Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifisering av Host trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner bruker gjær toksisitet og Suppressor screens

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Bakterielle patogener skiller proteiner inn i verten som mål avgjørende biologiske prosesser. Identifisering av verts banene som er målrettet mot bakterielle effektor proteiner, er nøkkelen til å ta opp molekylær patogenesen. Her er en metode som bruker en modifisert gjær Suppressor og toksisitet skjermen for å belyse vert trasé målrettet av giftige bakteriell effektor proteiner er beskrevet.

Abstract

Intracellulære bakterier skiller ut virulens faktorer kalt effektor proteiner inn i verten stoffer som handler for å undergrave vert proteiner og/eller deres tilknyttede biologiske trasé til fordel for bakterien. Identifisering av antatte bakteriell effektor proteiner har blitt mer håndterlig på grunn av fremskritt i bakterielle Genova sekvensering og advent av algoritmer som tillater i silisiummangan identifisering av gener koding sekresjon kandidater og/eller eukaryote-lignende Domener. Identifisering av disse viktige virulens faktorene er imidlertid bare et første skritt. Målet er naturligvis å bestemme molekyl funksjonen til effektor proteiner og belyse hvordan de samhandler med verten. I de senere årene, teknikker som gjær to-hybrid skjerm og stor skala immunoprecipitations kombinert med masse massespektrometri har hjulpet i identifisering av protein-protein interaksjoner. Selv om identifisering av en verts bindende partner er det avgjørende første skrittet mot å Elucidating molekyl funksjonen til et bakteriell effektor protein, finnes det noen ganger verts proteinet som har flere biologiske funksjoner (f.eks. utgangen, clathrin, tubulin) eller bakteriell protein kan ikke fysisk binde vert proteiner, frata forskeren av avgjørende informasjon om den presise verten stien blir manipulert. En modifisert gjær toksisitet skjermen kombinert med en Suppressor skjermen har blitt tilpasset for å identifisere verten trasé påvirket av bakteriell effektor proteiner. Toksisitet skjermen er avhengig av en giftig effekt i gjær forårsaket av effektor protein forstyrrer verten biologiske trasé, som ofte manifesterer som en vekst defekt. Uttrykk for en gjær genomisk biblioteket brukes til å identifisere verten faktorer som undertrykker toksisitet av bakteriell effektor protein og dermed identifisere proteiner i veien at effektor protein mål. Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner for både toksisitet og Suppressor skjermene. Disse teknikkene kan utføres i enhver Lab i stand til molekylær kloning og dyrking av gjær og Escherichia coli.

Introduction

Den første rapporten av prosedyrer som ligner på de som presenteres her preget Legionella pneumophila type IV effektor SidD, en deAMPylase som modifiserer Rab11. Sammenlignbare teknikker ble brukt for karakterisering av flere L. pneumophila effekt Orer1,2,3. Analysen ble tilpasset for å karakterisere en Coxiella coxiella type IV effektor protein4, og nylig nytten av denne teknikken ble utvidet for karakterisering av Chlamydia trachomatis inkludering membran proteiner5 .

Denne protokollen kan deles inn i to store deler: 1) gjær toksisitet skjermen, der bakteriell effektor protein av interesse er uttrykt i gjær og kloner er vist for en giftig fenotype som dokumentert av en vekst defekt, og 2) gjær Suppressor skjermen , der giftig fenotype er undertrykt av uttrykk for en gjær genomisk bibliotek i giftig belastning. Dermed er toksisitet skjermen en skjerm for giftig fenotyper som manifesterer som vekst defekter når bakteriell effektor av interesse er overexpressed. Giftig kloner, hell forvandlet med og uttrykker bakteriell effektor, er valgt og lagret for neste trinn. Den andre store skritt innebærer overexpressing en delvis fordøyd gjær genomisk biblioteket i giftig gjær klone. Plasmider gjør opp gjær genomisk biblioteket foreslått for bruk i denne protokollen bære 5 − 20 KB inserts, vanligvis tilsvarende 3 − 13 gjær åpne lese RAM mer (ORF) av en gjennomsnittlig gen størrelse på ~ 1,5 kb tvers av alle plasmider, som representerer hele gjær Genova dekket omtrent 10x. Denne delen av analysen kalles Suppressor skjermen, som målet er å undertrykke toksisitet av bakteriell effektor protein. Potensielle Suppressor plasmider er isolert fra gjær, sekvensert, og den undertrykke ORFs identifisert. Begrunnelsen underliggende Suppressor skjermen er at effektor protein binder, samhandler med, og/eller overvelder komponenter av verten veien den mål, og som gir de vert proteiner tilbake i overkant kan redde den giftige effekten på veien og dermed, vekst mangelen. Dermed identifiserte ORFs som undertrykker toksisitet ofte representerer flere deltakere på en vert sti. Ortogonale eksperimenter blir deretter utført for å verifisere at bakteriell effektor faktisk samhandler med de impliserte veien. Dette er spesielt nødvendig hvis en bindende partner som clathrin eller utgangen er identifisert, fordi disse proteinene er involvert i en rekke verts prosesser. Ytterligere eksperimenter kan deretter belyse den fysiologiske funksjonen til det effektor proteinet under infeksjonen. Den toksisitet og Suppressor skjermene er også kraftige verktøy for å tyde den fysiologiske funksjon av bakterielle effektor proteiner som ikke fysisk binder verten proteiner med slektskap tilstrekkelig til å oppdage ved immunutfelling eller som samhandler med vert i enzymatisk hit-and-Run interaksjoner som ikke kan oppdages av en gjær-to hybrid skjerm.

Selv om Suppressor skjermen kan være en kraftig metode for å avdekke potensielle fysiologiske interaksjoner mellom bakteriell effektor proteiner og vert trasé, bakteriell effektor protein må indusere en vekst defekt i gjær, ellers bruker det i Suppressor skjermen vil være til liten nytte. Videre må den giftige fenotype resultere i minst en 2 − 3 log10 underskudd i vekst eller det vil være vanskelig å identifisere Suppressors. Hvis et laboratorium er satt opp for cellekultur, screening effektor proteiner for toksisitet i vanlige cellelinjer som HeLa kan ofte gi innsikt om hvorvidt det er verdt innsatsen for å fortsette med gjær toksisitet skjermen. Utenfor livmoren uttrykk for effektor protein i HeLa celler noen ganger resulterer i toksisitet som samsvarer veldig sterkt med toksisitet i gjær belastningen brukes for disse skjermene4. Observer kjennetegn ved stress i HeLa celler inkluderer tap av stress fibre, celle avløsning fra platen, og kjernefysisk kondens indikerer apoptose. Enhver visuell indikasjon på stress i jakten celler gjør protein av interesse en god kandidat for inducing en vekst defekt i gjær, som replikere mye raskere og er dermed mer mottakelig for forstyrrelsene av essensielle trasé.

Det bør bemerkes at Suppressor skjermen ikke alltid identifisere vert bindende partnere som Suppressors, men det kan fortsatt implisere kritiske komponenter av verten Pathway (s) målrettede, gir et helhetlig syn på de biologiske prosessene blir kapret av bakteriell effektor protein. På overflaten synes dette counterintuitive, fordi gir bindende partner av effektor protein i overkant ville forventes å redde vekst defekt. I arbeidet med å identifisere trasé målrettet av C. trachomatis EFFEKTOR protein CT229 (CpoS), som binder seg til minst 10 forskjellige Rab GTPases under infeksjon5, ingen av Rab bindende partnere undertrykt toksisitet av CT229. Imidlertid ble tallrike Suppressors involvert i clathrin-belagt vesicle (CCV) identifisert, noe som førte til ytterligere arbeid med å demonstrere at CT229 spesifikt subverts Rab-avhengige CCV smugling. Tilsvarende når gransker C. coxiella effektor protein Cbu0041 (CirA) flere Rho GTPases som reddet gjær vekst defekt ble identifisert, og det ble senere funnet at CirA fungerer som en GTPase aktivere PROTEIN (gap) for RhoA4.

Nytten av gjær Suppressor skjermen for Elucidating vert trasé rettet mot bakteriell effektor proteiner kan ikke være overdrevet, og andre forskere forsøker å karakterisere intracellulære bakteriell effektor proteiner kan i stor grad ha nytte av disse teknikkene. Disse analysene er av verdi hvis immunoprecipitations og/eller gjær-to hybrid skjermer har unnlatt å finne en bindende partner og kan belyse hvilke trasé er målrettet av bakteriell effektor protein. Her, detaljerte protokoller for toksisitet og Suppressor skjermer for å identifisere vert biologiske trasé målrettet av intracellulære bakteriell effektor proteiner er gitt, samt noen av de vanlige hindringene oppleves når du bruker disse analysene og deres tilhørende løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av medier og reagenser

Merk: platene bør være forberedt før den dagen analysen og er bra for 1 måned. Media og reagenser kan gjøres når som helst og er bra for 1 måned.

  1. Forbered 1 L av glukose oppløsningen (10% w/v) ved å oppløse 100 g av D-(+)-glukose i 800 mL destillert vann i et 1, 000 mL beger. Juster volumet til 1 L med destillert vann. Filtrer gjennom et sterilt 0,2 μm-filter til en steril 1 L medie lagrings flaske.
  2. Forbered 1 L av den galaktose oppløsningen (10% w/v) ved å oppløse 100 g av D-(+)-galaktose i 800 mL destillert vann i et 1 L beger. Juster volumet til 1 mL ved hjelp av destillert vann og Filtrer gjennom et sterilt 0,2 μm-filter til en steril 1 000 mL medie lagrings flaske.
  3. Forbered 1 L av gjærekstrakt peptone druesukker (YPD) agar ved oppløsning 10 g gjærekstrakt, 20 g peptone, 20 g glukose, og 20 g av agar i 1 000 mL destillert vann. Autoklav i 20 min og kjølig i 56 ° c vannbad til avkjølt. Hell i 100 mm plater ved hjelp av ~ 20 mL Media per plate.
  4. Forbered 1 L av YPD buljong ved å oppløse 10 g gjærekstrakt, 20 g peptone, og 20 g glukose i 1 000 ml destillert vann. Autoklav i 20 min.
  5. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) glukose agar. For 1 L, oppløse 6,7 g gjær nitrogen base uten aminosyrer, 1,9 g frafall supplement uten uracil, og 15 g av agar i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 ° c til temperaturen er ~ 50 − 60 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 mL glukoseoppløsning fremstilt i trinn 1,1. Bland godt ved å forsiktig virvlende eller plassere på rør plate. Hell i 100 mm plater ved hjelp av ~ 20 mL Media per plate.
  6. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) galaktose agar. For 1 L, oppløse 6,7 g gjær nitrogen base uten aminosyrer, 1,9 g frafall supplement uten uracil, og 15 g av agar i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 ° c til temperaturen er ~ 50 − 60 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 mL av galaktose løsning fremstilt i trinn 1,2. Bland godt ved å forsiktig virvlende eller plassere på rør platen. Hell i 100 mm plater ved hjelp av ~ 20 mL Media per plate.
  7. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) glukose buljong. For 1 L, oppløse 6,7 g av gjær nitrogen base uten aminosyrer og 1,9 g frafall supplement uten uracil i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 ° c til temperaturen er ~ 50 − 60 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 ml glukoseoppløsning fremstilt i trinn 1,1.
  8. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) leucine (leu-) glukose agar. For 1 L, oppløse 6,7 g av gjær nitrogen base uten aminosyrer; 1,9 g av frafall supplement uten uracil, leucine, og tryptofan; 15 g av agar; og 0,076 g tryptofan i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 ° c til temperaturen er ~ 50 − 60 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 mL glukoseoppløsning fremstilt i trinn 1,1. Hell i 100 mm plater ved hjelp av ~ 20 mL Media per plate.
  9. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) leucine (leu-) galaktose agar. For 1 L, oppløse 6,7 g av gjær nitrogen base uten aminosyrer; 1,9 g av frafall supplement uten uracil, leucine, og tryptofan; 15 g av agar; og 0,076 g tryptofan i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 ° c til temperaturen er ~ 50 − 60 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 mL av galaktose løsning fremstilt i trinn 1,2. Bland godt ved å forsiktig virvlende eller plassere på en røre plate. Hell i 100 mm plater ved hjelp av ~ 20 mL Media per plate.
  10. Forbered syntetisk frafall (SD) uracil (ura-) leucine (leu-) glukose buljong. For 1 L, oppløse 6,7 g av gjær nitrogen base uten aminosyrer; 1,9 g av frafall supplement uten uracil, leucine, tryptofan; og 0,076 g tryptofan i 800 mL destillert vann. Autoklav i 20 minutter og avkjøles i et vannbad på 56 − 60 ° c til temperaturen er ~ 50 ° c. Ved hjelp av en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradert sylinder, tilsett 200 mL glukoseoppløsning fremstilt i trinn 1,1.
  11. Forbered polyetylen-glykol (PEG) løsning. Tilsett 50% w/v av polyetylen glykol 3350 i destillert vann. Steriliseres med autoklavering.
  12. Forbered 1 M litium acetate (LiAc) ved oppløsning 10,2 g av litium acetate tørke i 200 mL destillert vann. Steriliseres med autoklavering.
  13. Forbered sild sperm DNA. Fortynning av 10 mg/mL sild sperm DNA til 2 mg/mL ved bruk av destillert vann. Heat ved 100 ° c i 5 min og umiddelbart plass på isen i 5 min.

2. kloning genet av interesse i gjær toksisitet plasmider pYesNTA-kan

Merk: for tiden er det en rekke gjær toksisitet vektorer tilgjengelig både kommersielt og faglig. Den gjær Suppressor skjermen kan brukes i forbindelse med mange av disse vektorer forutsatt plasmider uttrykker effektor protein av interesse bruker en frafall annet valg enn uracil og en antibiotika markør annet enn blaR. Dette arbeidet brukes en modifisert pYesNTA vektor4,5 som inkluderer en kanamycin motstand kassett for enklere screening for potensielle Suppressors. Den kloning ordningen må tillate for effektor protein å være i-ramme med gal promoter og His-tag. Den Chlamydia trachomatis inkludering MEMBRAN protein CT229 ble brukt som et bevis på prinsippet for disse analysene.

  1. Bruk PCR for å forsterke CT229 fra C. trachomatis genomisk DNA etter produsentens anvisninger ved hjelp av CT229 + 1 KPN F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) og CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC)-primere. Bruk følgende PCR-betingelser: (1) 98 ° c i 30 s; (2) 98 ° c i 10 s, 55 ° c i 30 s, 72 ° c i 2 min; (3) Gjenta trinn 2 for totalt 25x; (4) 72 ° c i 10 min; og (5) 4 ° c hold.
  2. Analyser 5 μL av PCR-produktet på en 1% agarose gel (figur 1).
  3. Rens de resterende 45 μL av DNA ved bruk av et PCR rensesett etter produsentens anvisninger.
  4. Fordøye 50 μL av renset PCR-innsats og pYesNTA-kan (figur 2) for 1 time ved 37 ° c i et vannbad med KPNI-HF og XHOI-HF.
    Merk: for pYesNTA-kan, fordøye 5 mikrogram plasmider ved hjelp av 5 μL av KpnI-HF, 5 μL av XhoI-HF, og 6 μL av buffer i et total volum på 60 μL. For innsatsen, fordøye hele 50 μL av renset PCR-produkt ved hjelp av 2 μL av KpnI-HF, 2 μL av XhoI-HF, og 6 μL av buffer.
  5. Kjør hele plasmider fordøye på en 1% agarose gel. Utfør rensing av fordøyd plasmider ved hjelp av en gel Extraction Kit følge produsentens instruksjoner.
  6. Rens den fordøyd PCR-innsatsen ved hjelp av et PCR rensesett etter produsentens anvisninger.
  7. Klon innsatsen inn i pYesNTA-kan bruke 2 μL av pYesNTA-du (trinn 2,5), 2 μL av DNA ligase buffer, 1 μL av T4 ligase, og 15 μL av innsats (trinn 2,6). Ruge ved romtemperatur i 1 time.
  8. Legg hele kloning reaksjonen til 50 μL av E. coli kompetente celler og utføre transformasjonen reaksjonen.
  9. Plate hele transformasjon reaksjonen på en LB plate som inneholder 100 μg/mL av carbenicillin.
  10. Vaksinere 10 mL av LB inneholder 100 mikrogram/mL carbenicillin med tre individuelle kolonier. Ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 150 RPM.
  11. Isoler plasmider ved hjelp av et plasmider miniprep sett etter produsentens anvisninger.
  12. Sekvens de isolerte plasmider ved hjelp av gen-spesifikk grunning (trinn 2,1).

3. test protein av interesse for toksisitet i gjær

  1. Stripe Saccharomyces cerevisiae W303 på YPD agar (trinn 1,3) for å få isolerte kolonier. Ruge ved 30 ° c i 24 timer.
  2. Vaksinere 10 mL YPD buljong (trinn 1,4) med en enkelt koloni fra agar plate (trinn 3,1). Ruge ved 30 ° c med risting ved 150 RPM over natten.
  3. Tilsett 0,5 mL over natten kulturen til 10 mL YPD buljong (trinn 1,4) og ruge ved 30 ° c med risting ved 150 RPM for 4 h.
    1. Pellet 10 mL kultur ved 3 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
    2. Resuspend pellet i 1 mL sterilt vann, overføring til mikrosentrifugen røret, og pellet ved 3 000 x g i 1 min ved romtemperatur.
    3. Resuspend pellet i 1 mL 1 mM litium acetate (LiAc) og pellets ved 3 000 x g i 1 min ved romtemperatur.
    4. Gjenta LiAc vask 2x.
    5. Fjern vasken. Resuspend pellet i 2,4 mL 50% PEG 3350. Tilsett 360 μL av 1M LiAc, 500 μL av 2 mg/ml sild SPERM DNA, og 400 μL av sterilt vann.
      Merk: Dette er tilstrekkelig for 20 transformasjoner.
    6. Tilsett 180 μL av transformasjonen Mix fra trinn 3.3.5 til et mikrosentrifugen rør som inneholder 5 μL av pYesNTA-kan CT229 plasmider DNA (100 − 500 ng) fra trinn 2,12.
    7. Ruge i et vannbad ved 30 ° c i 30 min.
    8. Ruge i et vannbad ved 42 ° c i 30 min.
    9. Pellet ved 3 000 x g i 1 min ved romtemperatur.
    10. Fjern transformerings blandingen med pipette. Resuspend pellet i 100 av sterilt vann. Plate transformasjonen på SD ura- agar med glukose (trinn 1,5).
    11. Ruge plater ved 30 ° c for 48 h.
  4. Vaksinere 5 mL SD ura- buljong som inneholder glukose (trinn 1,7) med en enkelt koloni fra platen. Ruge over natten ved 30 ° c med risting ved 150 RPM. Inkluder gjær forvandlet med vektoren alene som en negativ kontroll.
    1. Tilsett 180 μL av sterilt vann til 5 brønner på en 96 brønn plate (a2 − a6).
    2. Vortex den over natten kulturen å blande.
    3. Tilsett 180 μL av gjær til den første brønnen (a1). Serielt fortynne 1:10 (seks prøver totalt inkludert ufortynnet).
    4. Ved hjelp av en flerkanals pipette, spot 5 μL av hver fortynning på SD ura- glukose (trinn 1,5) og ura- galaktose (trinn 1,6) agar plater. Ruge ved 30 ° c for 48 h.
  5. Vurdere toksisitet ved å sammenligne veksten av gjær uttrykker effektor protein av interesse dyrket på galaktose-inneholdende medier til veksten av gjær uttrykker vektoren alene.
  6. Bekreft uttrykket for hans-tag Fusion protein med vestlige blotting.

4. Transformer giftig gjær med gjær genomisk biblioteket

  1. Vaksinere 100 mL av SD ura- glukose buljong (trinn 1,7) med 1 ml av aksjen fra trinn 3,4. Ruge for 16 − 24 timer ved 30 ° c med risting ved 150 RPM. Plasser 900 mL SD ura- glukose buljong ved 30 ° c over natten for å prewarm mediene.
  2. Tilsett hele 100 mL av natten kulturen til prewarmed 1 L kolbe. Ruge for 4 − 5 timer ved 30 ° c med risting ved 150 RPM.
    1. Pellet kulturen på 6 000 x g for 10 min ved 4 ° c.
    2. Kast supernatanten. Resuspend pellet i 250 mL sterilt vann. Pellet kulturen på 6 000 x g for 5 min ved 4 ° c.
    3. Kast supernatanten. Resuspend pellet i 250 mL 1 mM LiAc. Pellet kulturen på 6 000 x g for 5 min ved 4 ° c.
    4. Fjern LiAc og resuspend pellet i 9,6 mL 50% PEG 3350. Tilsett 1,44 mL 1M LiAc, 2 mL 2 mg/mL sild sperm DNA, 50 mikrogram i pYep13 genomisk bibliotek (ATCC 37323). Juster volumet til 15 mL med sterilt vann. Bland forsiktig ved inversjon.
    5. Ruge i et vannbad ved 30 ° c i 30 min.
    6. Tilsett 750 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) for å forbedre transformasjonen effektivitet. Ruge i et vannbad ved 42 ° c i 30 min. bland med forsiktig inversjon hver 10 min.
    7. Pellet gjær på 3 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
    8. Kast supernatanten og resuspend pellet i 10 mL sterilt vann. Pellet ved 3 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
    9. Resuspend pellet i 8 mL sterilt vann.
    10. For å bestemme transformasjon effektivitet, fortynne 1:10 og plate 100 μL av hver fortynning på SD ura- leu- glukose agar (trinn 1,8).
    11. Plate 200 μL av prøven på SD ura- leu- galaktose agar (trinn 1,9) plater. Bruk totalt 50 plater.
    12. Ruge ved 30 ° c i 48 − 96 timer eller til koloniene vises.
      Merk: koloniene vises vanligvis på glukose agar plater ved 48 − 72 h og galaktose agar plater på 72 − 96 t.
  3. Patch kolonier (potensielle redder) på SD ura- leu- galaktose agar (trinn 1,9) for å utvide og gjøre lager. Ruge ved 30 ° c for 24 − 48h.
  4. Vaksinere 5 mL SD ura- leu- glukose buljong (trinn 1,10) ved hjelp av den delen av plasteret. Ruge over natten ved 26 ° c med risting ved 150 RPM.
    1. Tilsett 180 μL av sterilt vann til 5 brønner på en 96 brønn plate (a2 − a6).
    2. Vortex den over natten kulturen å blande.
    3. Tilsett 180 μL av gjær til den første brønnen (a1). Serielt fortynne 1:10 (seks prøver totalt inkludert ufortynnet).
    4. Ved hjelp av en flerkanals pipette, punkt 5 μL av hver fortynning på SD ura- GLUKOSE og SD ura- galaktose agar plater. Inkluder giftig effektor alene som en kontroll.
    5. Ruge ved 30 ° c for 48 h.
  5. Sammenlign veksten av gjær uttrykker giftig effektor alene til gjær som inneholder den potensielle Suppressors. Bare fortsette med potensielle Suppressors som har redusert toksisitet i forhold til gjær uttrykker effektor alene.

5. Identifiser og Bekreft Suppressors

  1. Vaksinere 5 mL SD ura- leu- glukose buljong (trinn 1,10) med 100 μL av gjær fra trinn 4,4 og ruge over natten ved 30 ° c med risting ved 150 RPM.
    1. Pellet gjær på 3 000 x g for 2 min ved romtemperatur. Kast supernatanten forsiktig med en pipette.
    2. Isoler plasmider med en gjær plasmider miniprep sett etter produsentens anvisninger.
  2. Transformer den isolerte plasmider inn i E. coli kompetente celler og plate hele transformasjon på lb agar med 100 μg/ml av carbenicillin. Ruge ved 37 ° c for 24 h.
  3. Vaksinere 10 mL LB buljong inneholdende 100 μg/mL av carbenicillin, med tre kolonier fra platen og ruge ved 37 ° c over natten med risting ved 150 RPM.
    1. Pellet kulturer ved 3 000 x g for 10 min ved romtemperatur. Isoler plasmider ved hjelp av et miniprep sett etter produsentens anvisninger.
  4. Retransform den giftige gjær med den isolerte plasmider fra trinn 5.3.1 følge trinnene i del 3 av protokollen.
    1. Vaksinere 5 mL SD ura- leu- glukose buljong med en koloni fra transformasjonen plate. Ruge over natten ved 30 ° c med risting ved 150 RPM.
    2. Flekk på ura- leu- glukose og galaktose agar å bekrefte undertrykkelse av toksisitet.
  5. Sekvens med pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) og pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) primere å identifisere gjær ORFs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før selve gjær Suppressor skjermen kan utføres, må effektor protein av interesse testes for toksisitet i gjær. Dette oppnås ved å uttrykke protein av interesse for gjær under kontroll av en galaktose-induserbart promoter. Vekst på glukose (noninducing forhold) bør først sammenlignes med å sikre toksisitet er spesielt på grunn av uttrykk for protein av interesse og er ikke en generell defekt. Som vist i Figur 3, manifesterer toksisitet som mindre kolonier og/eller redusert vekst. En 2 − 3 log nedgang i gjær veksten er ideell for gjær Suppressor skjermene.

Som vist i Figur 4, den toksisitet og Suppressor skjermen kan oppnås i åtte trinn ved hjelp av metodene som er beskrevet i protokollen delen. Genet av interesse er klonet til en passende vektor1, og den resulterende konstruksjoner er forvandlet til gjær å vurdere toksisitet. Denne studien brukte CT229 som genet av interesse og pYesNTA-kan som vektoren. I tillegg ble uttrykket av hans-Tagged Fusion protein bekreftet av vestlige blotting. Ideelt sett bør en 2 − 3 Logg reduksjon i gjær som dyrkes på galaktose medier observeres. Hvis protein av interesse er giftig for gjær (Figur 3 og Figur 4), Suppressor skjermen kan gjennomføres ved å transformere den giftige belastningen med gjær genomisk biblioteket pYep13. Transformants er belagt opp på glukose agar å avgjøre transformasjon effektivitet og galaktose agar å identifisere potensielle Suppressors. Ved hjelp av denne protokollen, en minimum transformasjon effektivitet på 5 x 105 ble oppnådd med totalt 10 − 250 kolonier på galaktose agar. Patching disse koloniene på SD ura- leu- galaktose agar (Figur 4) hjulpet i identifisering av True Suppressors, fordi mange falske positiver ikke vil vokse når lappet. Her ble 50 kolonier lappet og åtte kloner som undertrykte effektor toksisitet ble innhentet (Figur 4). Spotting suppressors på SD ura- leu- galaktose agar ble gjort for å bekrefte undertrykkelse av toksisitet. Som vist i Figur 4, PSup1 og pSup 2 undertrykt toksisitet av effektor protein, mens pSup3 ikke. Derfor ble pSup3 forkastet. Plasmider ble senere isolert fra Suppressors og forvandlet til E. coli for å øke plasmider utbyttet. Plasmider kan da bli retransformed inn i giftig gjær for å bekrefte at den isolerte plasmider definitivt undertrykker effektor toksisitet (Figur 4). Mens de fleste av de isolerte plasmider bør redde toksisitet, noen ganger en plasmider som ikke undertrykke toksisitet når retransformed inn i giftig gjær belastningen er innhentet. Disse plasmider forkastes, og bare de som undertrykker toksisitet etter retransformation bør være i rekkefølge.

Den isolerte plasmider vil inneholde flere gjær ORFs4. Å identifisere som er den sanne Suppressor, kan hver ORF være individuelt klonet og uttrykt i giftig gjær belastningen som tidligere beskrevet1,2,3,4.

Figure 1
Figur 1: PCR forsterkning av mål genet. CT229 fra Chlamydia trachomatis serovar L2 ble PCR forsterket fra genomisk DNA. PCR-produktene ble analysert på en 1% agarose gel beiset med etidiumbromid bromide. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: pYesNTA-kan plasmider kart. Målet genet av interesse ble klonet i flere kloning nettstedet (MCS) av pYesNTA-kan. Kanamycin ble brukt til valg i e. coli og uracil frafall ble brukt til valg i S. cerevisiae. Uttrykk for det hans-kodede fusjons proteinet ble verifisert av Western blotting. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative gjær toksisitet resultater. Effektor proteiner av interesse ble klonet i pYesNTA-kan. Sequence-verifisert plasmider ble forvandlet til S. cerevisiae og transformants ble serielt fortynnet og flekkete på ura- glukose og galaktose agar å vurdere toksisitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: oversikt over gjær Suppressor skjermen. Målet genet av interesse ble klonet i pYesNTA-kan og plasmider ble forvandlet til S. cerevisiae. Transformants ble serielt fortynnet og oppdaget på ura- glukose og galaktose agar å vurdere toksisitet. For å identifisere veien målrettet av giftig effektor protein, gjær belastningen uttrykker giftig protein ble forvandlet med en gjær genomisk bibliotek. Koloniene ble lappet på ura- leu- galaktose agar og flekkete å vurdere toksisitet. Plasmider ble isolert fra de som undertrykker toksisitet av det effektor proteinet. Plasmider ble retransformed inn i giftig gjær belastningen for å bekrefte at den isolerte plasmider er en Suppressor. Plasmider fra Suppressors var sekvensert å identifisere gjær ORFs stede. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen skisserer trinn-for-trinn prosedyrer for å identifisere vert biologiske trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner ved hjelp av en modifisert gjær toksisitet og Suppressor skjermen. Gjær belastningen brukes, S. cerevisiae W303, er auxotrophic for både uracil og leucine. Uracil auxotrophy av belastningen brukes til å velge gjær bærer protein av interesse på pYesNTA-kan vektor mens leucine auxotrophy brukes til å velge for gjær genomisk biblioteket vektor pYep13. Den gjær genomisk biblioteket plasmider bære 3 − 13 ORFs, slik at hver ORF bør individuelt klonet i P415-ADH vektor6 eller en lignende vektor og retransformed i giftig gjær å identifisere som er den sanne Suppressor. Det er typisk å identifisere flere Suppressors representerer en vert biologisk sti. Suppressors kan noen ganger være direkte bindende partnere av bakteriell protein av interesse, men ikke alltid.

Generere gjær kloner bærer bakteriell protein av interesse på pYesNTA-kan er det første store skrittet og stor forsiktighet bør tas for å bevare integriteten til disse kloner så snart som mulig fordi det er sterke negative valg for gjær bære giftig proteiner, selv uten tilsiktet galaktose induksjon, og de kan miste plasmider. Noen ganger er det plasmider tap selv når gjær opprettholdes underutvalg på frafall Media. En metode har tidligere blitt rapportert å redusere forekomsten av plasmider tap ved linearizing vektoren og integrere det i gjær Genova1.

En stor ulempe med disse teknikkene er at Suppressor skjermen bare gir meningsfulle data hvis overuttrykte av bakteriell effektor protein utløser en overholdelse og konsistent vekst defekt i gjær. Den primære vanskeligheten i denne metoden er når ingen Suppressors er identifisert. Det er vanskelig å avgjøre om en unnlatelse av å identifisere Suppressors skyldes biologiske årsaker eller tekniske problemer. Fra et biologisk perspektiv, kan det være flere årsaker: protein av interesse kan være så giftig at proteiner fra genomisk biblioteket ikke er i stand til å betydelig undertrykke toksisitet, kan den målrettede veien være ute av stand til unnsetning, eller mange co-uttrykt faktorer kan være nødvendig for å overvinne den giftige effekten. Nærme seg det Biological forklaringen er utfordrende, idet der er mange udefinert variabler å analysere. Fordi det er en etablert protokoll, utforske tekniske forklaringer er en mye mer medgjørlig tilnærming. Fra et teknisk synspunkt, en unnlatelse av å identifisere Suppressors er trolig et resultat av lav transformasjon effektiviteten av gjær genomisk biblioteket. Denne protokollen bruker ATCC S. cerevisiae AB320 delvis fordøyd genomisk biblioteket i pYEp13. Andre biblioteker kan være tilstrekkelig så vel som andre vektorer, men denne protokollen spesifikt bruker ATCC biblioteket og det er ingen studier publisert som rapporterer alternative bibliotek eller vektor kilder. Det anbefales sterkt at dekningen av gjær Genova bør være minst 10x, eller underrepresentation kan hindre identifisering av Suppressors. Redusert transformasjon effektivitet kan bringe disse tallene under 1x. Dermed kan deler av gjær-Genova ikke være representert i Suppressor skjermen. Lav transformasjon effektivitet kan skyldes mange problemer, inkludert dårlige reagenser eller dårlig bibliotek forberedelse. Denne metoden overholder i stor grad til DMSO/LiAc transformasjon metoden først lagt frem av Hill et al.7. Det anbefales at nye DMSO, 50% PEG, og fersk sild sperm DNA er kjøpt og forberedt for transformasjoner og brukes utelukkende for disse analysene å redusere forurensning eller degradering av kvaliteten på reagensene. DMSO er svært hygroskopisk og absorberer vann fra atmosfæren lett. Derfor er det anbefalt å gjøre mange individuelle bruk alikvoter for å unngå gjentatt åpning av en container lokk og eksponering for atmosfæren. Høy kvalitet sild sperm DNA kan lagres ved-20 ° c og er fortsatt egnet for bruk i flere år, selv om en frisk forberedelse bør tilberedes fra lager for hver transformasjon. Når kokt og avkjølt, den sild sperm DNA bør ikke reboiled eller gjenbrukes, så det er best å bare fjerne det som er nødvendig og unngå å gjøre mer enn det som er nødvendig for gjeldende transformasjon. Oppmerksomhet på detaljer kan i stor grad forbedre transformasjonen effektiviteten av gjær og forbedre sjansene for å identifisere en Suppressor.

Tatt i betraktning at gjær pYep13 vektoren bærer 3 − 13 forskjellige gjær ORFs, redusere antall falske positive plasmider er viktig å identifisere Suppressors. Gjær kan ta opp og havn flere eksemplarer av lignende vektorer, mens den generelle visdommen forbundet med plasmider inkompatibilitet tradisjonelt tilsier at E. coli bare opprettholder en type plasmider med samme opprinnelse i replikering (Ori) om gangen, Selv om dette ikke alltid er tilfelle. Dette kan bli et stort problem når du forsøker å identifisere Suppressor kandidater. Hvis Suppressor gjær kloner er identifisert, vil plasmider bli ekstrahert og retransformed i E. coli for forplantning og påfølgende sekvensering for identifisering. Når kandidaten Suppressor plasmider har vært isolert og retransformed i E. coli, er det sterkt anbefalt at minst fem E. coli koloniene er plukket for sekvensering, fordi det er mulig at enkelte kloner kan bære forskjellige plasmider. Siden E. coli bør bare være i stand til å spre en plasmider om gangen, hvis gjær isolasjon gir flere plasmider, ulike E. coli kloner på tallerkenen bør bære bare én av dem om gangen. Derfor plukker fem kolonier basert på normal transformasjon effektivitet i E. coli bør vise om kloner bærer samme eller forskjellige plasmider. Hvis flere plasmider oppstå etter sekvensering av plasmider fra E. coli, så hver og en skal bli forvandlet til giftig gjær klone og vurdert for redning av vekst defekt. Videre, selv om bare en enkelt Suppressor plasmider er identifisert, for rigor og reproduserbarhet retransformation av plasmider inn i giftig klone er oppmuntret.

Den gjær Suppressor analysen er et svært stort eksperiment og hensiktsmessig tid og materialer bør planlegges tilsvarende. Denne protokollen inneholder mange detaljer som må følges strengt og det anbefales at forskeren gjennomfører disse analysene nøye lese og se protokollen i sin helhet før du starter en analyse. Dette er en multipartite prosedyre inkludert både bakterier og gjær som må dyrkes ved forskjellige temperaturer. Isolering av plasmider fra gjær kan noen ganger være vanskelig på grunn av deres tøffe celle veggen og bruk av DMSO bidrar til å oppnå høyere transformasjon effektivitet.

En av de største fordelene med gjær toksisitet og Suppressor skjermen er at bakteriell effektor ikke trenger å fysisk binde til verten underlag for noen merkbar mengde tid til å oppdage antatte veien målrettet. Bare en liten håndfull studier har rapportert ved hjelp av denne eller en lignende teknikk1-5. Men det finnes rapporter om teknikker som identifiserer vert trasé og mange teknikker til skjermen for bindende partnere av bakteriell effektor proteiner. Kramer et al. rapporterte en ny systembiologi tilnærming for å identifisere trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner8. Teknikken brukes en haploide sletting stamme samling av S. cerevisiae til skjermen for mutanter følsom for Shigella effektor Osp4. Ved hjelp av denne teknikken, var Osp4 knyttet til regulering av MAPK signalering og demping av medfødt immunitet i vert celler. Array-baserte, høy gjennomstrømming, automatisert gjær-to hybrid skjermer kan nå raskt identifisere antatte bakteriell effektor bindende partnere ved screening mange på samme tid mot millioner av verten proteiner9. Tilsvarende er høy-gjennomstrømning immunoprecipitations kombinert med masse massespektrometri brukes til å masse identifisere antatte bindende partnere av hele familier av bakteriell effektor proteiner10. Mens mange av disse studiene kan akselerere tidsplanen for effektor protein karakterisering, de sjelden gir innsikt om hvilke fysiologiske prosesser blir manipulert og hva helhetlig utfallet av disse interaksjoner er. Dermed teknikker som gjær toksisitet og Suppressor skjermen er avgjørende for belyse cellulære prosesser blir manipulert av disse effektor proteiner. På et tidspunkt, observasjoner identifisere bindende partnere eller trasé rettet mot bakteriell effektor proteiner må gå tilbake til cellulære infeksjoner modeller for å avgjøre om disse in vitro funnene holder sant i fysiologisk relevante scenarier. Genetisk manipulering av forplikte intracellulære patogener som C. trachomatis har vært et stort hinder inntil nylig11-15 og generering av områdespesifikke mutanter å studere effektor proteiner var ikke mulig. I de siste årene skjønt, en revolusjon i å generere Klamydia mutanter, utfyller dem, og overexpressing målet proteiner har skjedd. Disse siste fremskritt har sterkt forbedret verdien av informasjonen avledet fra studier ved hjelp av toksisitet og Suppressor skjermene som det er nå mulig å gå fra gjær direkte inn i infeksjonen å granske gyldigheten av resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Shelby Andersen, Abby McCullough og Laurel Woods for deres hjelp med disse teknikkene. Denne studien ble finansiert ved oppstart midler fra University of Iowa Institutt for mikrobiologi og immunologi til Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Tags

Genetikk bakteriell effektor protein gjær Suppressor effektor protein funksjon gjær skjermer Chlamydia trachomatis type III skilles ut effektor protein Pathway identifisering
Identifisering av Host trasé målrettet av bakteriell effektor proteiner bruker gjær toksisitet og Suppressor screens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter