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Genetics

खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

जीवाणु रोगजनक मेजबान में प्रोटीन स्रावित करते हैं जो महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को लक्षित करते हैं। जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान आणविक रोगजनन को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, विषाक्त जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते स्पष्ट करने के लिए एक संशोधित खमीर suppressor और विषाक्तता स्क्रीन का उपयोग कर एक विधि का वर्णन किया गया है.

Abstract

इंट्रासेल्यूलर बैक्टीरिया उग्रता कारकों को होस्ट साइटोसोल में प्रभावक प्रोटीन कहते हैं जो मेजबान प्रोटीन को नष्ट करने का कार्य करते हैं और/या जीवाणु के लाभ के लिए उनके संबद्ध जैविक रास्ते। putative बैक्टीरियल प्रभावक प्रोटीन की पहचान जीवाणु जीनोम अनुक्रमण में प्रगति और एल्गोरिदम के आगमन के कारण अधिक प्रबंधनीय हो गया है कि जीन एन्कोडिंग स्राव उम्मीदवारों की सिलिको पहचान में अनुमति देते हैं और / डोमेन. हालांकि, इन महत्वपूर्ण उग्र कारकों की पहचान केवल एक प्रारंभिक कदम है। स्वाभाविक रूप से, लक्ष्य प्रभावक प्रोटीन के आणविक समारोह का निर्धारण और स्पष्ट कैसे वे मेजबान के साथ बातचीत है. हाल के वर्षों में, खमीर दो-हाइब्रिड स्क्रीन और बड़े पैमाने पर इम्यूनोवेरेक्शन जैसी तकनीकों ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान में सहायता की है। हालांकि एक मेजबान बाध्यकारी साथी की पहचान एक जीवाणु प्रभावक प्रोटीन के आणविक समारोह स्पष्ट करने की ओर महत्वपूर्ण पहला कदम है, कभी कभी मेजबान प्रोटीन कई जैविक कार्य किया है पाया जाता है (उदा., actin, clathrin, tubulin), या जीवाणु प्रोटीन शारीरिक रूप से मेजबान प्रोटीन बाँध नहीं हो सकता है, सटीक मेजबान मार्ग के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के शोधकर्ता वंचित हेरफेर किया जा रहा है. एक संशोधित खमीर विषाक्तता स्क्रीन एक दमन स्क्रीन के साथ मिलकर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन से प्रभावित मेजबान रास्ते की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया गया है. विषाक्तता स्क्रीन मेजबान जैविक रास्ते, जो अक्सर एक विकास दोष के रूप में प्रकट होता है के साथ हस्तक्षेप प्रभावक प्रोटीन की वजह से खमीर में एक विषाक्त प्रभाव पर निर्भर करता है. एक खमीर जीनोमिक पुस्तकालय की अभिव्यक्ति मेजबान कारकों है कि जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबाने और इस प्रकार मार्ग है कि प्रभावक प्रोटीन लक्ष्य में प्रोटीन की पहचान की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल दोनों विषाक्तता और suppressor स्क्रीन के लिए विस्तृत निर्देश शामिल हैं. इन तकनीकों को किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है जो आणविक क्लोनिंग और खमीर और एस्चेरीचिया कोलीकी खेती करने में सक्षम हो सकती है .

Introduction

यहाँ प्रस्तुत उन लोगों के समान प्रक्रियाओं की पहली रिपोर्ट Legionella न्यूमोफिला प्रकार चतुर्थ प्रभावक SidD, एक deAMPylase कि Rab11को संशोधित करता है विशेषता है. अनेक एल न्यूमोफिला प्रभावक1,2,3की विशेषता के लिए तुलनात्मक तकनीकों का प्रयोग किया गया . परख एक Coxiella burnetii प्रकार चतुर्थ प्रभावक प्रोटीन4की विशेषता के लिए अनुकूलित किया गया था , और हाल ही में इस तकनीक की उपयोगिता क्लैमिडिया trachomatis शामिल झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन के लक्षण के लिए विस्तार किया गया था5 .

इस प्रोटोकॉल दो प्रमुख भागों में टूट सकता है: 1) खमीर विषाक्तता स्क्रीन, जिसमें ब्याज के जीवाणु प्रभावक प्रोटीन खमीर और क्लोन में व्यक्त की है एक विषाक्त phenotype के लिए एक विकास दोष द्वारा सबूत के रूप में जांच कर रहे हैं, और 2) खमीर suppressor स्क्रीन , जिसमें विषाक्त phenotype विषाक्त तनाव में एक खमीर जीनोमिक पुस्तकालय की अभिव्यक्ति द्वारा दबा दिया है. इस प्रकार, विषाक्तता स्क्रीन विषाक्त phenotypes कि विकास दोष के रूप में प्रकट जब ब्याज के जीवाणु प्रभावक overexpressed है के लिए एक स्क्रीन है. विषाक्त क्लोन, सफलतापूर्वक के साथ बदल दिया और जीवाणु प्रभावक व्यक्त, चयनित और अगले कदम के लिए बचाया जाता है. दूसरा बड़ा कदम विषाक्त खमीर क्लोन में एक आंशिक रूप से पचा खमीर जीनोमिक पुस्तकालय overexpressing शामिल है. इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए सुझाए गए खमीर जीनोमिक लाइब्रेरी बनाने वाले प्लासमिड्स ले 5 "20 केबी आवेषण, आमतौर पर सभी प्लाज्मिड में $ 1.5 केबी के औसत जीन आकार के 3 "13 खमीर ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) के अनुरूप होते हैं, पूरे खमीर जीनोम को कवर करते हुए लगभग 10x. परख के इस भाग को दमनकर्ता स्क्रीन कहा जाता है, क्योंकि लक्ष्य जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबाना है। संभावित suppressor प्लाज्मिड खमीर से अलग कर रहे हैं, अनुक्रम, और दबाने ORFs की पहचान की. दबानेवाला स्क्रीन अंतर्निहित तर्क यह है कि effector प्रोटीन बांधता है, के साथ सूचना का आदान प्रदान, और / या मेजबान मार्ग यह लक्ष्य के घटकों डूब, और है कि उन मेजबान प्रोटीन अतिरिक्त में वापस उपलब्ध कराने के रास्ते पर विषाक्त प्रभाव बचाव कर सकते हैं और इस प्रकार, विकास दोष. इस प्रकार, पहचान ORFs कि विषाक्तता को दबाने अक्सर एक मेजबान मार्ग के कई प्रतिभागियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऑर्थोगोनल प्रयोगों तो सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि जीवाणु प्रभावक वास्तव में फंसा हुआ मार्ग के साथ सूचना का आदान प्रदान. यह विशेष रूप से आवश्यक है अगर इस तरह के clathrin या actin के रूप में एक बाध्यकारी साथी की पहचान की गई है, क्योंकि इन प्रोटीन मेजबान प्रक्रियाओं की एक भीड़ में शामिल हैं. इसके बाद और प्रयोग संक्रमण के दौरान प्रभावक प्रोटीन के शारीरिक समारोह को स्पष्ट कर सकते हैं। विषाक्तता और दमन स्क्रीन भी जीवाणु effector प्रोटीन है कि शारीरिक रूप से इम्यूनोवर्षा द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त affinities के साथ मेजबान प्रोटीन बाँध नहीं है या कि के साथ बातचीत के शारीरिक समारोह को समझने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं एंजाइमी हिट-एंड-रन इंटरैक्शन में होस्ट जो खमीर-दो हाइब्रिड स्क्रीन द्वारा नहीं पता लगाया जा सकता है।

हालांकि suppressor स्क्रीन जीवाणु प्रभावक प्रोटीन और मेजबान रास्ते के बीच संभावित शारीरिक बातचीत प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है, जीवाणु effector प्रोटीन खमीर में एक विकास दोष प्रेरित करना चाहिए, अन्यथा में यह प्रयोग निरोधक स्क्रीन कम उपयोग की होगी. इसके अलावा, विषाक्त phenotype में परिणाम होना चाहिए कम से कम एक 2 "3 लॉग10 विकास में कमी या यह suppressors की पहचान करने के लिए मुश्किल हो जाएगा. यदि एक प्रयोगशाला सेल संस्कृति के लिए स्थापित किया गया है, ऐसे HeLa के रूप में आम सेल लाइनों में विषाक्तता के लिए प्रभावक प्रोटीन स्क्रीनिंग अक्सर के रूप में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं कि क्या यह खमीर विषाक्तता स्क्रीन के साथ आगे बढ़ने के प्रयास के लायक है. Hela कोशिकाओं में प्रभावक प्रोटीन के अस्थानिक अभिव्यक्ति कभी कभी विषाक्तता में परिणाम है कि इन स्क्रीन4के लिए इस्तेमाल खमीर तनाव में विषाक्तता के साथ बहुत दृढ़ता से संबंधित है . HeLa कोशिकाओं में तनाव की प्रेक्षणीय पहचान तनाव फाइबर की हानि, थाली से सेल टुकड़ी, और परमाणु संघनन apoptosis का संकेत शामिल हैं. HeLa कोशिकाओं में तनाव के किसी भी दृश्य संकेत ब्याज की प्रोटीन खमीर में एक विकास दोष है, जो और अधिक तेजी से दोहराने और इस प्रकार आवश्यक रास्ते के क्षोभ के लिए अधिक उत्तरदायी हैं प्रेरित करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाते हैं.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि दबानेवाला स्क्रीन हमेशा suppressors के रूप में मेजबान बाध्यकारी भागीदारों की पहचान नहीं करता है, लेकिन यह अभी भी मेजबान मार्ग के महत्वपूर्ण घटकों को फंसा सकते हैं (ओं) लक्षित, जैविक प्रक्रियाओं के एक समग्र दृष्टिकोण उपज द्वारा अपहरण कर लिया जा रहा है जीवाणु प्रभावक प्रोटीन. सतह पर, यह counterintuitive लगता है, क्योंकि अतिरिक्त में effector प्रोटीन के बंधन साथी प्रदान करने के लिए विकास दोष बचाव की उम्मीद की जाएगी. सी trachomatis effector प्रोटीन CT229 (CpoS) द्वारा लक्षित रास्ते की पहचान करने के प्रयासों में, जो संक्रमण के दौरान कम से कम 10 विभिन्न Rab GTPases को बांधताहै 5, Rab बाध्यकारी भागीदारों में से कोई भी CT229 की विषाक्तता को दबा दिया. हालांकि, clathrin लेपित vesicle (CCV) तस्करी में शामिल कई suppressors की पहचान की गई, जो आगे काम करने के लिए प्रदर्शन है कि CT229 विशेष रूप से राब निर्भर CCV तस्करी subverts. इसी तरह, जब सी burnetii प्रभावक प्रोटीन Cbu0041 (CirA) कई Rho GTPases कि खमीर विकास दोष बचाया की जांच की पहचान की गई, और यह बाद में पाया गया कि CirA एक GTPasse के रूप में कार्य करता है प्रोटीन (GAP) RhoA4के लिए सक्रिय .

जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते स्पष्ट करने के लिए खमीर suppressor स्क्रीन की उपयोगिता अतिरंजित नहीं किया जा सकता है, और अन्य शोधकर्ताओं intracellular जीवाणु प्रभावक प्रोटीन की विशेषता का प्रयास बहुत से लाभ हो सकता है इन तकनीकों. इन परख मूल्य के हैं अगर इम्यूनोप्रीसिएंस और / या खमीर दो संकर स्क्रीन एक बाध्यकारी साथी खोजने में विफल रहे हैं और स्पष्ट कर सकते हैं जो रास्ते जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित कर रहे हैं. यहाँ, विषाक्तता और suppressor स्क्रीन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल इंट्रासेलुलर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान जैविक रास्ते की पहचान करने के लिए प्रदान की जाती हैं, साथ ही आम बाधाओं में से कुछ का अनुभव जब इन परख और उनके इसी समाधान.

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Protocol

1. मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: प्लेट्स परख के दिन से पहले तैयार किया जाना चाहिए और 1 महीने के लिए अच्छा कर रहे हैं. मीडिया और अभिकर्मकों किसी भी बिंदु पर बनाया जा सकता है और 1 महीने के लिए अच्छा कर रहे हैं.

  1. 1 000 एमएल बीकर में आसुत जल के 800 एमएल में 100 ग्राम D-+)-ग्लूकोज को भंग करके ग्लूकोज घोल (10% w/v) तैयार की। आसुत जल के साथ 1 ल तक आयतन समायोजित की जासकते हैं। एक बाँझ 1 एल मीडिया भंडारण बोतल में एक 0.2 डिग्री बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर.
  2. 1 ल बीकर में आसुत जल के 800 एमएल में 100 ग्राम डी-(+)- गैलैक्टोज को भंग करके गैलाक््टोस विलयन (10% w/v) तैयार की। आसुत पानी का उपयोग कर 1 एमएल के लिए मात्रा को समायोजित करें और एक बाँझ 1,000 एमएल मीडिया भंडारण बोतल में एक 0.2 डिग्री बाँझ फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  3. 10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम पेपटोन, 20 ग्राम ग्लूकोज, और 20 ग्राम आसुत जल में 20 ग्राम आगर को भंग करके खमीर निकालने पेपटोन डेक्सट्रोज (YPD) agar की 1 L तैयार करें। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और ठंडा होने तक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा। प्रति प्लेट मीडिया के $ 20 एमएल का उपयोग कर 100 मिमी प्लेटों में डालो।
  4. 10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम पेपटोन, और 1,000 एमएल आसुत पानी में 20 ग्राम ग्लूकोज को भंग करके 1 एल YPD शोरबा तैयार करें। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
  5. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी) यूरासिल(उरा -) ग्लूकोज गार तैयार करें। 1 ल् के लिए, एमिनो अम्लों के बिना 6ण्7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन आधार को भंग करें, यूरेसिल के बिना 1.9 ग्राम ड्रॉपआउट पूरक, और 800 एमएल आसुत जल में 15 ग्राम आगर को भंग करें। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान है $50 डिग्री 60 डिग्री सेल्सियस. एक 50 एमएल serological pipette या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.1 में तैयार ग्लूकोज समाधान के 200 एमएल जोड़ें. धीरे घूमता है या हलचल थाली पर जगह से अच्छी तरह से मिलाएं. प्रति प्लेट मीडिया के $ 20 एमएल का उपयोग कर 100 मिमी प्लेटों में डालो।
  6. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी)यूरासिल(उरा - ) गैलाक्टोस आगर तैयार करें। 1 ल् के लिए, एमिनो अम्लों के बिना 6ण्7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन आधार को भंग करें, यूरेसिल के बिना 1.9 ग्राम ड्रॉपआउट पूरक, और 800 एमएल आसुत जल में 15 ग्राम आगर को भंग करें। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान है $50 डिग्री 60 डिग्री सेल्सियस. एक 50 एमएल serological pipette या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.2 में तैयार गैलाक््टोज समाधान के 200 एमएल जोड़ें. धीरे घूमता है या हलचल थाली पर जगह से अच्छी तरह से मिलाएं. प्रति प्लेट मीडिया के $ 20 एमएल का उपयोग कर 100 मिमी प्लेटों में डालो।
  7. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी) यूरासिल (यूरा-) ग्लूकोज शोरबा तैयार करें। 1 ल के लिए 6ण्7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन क्षारक को अमीनो अम्लों के बिना तथा 800 एमएल आसुत जल में यूरेसिल के बिना 1ण्9 ग्राम ड्रॉपआउट पूरक को भंग करें। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान है $50 डिग्री 60 डिग्री सेल्सियस. एक 50 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.1 में तैयार ग्लूकोज समाधान के 200 मिलीलीटर जोड़ें।
  8. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी) यूरेसिल (यूरा-) ल्यूसिन (ल्यू- )ग्लूकोज गार तैयार करें। 1 ल के लिए, एमिनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस के 6ण्7 छ को भंग करें; 1.9 जी uracil, ल्यूकोइन, और tryptophan बिना ड्रॉपआउट पूरक; 15 ग्राम आगर; और 800 एमएल आसुत जल में 0.076 ग्राम ट्रिप्टोफान। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान है $50 डिग्री 60 डिग्री सेल्सियस. एक 50 एमएल serological pipette या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.1 में तैयार ग्लूकोज समाधान के 200 एमएल जोड़ें. प्रति प्लेट मीडिया के $ 20 एमएल का उपयोग कर 100 मिमी प्लेटों में डालो।
  9. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी) यूरासिल(उरा -) ल्यूकोइन (ल्यू-) गैलाक्टोज आगर तैयार करें। 1 ल के लिए, एमिनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस के 6.7 छ भंग; 1.9 जी uracil, ल्यूकोइन, और tryptophan बिना ड्रॉपआउट पूरक; 15 ग्राम आगर; और 800 एमएल आसुत जल में 0.076 ग्राम ट्रिप्टोफान। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान है $50 डिग्री 60 डिग्री सेल्सियस. एक 50 एमएल serological pipette या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.2 में तैयार गैलाक््टोज समाधान के 200 एमएल जोड़ें. धीरे घूमता या एक हलचल थाली पर रखकर अच्छी तरह से मिलाएं. प्रति प्लेट मीडिया के $ 20 एमएल का उपयोग कर 100 मिमी प्लेटों में डालो।
  10. सिंथेटिक ड्रॉपआउट (एसडी) यूरेसिल (यूरा-) ल्यूसिन (ल्यू-) ग्लूकोज शोरबा तैयार करें। 1 ल के लिए, एमिनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस के 6.7 छ भंग; 1.9 जी uracil, ल्यूकोइन, ट्रिप्टोफान के बिना ड्रॉपआउट पूरक; और 800 एमएल आसुत जल में 0.076 ग्राम ट्रिप्टोफान। 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव और एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ठंडा जब तक तापमान $ 50 डिग्री सेल्सियस है। एक 50 एमएल serological pipette या एक बाँझ स्नातक सिलेंडर का उपयोग करना, चरण 1.1 में तैयार ग्लूकोज समाधान के 200 एमएल जोड़ें.
  11. पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) घोल तैयार करें। आसुत जल में पॉलीथीन ग्लाइकोल 3350 का 50% w/v जोड़ें। ऑटोक्लेव द्वारा बंध्याकरण।
  12. 200 एमएल आसुत जल में 10.2 ग्राम लिथियम ऐसीटेट निर्जलित को भंग करके 1 एम लिथियम ऐसीटेट (LiAc) तैयार करें। ऑटोक्लेव द्वारा बंध्याकरण।
  13. हेरिंग शुक्राणु डीएनए तैयार करें। डिल्यूट 10 mg/mL हेरिंग शुक्राणु डीएनए करने के लिए 2 mg/mL आसुत पानी का उपयोग कर. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और तुरंत 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है।

2. खमीर विषाक्तता प्लाज्मिड YESNTA-Kan में ब्याज की जीन क्लोनिंग

नोट: वर्तमान में, वहाँ एक किस्म खमीर विषाक्तता वैक्टर दोनों व्यावसायिक और अकादमिक उपलब्ध हैं. खमीर निरोधक स्क्रीन का उपयोग इनमें से कई सदिशों के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है बशर्ते प्लाज्मिड , ब्याज के प्रभावक प्रोटीन को व्यक्त करते हुए यूरेसिल के अलावा ड्रॉपआउट चयन और ब्लाआरके अलावा अन्य एंटीबायोटिक मार्कर का उपयोग करता है . यह काम एक संशोधित PYesNTA वेक्टर4,5 कि संभावित suppressors के लिए आसान स्क्रीनिंग के लिए एक kanamycin प्रतिरोध कैसेट भी शामिल है इस्तेमाल किया. क्लोनिंग योजना के लिए प्रभावक प्रोटीन के लिए Gal प्रमोटर और उनके टैग के साथ फ्रेम में होने की अनुमति चाहिए. क्लैमिडिया ट्रेकोमैटिस समावेश झिल्ली प्रोटीन CT229 इन परख के लिए सिद्धांत का एक सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

  1. CT229 +1 Kpn F (CCGGTAATGAGCTGTATATATAGT) और CT229 XHOI R (CCCTCGAGTTGACGGGT) प्राइमर्स का उपयोग करके निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सीटी229 से CT229 CT29 को बढ़ाना PCR का उपयोग करें। निम्नPC शर्तों का उपयोग करें: (1) 30 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; (2) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; (3) 25x की कुल के लिए चरण 2 दोहराएँ; (4) 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और (5) 4 डिग्री सेल्सियस पकड़.
  2. 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 5 $L का विश्लेषण करें (चित्र 1) .
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर शोधन किट का उपयोग करके शेष 45 जेडएल डीएनए को शुद्ध करें।
  4. शुद्ध पीसीआर डालने के 50 डिग्री सेल्सियस को डाइजेस्ट करें और पी.पी.एन.आई-एचएफ और जोओआई-एचएफ का उपयोग करके पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए पी.एस.एन.टी.ए.-कान (चित्र 2) का उपयोग करते हुए।
    नोट: pYesNTA-Kan के लिए, 5 g प्लाज्मिड को डाइजेस्ट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर केपीएनआई-एचएफ का 5 डिग्री एल, XhoI-HF का 5 डिग्री एल, और 60 डिग्री सेल्सियस की कुल मात्रा में बफर का 6 डिग्री एल। सम्मिलित करने के लिए, शुद्ध पीसीआर उत्पाद के पूरे 50 डिग्री एल को पचाने के लिए 2 KpnI-HF के $L, XhoI-HF के 2 $L, और बफर के 6 डिग्री एल का उपयोग करते हुए।
  5. एक 1% agarose जेल पर पूरे प्लाज्मिड डाइजेस्ट चलाते हैं। निर्माता के निर्देशों का पालन एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर पचा प्लाज्मिड की शुद्धि प्रदर्शन करते हैं।
  6. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके पचे हुए पीसीआर को शुद्ध करें।
  7. PYesNTA-Kan में सम्मिलित क्लोन 2 pYesNTA-Kan के एल का उपयोग कर (चरण 2.5), डीएनए लिगाज़ बफर के 2 $L, T4 ligase के 1 $L, और डालने के 15 $L (चरण 2.6) का उपयोग कर. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  8. ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं के 50 डिग्री सेल्सियस के लिए पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया जोड़ें और परिवर्तन प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
  9. एक LB प्लेट पर संपूर्ण रूपांतरण अभिक्रिया को प्लेट करें जिसमें 100 ग्राम/एमएल कार्बेनिकसिलिन है।
  10. एलएलबी के 10 एमएल में तीन अलग-अलग कालोनियों के साथ 100 ग्राम/एमएल कार्बेनिकसिलिन शामिल हैं। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
  11. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करके प्लाज्मिड को अलग करें।
  12. जीन-विशिष्ट प्राइमर (चरण 2-1) का उपयोग करके पृथक प्लाज्मिड अनुक्रम।

3. खमीर में विषाक्तता के लिए ब्याज की प्रोटीन का परीक्षण

  1. अलग कालोनियों को प्राप्त करने के लिए YPD agar (चरण 1.3) पर स्ट्रीक Saccharomyces cerevisiae W303. 24 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  2. आगर प्लेट (चरण 3.1) से एक एकल कॉलोनी के साथ YPD शोरबा (कदम 1.4) के 10 एमएल टीका। रात भर 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. रात भर की संस्कृति के 0.5 एमएल को 10 एमएल के YPD शोरबा (चरण 1.4) में जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए 150 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेट करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर संस्कृति के 10 एमएल गोली।
    2. बाँझ पानी के 1 एमएल में गोली resuspend, microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण, और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर गोली.
    3. 1 एमएल में 1 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें 1 m लिथियम एसीटेट (LIAc) और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 3,000 x g पर गोली।
    4. LIAc धोने 2x दोहराएँ.
    5. धोने निकालें. 50% खूंटी 3350 के 2.4 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। 1M LiAc के 360 $L जोड़ें, 500 $L के 2 मिलीग्राम/एमएल हेरिंग शुक्राणु डीएनए के, और बाँझ पानी के 400 $L.
      नोट: यह 20 रूपांतरणों के लिए पर्याप्त है।
    6. चरण 3.3.5 से परिवर्तन मिश्रण के 180 $L जोड़ें एक microcentrifuge ट्यूब के लिए युक्त 5 $L pYesNTA-Kan CT229 प्लाज़्मिड डीएनए (100 डिग्री 500 एनजी) चरण 2.12 से.
    7. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में इनक्यूबेट।
    8. 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में इनक्यूबेट।
    9. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर गोली।
    10. पिपेट के साथ रूपांतरण मिश्रण निकालें. बाँझ पानी के 100 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें। एसडी यूरा पर परिवर्तन प्लेट- ग्लूकोज के साथ agar (कदम 1.5).
    11. 48 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें।
  4. एसडी यूरा के 5 एमएल टीका- प्लेट से एक ही कॉलोनी के साथ ग्लूकोज (कदम 1.7) युक्त शोरबा। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अकेले वेक्टर के साथ तब्दील खमीर शामिल हैं.
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली (A2 $A6) के 5 कुओं के लिए बाँझ पानी के 180 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
    2. मिश्रण करने के लिए रात भर संस्कृति भंवर.
    3. पहली अच्छी तरह से करने के लिए खमीर के 180 $L जोड़ें (A1). क्रमिक रूप से पतला 1:10 (बिना diluted सहित कुल में छह नमूने).
    4. एक multichannel pipette का उपयोग करना, एसडी यूरा पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 5 डिग्री एल हाजिर- ग्लूकोज (कदम 1.5) और यूरा- गैलैक्टोज (चरण 1.6) agar प्लेटें. 48 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. अकेले वेक्टर व्यक्त खमीर के विकास के लिए गैलेक्टोज युक्त मीडिया पर हो ब्याज के प्रभावक प्रोटीन व्यक्त करके विषाक्तता का आकलन करें।
  6. पश्चिमी सोख्ता द्वारा अपने टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें.

4. खमीर जीनोमिक पुस्तकालय के साथ विषाक्त खमीर रूपांतरण

  1. एसडी उरा के 100 एमएल टीका- ग्लूकोज शोरबा (कदम 1.7) कदम से शेयर के 1 एमएल का उपयोग कर 3.4. 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 16 डिग्री 24 एच के लिए इनक्यूबेट। एसडी यूरा के 900 एमएलरखें - ग्लूकोज शोरबा 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मीडिया prewarm करने के लिए।
  2. प्रीवार्म्ड 1 एल फ्लास्क में रात भर की संस्कृति के पूरे 100 एमएल जोड़ें। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री 5 एच के लिए इनक्यूबेट।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर संस्कृति गोली।
    2. महादलित को त्याग दें। बाँझ पानी के 250 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6,000 x g पर संस्कृति गोली।
    3. महादलित को त्याग दें। 1 एमएम LIAc के 250 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 6,000 x g पर संस्कृति गोली।
    4. LiAc निकालें और 50% खूंटी 3350 के 9.6 एमएल में गोली resuspend. 1M LiAc के 1.44 एमएल जोड़ें, 2 मिलीग्राम/एमएल हेरिंग शुक्राणु डीएनए के 2 एमएल, pYep13 जीनोमिक पुस्तकालय के 50 डिग्री ग्राम (ATCC 37323) जोड़ें। बाँझ पानी के साथ 15 एमएल करने के लिए मात्रा समायोजित करें। व्युत्क्रम द्वारा धीरे से मिलाएं।
    5. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में इनक्यूबेट।
    6. परिवर्तन दक्षता को बढ़ाने के लिए डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) के 750 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में इनक्यूबेट। कोमल व्युत्क्रम से हर 10 मिनट में मिक्स करें।
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर खमीर गोली।
    8. सुपरनेंट को त्याग दें और 10 एमएल बाँझ पानी में गोली को फिर से फेंट लें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर गोली।
    9. बाँझ पानी के 8 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    10. परिवर्तन दक्षता निर्धारित करने के लिए, एसडी यूरा- Leu- ग्लूकोज आगर (चरण 1.8) पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1:10 और प्लेट 100 $L पतला।
    11. एसडी यूरा- Leu- Galactose agar (चरण 1.9) प्लेटों पर नमूने की प्लेट 200 $L. कुल में 50 प्लेटों का प्रयोग करें.
    12. 48 डिग्री 96 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट या जब तक कालोनियों दिखाई देते हैं।
      नोट: कालोनियों में आम तौर पर ग्लूकोज आगर प्लेटों पर 48 डिग्री 72 ज और गैलाक्टोज आगर प्लेटों पर 72 डिग्री 96 ज पर दिखाई देते हैं।
  3. एसडी उरा- Leu- Galactose agar (कदम 1.9) पर पैच कालोनियों (संभावित बचाव) का विस्तार और स्टॉक बनाने के लिए। 24 डिग्री 48h के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. एसडी उरा के 5 एमएल टीका- Leu- ग्लूकोज शोरबा (कदम 1.10) पैच के हिस्से का उपयोग कर। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली (A2$A6) के 5 कुओं के लिए बाँझ पानी के 180 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
    2. मिश्रण करने के लिए रात भर संस्कृति भंवर.
    3. पहली अच्छी तरह से करने के लिए खमीर के 180 $L जोड़ें (A1). क्रमिक रूप से पतला 1:10 (बिना diluted सहित कुल में छह नमूने).
    4. एक multichannel pipette का उपयोग करना, एसडी यूरा पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 5 डिग्री एल हाजिर- ग्लूकोज और एसडी यूरा- galactose आगर प्लेटें. एक नियंत्रण के रूप में अकेले विषाक्त प्रभावक शामिल करें.
    5. 48 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. संभावित suppressors युक्त खमीर के लिए अकेले विषाक्त प्रभावक व्यक्त खमीर के विकास की तुलना करें. केवल संभावित suppressors कि अकेले प्रभावक व्यक्त खमीर की तुलना में विषाक्तता कम हो गया है के साथ आगे बढ़ना.

5. की पहचान और suppressors की पुष्टि

  1. एसडी यूरा- ल्यू- ग्लूकोज शोरबा (कदम 1.10) के 5 एमएल को 100 डिग्री सेल्सियस के साथ चरण 4.4 से और 150 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    1. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर खमीर गोली। पिपेट का उपयोग करके सुपरनेट को धीरे से त्याग दें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक खमीर प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट के साथ प्लाज्मिड को अलग करें।
  2. पृथक प्लाज्मिड को ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में रूपांतरित करें और एलबी आगर पर पूरे रूपांतरण को कार्बेनिसिलिन के 100 ग्राम/एमएल के साथ प्लेट करें। 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. एलबी शोरबा के 10 एमएल में 100 ग्राम/एमएल कार्बेनिसिलिन होता है, जिसमें प्लेट से तीन कॉलोनियां होती हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 150 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेट होती हैं।
    1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर गोली संस्कृतियों। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक miniprep किट का उपयोग कर प्लाज़्मिड को अलग करें।
  4. कदम से अलग प्लाज्मिड के साथ विषाक्त खमीर retransform 5.3.1 प्रोटोकॉल के भाग 3 में चरणों का पालन.
    1. एसडी उरा- Leu- ग्लूकोज शोरबा के 5 एमएल टीका परिवर्तन प्लेट से एक कॉलोनी के साथ। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट करें।
    2. विषाक्तताके दमन की पुष्टि करने के लिए उरा - ल्यू- ग्लूकोज और गैलाक्टोज आगर पर स्पॉट।
  5. खमीर ORFs की पहचान करने के लिए pYep13 एफ (ACTACGCGATGGGA) और pYep13 आर (TGATGCCGGCCACGATGC) प्राइमर का उपयोग करअनुक्रम।

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Representative Results

इससे पहले कि वास्तविक खमीर suppressor स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता है, ब्याज की effector प्रोटीन खमीर में विषाक्तता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. यह एक गैलाक््टोज-प्रेरित प्रमोटर के नियंत्रण में खमीर में ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करके पूरा किया है. ग्लूकोज पर वृद्धि (noninducing शर्तों) पहले विषाक्तता सुनिश्चित करने के लिए तुलना की जानी चाहिए विशेष रूप से ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण है और एक सामान्य दोष नहीं है. जैसा कि चित्र 3 में दर्शायागया है, विषाक्तता छोटी कालोनियों के रूप में प्रकट होती है और/अथवा कम वृद्धि होती है। खमीर विकास में एक 2 "3 लॉग कमी खमीर suppressor स्क्रीन के लिए आदर्श है.

जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, विषाक् तता और निरोधक स्क्रीन प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित विधियों का उपयोग करते हुए आठ चरणों में पूरा किया जा सकता है। ब्याज के जीन एक उपयुक्त वेक्टर1में क्लोन है, और जिसके परिणामस्वरूप निर्माण खमीर में तब्दील हो रहे हैं विषाक्तता का आकलन. इस अध्ययन में CT229 को रुचि के जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था और pYesNTA-Kan सदिश के रूप में. इसके अतिरिक्त, उसकी टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति पश्चिमी blotting द्वारा की पुष्टि की थी. आदर्श रूप में, गैलिक्टोज युक्त मीडिया पर उगाए गए खमीर में 2 "3 लॉग कमी देखी जानी चाहिए। यदि ब्याज का प्रोटीन खमीर के लिए विषाक्त है (चित्र 3 और चित्र ा0 4) , दमन स्क्रीन खमीर जीनोमिक पुस्तकालय pYep13 के साथ विषाक्त तनाव को बदलने के द्वारा आयोजित किया जा सकता है. रूपांतरणकर्ताओं को संभावित दमनकर्ताओं की पहचान करने के लिए रूपांतरण दक्षता और गैलैक्टोज आगर निर्धारित करने के लिए ग्लूकोज आगर पर चढ़ाया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, 5 x 105 की न्यूनतम परिवर्तन दक्षता को गैलैक्टोस आगर पर कुल 10 डिग्री 250 कालोनियों के साथ प्राप्त किया गया था। एसडी यूरा- ल्यू- गैलैक्टोस आगर पर इन कालोनियों को पैच करना (चित्र 4) सच्चे दमनकर्ताओं की पहचान में सहायता प्राप्त है, क्योंकि कई झूठे सकारात्मक जब समझौता नहीं होगा। यहाँ, 50 कालोनियों समझौता किया गया और आठ क्लोन कि प्रभावक विषाक्तता दबा प्राप्त किया गया (चित्र 4) . एसडी उरा - Leu- Galactose agar पर suppressors खोलना विषाक्तता के दमन की पुष्टि करने के लिए किया गया था. जैसा कि चित्र 4, चप1 और चप 2 में दर्शाए गए हैं, ने प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबा दिया, जबकि चसप3 ने ऐसा नहीं किया। इसलिए, pSup3 छोड़ दिया गया था। प्लाज्मिड को बाद में दबाने वालों से अलग कर दिया गया और प्लाज्मिड उपज को बढ़ाने के लिए ई. कोलाई में बदल दिया गया। प्लाज्मिड तो विषाक्त खमीर में retransformed किया जा सकता है पुष्टि करने के लिए कि अलग प्लाज्मिड निश्चित रूप से प्रभावक विषाक्तता को दबा (चित्र 4) . जबकि अलग प्लाज्मिड के अधिकांश विषाक्तता बचाव करना चाहिए, कभी कभी एक प्लाज्मिड कि विषाक्तता को दबा नहीं है जब विषाक्त खमीर तनाव में retransformed प्राप्त की है. उन प्लाज्मिड खारिज कर रहे हैं, और केवल उन है कि retransformation के बाद विषाक्तता को दबाने अनुक्रम किया जाना चाहिए.

पृथक प्लाज़्मिड में अनेक खमीर ओआरएफ4होंगे. यह पहचान ने कि कौन सा सच्चा निरोधक है , प्रत्येक ORF को अलग-अलग क्लोन किया जा सकता है और विषाक्त खमीर तनाव में व्यक्त किया जा सकता है जैसा कि पहले1,2,3,4में वर्णित किया गया है .

Figure 1
चित्र 1: लक्ष्य जीन का पीसीआर प्रवर्धन। क्लैमिडिया ट्रेकोमैटिस सेरोवर एल 2 से CT229 पीसीआर जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धित किया गया था। पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण 1% एगारोस जेल पर किया गया जो एथिडियम ब्रोमाइड के साथ दाग ित था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: PYesNTA-कान प्लाज़्मिड मानचित्र। ब्याज के लक्ष्य जीन को YESNTA-Kan. Kanamycin के एकाधिक क्लोनिंग साइट (एमसीएस) में क्लोन किया गया था, जिसका उपयोग ई. कोलाई में चयन के लिए किया गया था और यूरेसिल ड्रॉपआउट का उपयोग एस सेरेविसिया में चयन के लिए किया गया था। उसकी टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति पश्चिमी सोख्ता द्वारा सत्यापित किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि खमीर विषाक्तता परिणाम. ब्याज के प्रभावक प्रोटीन pYesNTA-Kan में क्लोन किया गया. अनुक्रम सत्यापित प्लाज्मिड एस सेरेविसिया में तब्दील हो गए थे और transformants क्रमिक पतला और मूत्रकीका ंवलापन का आकलन करने के लिए यूरा- ग्लूकोज और गैलाक्टोस आगर पर देखा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: खमीर suppressor स्क्रीन का अवलोकन. ब्याज के लक्ष्य जीन को YESNTA-Kan में क्लोन किया गया था और प्लाज्मिड एस सेरेविएसियामें परिवर्तित कर दिया गया था। ट्रांसफार्मरों को क्रमिक रूप से पतला किया गया था और विषाक्तता का आकलन करने के लिए यूरा- ग्लूकोज और गैलैक्टोस आगर पर देखा गया था। विषाक्त प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मार्ग की पहचान करने के लिए, विषाक्त प्रोटीन व्यक्त खमीर तनाव एक खमीर जीनोमिक पुस्तकालय के साथ बदल गया था. कालोनियों Ura- Leu- Galactose agar पर समझौता किया गया और विषाक्तता का आकलन करने के लिए देखा गया. Plasmids उन है कि प्रभावक प्रोटीन की विषाक्तता को दबाने से अलग थे. Plasmids विषाक्त खमीर तनाव में retransformed थे पुष्टि करने के लिए कि अलग प्लाज्मिड एक दमनकर्ता है. suppressors से Plasmids मौजूद खमीर ORFs की पहचान करने के लिए अनुक्रम थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक संशोधित खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान जैविक रास्ते की पहचान करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं की रूपरेखा. खमीर तनाव का इस्तेमाल किया, एस cerevisiae W303, दोनों uracil और ल्यूकोइन के लिए auxotrophic है. तनाव के Uracil auxtrophy pYesNTA-कान वेक्टर पर ब्याज की प्रोटीन ले खमीर का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि ल्यूकोइन auxotrophy खमीर जीनोमिक पुस्तकालय वेक्टर pYep13 के लिए चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। खमीर जीनोमिक पुस्तकालय plasmids ले 3 "13 ORFs, तो प्रत्येक ORF व्यक्तिगत रूप से p415-ADH वेक्टर6 या एक समान वेक्टर में क्लोन किया जाना चाहिए और विषाक्त खमीर में retransformed की पहचान करने के लिए जो सच suppressor है. यह एक मेजबान जैविक मार्ग का प्रतिनिधित्व कई suppressors की पहचान करने के लिए विशिष्ट है. Suppressors कभी कभी ब्याज की जीवाणु प्रोटीन के प्रत्यक्ष बाध्यकारी भागीदार हो सकता है, लेकिन हमेशा नहीं.

खमीर क्लोन पैदा करने के लिए YESNTA-Kan पर ब्याज की जीवाणु प्रोटीन ले जाने का पहला बड़ा कदम है और महान देखभाल के लिए जितनी जल्दी हो सके इन क्लोनों की अखंडता की रक्षा के लिए लिया जाना चाहिए क्योंकि वहाँ खमीर विषाक्त ले जाने के लिए मजबूत नकारात्मक चयन है प्रोटीन, यहां तक कि जानबूझकर गैलाक्टोस प्रेरण के बिना, और वे प्लाज्मिड खो सकते हैं. कभी कभी वहाँ प्लाज्मिड नुकसान भी है जब खमीर ड्रॉपआउट मीडिया पर चयन के तहत बनाए रखा है. एक विधि पहले से वेक्टर linearizing और यह खमीर जीनोम1के भीतर एकीकृत द्वारा प्लाज्मिड हानि की घटना को कम करने के लिए सूचित किया गया है.

इन तकनीकों का एक प्रमुख दोष यह है कि दमन स्क्रीन केवल सार्थक डेटा पैदावार अगर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन के overexpression खमीर में एक प्रेक्षणीय और लगातार विकास दोष चलाता है. कोई suppressors की पहचान कर रहे हैं, जब इस विधि में प्राथमिक कठिनाई है. यह निर्धारित करना कठिन है कि क्या दमनकर्ताओं की पहचान करने में विफलता जैविक कारणों या तकनीकी मुद्दों के कारण है। एक जैविक दृष्टिकोण से, वहाँ कई कारण हो सकता है: ब्याज का प्रोटीन इतना विषाक्त हो सकता है कि जीनोमिक पुस्तकालय से प्रोटीन काफी विषाक्तता को दबाने में सक्षम नहीं हैं, लक्षित मार्ग बचाव में असमर्थ हो सकता है, या कई सह expressed कारकों विषाक्त प्रभाव पर काबू पाने के लिए आवश्यक हो सकता है. जैविक व्याख्या के दृष्टिकोण चुनौतीपूर्ण है, के रूप में वहाँ कई अनिर्धारित चर विच्छेदन के लिए कर रहे हैं. क्योंकि वहाँ एक स्थापित प्रोटोकॉल है, तकनीकी स्पष्टीकरण की खोज एक बहुत अधिक पथ्य दृष्टिकोण है. एक तकनीकी दृष्टिकोण से, suppressors की पहचान करने के लिए एक विफलता की संभावना खमीर जीनोमिक पुस्तकालय के कम परिवर्तन दक्षता का परिणाम है. इस प्रोटोकॉल PYEp13 में ATCC एस cerevisiae AB320 आंशिक रूप से पचा जीनोमिक पुस्तकालय का उपयोग करता है। अन्य लायब्रेरी के साथ ही अन्य सदिश के रूप में पर्याप्त हो सकता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से ATCC लायब्रेरी का उपयोग करता है और कोई अध्ययन वर्तमान में प्रकाशित वैकल्पिक लायब्रेरी या वेक्टर स्रोतों की रिपोर्ट कर रहे हैं। यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि खमीर जीनोम की कवरेज कम से कम 10x होना चाहिए, या underrepresentation suppressors की पहचान में बाधा हो सकती है. कम परिवर्तन दक्षता 1x के तहत इन नंबरों ला सकते हैं. इस प्रकार, खमीर जीनोम के कुछ हिस्सों को दबाने स्क्रीन में प्रतिनिधित्व नहीं किया जा सकता है. कम परिवर्तन दक्षता बुरा अभिकर्मकों या गरीब पुस्तकालय की तैयारी सहित कई मुद्दों के कारण हो सकता है. इस विधि को काफी हद तक DMSO/LiAc परिवर्तन विधि का पालन करता है पहले हिल एट अल द्वारा प्रस्तुत7. यह अनुशंसा की जाती है कि नए DMSO, 50% खूंटी, और ताजा हेरिंग शुक्राणु डीएनए खरीदा और परिवर्तनों के लिए तैयार कर रहे हैं और इन assays के लिए विशेष रूप से इस्तेमाल के लिए संदूषण या अभिकर्मकों की गुणवत्ता की गिरावट को कम करने के लिए. डीएमएसओ अत्यधिक आर्द्रताग्राही होता है और वायुमंडल से जल को आसानी से अवशोषित कर लेता है। इसलिए, कई व्यक्तिगत उपयोग alicots बनाने के लिए एक कंटेनर के ढक्कन और वातावरण के लिए जोखिम के बार-बार खोलने से बचने की सिफारिश की है. उच्च गुणवत्ता वाले हेरिंग शुक्राणु डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और कई वर्षों के लिए उपयोग के लिए फिट रहता है, हालांकि प्रत्येक परिवर्तन के लिए स्टॉक से एक नई तैयारी तैयार की जानी चाहिए। एक बार उबला हुआ और ठंडा, हेरिंग शुक्राणु डीएनए reboiled या पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, तो यह केवल क्या जरूरत है हटाने के लिए सबसे अच्छा है और वर्तमान परिवर्तन के लिए आवश्यक है से अधिक बनाने से बचें. विस्तार करने के लिए ध्यान बहुत खमीर के परिवर्तन दक्षता में सुधार और एक suppressor की पहचान की संभावना में सुधार कर सकते हैं.

यह देखते हुए कि खमीर pYep13 वेक्टर 3 डिग्री 13 अलग खमीर ORFs किया जाता है, झूठी सकारात्मक प्लाज्मिड की संख्या को कम करने suppressors की पहचान करने के लिए सर्वोपरि है. खमीर ले और इसी तरह के वैक्टर के कई प्रतियां बंदरगाह कर सकते हैं, जबकि सामान्य ज्ञान प्लाज्मिड असंगति के साथ जुड़े पारंपरिक रूप से तय है कि ई. कोलाई केवल प्रतिकृति का एक ही मूल के साथ plasmid का एक प्रकार बनाए रखता है (ORI) एक समय में, हालांकि यह हमेशा मामला नहीं है. यह एक प्रमुख मुद्दा हो सकता है जब दमन उम्मीदवारों की पहचान करने का प्रयास. यदि दमन खमीर क्लोन की पहचान कर रहे हैं, plasmids निकाला जाएगा और प्रचार और पहचान के लिए बाद अनुक्रमण के लिए ई. कोलाई में retransformed. एक बार उम्मीदवार suppressor प्लाज्मिड अलग किया गया है और ई. कोलाईमें retransformed , यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि कम से कम पांच ई. कोलाई कालोनियों अनुक्रमण के लिए चुना जाता है, क्योंकि यह संभव है कि व्यक्तिगत क्लोन ले जा सकता है विभिन्न प्लाज्मिड। चूंकि ई. कोलाई केवल एक समय में एक प्लाज्मिड का प्रचार करने में सक्षम होना चाहिए, यदि खमीर अलगाव कई प्लाज्मिड पैदावार, थाली पर विभिन्न ई. कोलाई क्लोन एक समय में उनमें से केवल एक ही ले जाना चाहिए. इसलिए ई. कोलाई में सामान्य परिवर्तन दक्षता के आधार पर पांच कालोनियों उठा कि क्लोन एक ही या अलग प्लाज्मिड ले जा रहे हैं दिखाना चाहिए. यदि ई. कोलाईसे प्लाज्मिड के अनुक्रमण के बाद कई प्लाज्मिड उत्पन्न होते हैं, तो प्रत्येक को विषाक्त खमीर क्लोन में तब्दील किया जाना चाहिए और विकास दोष के बचाव के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, भले ही केवल एक ही दमन प्लाज्मिड की पहचान की है, के लिए कठोरता और विषाक्त क्लोन में प्लाज्मिड के reproducibility retransformation प्रोत्साहित किया जाता है.

खमीर suppressor परख एक बहुत बड़ा प्रयोग है और उचित समय और सामग्री तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए. इस प्रोटोकॉल कई विवरण है कि सख्ती से पालन किया जाना चाहिए शामिल हैं और यह सिफारिश की है कि शोधकर्ता इन परख का आयोजन ध्यान से पढ़ें और पूर्ण में एक परख शुरू करने से पहले प्रोटोकॉल घड़ी. यह बैक्टीरिया और खमीर दोनों सहित एक बहुपक्षीय प्रक्रिया है जिसे विभिन्न तापमानों पर खेती करने की आवश्यकता है। खमीर से प्लाज्मिड का अलगाव कभी कभी उनके कठिन सेल दीवार के कारण मुश्किल हो सकता है और DMSO का उपयोग उच्च परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने में मदद करता है।

खमीर विषाक्तता और दबानेवाला स्क्रीन का सबसे बड़ा लाभ में से एक यह है कि जीवाणु effector शारीरिक रूप से समय के किसी भी प्रशंसनीय राशि के लिए मेजबान substrates के लिए बाध्य करने की जरूरत नहीं है putative मार्ग लक्षित मार्ग का पता लगाने के लिए. केवल अध्ययन के एक छोटे से मुट्ठी भर इस या इसी तरह की तकनीक का उपयोग कर की सूचना दीहै 1-5. हालांकि, वहाँ तकनीक है कि मेजबान रास्ते और कई तकनीकों की पहचान जीवाणु प्रभावक प्रोटीन के बाध्यकारी भागीदारों के लिए स्क्रीन की रिपोर्ट कर रहे हैं. Kramer एट अल एक उपन्यास प्रणाली जीव विज्ञान दृष्टिकोण जीवाणु प्रभावक प्रोटीन8द्वारा लक्षित रास्ते की पहचान करने के लिए सूचना दी. तकनीक S. cerevisiae के एक अगुणित विलोपन तनाव संग्रह का इस्तेमाल किया Shigella effector Osp4 के प्रति संवेदनशील म्यूटेंट के लिए स्क्रीन करने के लिए. इस तकनीक का उपयोग करना, Osp4 MAPK संकेतन और मेजबान कोशिकाओं में सहज प्रतिरक्षा के क्षीणन के विनियमन से जुड़ा हुआ था. सरणी आधारित, उच्च throughput, स्वचालित खमीर दो संकर स्क्रीन अब तेजी से मेजबान प्रोटीन9के लाखों लोगों के खिलाफ एक ही समय में कई स्क्रीनिंग द्वारा putative जीवाणु प्रभावक बाध्यकारी भागीदारों की पहचान कर सकते हैं. इसी प्रकार, उच्च-थ्रूपुट इम्यूनोप्रीसेक्टिव्स जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन10के पूरे परिवारों के putative बाध्यकारी भागीदारों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा रहा है। जबकि इन अध्ययनों के कई effector प्रोटीन विशेषता की समय सारिणी में तेजी लाने कर सकते हैं, वे शायद ही कभी क्या शारीरिक प्रक्रियाओं हेरफेर किया जा रहा है और क्या इन बातचीत के समग्र परिणाम हैं के रूप में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. इस प्रकार, खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन के रूप में तकनीक सेलुलर प्रक्रियाओं को रोशन करने के लिए आवश्यक हैं इन प्रभावक प्रोटीन द्वारा हेरफेर किया जा रहा है. कुछ बिंदु पर, जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित बाध्यकारी भागीदारों या रास्ते की पहचान करने वाली टिप्पणियों को यह निर्धारित करने के लिए सेलुलर संक्रमण मॉडल पर लौटने की आवश्यकता होती है कि क्या इन इन इन इन निष्कर्षों को शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिदृश्यों में सही है। सी trachomatis जैसे अविकल्पी इंट्रासेल्यूलर रोगजनकों के आनुवंशिक हेरफेर हाल हीमें 11-15 तक एक बड़ी बाधा रही है और साइट-विशिष्ट म्यूटेंट का उत्पादन प्रभावक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संभव नहीं था। हालांकि पिछले कुछ वर्षों में, क्लैमिडियल म्यूटेंट बनाने में एक क्रांति, उन्हें पूरक, और लक्ष्य प्रोटीन overexpressing हुआ है. ये हाल ही में अग्रिम बहुत विषाक्तता और suppressor स्क्रीन का उपयोग कर अध्ययन से प्राप्त जानकारी के मूल्य में वृद्धि हुई है के रूप में यह अब संभव है खमीर से सीधे संक्रमण में जाने के लिए परिणामों की वैधता की जांच.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम Shelby Andersen, एबी McCullough, और लॉरेल वुड्स इन तकनीकों के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन के माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी के आयोवा विभाग से मैरी एम वेबर के लिए स्टार्टअप धन द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

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References

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जेनेटिक्स अंक 152 जीवाणु प्रभावक प्रोटीन खमीर निरोधक प्रभावक प्रोटीन समारोह खमीर स्क्रीन क्लैमिडिया ट्रेकोमैटिस,प्रकार III स्रावित प्रभावक प्रोटीन मार्ग पहचान
खमीर विषाक्तता और दमन स्क्रीन का उपयोग कर जीवाणु प्रभावक प्रोटीन द्वारा लक्षित मेजबान रास्ते की पहचान
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Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

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