de fristående cellerna i detta medium med en pipett. Överför sedan till ett nytt 50 mL koniskt rör och centrifugera 270 x g i 10 minuter.
- Ta bort supernatanten och kassera. Tvätta cellpelleten en gång i 1x PBS, och sedan Omsuspendera cellpelleten i 20 mL färsk 15% FBS-DMEM/F12 med en pipett. Överför cellsuspensionen till en kultur kolv T-150.
- Kultur celler vid 37 ° c och 5% CO2. Dela och expandera celler varje 2-3 dagar som de når 80-100% sammanflödet genom att tillämpa 7 ml av 0,25% trypsin-EDTA, expanderar från en kolv till 8 flaskor.
Anmärkning: Detta kräver vanligtvis 3-4 passager, som tillåter lämplig expansion och behåller adipogen potential och patient-och Depot-specifika cellulära metaboliska fenotyper. Passaging Preadipocyter utöver 4-5 passager leder till förlust av adipogen potential. - Lossa celler i 8 flaskor med 7 mL 0,25% trypsin-EDTA per kolv enligt beskrivningen ovan, och inkubera vid 37 ° c i 10 minuter.
- Tillsätt 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 per kolv och Omsuspendera de fristående cellerna med en pipett. Överför hela cellsuspensionen fördelas jämnt i 3 50 mL koniska rör och centrifugera vid 270 x g i 10 min.
- Omsuspendera de resulterande cell pelletarna i 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 i ett 15 mL koniskt rör och räkna celler med cell räknare och Trypan Blue.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 270 x g i 10 min. Sedan Omsuspendera cellen pelleten i Preadipocyte frysning lösning till en slutlig cell koncentration av 1 x 106/ml, och alikvot 1 ml cellsuspension per 1,5 ml cryovial röret.
- Förvara cellerna i kryovials i 1 dygn vid-80 ° c. Överför sedan cryovials till flytande kväve för långtidslagring för 3-6 månader.
- När den är klar för användning, Tina en cryovial i en 37 ° c vattenbad för 3-5 min. Omsuspendera cellerna i 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, och centrifugera vid 270 x g i 10 min.
- Omsuspendera cellpelleten i 20 ml 15% FBS-DMEM/F12, Pipettera till en enda T-150 kolv, och sedan växa till 80% sammanflödet över 2-3 dagar vid 37 ° c och 5% Co2.
- Lossa celler med 7 mL 0,25% trypsin-EDTA per kolv enligt beskrivningen ovan i steg 5,6. Omsuspenderas vid 3 000 000 celler per mL (dvs. 6 x 104 celler per 20 μl) i 15% FBS-DMEM/F12 och Använd som beskrivs nedan (avsnitt 7, steg 7,4).
6. adipose vävnad ECM beredning
- Dag 1: frys-Tina och enzymatisk matsmältning #1
- Frys-Tina tidigare fryst (steg 4,2) MOMSPROVER lagrade i frysnings buffertlösning i 50 mL koniska rör från-80 ° c till 37 ° c i ett förvärmt vattenbad, inkuberande 20 min med mild periodisk manuell omrörning. När tinat, överföring tillbaka till-80 ° c och inkubera 20 min. Upprepa frysa-Tina 3x, slutar med upptining prover i en 37 ° c vattenbad.
- Med hjälp av sterila tång, överför MOMSPROVERNA till färska 50 mL koniska rör som innehåller 15-25 mL enzymatisk lösning #1, vilket säkerställer att MOMSPROVERNA är helt nedsänkt. Inkubera sedan över natten på en orbitalshaker (130 rpm, 37 ° c).
- Dag 2: enzymatisk nedbrytning #2
- Tvätta proverna 3x med 15-25 mL Sköljbuffertlösning i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt). Häll av Sköljbuffertlösning efter varje tvätt.
- Överför prover till färska 50 mL koniska rör som innehåller 15-25 mL enzymatisk lösning #2 och inkubera i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, över natten).
- Dag 3: Delipidation
- Tvätta proverna 3x med 15-25 mL Sköljbuffertlösning i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt). Häll av Sköljbuffertlösning efter varje tvätt.
- Överför prover till färska 50 mL koniska rör som innehåller 15-25 mL Polar lösning för lösningsmedels extraktion och inkubera i orbitalskak (130 rpm, 25 ° c, över natten). Efter detta steg, en majoritet av Lipiden bör tas bort, och proverna bör vara vit eller genomskinlig i färg.
Varning: Polar lösningsmedels extraktionslösning är brandfarlig och bör förvaras och användas vid 25 ° c.
- Dag 4: tvätta och förvaring
- Överför prover till färska 50 mL koniska rör som innehåller 15-25 mL Sköljbuffertlösning. Tvätta proverna 3x på en orbitalshaker (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt).
- Tvätta proverna 3x med 15-25 mL 70% etanol i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt) som häller av en etanollösning på 70% efter varje tvätt.
- Tvätta proverna en gång med förvaringslösning i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt).
- Med hjälp av sterila tång, överför prover till färska 50 mL koniska rör som innehåller 15-25 mL lagringslösning. Se till att tillräckligt med lagringslösning används för att helt doppa proverna. Förvaras vid 4 ° c i upp till 1 månad.
7. ECM-adipocyte beredning
- Överför lagrade ECM-fragment till enskilda brunnar med 24-borrplattor med sterila pintippar. Tillsätt så många ECM-fragment i så många brunnar som krävs för den planerade nedströms analysen (t. ex. glukosupptag eller lipolys, se nedan), inklusive dubbletter eller triplicates. Tvätta med 500 μL 70% etanol 3x i orbitalskak (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt).
- Rehydrate ECM genom att tvätta 3x i steril 1x PBS på en orbitalshaker (130 rpm, 37 ° c, 20 min varje tvätt).
- Använda steril sax, klippa och väga ECM i 100 mg fragment. Med hjälp av sterila pintippar, placera 1 100 mg fragment i varje brunn av en 24-brunn tallrik. Inkubera vid 25 ° c i 15 minuter för att medge att överflödig PBS extruderar från fragment. Ta försiktigt bort överflödig PBS med en pipett.
- Utsäde varje 100 mg ECM fragment med 20 μL preadipocyte cellsuspension (3 000 000 celler per mL, 6 x 104 celler per 20 μl, i 15% FBS-DMEM/F12, från steg 5,10). Pipettera cellerna direkt i ECM genom att placera spetsen på pipetten i ECM och försiktigt utverka cellsuspensionen i mitten av matrisen, noga med att cellsuspensionen inte svämma över och hamna på botten av brunnen.
- Om cellsuspensionen är överfylld från ECM där pipettspetsen har placerats, ta bort spetsen från den platsen och sätt in någon annanstans i ECM. Inkubera seedade ECM för 40 min vid 37 ° c.
Anmärkning: för RNA-extraktion för qrtPCR, utsäde varje 500 mg ECM fragment med 3 x 105 celler i 100 μL (3 000 000 celler per ml, dvs 3 x 105 celler per 100 μl, i 15% FBS-DMEM/F12).
- Om cellsuspensionen är överfylld från ECM där pipettspetsen har placerats, ta bort spetsen från den platsen och sätt in någon annanstans i ECM. Inkubera seedade ECM för 40 min vid 37 ° c.
- Fyll varje brunn av 24-brunnen plattan med 500 μL av tillväxtmedia för att täcka de seedade ECM fragment. Kultur vid 37 ° c och 5% CO2 för 72 h.
- Efter 72 h, försiktigt aspirera 15% FBS-DMEM/F12, luta plattan något för att tillåta media att pool under fragment, och placera pipettspetsen strax intill ECM-fragmentet utan att störa den. Efter aspirera, tillsätt 500 μL av differentiering media, byta Media varje 2-3 dagar med hjälp av en liknande teknik, för en total kultur period av 14 dagar.
- Kontrollera differentiering med hjälp av ljusmikroskop: celler kommer att ackumulera lipider, vrid brun-gul i färg och mer sfäriska i form.
Anmärkning: seedade matriser kan användas för metabolisk testning (t. ex. glukos upptagningsanalys, lipolys-analys, ORO), histologi eller immunohistokemi (IHC), eller vanlig vävnads avbildning. För fast vävnad ORO färgning och avbildning, frys ECM-adipocyte prover i flytande kväve.
- Kontrollera differentiering med hjälp av ljusmikroskop: celler kommer att ackumulera lipider, vrid brun-gul i färg och mer sfäriska i form.
8. metabolisk fenotypning
- Scanning elektronmikroskopi
- Fix prover i 2,5% glutaraldehyd i Sorensen ' s fosfatbuffert vid 25 ° c för 12 h. postfix i 1% osmium tetroxid i Sorensen ' s fosfatbuffert vid 4 ° c för 1 h.
- Seriellt torkar prover i etanol. Tvätta i hexamethyldisalizane, och lufttorka. Montera sedan på en scanning Electron mikroskopi stub med kolloidal grafit. Torr och Sputter-Coat med guld.
- Fånga bilder med ett Scanningelektronmikroskop.
- Olja röd-O färgning
- Levande vävnad: Oil Red-O Solution
- Aspirera noggrant media från brunnar med pipett. Tvätta sedan proverna en gång med 500 μL 1x PBS per brunn.
- Fixera prover med 200 μL 4% formalin i sterilt avjoniserat H2O vid 25 ° c i 15 min. Aspirera formalin med pipett, tvätta proverna två gånger med 1x PBS (500 μl vardera tvätt).
- Tillsätt 200 μL av 60% isopropanolprover vid 25 ° c i 5 min. Aspirera 60% isopropanol med pipett.
- Fläcken prover med olja röd-O arbetslösning vid 25 ° c i 5 min. Aspirera olja röd-O med en pipett och sedan tvätta prover 3x med 1x PBS (500 μL varje tvätt). Sedan bild med ett optiskt mikroskop.
- Fast vävnad: olja röd-O fläck kit
- Flash-frys ECM-adipocyte prover i optimal skärtemperatur (OCT) förening och sektion (5 μm) på en kryostat.
- Placera bilden i 85% propylenglykol i di/h2o för 2 min. Placera bilden i oro fläck vid 60 ° c i 6 min. Placera erkännanden LiDE i 85% propylenglykol i di/h2o under 1 min. Skölj bilden två gånger med di/h2o.
- Placera bilden i modifierad Mayer ' s hematoxylin från Oil Red-O färgning kit för 1 min. Skölj bilden två gånger med kranvatten. Skölj bilden två gånger med DI/H2O.
- Montera täckglas med hjälp av vattenhaltiga monteringsmedel och bild på ett mikroskop.
- RNA-extraktion från ECM för qrtPCR
Anmärkning: för att maximera RNA-avkastningen, Använd 500 mg ECM fragment seedade med 3 x 105 Preadipocyter i 100 μl och differentiera som ovan i 6-well plattor i 3 ml differentiering Media per brunn.- När differentierat, överföra varje enskild ECM-adipocyte prov i en 50 mL koniskt rör på is med hjälp av sterila tång.
- Tvätta den tomma brunnen med 500 μL Buffertrlt. Lägg buffert RLT till 50 mL koniskt rör med matchande ECM-adipocyte prov.
- Med hjälp av steril sax, finhacka varje ECM-adipocyte prov inom 50 mL koniska röret, medan du håller röret på is, sätta in saxen i det koniska röret för att finhacka vävnaden.
- Helt frysa och Tina de koniska rören från-80 ° c till 37 ° c 3x.
- Centrifugera koniska rör vid 500 x g och 4 ° c i 10 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och Använd för RNA-extraktion med en fiber vävnad RNA extraktion Kit (tabell över material).
- Levande vävnad: Oil Red-O Solution
- Bestämning av glukosupptag
- Differentiera 6 x 104 Preadipocyter i 100 mg ECM-fragment i 0,5 ml differentierings medium i 24-brunn-plattor enligt beskrivningen ovan (avsnitt 5).
- Efter 14 dagar av differentiering, ta bort mediet och tvätta ECM-adipocyter en gång med 1x PBS. Tillsätt 0,5 mL/brunn serum svält medium och kultur vid 37 ° c och 5% CO2 för 12 h.
- Ta bort medel och tvätta celler två gånger med 1x PBS. Tillsätt 0,5 mL/brunn 2% BSA i PBS och kultur vid 37 ° c och 5% CO2 för 2 h.
- Tvätta celler en gång med 1x PBS, tillsätt 0,5 mL/brunn 1x PBS med eller utan 200 nM insulin, och inkubera vid 37 ° c för 40 min.
- Aspirera 1x PBS, tillsätt 0,5 mL/brunn 1X PBS med 0,1 mM 2-Deoxy-D-glukos, 2 μCi/mL Deoxy-D-glukos, 2-[1,2-3H (N)], med eller utan 200 nm insulin, och inkubera vid 37 ° c och 5% Co2 för 40 min. Använd standard försiktighetsåtgärder för hantering och kassering av alla radioaktiva reagenser och avfall, på uppdrag av lokala institutionella regelverk.
- Ta bort mediet med en pipett och tvätta cellerna 3x med 1x PBS. Tillsätt 420 μL 1% SDS-lösning i DI/H2O-och lyse-celler med kraftig pipettering. Inkubera 25 ° c i 10 minuter.
- Samla 5 μL från varje brunn för Bradford protein assay. Överför 400 μL av kvarvarande celllysat till 2 mL scintillationsvätska i en scintillationsflaska. Räkna 3H-2dg aktivitet på scintillationräknare. Analysera data som räknas per minut normaliserade till protein, mg/mL.
- Lipolys-analys
- Differentiera 6 x 104 Preadipocyter i 100 mg ECM fragment i 0,5 ml humant differentierings medium i 24-brunn plattor som beskrivs ovan (avsnitt 5).
- Efter 14 dagars differentiering, ta bort medel och tvätta celler två gånger med varm 1x PBS. Tillsätt 0,5 mL av serum svält medium (utan insulin) med eller utan isoproterenol 3 μM, och kulturadipocyter vid 37 ° c och 5% CO2 för 72 h.
- Samla kultur supernatants, som kan lagras vid-80 ° c tills klar för analys. Samla in ECM i microcentrifug rör för DNA-kvantifiering för datanormalisering.
- Pipet 2 μL av varje supernatanten till en 96-brunn Microplate. Reserv brunnar för ämnen (destillerat H2O) och glycerolstandardlösning som tillhandahålls i Triglyceridbestämningssats.
- Tillsätt 270 μL fritt glycerolreagens från Triglyceridbestämningssats till varje brunn, Pipettera för att blanda. Inkubera plattan vid 37 ° c i 5 min.
- Mät absorbans vid 540 nm på en mikroplattspektrofotometer.
- Beräkna koncentrationen av glycerol och normalisera med DNA från ECM:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beredning av fettvävnad ECM, sådd med Preadipocyter, och in vitro-differentiering till mogna adipocyter resultera i tydliga sekventiella morfologiska förändringar i vävnad som möjliggör visuell bedömning av framstegen i hela protokollet (figur 1) . Preadipocyter som används för att sålla ECM isoleras med hjälp av kollagenas nedbrytning från separata MOMSPROVER (figur 2). Scanning elektronmikroskopi av ECM-adipocyte konstruktioner i varje skede av bearbetningen avslöjar decellularization av ECM och efterföljande rekapitulation av lipid-innehållande adipocyter vid omläggning och differentiering (figur 3). Kollagen 1-specifik immunohistokemi av decellularized ECM avslöjar underhåll av kollagen mikroarkitektur, medan olja röd-O färgning av levande och fasta/sektionerade 3D ECM-adipocyte konstruktioner avslöjar lipid-innehållande adipocyter (figur 4 A). qrtpcr från adipocyter differentierat i ECM visar markant uppreglering av adipogen gener i förhållande till odifferentierade Preadipocyter odlade i ECM (figur 4B). Metabolisk fenotypning av ECM-adipocyte konstruktioner studerar alla kombinationer av ECM och adipocyter från diabetiker (DM) och icke-diabetiska (NDM) försökspersoner avslöjar nedsatt glukosupptag och lipolytisk funktion i ECM-adipocyte konstruktioner från DM i förhållande till NDM vävnader, går igenom DM-specifika metaboliska defekter vi har tidigare rapporterat i mänskliga adipocyter i standard 2D kultur11. Viktigt är att NDM ECM räddar insulinstimulerat glukosupptag och lipolytisk kapacitet i DM-adipocyter (figur 4C)11. Tillsammans visar dessa data sjukdomsspecifik reglering av fettceller cellulär metabolism av ECM. Ytterligare detaljer rapporteras i Baker et al.11.
Figur 1: arbetsflöde för beredning av ECM-adipocyte. Dag 1: hela visceral fettvävnad prover genomgår tre frys-Tina cykler följt av övernattning inkubering med enzymatisk digestionslösning #1. Dag 2: efter matsmältningen med enzymatisk lösning #1, prover smälts över natten med enzymatisk digestionslösning #2. Vid denna punkt, prover kommer att vara delvis delipidated. Dag 3: efter enzymatisk matsmältning #2, prover genomgå övernattning inkubering med Polar lösningsmedel extraktion lösning, som kommer att slutföra delipidation. Efter dag 3 bör proverna vara helt delipidated och vit/genomskinlig i färg. Proverna tvättas noggrant med sköljbuffertlösning då 70% etanol och lagras i lagringslösning i 40 ° c tills de är redo för omläggning med Preadipocyter. Dag 4: Preadipocyter är seedade i decellularized moms följt av adipogen differentiering för 14 dagar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: arbetsflöde för isolering av preadipocyte. MOMSEN mals, rötas med kollagenase, filtreras, centrifugeras, och resulterande stromovaskulär cell pelleten pläterad och odlade för att expandera Preadipocyter. Se Baker et al. 201721 för mer information om Human preadipocyte-isolering och 2D-fettceller-kultur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Skanna elektronmikroskopi bilder. Intakt fettvävnad, decellularized fettvävnad, och decellularized fettvävnad återbefolkas med Preadipocyter och differentierade i adipogen media för 14 dagar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: karakterisering av adipocyter i ECM. (A) decellularized fettvävnad ECM upprätthåller mikroarkitektur och stöder fettceller differentiering: Top: kollagen 1 immunohistokemi av hela mänskliga moms före och efter decellularization visar underhåll av mikroarkitektur mitten: 3D-konfokala mikrofotografier av levande mänskliga adipocyter inom ECM; intakt decellularized mänsklig VAT målat med olja röd-O innan omläggning med Preadipocyter, 4 dagar efter sådd, och 14 dagar efter sådd med Preadipocyter följt av adipogen differentiering; blå: DAPI färgning av cellkärnor; röd: olja röd-O färgning av intracellulär lipid; botten: formalin-fast, paraffin-inbäddade, 5 μm sektionerad, olja röd-O-färgade mänskliga momsen före decellularization, omedelbart efter decellularization, och efter decellularization, preadipocyte-seeding, och 14 dagar av adipogen differentiering, visar cytoplasmiska lipidackumulering i adipocyter inom ECM. (B) adipocyter i ECM upregulate adipogen genuttryck: qrtpcr analys jämföra adipogen Gene avskrift nivåer i RNA från mänskliga VAT adipocyter differentierade i VAT ECM för 14 dagar i förhållande till odifferentierade Preadipocyter i VAT ECM odlade för 72 h i nonadipogenic media. Data är medelvärdet ± SEM. acly: ATP Citrate lyase, atgl: fett triglyceridlipas, FASN: fettsyra syntas, pparg: peroxisomal proliferativ aktiverad receptor gamma; ordinate: Vik skillnad i avskrift nivå i mogna adipocyter i förhållande till odifferentierade preadipocyte referent = 1; alla vik skillnader signifikanta (p < 0,001, parade t-test); ECM från 10 försökspersoner, Preadipocyter/adipocyter från n = 11 försökspersoner. (C) ECM reglerar fettceller metabolism på ett DM-specifikt sätt: 3D-ECM från DM eller NDM försökspersoner seedade med Preadipocyter från DM eller NDM försökspersoner, differentierade till adipocyter, och studerade med metabolisk fenotypning. Datastaplar märkta med patientens källa (NDM, DM) av ECM och adipocyter (ECM/AD); t. ex. betecknar NDM/NDM både ECM och Preadipocyter härledda från NDM-patienter, medan NDM/DM betecknar ECM från NDM-patienter i kombination med Preadipocyter från DM-patienter. Data är medelvärdet ± SEM. ordinates: glukosupptag (CPM), normaliserat till ECM/cell lysate proteinkoncentration (mg/mL); lipolys: kultursupernatant glycerolkoncentration (mg/mL) normaliserad till ECM/cell lysate DNA-koncentration (ng/mL); * p < 0.050, * * p < 0.100 jämföra indikerad data-punkt till motsvarande datapunkt (basal-eller insulinstimulerad för glukosupptag, basal eller isoproterenol-stimulerad för lipolys) i DM/DM-armen, med hjälp av blandad modellanalys justering för upprepad åtgärder ECM från n = 9 NDM, 8 DM försökspersoner, Preadipocyter från 10 NDM, 9 DM försökspersoner för glukosupptag; ECM från 6 NDM, 6 DM försökspersoner, Preadipocyter från 6 NDM, 6 DM försökspersoner för lipolys. Denna siffra har anpassats från o ' Rourke och Lumeng11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ECM-adipocyte kultur modell ger ett värdefullt verktyg för dissekera de enskilda rollerna av ECM och celler i diktera Ultimate vävnad fenotyp. ECM isolering protokollet är ganska reproducerbar, men variationer i decellularization processen kan observeras. Dag 3 delipidation steg är en kritisk punkt i protokollet. Vid slutförandet av över natten utvinning, delipidation av matrisen bör styrkas av den polära lösningsmedels lösning svarvning gult, medan matrisen bör övergå från en gul-orange färg egenskap av intakt fettvävnad till genomskinlig/ vit (figur 1). Om dessa färgförändringar inte inträffar, då delipidation är sannolikt inte komplett. Inter-patient variation i delipidation effektivitet är vanligt, men hittills har vi inte observerat någon korrelation av effektivitet delipidation med ämne DM status, ålder, BMI, eller andra kliniska variabler. Stora prover (större än 20 g) kommer inte att genomgå effektiv delipidation; bearbetning av prover < 20 g kan förhindra detta problem. Om ett prov inte visas helt delipidated efter dag 3, dela provet i hälften med steril sax, sedan överföra prover till färska 15-20 mL av Polar lösningsmedel extraktion lösning och placera på en orbital Shaker för 3-5 h. Vissa prover kan inte helt decellularize efter att ha upprepat Polar lösningsmedel extraktion steg. Om en majoritet av provet är decellularized, är det möjligt att skära ut de avsnitt som innehåller lipid innan du använder provet i experiment.
Kontaminering kan inträffa om steriliteten inte upprätthålls omsorgsfullt under hela processen. Allt arbete bör utföras i ett laminärt flöde huva med hjälp av standard cellkultur försiktighetsåtgärder. Vi lagrar vanligtvis ECM i upp till 3 månader vid 4 ° c, och Preadipocyter i upp till 6 månader i flytande kväve. Bibehållande av biofunctionality och sjukdoms-och Depot-specifika egenskaper utöver denna tid har inte testats.
Konfokal mikroskopi möjliggör visualisering av mogna adipocyter inom ECM, vilket kan förstärkas med olja röd-O färgning. Scanning elektronmikroskopi (SEM) ger också en icke-kvantitativ metod för att visualisera adipocyter inom ECM. Notera, SEM och olja röd-O färgning föreslå unilocular adipocyter i ECM-adipocyte konstruktioner, en morfologi som liknar in vivo adipocyter och i motsats till de typiska multilocular adipocyter observerats när Preadipocyter genomgå adipogen differentiering på 2D-plast (figur 3, figur 4A). Denna observation tyder på att ECM ger en mer fysiologisk miljö för adipogen differentiering än standard vävnad kultur på plast. Fixering och snittning av ECM-adipocyte konstruktioner kan vara svårt, eftersom OCT-inbäddade konstruktioner är bräckliga och inte avsnitt lätt. Snittning av inbäddade vävnader omedelbart efter avlägsnande från lagret-80 ° c frys och utför snittning i ett kallt rum (4 ° c) på en förkyld kryostat gör snittning möjlig.
ECM-adipocyte kultur ger en fysiologisk miljö som approximerar in vivo fettvävnad miljö och ger en hållbar miljö för preadipocyte stamcells tillväxt och differentiering, vilket framgår av uppreglering av adipogen gener i 3D-ECM-adipocyte kultur. ECM-fettceller kulturer också engagera sig i fettceller metaboliska funktioner, inklusive glukosupptag och lipolys8. Vi rapporterar glukosupptag som CPM normaliserade till antingen totalt protein som utvinns ur ECM-adipocyte-kulturer mätt med en Bradford-analys, eller till DNA-innehåll mätt med en DNA-analyssats, och har observerat liknande resultat med båda metoderna. Likaså, Vi rapporterar lipolys som mg/mL av glycerol frisättning normaliserade till antingen protein eller DNA, även med liknande resultat erhålls med antingen normaliserings metod. Andra föreslår normalisera fettceller metaboliska data till lipid innehåll, men hittills våra försök att tillförlitligt extrahera lipid från ECM konstruktioner har misslyckats. Rapportera glukos upptagningsförmåga som mol glukos per tidsenhet och lipolys som mol av glycerol/fria fettsyror per tidsenhet kan tillåta mer exakta jämförelser mellan olika experiment. Isolering av RNA från ECM för qrtPCR analys kännetecknas av lägre avkastning jämfört med celler i 2D-kultur, men beredning av större ECM fragment seedade med fler celler övervinner detta problem, som beskrivs i steg 8.3.1. Vi har stött på svårigheter att isolera tillräckliga mängder av oskadat protein med foshomoisar intakt för Western blot-analys, vilket innebär en begränsning av modellen.
Liknande metod för att isolera ECM från fettvävnad och sådd med Preadipocyter har tidigare publicerats, med belägg som tyder på att ECM kan främja adipogen differentiering frånvarande klassiska adipogen mediatorer inklusive Camp agonister, insulin och ppar-γ-agonister12,14. Våra data är den första att demonstrera sjukdomsspecifik reglering av cellulär metabolism av ECM i fettvävnad, med metoder där adipocyter stimuleras med klassiska adipogen differentiering faktorer11; liknande studier i avsaknad av adipogen stimuli är ett mål för framtida forskning. Andra har visat liknande sjukdomsspecifika ECM-cell överhörning med hjälp av ECM och celler isolerade från lungvävnad19,20. Alternativa strategier har också använts, inklusive skapandet av matriser genom att blanda homogeniserade fettvävnad ECM preparat i peptid hydrogeler12.
Medan Inter-patient variation i human fettceller cellulär metabolism observeras i både 2D-plast och 3D-ECM kultur, när analyseras i aggregerad, dessa celler manifestera sjukdoms-, depå-och kön-specifika skillnader i cellulär metabolism, som beskrivs av vår grupp och andra11,21,22,23,24, validera nyttan och generaliserbarhet av dessa kultur modeller för studiet av fettceller cellulär metabolism. Vi har visat att adipocyter differentierade i sjukdomsmatchade ECM (dvs., NDM adipocyter i NDM ECM, DM adipocyter i DM ECM) recapitulate metaboliska fenotyper av isolerade NDM och DM adipocyter i standard 2D kultur, stödja ECM-adipocyte kultur som en modell för att studera sjukdomsspecifika förändringar i fettceller cellulär metabolism i en mer fysiologisk miljö. Vi har inte observerat skillnader i omfattningen eller riktningen av metaboliska funktioner, inklusive glukosupptag eller lipolys, när ECM och adipocyter från samma eller olika givare studeras. I båda fallen konstruerar ECM-adipocyte manifest DM-specifik metabolisk fenotyp (t. ex. minskad GU i DM/DM i förhållande till NDM/NDM-konstruktioner), utan någon tydlig skillnad när man jämför konstruktioner bestående av ECM och adipocyter från samma eller olika givare .
ECM-adipocyte kultur tillåter studier av kombinationer av ECM och Preadipocyter från distinkta patientpopulationer och vävnads depåer, tillåter analys av sjukdoms-och Depot-specifika bidrag av ECM och adipocyter till Ultimate fettvävnad metabolisk Fenotyp. Visar denna styrka av ECM-adipocyte kultur modell, har vi visat att ECM från NDM vävnad har kapacitet att rädda metabola defekter i DM adipocyter (figur 4C)11. Preliminära uppgifter i murina viscerala och subkutana fettvävnader tyder på att murina ECM reglerar murina fettceller metabolism på samma sätt i en depå-specifika sätt (opublicerade data, o ' Rourke RW, 2019), vilket tyder på att detta modellsystem kan användas för att studera ECM-adipocyte överhörning i både murin och mänskliga system. Dessutom, denna modell tillåter studier av isolerad manipulation av ECM som ett sätt att reglera fettvävnad fenotyp. Förstudie av ECM behandlas under förhållanden som inducerar glycation riktade specifikt till ECM, till exempel, tyder på att dessa modifieringar reglerar cellulära metaboliska fenotyp av celler därefter seedade i behandlade ECM (opublicerade data, O ' Rourke RW, 2019), vilket ger en modell för studier av effekterna av riktad manipulation av ECM på fettceller fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa och Retha Geiss för hjälp med studiekoordination. SEM utfördes av University of Michigan Microscopy & bildanalys laboratorium biomedicinsk forskning Core facility. Detta projekt stöddes av NIH Grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), veteraner Affairs merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot och genomförbarhets bidrag från Michigan diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans administration VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronmikroskopi utförs av University of Michigan mikroskopi & bildanalys laboratorium biomedicinsk forskning Core facility. Figur 4 i detta manuskript publicerades ursprungligen i Baker et al., J Clin endo Metab 2017; 1 mars, 102 (3), 1032-1043. DOI: 10.1210/JC. 2016-2915, och har reproducerats genom tillstånd av Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. För tillstånd att återanvända detta material, vänligen besök http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
