Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyse van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken door middel van cluster-geïnduceerde desorptie /Ionisatie massaspectrometrie

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60487
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Institute of Applied Physics and Center for Materials Research (LaMa), Justus Liebig University Giessen, 2Bruker Daltonik GmbH
* These authors contributed equally

Summary

Neutraal SO2 clusters van lage kinetische energie (< 0,8 eV/bestanddeel) worden gebruikt om complexe oppervlaktemoleculen zoals peptiden of lipiden te desorberen voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie met behulp van een ionenvalmassaspectrometer. Er is geen speciale monstervoorbereiding vereist en real-time observatie van reacties is mogelijk.

Abstract

Desorptie/ionisatie Geïnduceerd door Neutrale SO2 Clusters (DINeC) wordt gebruikt als een zeer zachte en efficiënte desorptie/ionisatietechniek voor massaspectrometrie (MS) van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken. DINeC is gebaseerd op een bundel van SO2 clusters die van invloed zijn op het monsteroppervlak bij lage clusterenergie. Tijdens cluster-oppervlakte-impact worden sommige oppervlaktemoleculen gedesorbeerd en geïoniseerd via oplosing in het impactcluster; als gevolg van dit opgeloste gemedieerde desorptiemechanisme is lage clusterenergie voldoende en is het desorptieproces uiterst zacht. Zowel oppervlakteadsorbaten als moleculen waaruit het oppervlak bestaat, kunnen worden geanalyseerd. Heldere en fragmentatievrije spectra uit complexe moleculen zoals peptiden en eiwitten worden verkregen. Dinec vereist geen speciale monsterbereiding, met name geen matrix hoeft te worden toegepast. De methode levert kwantitatieve informatie over de samenstelling van de monsters; moleculen aan een oppervlaktedekking van maar liefst 0,1 % van een monolayer kunnen worden gedetecteerd. Oppervlaktereacties zoals H/D-uitwisseling of thermische afbraak kunnen in real-time worden waargenomen en de kinetiek van de reacties kan worden afgeleid. Met behulp van een gepulseerde nozzle voor clusterbundelgeneratie kan DINeC efficiënt worden gecombineerd met ionenvalmassaspectrometrie. Het matrixvrije en zachte karakter van het DINeC-proces in combinatie met de MSn-mogelijkheden van de ionenval maakt een zeer gedetailleerde en ondubbelzinnige analyse mogelijk van de chemische samenstelling van complexe organische monsters en organische adsorbaten op oppervlakken.

Introduction

Oppervlaktegevoelige analysetechnieken zijn vaak gebaseerd op deeltjessondes zoals laagenergetische elektronen, atomen of ionen die sterk interageren met vaste monsters. Als gevolg hiervan vertonen ze een hoge oppervlaktegevoeligheid en kan gedetailleerde informatie over de oppervlaktestructuur worden verkregen1. Chemische informatie is echter vaak beperkt. Zo kan x-ray foto-elektronenspectroscopie kwantitatieve informatie geven over de atoomsamenstelling en over de gemiddelde chemische omgeving van een bepaalde soort (bijvoorbeeld de koolstofatomen in een organisch molecuul dat op een oppervlak wordt geadsorbeerd2). Meer gedetailleerde informatie over complexe, oppervlakteadsorbedmoleculen, zoals hun gedetailleerde structuur of bindende sites, is echter moeilijk te verkrijgen met standaard oppervlakteanalysetechnieken. Anderzijds neemt de behoefte aan dergelijke informatie toe met de toenemende belangstelling voor oppervlaktefunctionalisatie door middel van organische moleculen. De uitdijende velden van on-surface synthese3 of oppervlaktefunctionalisatie door gehechtheid van biomoleculen4,5 zijn twee prominente voorbeelden. Op al deze gebieden worden fundamentele vragen over substraat-adsorbate en adsorbate-adsorbate interacties onderzocht om de systemen beter te begrijpen. Voor deze onderzoeken is een maximum aan informatie over de geadsordeerde moleculen wenselijk.

Voor een deel kan secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) dergelijke informatie geven. Ten eerste is SIMS zeer oppervlaktegevoelig. Second, as the sputtered adsorbates and their fragments are detected by means of MS, information well beyond atomic composition is obtained. Afhankelijk van de aard van de chemische soort die op het oppervlak wordt geadsorbeerd, kan het worden geïdentificeerd aan de basis van de moleculaire massa en het fragmentpatroon dat in het massaspectrum wordt waargenomen6. De fragmenten veroorzaakt door de primaire ionen inderdaad kan helpen voor de identificatie van het geanalyseerde materiaal. Aan de andere kant, als primaire ionen geïnduceerde wijziging (fragmentatie, ionen-geïnduceerde reacties, mengen) van het monster te sterk is, gaat de meeste informatie over de oorspronkelijke toestand van het monster verloren. Er zijn dus grote inspanningen geleverd om de fragmentatie in SIMS te verminderen (bijvoorbeeld door geladen moleculaire clusters als primaire ionen7,8,9) te gebruiken. Fragmentatie domineert echter nog steeds SIMS-spectra van grote macromoleculen en biologische monsters10,waardoor de toepassing van SIMS op verschillende gebieden wordt beperkt.

Als alternatief hebben we aangetoond dat desorptie/ionisatie veroorzaakt door neutrale clusters (DINeC) een zachte en matrixvrije ionisatiemethode is die met succes is gebruikt voor massaspectrometrische analyse van complexe moleculen11,12,13,14,15,16,17. DINeC is gebaseerd op een bundel van moleculaire clusters die bestaan uit 103 tot 104 SO2 moleculen (Figuur 1). Wanneer de clusters invloed hebben op het monster, werken ze op verschillende manieren samen met de moleculen op en in het oppervlak: ten eerste wordt een deel van de kinetische energie van het cluster herverdeeld en activeert desorptie. Even zo belangrijk is dat het desorbingmolecuul in het cluster wordt opgelost tijdens cluster-oppervlakte-impact11,18,19 ( figuur1 en figuur 2). Met andere woorden, op basis van de hoge dipool moment van SO2, de clusters zeer efficiënt dienen als een voorbijgaande matrix voor polaire analyten. Als gevolg hiervan vindt de desorptie van de analytmoleculen plaats bij cluster-energieën zo laag als 1 eV/molecuul en lager. Het zachte karakter van het desorptieproces wordt verder ondersteund door snelle koeling van het systeem wanneer het SO2-cluster tijdens en na oppervlakte-impact11,19verbrijzelt . Als gevolg van deze verschillende aspecten verloopt cluster-geïnduceerde desorptie van complexe moleculen zoals peptiden, eiwitten, lipiden en kleurstoffen zonder enige fragmentatie van de desorbing moleculen11,15; typische massaspectra tonen de dominante piek bij de m/z-waarde van het intacte molecuul ([M+H]+ of [M-H]-, figuur 3). Afhankelijk van het aantal en de aard van functionele groepen in het molecuul, meerdere geladen kationen van het formulier [M + n· H]n+ worden waargenomen11,15,18. Voor biomoleculen vindt ionisatie meestal plaats via opname of abstractie van een proton bij respectievelijk een basis- of zure functionele groep, respectievelijk11. Als watermoleculen aanwezig zijn in het monster, kunnen SO2 moleculen uit het cluster reageren met deze watermoleculen die zwavelzuur vormen18. Deze laatste kan fungeren als een efficiënte protonbron die het ionisatieproces in geval van ionisatie via protonopname (positieve ionenmodus)13,18verder bevordert.

Figure 1
Figuur 1: Schematische illustratie van cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie en experimentele opstelling. Cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie wordt uitgevoerd in een hoogvacuümvat. Een straal van SO2 clusters (gele stippen) wordt geproduceerd via supersonische uitbreiding van een SO2/ Hij gasmengsel uit een gepulseerde mondstuk. Tijdens cluster-oppervlakte-impact worden oppervlaktemoleculen ontlast en geïoniseerd. Moleculaire ionen (rode/oranje stippen) worden overgebracht via een bevooroordeeld raster, een dubbele ionentrechterinlaat en octopolaire ionengidsen in de ionenval voor massaspectrometrie. Typische massaspectra tonen dominante pieken bij m/z-waarden van de intacte moleculen, hier: M1 (oranje) en M2 (rood) in positieve ionenmodus. Opblazen: Tijdens de impact van het clusteroppervlak worden de desorbedmoleculen opgelost in het impactcluster of een van de fragmenten. Verdere verbrijzeling en verdamping van SO2 moleculen leiden dan naar de kale, intacte moleculaire ion zoals gedetecteerd in de massaspectrometer. Zie ook figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Momentopnamen van moleculaire dynamicasimulaties ter illustratie van cluster-geïnduceerde desorptie via oplosing. (A) Een SO2-cluster (300 moleculen) benadert het oppervlak met 1250 m/s loodrecht op het oppervlak waarop een dipeptide (aspartiumzuur-arginine, ASP-ARG) wordt geadsorbeerd. (B) Bij cluster-oppervlakte-impact versplintert het cluster. De adsorbeerde dipeptide interageert met de omliggende SO2 moleculen leidt tot het oplossen ervan in een van de clusterfragmenten. (C) De clusterfragmenten worden van het oppervlak afgestoten. Het geëtiketteerde fragment (blauwe cirkel) draagt het dipeptide dat in dit fragment wordt ontleed. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatief massaspectrum en moleculair model van angiotensine II. (A) Massaspectra (bovenste paneel: positieve ionenmodus, onderste paneel: negatieve ionenmodus) zoals verkregen na cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie van een angiotensinII-monster. Het monster werd bereid door de desbetreffende oplossing op een Si-wafer (bedekt met het natuurlijke oxide) te laten vallen. De belangrijkste pieken worden toegewezen aan het intacte biomolecuul, [M+H]+ en [M-H]- ; er worden geen fragmentatiepatronen waargenomen. Dimers ([2M+H]+pijl) geven verder de zachte aard van het desorptieproces aan. Het positieve ionensignaal is intenser door de invloed van de SO2 clusters18. (B) Ruimtevullend model en aminozuursequentie van angiotensine II. Witte ballen wijzen op waterstofatomen; zwart: koolstof; blauw: stikstof; rood: zuurstof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

DINeC kan worden toegepast op elke vorm van massief monster dat compatibel is met hoogvacuümomstandigheden. Er is geen speciale monstervoorbereiding nodig, met name geen matrix hoeft te worden toegepast vóór dinec-ms-metingen, in tegenstelling tot matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) massaspectrometrie en aanverwante technieken20,21. Dit maakt real-time metingen van chemische veranderingen van het monster mogelijk met verschillende experimentele omstandigheden, zoals achtergronddruk van reactieve soorten in de vacuümkamer22 of monstertemperatuur. De detectielimiet van DINeC-MS is aangetoond dat het in het femtomole-bereikligt 11. Bij toepassing op de analyse van biomoleculen die op vaste oppervlakken in het submonolayerregime worden geadsorbeerd, werd een oppervlaktedekking van 0,1% van een monolayer gedetecteerd23. In deze dekkingsregeling is de signaalintensiteit lineair afhankelijk van de oppervlaktedekking en kan DINeC-MS worden gebruikt voor kwantitatieve analyse van de oppervlaktesamenstelling23. In het geval van gemengde monsters is een kwantitatieve evaluatie van de monstersamenstelling mogelijk17,24, aangezien er geen groot effect van het chemische milieu op de ionisatiewaarschijnlijkheid wordt waargenomen (bijvoorbeeld in het geval van gemengde lipide/peptidemonsters17). Dit staat in schril contrast met SIMS, waarvoor de ionisatiewaarschijnlijkheid van een bepaalde soort doorgaans sterk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van verschillende chemische componenten (het zogenaamde "matrixeffect"25,26).

Naast oppervlakteanalyse kan de chemische samenstelling in het ondergrondse gebied worden onderzocht door middel van diepteprofilering17. Met de huidige opstelling zijn de typische desorptiesnelheden van cluster-geïnduceerde desorptie van biomoleculen van de orde 10-3 nm/s. Een hoge diepteresolutie in het bereik van 1 tot 2 nm is waargenomen voor gemengde lipide / peptide monsters17.

Een ander toepassingsgebied is de combinatie van DINeC-MS met dunne laagchromatografie (TLC). Conventionele TLC-platen kunnen rechtstreeks worden geanalyseerd door middel van DINeC-MS. Positieafhankelijke massaspectra kunnen worden verkregen uit de TLC-platen en dus kunnen massaspecifieke chromatogrammen worden verkregen uit de TLC-platen27. Er is geen hereling van de gescheiden analyten nodig, anders dan TLC in combinatie met ESI28,29. Ook voor de DINeC-MS + TLC combinatie is geen matrix nodig, in tegenstelling tot de koppeling van TLC met MALDI28,29.

Desorptie elektrospray ionisatie (DESI) is ook een zachte desorptie/ionisatiemethode voor MS-toepassingen30,31. De meest opvallende verschillen tussen DINeC en DESI zijn: het kwantitatieve karakter van DINeC23, de verenigbaarheid met ultra-hoogvacuüm (UHV) omstandigheden, met name de mogelijkheid om monsters voorbereid en overgedragen in UHV-omstandigheden te onderzoeken zonder het vacuüm te breken23, evenals de mogelijkheid om niet-polaire moleculen efficiënt te desorberen19.

In principe kan DINeC als desorptie/ionisatiebron worden gekoppeld aan elk type massaspectrometer. De combinatie met ionenvalmassaspectrometrie heeft echter twee belangrijke voordelen: ten eerste komen de pulsbreedte en herhalingssnelheid van een typische gepulseerde clusterbundel zeer goed overeen met de discontinu accumulatietijd en de spectrale snelheid van de ionenval15,32. Ten tweede leidt de zachte aard van het DINeC-proces tot desorptie van intacte moleculen. In combinatie met de MSn-mogelijkheden van ionenvalmassaspectrometrie maakt dit een meest uitgebreide analyse van de onderzochte monstersmogelijk 15.

Protocol

OPMERKING: Het protocol kan op elk gewenst moment worden onderbroken.

1. Bereiding van substraten

  1. Snijd voor standaardmonsters de substraten uit siliciumwafers (dikte van ongeveer 0, 1 mm) in stukken van 1 x 1 cm2.
  2. Reinig de Si substraten in een echobad van ethanol en aceton voor 15 min elk.
  3. Droog de substraten in een stroom van droog stikstofgas.

2. Bereiding van monsters

  1. Standaard monstervoorbereiding
    1. Voor standaardmonsters bereidt u de oplossing voor die de analytmoleculen bevat volgens de te behandelen wetenschappelijke vraag. De concentratie van de analyt moet ten minste 1 x 10-10 mol/L zijn.
    2. Drop-cast 5 tot 30 μL van de monsteroplossing op het substraat. Afhankelijk van de dampdruk van het oplosmiddel laat u het monster drogen onder omgevingsomstandigheden of in een desiccator totdat alle oplosmiddelen zijn verdampt en een droge film is gevormd. Afhankelijk van de hoeveelheid toegepaste stof kan de dikte van de film tussen enkele tien μm (visuele inspectie mogelijk) en de monolayer tot submonolayer regime (dus niet detecteerbaar door het oog).
    3. Monteer de monsters op de monsterhouder (bijvoorbeeld met plakband of klemmen die door schroeven worden aangedraaid, afhankelijk van de vereiste monsters en vacuümomstandigheden).
    4. Monteer indien mogelijk bovendien een referentiemonster zoals een micrometerdikke film angiotensinii, op de monsterhouder.
  2. Alternatieve monsterbereiding
    1. Gebruik indien van toepassing alternatieve monsterbereidingsschema's zoals elektrospray ion-beam deposition (ES-IBD) in vacuüm- of dipcoating in een desbetreffende oplossing.
    2. Monteer monsters die vóór de voorbereidingsstappen in vacuüm op de HOUDER van het DINeC-monster moeten worden bereid en overgebracht.
    3. Zorg ervoor dat dip-coated monsters droog zijn na de laatste voorbereidingstap.
    4. Denk aan de eenvoudigste voorbereidingsregeling. Als voorbeeld, voor het onderzoek van highlighter inkt, gewoon een stip op het substraat oppervlak te trekken.

3. Overdracht van monsters in DINeC massaspectrometer

  1. Overdracht van monsters van omgevingscondities in de geëvacueerde DINeC-kamer
    1. Ontlucht het laadslotsysteem.
    2. Open het laadslot en monteer de monsterhouder.
    3. Sluit de laadvergrendeling en pomp de laadslotkamer af tot een druk van minder dan 2 x 10-5 mbar.
    4. Open de klep naar de DINeC-kamer en breng de monsterhouder met de overdrachtsstaaf naar de hoofdmanipulator. Bevestig de monsterhouder aan de manipulator.
    5. Trek de overdrachtsssstaaf in en sluit de klep tussen load-lock en DINeC-kamer.
       
  2. Overdracht van monsters van vacuüm in de geëvacueerde DINeC-kamer
    1. Gebruik een transporteerbare vacuümcontainer, die kan worden bevestigd aan de CF40 flens van de DINeC-kamer. Breng de monsters, die werden bereid in vacuüm, met deze container zonder het breken van het vacuüm. Zorg ervoor dat de monsters zijn gemonteerd op een monsterhouder die compatibel is met de manipulator die in het DINeC-systeem wordt gebruikt.
    2. Bevestig de transporteerbare vacuümcontainer aan de CF40 flens en pomp het volume tussen container en DINeC-kamer.
    3. Zodra de druk onder 2 x 10-5 mbar is gedaald, opent u de poortkleppen naar de DINeC-kamer en de transporteerbare vacuümcontainer en brengt u het monster naar de DINeC-kamer met behulp van een wobble stick of een ander overdrachtssysteem met een lineaire beweging van meer dan 50 cm.
    4. Trek het transfersysteem in en sluit de twee poortkleppen.

4. Bereiding van het gasmengsel

  1. Bereid een mengsel van ongeveer 3% SO2 in helium door eerst de gasflessen van het gasmengsysteem gedurende 10 min te evacueren.
  2. Vul de cilinders met SO2 tot een druk van 1 bar is bereikt.
  3. Vul de cilinders verder met helium tot een totale druk van 30 bar is bereikt.
    LET OP: Bij het gebruik van SO2moeten de respectieve veiligheidsmaatregelen, zoals het opslaan van SO2-cilinders in aangewezen gaskasten, altijd worden nageleefd.

5. Bereiding van DINeC massaspectrometer

  1. Open de klep tussen de gasfles en het mondstuk. Pas de druk van het SO2/He gasmengsel aan de omtrek van het gasmengsysteem aan op 15 bar.
  2. Stel de positie van de manipulator in op de positie van het referentiemonster.
  3. Voor het meten van kationische massaspectra, stelt u het monster en de rasterbias in op respectievelijk +40 en +7 V.
  4. Als u het gepulseerde mondstuk en de ionenvalmassaspectrometer wilt aansturen, stelt u de externe functiegenerator in op 2 Hz. Stel met de vertragingsgenerator de vertraging Δtn in tussen het foutiesignaal duidelijk van de ionenval en het triggersignaal voor het gepulseerde mondstuk op 5 ms.
  5. Pas in de besturingssoftware de volgende parameters aan door op de respectievelijke knoppen te drukken of de respectievelijke waarden te typen op de pagina Modus van het hoofddialoogvenster: Scanmodus: Verbeterde resolutie, bereik: m/z 50 – 3000, Accu-tijd: 0,1 ms, Gemiddeld: 10 cycli, Polariteit: positief voor de meting van kationische massaspectra
    OPMERKING: Voor het meten van anionische spectra, het monster en grid bias moeten negatief zijn met betrekking tot de grond, Polariteit moet worden overgeschakeld naar Negatief in de controle software.

6. Meting van massaspectra

  1. Zodra een druk van minder dan 3 x 10-6 mbar in de DINeC-kamer is bereikt, kan de meting worden gestart. Start de meting door eerst stand-by te drukken en druk vervolgens op Bedienen in de besturingssoftware. Begin met het opnemen van de metingen die op de play-knop drukken.
  2. Meet een testspectrum uit een referentiemonster zoals angiotensinII gedurende ongeveer 300 s. Volg de tijdsafhankelijkheid van het signaal met behulp van het Chromatogram ingesteld op de respectievelijke m/z-waarde. Optimaliseer de signaalintensiteit door de vertraging Δtn af te stellen tussen het signaal Clear-val en het signaal dat het gepulseerde mondstuk activeert.
  3. Verplaats de manipulator naar de positie van het te meten monster. Optimaliseer de signaalintensiteit door de monsterpositie in het vlak van de monsterhouder aan te passen.
  4. Verwerf massaspectra in de tijdspanne van belang. Wijzig de experimentele parameters zoals de monstertemperatuur of de achtergronddruk in de kamer op basis van de details van het experiment. Blijf massaspectra nemen bij het variëren van de experimentele parameters.

7. Evaluatie van gegevens

  1. Nadat de meting is voltooid, laadt u de desbetreffende gegevensset in het programma Gegevensanalyse. Selecteer de tijdspanne van belang in het chromatogram met de rechterknop van de muis. Het gemiddelde spectrum wordt weergegeven in een apart venster.
  2. Exporteer het spectrum als gegevensbestand voor verdere verwerking in een programma naar keuze.

   

Representative Results

In het volgende worden twee voorbeelden voor de real-time toepassing van DINeC-MS gepresenteerd. Figuur 4 toont de verandering van het massaspectrum verkregen uit angiotensine II wanneer het monster wordt verwarmd tot ongeveer 140 °C. Wanneer de uiteindelijke temperatuur wordt bereikt (figuur 4B, figuur 4E), wordt het spectrum gekenmerkt door een extra piek die het verlies van een entiteit H2O(m/z = 1029) aangeeft. Bij het bij houden van het monster op die temperatuur wordt verdere ontleding van de angiotensine II-moleculen waargenomen (figuur 4C), inclusief het verlies van een van de eindaminozuren, aspartisch zuur (piek bij m/z = 932, figuur 4D). Kwantitatieve analyse van de gegevens maakt het mogelijk om de onderliggende reactiekinetiek te evalueren (figuur 4E). Figuur 4E toont met name aan dat de entiteit met m/z = 1029 een tussenproduct is dat verder ontleedt in kleinere fragmenten naarmate de intensiteit eerst toeneemt en vervolgens afneemt. De gelijktijdige tariefconstanten zijn zo in de zelfde orde van grootte.

Als tweede voorbeeld wordt het onderzoek naar de uitwisseling van waterstof/deuterium in angiotensin II22 geïllustreerd in figuur 5. Bij blootstelling van het angiotensinemonster aan D2O in de DINeC-kamer (pD2O = 10-4 mbar) wordt het isotopenpatroon van angiotensinii verbreed en verschoven naar hogere m/z-waarden die duiden op de uitwisseling van H door D-atomen. Het proces is snel tijdens de eerste 60 s, maar vertraagt aanzienlijk in de verdere loop van het experiment: Het isotooppatroon in figuur 5B bestrijkt een breed m/z-bereik (ongeveer 15 m/z-eenheden). Wanneer we de mate van deuteratie d definiëren als het aantal uitgewisselde H-atomen in een molecuul, kunnen waarden van d tussen d = 0 tot d = 13 uit het spectrum worden gehaald. In figuur 5Cwordt het isotooppatroon opnieuw in breedte verminderd. Deze observatie kan worden toegeschreven aan de sterk verminderde intensiteit van de pieken die worden geassocieerd met de laagste graden van deuteratie. In figuur 5Dwordt het spectrum voor nog langere reactietijden weergegeven. Het overdekte m/z-bereik blijft nagenoeg gelijk, maar het massacentrum van het spectrum verschuift nog steeds langzaam naar toenemende m/z-waarden. Voor lange blootstellingstijden bereikt een deel van de moleculen de hoogste mate van deuteratie, dmax = 17. Het komt overeen met het maximum aantal uitwisselbare H-atomen, gegeven door het aantal H-atomen gebonden aan functionele groepen zoals carboxylic zuren of aminegroepen.

Reeds van de tijdelijke evolutie van de spectra, kan men afleiden dat de uitwisseling H/D met verschillende tariefconstanten plaatsvindt. Voor een kwantitatieve beschrijving van deze waarneming wordt de gemiddelde mate van deuteratie d? in figuur 5E uitgezet als functie van de tijd. Inspectie van de experimentele resultaten (symbolen) onthult drie verschillende regimes: een snelle toename van d? operatieve voor t < 50 s, een tussenregime voor 50 s < t < 200 s, en een langzame maar bijna continue toename voor t > 200 s. De experimentele resultaten werden gesimuleerd door middel van Monte Carlo simulaties; pseudo-eerste-orde reactie kinetiek met reactieconstanten ki werd verondersteld voor de Uitwisseling H/D bij de functionele groepen van de onderzochte molecules22. Een goede overeenkomst tussen simulaties en experimentele resultaten in alle drie de regimes werd pas verkregen wanneer ten minste drie verschillende koersconstanten ki voor de H/D-uitwisseling in angiotensine II-moleculen werden toegepast. In figuur 5F,Gworden de kinetiek en als gevolg van de aanpassing van de experimentele isotopenpatronen door de som van isotopenpatronen voor verschillende graden van deuteratie(figuur 5A tot en met figuur 5D)weergegeven. De goede overeenkomst tussen experimentele gegevens en simulaties en de zeer verschillende wisselkoersen voor lage en hoge graden van deuteraties worden duidelijk waargenomen. In vergelijking met verschillende oligopeptiden zoals hexaglycine werden de snelle wisselkoersen toegeschreven aan de expliciete functionele groepen, terwijl de trage wisselkoersen werden geassocieerd met de amidegroepen van de ruggengraat van het peptide22.

Terwijl deze eerste twee voorbeelden werden gemeten met micrometerdikke angiotensine II-monsters, toont figuur 6 de resultaten die zijn verkregen uit submonolayerdekking van angiotensine II op goudmonsters zoals bereid door middel van elektrospray ionenstraaldepositie (ES-IBD)23. Een lineaire afhankelijkheid van de signaalintensiteit op de hoeveelheid stof wordt waargenomen over 3 ordes van grootte, de laagste hoeveelheid stof gedetecteerd komt overeen met 0,1% van een monolayer van angiotensine II moleculen op het goudoppervlak. H/D-uitwisselingsexperimenten zoals getoond in figuur 5 werden ook uitgevoerd met angiotensine II op goud in het submonolayerregime23.

Figure 4
Figuur 4: Real-time observatie van thermische afbraak van angiotensine II. (A-C) Massaspectra zoals verkregen na cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie van een angiotensinii-monster. (A) Vers monster bij RT. (B) Monster verwarmd tot ongeveer 140 °C. Naast de piek op m/z = 1047, die wordt geassocieerd met het intacte molecuul [M+H]+, verschijnen pieken bij m/z = 932, 1012 en 1029 (aangegeven door pijlen). (C) De laatste pieken nemen toe en de belangrijkste piek neemt met de tijd af wanneer het monster op verhoogde temperatuur blijft. (D) Structurele formule van angiotensine II die het fragment (bruine haakjes) aangeeft dat leidt tot het verschijnen van de piek bij m/z = 932 door verlies van één aminozuureenheid (aspartiumzuur). (E) Tijdsafhankelijkheid van de monstertemperatuur en de intensiteit van de belangrijkste pieken die in de percelen (A) tot en met C worden aangegeven). Vaste lijnen zijn geleiders naar het oog. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Real-time observatie van H/D-uitwisseling in angiotensine II. (A-D) Kationische massaspectra van angiotensine II, verkregen door middel van DINeC-MS. Als gevolg van H/D-uitwisseling verbreedt en verschuift het isotopenpatroon naar hogere m/z-waarden in (B) tot (D) in vergelijking met het isotooppatroon van de niet-gedeuteerde soorten zoals vermeld (A). Rode lijnen zijn gegevens, stippelcyaanlijnen zijn geschikt voor de gegevens rekening houdend met verschillende mate van deuteratie. (E) Gemiddelde mate van deuteratie d?als functie van de tijd zoals afgeleid uit de experimenten (open stippen). Bovendien wordt d?als functie van tijd die door middel van de simulaties van Monte Carlo wordt afgeleid getoond. Zwarte stippelcurve: simulaties rekening houdend met één constante(k1); rode curve: rekening houdend met drie koersconstanten (k1, k2, k3). (F,G) Relatieve signaalintensiteiten van geselecteerde graden van deuteratie van angiotensine II (symbolen + vaste lijnen) als functie van de tijd, samen met de overeenkomstige resultaten van de Monte Carlo simulaties (stippellijnen). Dit cijfer is gewijzigd van referentie 22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Toepassing van DINeC-MS op angiotensine II op goud in het submonolayerregime. (A) Schematische weergave van de combinatie van ES-IBD voor afzetting en DINeC-MS voor massaspectrometrie van geïsoleerde angiotensine II moleculen in het submonolayer regime. B) Afhankelijkheid van signaalintensiteit van de hoeveelheid stof die op het monster wordt afgezet, zoals verkregen uit twee onafhankelijke gegevenssets (gevulde en open symbolen). Insets: DINeC massaspectra zoals verkregen uit monsters waarop een hoeveelheid stof werd afgezet zoals aangegeven. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 23. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

In veel studies die tot nu toe zijn uitgevoerd, is een hoge gevoeligheid van DINeC-MS op verschillende stoffen aangetoond. Dit maakt het inderdaad mogelijk om analyten te meten tot een hoeveelheid stof in het femtomole-regime11. Vanwege deze hoge gevoeligheid moet monsterpreparaat, met name substraatreiniging, worden uitgevoerd met zeer zuivere chemicaliën om besmetting in de DINeC massaspectra te voorkomen. Aangezien het voor veel analysetechnieken het geval is, helpt een goede achtergrondmeting van een leeg substraat pieken te scheiden van de analyt en pieken die hun oorsprong hebben in substraat/monstervoorbereiding.

Hoewel we hebben aangetoond dat de ionisatiewaarschijnlijkheid van een bepaald analytmolecuul niet sterk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van co-adsorbaten of medebestanddelen in gemengde monsters17,24, kan de ionisatiewaarschijnlijkheid variëren van stof tot stof13. Zo is het nog belangrijker om onder schone omstandigheden te werken, omdat verontreinigingen, afhankelijk van hun ionisatiewaarschijnlijkheid, kunnen bijdragen aan het signaal dat veel sterker is dan de analyt. Voorgevormde ionen (bijvoorbeeld, zoals gevonden in het geval van veel kleurstofmoleculen), of moleculen met functionele groepen die een duidelijke neiging tot protonopname of deprotonatie (d.w.z. basen of zuren) vertonen, vertonen meestal een hoge ionisatiewaarschijnlijkheid bij DINeC-MS. Als er geen dergelijke functionele groep aanwezig is in de analyt, kan de ionisatiewaarschijnlijkheid laag zijn. De monsters kunnen vervolgens worden behandeld door ioniserende middelen zoals trifluorzuur (bijvoorbeeld door blootstelling van het monster aan de dampdruk van het ioniserende middel).

De representatieve resultaten die in figuur 4 en figuur 5 worden besproken, tonen aan dat DINeC-MS toepasbaar is voor real-time onderzoeken naar chemische reacties door middel van massaspectrometrie. Figuur 6 illustreert de submonolayergevoeligheid van de methode. Als de twee eigenschappen worden gecombineerd, chemische reacties op oppervlakken en hun producten kunnen worden gevolgd in real time23. Dit kan met name van belang zijn voor de zogenaamde "on-surface synthese" die leidt tot de assemblage van macromoleculaire structuren op oppervlakken3,33,34,35,36. In de huidige opzet is het observeren van dergelijke oppervlaktereacties mogelijk op oppervlakken met een lagere reactiviteit zoals goud23 en andere edele metalen; de experimenten zijn moeilijker uit te voeren op zeer reactieve oppervlakken zoals siliciumoppervlakken37, omdat de basisdruk in de desorptiekamer zich in het bereik van 10-7mbar bevindt. De huidige activiteiten hebben betrekking op deze beperking en er wordt een UHV-compatibel DINeC-apparaat opgebouwd. In het geval van reactieve oppervlakken moet de interactie tussen SO2 en het substraatoppervlak worden getest voorafgaand aan de metingen van oppervlakteadsorbaten en oppervlaktereacties.

Omdat de clusterbundel neutraal is, kan deze niet worden scherp. De grootte van de lichtbundel op het monster wordt dus bepaald door de geometrie van de opstelling en opening van de gebruikte skimmer; typische waarden voor de bundeldiameter op het monster is een tot enkele millimeters. Als gevolg hiervan is beeldvorming door het scannen van het monster alleen mogelijk met een zeer lage resolutie. Aan de andere kant, gegeven door de hoge ionisatie waarschijnlijkheid13, DINeC maakt efficiënt gebruik van de desorbed moleculen. Zo lijkt een combinatie van DINeC-MS en een ion-imaging detector38 zeer aantrekkelijk.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.

Acknowledgments

De auteurs erkennen financiële steun van het Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) en de Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). De auteurs danken Prof. Rauschenbach (Universiteit van Oxford) en zijn team voor een vruchtbare samenwerking op het gebied van gecombineerde ES-IBD/DINeC experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone rotisolv HPLC Roth 7328.2 HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC Roth p076.1 HPLC Gradient Grade
Helium Praxair 4800086706 Purity 99.9999%
Nitrogen Praxair 40728408 Purity 99.5 - 100%
Silicon Wafers Active Business Company GmbH G60007
Sulfur dioxide Air Liquide P1734S10R0A001 Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS Roth HN43.1 Ultra LC-MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vickerman, J. C., Gilmore, I. Surface Analysis: The Principal Techniques. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).
  2. Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001). Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).
  3. Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks. Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).
  4. Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey. Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).
  5. Adler-Abramovich, L., Gazit, E. The physical properties of supramolecular peptide assemblies: from building block association to technological applications. Chemical Society Reviews. 43, 6881-6893 (2014).
  6. Vickerman, J. C., Briggs, D. TOF-SIMS: Materials Analysis by Mass Spectrometry, 2nd ed. , IM Publications. Chichester, UK. (2013).
  7. Winograd, N. The magic of cluster SIMS. Analytical Chemistry. 77, 142-149 (2005).
  8. Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions. Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).
  9. Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).
  10. Yokoyama, Y., Aoyagi, S., Fujii, M., Matsuo, J., Fletcher, J. S., Lockyer, N. P., Vickerman, J. C., Passarelli, M. K., Havelund, R., Seah, M. P. Peptide Fragmentation and Surface Structural Analysis by Means of ToF-SIMS Using Large Cluster Ion Sources. Analytical Chemistry. 88, 3592-3597 (2016).
  11. Gebhardt, C. R., Tomsic, A., Schröder, H., Durr, M., Kompa, K. L. Matrix-Free Formation of Gas-Phase Biomolecular Ions by Soft Cluster-Induced Desorption. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 4162-4165 (2009).
  12. Baur, M., Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Durr, M. Soft Clusterinduced Desorption and Ionization of Biomolecules - Influence of Surface Load and Morphology on Desorption Efficiency. Applied Physics Letters. 99, 234103 (2011).
  13. Lee, B. J., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Quantification of the Ionization Probability During Desorption/Ionization of Oligopeptides Induced by Neutral Cluster Impact. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 27, 1090-1094 (2013).
  14. Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides - Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration. Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).
  15. Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).
  16. Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase. Nano Letters. 14, 563-569 (2014).
  17. Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect. Biointerphases. 13, 03B405 (2018).
  18. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. Influence of the Cluster Constituents' Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters. Journal of Chemical Physics. 146, 134705 (2017).
  19. Schneider, P., Durr, M. Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents. Journal of Chemical Physics. 150, 214301 (2019).
  20. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10 000 Daltons. Analytical Chemistry. 60, 2299-2301 (1988).
  21. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).
  22. Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).
  23. Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90, 3328 (2018).
  24. Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact. Biointerphases. 11, 02A316 (2016).
  25. Shard, A. G., Spencer, S. J., Smith, S. A., Havelund, R., Gilmore, I. S. International Journal of Mass Spectrometry. 377, 599-609 (2015).
  26. Nakano, S., Yamagishi, T., Aoyagi, S., Portz, A., Durr, M., Iwai, H., Kawashima, T. Evaluation of Matrix Effects on TOF-SIMS Data of Leu-enkephalin and DOPC Mixed Samples. Biointerphases. 13, 03B403 (2018).
  27. Heep, J., Tuchecker, P. H. K., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. ACS Omega. 4, 22426-22430 (2019).
  28. Morlock, G., Schwack, W. Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. Trends in Analytical Chemistry. 29, 1157-1171 (2010).
  29. Cheng, S. C., Huang, M. Z., Shiea, J. Thin layer chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218, 2700-2711 (2011).
  30. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306, 471 (2004).
  31. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566 (2006).
  32. Dürr, M., Gebhardt, C. Ion generation in mass spectrometers by cluster bombardment. US Patent. , 926322 B2 (2019).
  33. Lindner, R., Kuhnle, A. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. ChemPhysChem. 16, 1582-1592 (2015).
  34. Dong, L., Liu, P. N., Lin, N. Bottom-up Assembly of Molecular Wagons on a Surface. Accounts of Chemical Research. 48, 2765-2774 (2015).
  35. Björk, J. Reaction mechanisms for on-surface synthesis of covalent nanostructures. Journal of Physics: Condensed Matter. 28, 083002 (2016).
  36. Rauschenbach, S., Rinke, G., Gutzler, R., Abb, S., Albarghash, A., Le, D., Rahman, T. S., Durr, M., Harnau, L., Kern, K. Two-Dimensional Folding of Polypeptides into Molecular Nanostructures at Surfaces. ACS Nano. 11, 2420-2427 (2017).
  37. Dürr, M., Höfer, U. Dissociative adsorption of molecular hydrogen on silicon surfaces. Surface Science Reports. 61, 465-526 (2006).
  38. Zhang, J., Franzreb, K., Aksyonov, S. A., Williams, P. Mass Spectra and Yields of Intact Charged Biomolecules Ejected by Massive Cluster Impact for Bioimaging in a Time-of-Flight Secondary Ion Microscope. Analytical Chemistry. 87, 10779-10784 (2015).

Tags

Chemie Kwestie 157 massaspectrometrie cluster desorptie matrix-vrij zacht oppervlakte adsorbates reactiekinetiek H/D uitwisseling
Analyse van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken door middel van cluster-geïnduceerde desorptie /Ionisatie massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz,… More

Bomhardt, K., Schneider, P., Portz, A., Gebhardt, C. R., Dürr, M. Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60487, doi:10.3791/60487 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter