Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyse av komplekse molekyler og deres reaksjoner på overflater ved hjelp av cluster-indusert desorpsjon / ionisering massespektrometri

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60487
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa), Justus Liebig University Giessen, 2Bruker Daltonik GmbH
* These authors contributed equally

Summary

Nøytral SO2 klynger av lav kinetisk energi (< 0,8 eV / bestanddeler) brukes til å desorb komplekse overflatemolekyler som peptider eller lipider for videre analyse ved hjelp av en ionfelle massespektrometer. Ingen spesiell prøveforberedelse er nødvendig, og sanntidsobservasjon av reaksjoner er mulig.

Abstract

Desorpsjon/ionisering indusert av nøytralso2 klynger (DINeC) er ansatt som en veldig myk og effektiv desorpsjons-/ioniseringsteknikk for massespektrometri (MS) av komplekse molekyler og deres reaksjoner på overflater. DINeC er basert på en stråle av SO 2-klynger som påvirker prøveoverflaten ved lav klyngeenergi. Under klyngeoverflatepåvirkning blir noen av overflatemolekylene desorbed og ionisert via oppløsning i den påvirkende klyngen; som et resultat av denne oppløsende desorpsjonsmekanismen, er lav klyngeenergi tilstrekkelig og desorpsjonsprosessen er ekstremt myk. Både overflateadsorbates og molekyler som overflaten består av, kan analyseres. Klar og fragmenteringsfri spektras fra komplekse molekyler som peptider og proteiner oppnås. DINeC krever ingen spesiell prøveforberedelse, spesielt ingen matrise må påføres. Metoden gir kvantitativ informasjon om sammensetningen av prøvene; molekyler med overflatedekning så lavt som 0,1 % av en monolayer kan oppdages. Overflatereaksjoner som H/D-utveksling eller termisk nedbrytning kan observeres i sanntid, og kinetikken til reaksjonene kan utledes. Ved hjelp av en pulserende dyse for klyngestrålegenerering, kan DINeC effektivt kombineres med ionfellemassespektrometri. Den matrisefrie og myke karakteren av DINeC-prosessen i kombinasjon med MSn-egenskapene til ionefellen gir svært detaljert og entydig analyse av den kjemiske sammensetningen av komplekse organiske prøver og organiske adsorbates på overflater.

Introduction

Overflatesensitive analyseteknikker er ofte basert på partikkelsonder som lavenergielektroner, atomer eller ioner som sterkt samhandler med solide prøver. Som en konsekvens viser de høy overflatefølsomhet og detaljert informasjon om overflatestruktur kan fås1. Kjemisk informasjon er imidlertid ofte begrenset. Som et eksempel kan røntgenfotoelektronspektroskopi gi kvantitativ informasjon om atomsammensetningen og på gjennomsnittlig kjemisk miljø av en gitt art (f.eks. karbonatomer i et organisk molekyl adsorbed på en overflate2). Mer detaljert informasjon om komplekse, overflateadsorbeinte molekyler, for eksempel deres detaljerte struktur eller bindingssteder, er imidlertid vanskelig å få tak i med standard overflateanalyseteknikker. På den annen side vokser behovet for slik informasjon med den økende interessen for overflatefunksjonalisering ved hjelp av organiske molekyler. De ekspanderende feltene av overflatesyntese3 eller overflatefunksjonalisering ved vedlegg av biomolekyler4,5 er to fremtredende eksempler. I alle disse feltene undersøkes grunnleggende spørsmål om interaksjoner mellom underlag og adsorbat-adsorbateannonser for å bedre forstå systemene. For disse undersøkelsene er maksimalt informasjon om adsorbedmolekylene ønskelig.

Delvis kan sekundær ion massespektrometri (SIMS) gi slik informasjon. Simmene er først svært følsomme. For det andre, som sputtered adsorbates og deres fragmenter oppdages ved hjelp av MS, informasjon langt utover atomsammensetning er oppnådd. Avhengig av arten av de kjemiske artene adsorbed på overflaten, kan det identifiseres ved sin molekylære masse og fragment mønster observert i massespekteret6. Fragmentene indusert av de primære ionene kan faktisk bidra til identifisering av det analyserte materialet. På den annen side, hvis primær-ion indusert modifikasjon (fragmentering, ion-induserte reaksjoner, blanding) av prøven er for sterk, er de fleste opplysninger om den opprinnelige tilstanden til prøven tapt. Dermed har det blitt gjort store anstrengelser for å redusere fragmentering i SIMS (f.eks. ved hjelp av ladede molekylære klynger som primære ioner7,8,9). Fragmentering dominerer imidlertid fortsatt SIMS-spektra med store makromolekyler og biologiske prøver10,noe som begrenser anvendelsen av SIMS i ulike felt.

Som et alternativ har vi vist desorpsjon / ionisering indusert av nøytrale klynger (DINeC) for å være en myk og matrisefri ioniseringsmetode som har blitt brukt for massespektrometrisk analyse av komplekse molekyler11,12,13,14,15,16,17. DINeC er basert på en stråle av molekylære klynger som består av 103 til 104 SO2 molekyler (Figur 1). Når klyngene påvirker prøven, samhandler de på ulike måter med molekylene på og i overflaten: for det første distribueres en del av klyngens kinetiske energi og aktiverer desorpsjon. Tilsvarende viktig oppløses desorbingmolekylet i klyngen under klyngeoverflateeffekt11,18,19 ( figur1 og figur 2). Med andre ord, basert på det høye dipoleøyeblikket til SO2,fungerer klyngene svært effektivt som en forbigående matrise for polare analytter. Som et resultat foregår desorpsjon av analytemolekylene ved klyngeenergier så lavt som 1 eV/molekyl og under. Den myke naturen til desorpsjonsprosessen støttes ytterligere av rask kjøling av systemet når SO2-klyngen knuser under og etter overflatestøt11,19. Som en konsekvens av disse ulike aspektene fortsetter klyngeindusert desorpsjon av komplekse molekyler som peptider, proteiner, lipider og fargestoffer uten fragmentering av desorbingmolekylene11,15; typisk massespektra viser den dominerende toppen på m/z-verdien av det intakte molekylet ([M+H]+ eller [M-H]-, Figur 3). Avhengig av antall og art av funksjonelle grupper i molekylet, flere ladede kationer av skjemaet [M + n· H]n+ observeres11,15,18. For biomolekyler foregår ionisering vanligvis via opptak eller abstraksjon av et proton i en grunnleggende eller sur funksjonell gruppe, henholdsvis11. Hvis vannmolekyler er tilstede i prøven, kan SO2 molekyler fra klyngen reagere med disse vannmolekylene som danner svovelsyre18. Sistnevnte kan fungere som en effektiv protonkilde som ytterligere fremmer ioniseringsprosessen i tilfelle ionisering via protonopptak (positiv ionmodus)13,18.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av klyngeindusert desorpsjon/ionisering og eksperimentelt oppsett. Cluster-indusert desorpsjon/ionisering utføres i et høyvakuumfartøy. En stråle av SO2 klynger (gule prikker) er produsert via supersonisk utvidelse av en SO2/ He gassblanding fra en pulserende dyse. Under klyngeoverflatepåvirkning blir overflatemolekyler desorbed og ionisert. Molekylære ioner (røde/oransje prikker) overføres via et partisk rutenett, en dobbel iontraktinnløp og octopolarionguider inn i ionefellen for massespektrometri. Typisk evidens viser dominerende topper på m/z-verdiene til de intakte molekylene, her: M1 (oransje) og M2 (rød) i positiv ionmodus. Blås opp: Under klyngeoverflatepåvirkning oppløses de desorbedmolekylene i den påvirkende klyngen eller et av fragmentene. Ytterligere knusende og fordampning av SO2 molekyler fører deretter til den nakne, intakte molekylære ionen som det oppdages i massespektrometeret. Se også Figur 2. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Øyeblikksbilder av molekylære dynamikksimuleringer som illustrerer klyngeindusert desorpsjon via oppløsning. (A) En SO2-klynge (300 molekyler) nærmer seg overflaten med 1250 m/s vinkelrett på overflaten der en dipeptid (asparaginsyre-arginin, ASP-ARG) adsorberes. (B) Under klyngeoverflatepåvirkning knuser klyngen. Adsorbed dipeptid samhandler med de omkringliggende SO2 molekyler som fører til oppløsning i en av klyngefragmenter. (C) Klyngefragmentene er frastøtt fra overflaten. Det merkede fragmentet (blå sirkel) bærer dipeptid som er desorbed i dette fragmentet. Dette tallet er endret fra referanse 19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Representativt massespektrum og molekylær modell av angiotensin II. (A) Massespektra (øverste panel: positiv ionmodus, bunnpanel: negativ ion-modus) som oppnådd etter klyngeindusert desorpsjon/ionisering fra en angiotensin II-prøve. Prøven ble utarbeidet ved å slippe-støping den respektive løsningen på en Si wafer (dekket av sin naturlige oksid). De viktigste toppene er tildelt intakt biomolekyl, [M + H]+ og [M-H]-; ingen fragmenteringsmønstre observeres. Dimers ([2M+H]+, pil) indikerer videre den myke naturen til desorpsjonsprosessen. Det positive ionsignalet er mer intenst på grunn av påvirkning av SO 2-klyngene18. (B) Romfyllingsmodell og aminosyresekvens av angiotensin II. Hvite baller indikerer hydrogenatomer; svart: karbon; blå: nitrogen; rød: oksygen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

DINeC kan brukes på alle typer solid prøve som er kompatibel med høyvakuumforhold. Ingen spesiell prøveforberedelse er nødvendig, spesielt ingen matrise må påføres før DINeC-MS målinger, i motsetning til matriseassistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometri og relaterte teknikker20,21. Dette muliggjør sanntidsmålinger av kjemiske endringer i prøven med varierende eksperimentelle forhold som bakgrunnstrykk av reaktive arter i vakuumkammeret22 eller prøvetemperatur. Deteksjonsgrensen for DINeC-MS har vist seg å være i femtomolområdet11. Når det brukes på analyse av biomolekyler adsorbed på faste overflater i submonolayer regimet, en overflatedekning så lavt som 0,1% av en monolayer ble oppdaget23. I dette dekningsregimet avhenger signalintensiteten lineært på overflatedekning, og DINeC-MS kan brukes til kvantitativ analyse av overflatesammensetningen23. Ved blandede prøver er det mulig med en kvantitativ evaluering av prøvesammensetningen17,24,da det ikke observeres noen stor effekt av det kjemiske miljøet på ioniseringssannsynligheten (f.eks. i tilfelle av blandede lipid-/peptidprøver17). Dette står i klar kontrast til SIMMene, hvor ioniseringssannsynligheten for en gitt art vanligvis er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av forskjellige kjemiske komponenter (den såkalte "matriseeffekten"25,26).

I tillegg til overflateanalyse kan kjemisk sammensetning i undergrunnsområdet undersøkes ved hjelp av dybdeprofilering17. Med dagens oppsett er typiske desorpsjonsrater av klyngeindusert desorpsjon av biomolekyler av rekkefølgen 10-3 nm/s. En høy dybdeoppløsning i området 1 til 2 nm er observert for blandede lipid-/peptidprøver17.

Et ytterligere bruksfelt er kombinasjonen av DINeC-MS med tynt lagkromatografi (TLC). Konvensjonelle TLC plater kan analyseres direkte ved hjelp av DINeC-MS. Posisjonsavhengig massespektra kan kjøpes fra TLC plater og dermed massespesifikke kromatorammer kan fås fra TLC plater27. Ingen re-elution av de separerte analytene er nødvendig, forskjellig fra TLC i kombinasjon med ESI28,29. Ingen matrise er nødvendig for DINeC-MS + TLC kombinasjonen heller, i motsetning til koblingen av TLC med MALDI28,29.

Desorpsjon elektrospray ionisering (DESI) er også en myk desorpsjons-/ioniseringsmetode for MS-applikasjoner30,31. De mest slående forskjellene mellom DINeC og DESI er: den kvantitative karakteren av DINeC23, kompatibiliteten med ultra-høyvakuumforhold (UHV), spesielt muligheten til å undersøke prøver forberedt og overført i UHV-forhold uten å brytevakuumet 23,samt muligheten til å effektivt desorb ikke-polare molekyler19.

I prinsippet kan DINeC som desorpsjons-/ioniseringskilde kobles til alle typer massespektrometer. Imidlertid har kombinasjonen med ionfellemassespektrometri to hovedfordeler: for det første tilsvarer pulsbredden og repetisjonshastigheten til en typisk pulserende klyngebjelke veldig godt til den usammenhengende akkumuleringstiden, samt spektralhastigheten til ionfellen15,32. For det andre fører dinecs myke natur til desorpsjon av intakte molekyler. I kombinasjon med MSn-egenskapene til ionfellemassespektrometri, gir dette en mest omfattende analyse av de undersøkte prøvene15.

Protocol

MERK: Protokollen kan settes på pause når som helst.

1. Utarbeidelse av underlag

  1. For standardprøver, kutt underlaget fra silisiumwafers (tykkelse på ca. 0,5 til 1 mm) i stykker på 1 x 1 cm2.
  2. Rengjør Si-substratene i et ultralydbad av etanol og aceton i 15 min hver.
  3. Tørk underlaget i en strøm av tørr nitrogengass.

2. Utarbeidelse av prøver

  1. Standard prøveforberedelse
    1. For standard prøver, forberede løsningen som inneholder analyte molekyler i henhold til det vitenskapelige spørsmålet som skal løses. Konsentrasjonen av analyten bør være minst 1 x 10-10 mol/L.
    2. Fell 5 til 30 μL av prøveløsningen på substratet. Avhengig av væsketrykket, la prøven tørke under omgivelsesforhold eller i en utvanningsmiddel til alt løsningsmiddel har blitt fordampet og en tørrfilm er dannet. Avhengig av mengden stoff som påføres, kan tykkelsen på filmen være mellom flere ti μm (visuell inspeksjon mulig) og monolayer til sub-monolayer regime (dermed ikke påviselig av øyet).
    3. Monter prøvene på prøveholderen (f.eks. ved hjelp av klebrig tape eller klemmer strammet av skruer, avhengig av prøvene og vakuumforholdene som kreves).
    4. Hvis det er mulig, monterer du i tillegg en referanseprøve, for eksempel en mikrometertykk film av angiotensin II, på prøveholderen.
  2. Alternativ prøveforberedelse
    1. Bruk alternative prøveforberedelsesordninger som avsetning av elektrosprayionstråle (ES-IBD) i vakuum- eller dipbelegg i en respektiv løsning hvis det er aktuelt.
    2. Monteringsprøver som skal tilberedes og overføres i vakuum på DINeC-prøveholderen før klargjøringstrinnene.
    3. Sørg for at dip-belagte prøver er tørre etter det siste forberedelsestrinnet.
    4. Vurder den enkleste forberedelsesordningen. Som et eksempel, for undersøkelse av merkepennblekk, tegner du bare en prikk på underlaget.

3. Overføring av prøver til DINeC massespektrometer

  1. Overføring av prøver fra omgivelsesforhold til det evakuerte DINeC-kammeret
    1. Luft opp lastlåssystemet.
    2. Åpne lastelåsen og monter prøveholderen.
    3. Lukk lastlåsen og pump ned lastlåskammeret til et trykk under 2 x 10-5 mbar.
    4. Åpne ventilen til DINeC-kammeret og overfør prøveholderen med overføringsstangen til hovedmanipulatoren. Fest prøveholderen til manipulatoren.
    5. Trekk tilbake overføringsstangen og lukk ventilen mellom lastlås og DINeC-kammer.
       
  2. Overføring av prøver fra vakuum til det evakuerte DINeC-kammeret
    1. Bruk en transportabel vakuumbeholder, som kan festes til CF40 flens en DINeC-kammer. Overfør prøvene, som ble utarbeidet i vakuum, med denne beholderen uten å bryte vakuumet. Kontroller at prøvene er montert på en prøveholder som er kompatibel med manipulatoren som brukes i DINeC-systemet.
    2. Fest den transportbare vakuumbeholderen til CF40-flensen og pump ned volumet mellom beholderog DINeC-kammeret.
    3. Når trykket har falt under 2 x 10-5 mbar, åpne portventilene til DINeC-kammeret og den transportbare vakuumbeholderen og overfør prøven til DINeC-kammeret til manipulatoren ved hjelp av en wobble-pinne eller et annet overføringssystem med mer enn 50 cm lineær bevegelse.
    4. Trekk tilbake overføringssystemet og lukk de to portventilene.

4. Tilberedning av gassblanding

  1. Forbered en blanding av ca. 3% SO2 i helium ved først å evakuere gassflaskene på gassblandesystemet i 10 min.
  2. Fyll sylinderne med SO2 til et trykk på 1 bar er nådd.
  3. Fyll sylinderne ytterligere med helium til et totalt trykk på 30 bar er nådd.
    FORSIKTIG: Når du bruker SO2,må de respektive sikkerhetsforanstaltningene som lagring av SO2-sylindere i utpekte gassskap alltid oppfylles.

5. Utarbeidelse av DINeC massespektrometer

  1. Åpne ventilen mellom gassflasken og dysen. Juster trykket på SO2/He-gassblandingen ved omrisset av gassblandesystemet til 15 bar.
  2. Sett posisjonen til manipulatoren til referanseeksemplets posisjon.
  3. For måling av kationisk massespektra setter du henholdsvis prøve- og rutenettbias til henholdsvis +40 og +7 V.
  4. For å drive den pulserende dysen og ionfellemassespektrometeret, sett den eksterne funksjonsgeneratoren til 2 Hz. Med forsinkelsesgeneratoren, sett tidsforsinkelsen Δtn mellom Clear-fellesignalet fra ionfellen og utløsersignalet for den pulserende dysen til 5 ms.
  5. I kontrollprogramvaren justerer du følgende parametere ved å trykke på de respektive knappene eller skrive inn de respektive verdiene på Modus-siden i hoveddialogvinduet: Skannemodus:Forbedret oppløsning, Område: m/z 50 – 3000, Accu-time:0.1 ms, Gjennomsnitt:10 sykluser, Polaritet: positiv for måling av kationisk massespektra
    MERK: For å måle anionisk spektras må prøven og nettskjevheten være negativ med hensyn til jord, polaritet må byttes til Negativ i kontrollprogramvaren.

6. Måling av massespektra

  1. Når et trykk under 3 x 10-6 mbar er nådd i DINeC-kammeret, kan målingen startes. Start målingen ved først å trykke på Stand by og deretter trykke på Bruk i kontrollprogramvaren. Begynn å registrere målingene ved å trykke på Play-knappen.
  2. Mål et testspekter fra et referanseeksempel som angiotensin II i ca. 300 s. Følg tidsavhengigheten av signalet ved hjelp av Kromatogram satt til den respektive m/z-verdien. Optimaliser signalintensiteten ved justering av tidsforsinkelsen Δtn mellom Clear-fellesignalet og signalet som utløser den pulserende dysen.
  3. Flytt manipulatoren til plasseringen av prøven som skal måles. Optimaliser signalintensiteten ved justering av prøveposisjonen i prøveholderplanet.
  4. Erverve massespektra over tidsrommet av interesse. Endre eksperimentelle parametere som prøvetemperatur eller bakgrunnstrykk i kammeret i henhold til detaljene i eksperimentet. Fortsett å ta massespektra når du varierer de eksperimentelle parametrene.

7. Dataevaluering

  1. Når målingen er fullført, laster du inn det respektive datasettet i dataanalyseprogrammet. Velg tidsforløpet av interesse for kromatogram med høyre knapp på musen. Det gjennomsnittlige spekteret vises i et eget vindu.
  2. Eksporter spekteret som en datafil for videre behandling i et valgprogram.

   

Representative Results

I det følgende presenteres to eksempler for sanntidsbruk av DINeC-MS. Figur 4 viser endringen av massespekteret hentet fra angiotensin II når prøven varmes opp til ca. 140 °C. Når den endelige temperaturen er nådd (Figur 4B, Figur 4E),er spekteret preget av en ekstra topp som indikerer tap av en H2O-enhet ( m/ z = 1029). Ved oppbevaring av prøven ved denne temperaturen observeres ytterligere nedbrytning av angiotensin II molekyler (figur 4C),inkludert tap av en av terminalaminosyreenheter, asparaginsyre (topp ved m/z = 932, figur 4D). Kvantitativ analyse av dataene gjør det mulig å evaluere de underliggende reaksjonskinetikkene (figur 4E). Spesielt viser figur 4E at enheten med m/z = 1029 er et mellomliggende som ytterligere brytes ned i mindre fragmenter etter hvert som intensiteten først øker og deretter reduseres. De samtidige hastighetkonstantene er dermed i samme størrelsesorden.

Som et annet eksempel er undersøkelsen av hydrogen/deuteriumutveksling i angiotensin II22 illustrert i figur 5. Ved eksponering av angiotensinprøven til D2O i DINeC-kammeret (pD2O = 10-4 mbar), utvides det isotopisk mønsteret av angiotensin II og flyttes mot høyere m/z-verdier som indikerer utveksling av H med D-atomer. Prosessen er rask i løpet av de første 60-tallet, men bremser betydelig ned i den videre løpet av eksperimentet: Isotopmønsteret i figur 5B dekker et bredt m /z-område (ca. 15 m/z-enheter). Når vi definerer graden av deuterasjon d som antall utvekslet H atomer i et molekyl, kan verdier av d mellom d = 0 til d = 13 ekstraheres fra spekteret. I figur 5Creduseres isotopmønsteret igjen i bredden. Denne observasjonen kan tilskrives den sterkt reduserte intensiteten av toppene som er forbundet med de laveste grader av uthjortasjon. I figur 5Dvises spekteret for enda lengre reaksjonstider. Den dekkede m / z-området forblir nesten det samme, men midten av massen av spekteret skifter fortsatt sakte mot å øke m / z-verdiene. For lange eksponeringstider når en del av molekylene den høyeste graden av deuterasjon, dmaks = 17. Det tilsvarer maksimalt antall utskiftbare H-atomer, gitt av antall H-atomer bundet til funksjonelle grupper som karboksylsyrer eller amingrupper.

Allerede fra den timelige utviklingen av spektra, kan det utledes at H / D utveksling finner sted med forskjellige rate konstanter. For en kvantitativ beskrivelse av denne observasjonen er den gjennomsnittlige graden av deuterasjon di plottet i figur 5E som en tidsfunksjon. Inspeksjon av de eksperimentelle resultatene (symboler) avslører tre forskjellige regimer: en rask økning av di operative for t < 50 s, et mellomliggende regime for 50 s < t < 200 s, og en langsom, men nesten kontinuerlig økning for t > 200 s. De eksperimentelle resultatene ble simulert ved hjelp av Monte Carlo-simuleringer; pseudo-første-orden reaksjon kinetikk med reaksjon konstanter kjeg ble antatt for H / D utveksling på funksjonelle grupper av molekylene undersøkt22. En god avtale mellom simuleringer og eksperimentelle resultater i alle tre regimer ble bare oppnådd når minst tre forskjellige rate konstanter ki for H / D utveksling i angiotensin II molekyler ble brukt. I figur 5F,Gvises kinetikken som utledet fra å montere de eksperimentelle isotopmønstrene ved summen av isotopmønstre for ulike grader av hjorteation ( figur5A til figur 5D)vises. Den gode avtalen mellom eksperimentelle data og simuleringer samt de svært forskjellige valutakursene for lave og høye grader av avviker ei tydelig. Sammenlignet med forskjellige oligopeptider som hexaglycine, ble de raske valutakursene tilskrevet de eksplisitte funksjonelle gruppene, mens de langsomme valutakursene var forbundet med de midte gruppene av peptidets ryggrad22.

Mens disse to første eksemplene ble målt med mikrometertykke angiotensin II-prøver, viser figur 6 resultatene som oppnådd fra submonolayer dekning av angiotensin II på gullprøver som utarbeidet ved hjelp av elektrospray ion-bjelke avsetning (ES-IBD)23. En lineær avhengighet av signalintensiteten på stoffmengden observeres over 3 størrelsesordens størrelsesorden, den laveste mengden stoff som oppdages tilsvarer 0,1% av et monolayer av angiotensin II molekyler på gulloverflaten. H/ D utveksling eksperimenter som vist i figur 5 ble også utført med angiotensin II på gull i submonolayer regime23.

Figure 4
Figur 4: Sanntidsobservasjon av termisk nedbrytning av angiotensin II. -Jeg har ikke noe å si. Massespektra som oppnådd etter cluster-indusert desorpsjon/ionisering fra en angiotensin II-prøve. (A) Fersk prøve ved RT. (B) Prøve oppvarmet til ca. 140 °C. I tillegg til toppen på m/z = 1047, som er forbundet med det intakte molekylet [M+H]+, topper på m/z = 932, 1012 og 1029 vises (indikert med piler). (C) De sistnevnte toppene øker og hovedtoppen avtar med tiden når prøven holdes ved forhøyet temperatur. (D) Strukturell formel av angiotensin II som indikerer fragmentet (brune braketter) som fører til utseendet på toppen på m/z = 932 ved tap av en aminosyreenhet (asparaginsyre). (E) Tidsavhengighet av prøvetemperatur og intensiteten av hovedtoppene som er angitt i plottene (A) til (C). Solide linjer er guider til øyet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Sanntidsobservasjon av H/D-utveksling i angiotensin II. (AD) Kationisk massespektra av angiotensin II som oppnådd ved hjelp av DINeC-MS. På grunn av H / D utveksling, utvider isotopmønsteret og skifter mot høyere m / z verdier i (B) til (D) sammenlignet med isotopmønsteret til de uutterte artene vist i (A). Røde linjer er data, stiplede cyan linjer passer til dataene tar hensyn til ulike grader av utrerasjon. (E) Gjennomsnittlig grad av utbedring som en funksjon av tid som utledet fra forsøkene (åpne prikker). I tillegg vises d's som en funksjon av tid utledet ved hjelp av Monte Carlo simuleringer. Svart stiplet kurve: simuleringer tar hensyn til en hastighet konstant (k1); rød kurve: tar hensyn til tre rate konstanter (k1, k2, k3). -Jeg har ikke noe å si. Relative signalintensiteter av utvalgte grader av deuterasjon av angiotensin II (symboler + faste linjer) som en funksjon av tid sammen med tilsvarende resultater av Monte Carlo-simuleringene (stiplede linjer). Dette tallet er endret fra referanse 22. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Anvendelse av DINeC-MS til angiotensin II på gull i submonolayer regimet. (A) Skjematisk representasjon av kombinasjonen av ES-IBD for deponering og DINeC-MS for massespektrometri av isolerte angiotensin II molekyler i submonolayer regimet. (B) Avhengighet av signalintensitet på mengdesubstans deponert på prøven som hentet fra to uavhengige datasett (fylte og åpne symboler). Innlegg: DINeC massespektra som er hentet fra prøver der en mengde stoff ble deponert som angitt. Dette tallet er endret fra referanse 23. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

I mange studier utført så langt, har en høy følsomhet av DINeC-MS på ulike stoffer blitt vist. Faktisk tillater dette målinger av analytter ned til en mengde substans i femtomolregimet11. På grunn av denne høye følsomheten må prøveforberedelse, spesielt substratrengjøring, utføres med svært rene kjemikalier for å unngå forurensning i DINeC-massespektrasen. Som det er tilfelle for mange analyseteknikker, bidrar en riktig bakgrunnsmåling fra et tomt substrat til å skille topper fra analyten og toppene som har sin opprinnelse i substrat / prøveforberedelse.

Selv om vi har vist at ioniseringssannsynligheten for et gitt analytemolekyl ikke er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av co-adsorbates eller co-bestanddeler i blandede prøver17,24, kan ioniseringssannsynligheten variere fra substans til substans13. Dermed er det enda viktigere å arbeide under rene forhold som forurensninger, avhengig av deres ioniseringssannsynlighet, kan bidra til signalet mye sterkere enn analyten. Forhåndsformede ioner (f.eks. som finnes i tilfelle av mange syemolekyler), eller molekyler med funksjonelle grupper som viser en klar tendens til protonopptak eller deprotonasjon (dvs. baser eller syrer), viser vanligvis høy ioniseringssannsynlighet i DINeC-MS. Hvis ingen slik funksjonell gruppe er til stede i analyten, kan ioniseringssannsynligheten være lav. Prøvene kan deretter behandles ved å ionisere midler som trifluorsyre (f.eks. ved eksponering av prøven for damptrykket til ioniserende middel).

De representative resultatene som diskuteres i figur 4 og figur 5 viser anvendelsen av DINeC-MS for sanntidsundersøkelser av kjemiske reaksjoner ved hjelp av massespektrometri. Figur 6 illustrerer metodens submonolayer-følsomhet. Hvis de to egenskapene kombineres, kan kjemiske reaksjoner på overflater og deres produkter følges i sanntid23. Dette kan være spesielt av interesse for såkalt "on-surface syntese" som fører til montering av makromolekylære strukturer på overflater3,33,34,35,36. I dagens oppsett er observasjonen av slike overflatereaksjoner mulig på overflater med lavere reaktivitet som gull23 og andre edle metaller; eksperimentene er vanskeligere å utføres på svært reaktive overflater som silisiumflater37,da grunntrykket i desorpsjonskammeret er i 10-7-mbar-området. Nåværende aktiviteter løser denne begrensningen, og et UHV-kompatibelt DINeC-apparat bygges opp. Når det gjelder reaktive overflater, må samspillet mellom SO2 og substratoverflaten testes før målinger av overflateadsorbates og overflatereaksjoner.

Siden klyngestrålen er nøytral, kan den ikke fokuseres. Strålestørrelse på prøven er dermed gitt av geometrien til oppsettet og åpningen av skimmeren i bruk; typiske verdier for strålediameteren på prøven er en til flere millimeter. Som et resultat er bildebehandling ved å skanne prøven bare mulig med svært lav oppløsning. På den annen side, gitt av den høye ioniseringssannsynligheten13,bruker DINeC effektivt dedesorbedmolekylene. Dermed ser en kombinasjon av DINeC-MS og en ion-bildedetektor38 ut til å være svært attraktiv.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) og Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (PS). Forfatterne takker prof. Rauschenbach (University of Oxford) og hans team for fruktbart samarbeid om kombinerte ES-IBD / DINeC eksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone rotisolv HPLC Roth 7328.2 HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC Roth p076.1 HPLC Gradient Grade
Helium Praxair 4800086706 Purity 99.9999%
Nitrogen Praxair 40728408 Purity 99.5 - 100%
Silicon Wafers Active Business Company GmbH G60007
Sulfur dioxide Air Liquide P1734S10R0A001 Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS Roth HN43.1 Ultra LC-MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vickerman, J. C., Gilmore, I. Surface Analysis: The Principal Techniques. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).
  2. Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
  3. Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
  4. Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
  5. Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
  6. Vickerman, J. C., Briggs, D. TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , IM Publications. Chichester, UK. (2013).
  7. Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
  8. Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
  9. Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
  10. Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
  11. Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
  12. Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules - Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
  13. Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
  14. Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides - Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
  15. Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
  16. Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
  17. Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
  18. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents' Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
  19. Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
  20. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  21. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
  22. Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
  23. Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
  24. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
  25. Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
  26. Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
  27. Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
  28. Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
  29. Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
  30. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
  31. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
  32. Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , 926322 B2 (2019).
  33. Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
  34. Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
  35. Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
  36. Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
  37. Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
  38. Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Tags

Kjemi Utgave 157 massespektrometri klynge desorpsjon matrisefri myk overflateadsorbates reaksjonkinetikk H/D utveksling
Analyse av komplekse molekyler og deres reaksjoner på overflater ved hjelp av cluster-indusert desorpsjon / ionisering massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz,… More

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter