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Genetics

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488

Summary

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Abstract

Las bacterias intracelulares secretan factores de virulencia llamados proteínas efectoras en el citosol huésped que actúan para subvertir las proteínas huésped y/o sus vías biológicas asociadas en beneficio de la bacteria. La identificación de proteínas efectoras bacterianas putativas se ha vuelto más manejable debido a los avances en la secuenciación del genoma bacteriano y la llegada de algoritmos que permiten en silico la identificación de genes que codifican candidatos a la secreción y/o eucariotas Dominios. Sin embargo, la identificación de estos importantes factores de virulencia es sólo un paso inicial. Naturalmente, el objetivo es determinar la función molecular de las proteínas efectoras y dilucidar cómo interactúan con el huésped. En los últimos años, técnicas como la pantalla dos híbridas de levadura y las inmunoprecipitaciones a gran escala, junto con la espectrometría de masas, han ayudado a identificar interacciones proteína-proteína. Aunque la identificación de un socio de unión huésped es el primer paso crucial para dilucidar la función molecular de una proteína efector bacteriana, a veces se encuentra que la proteína huésped tiene múltiples funciones biológicas (por ejemplo, actina, clathrin, tubulina), o la proteína bacteriana puede no unir físicamente las proteínas huésped, privando al investigador de información crucial sobre la vía exacta del huésped que se está manipulando. Se ha adaptado una pantalla de toxicidad por levadura modificada junto con una pantalla supresora para identificar las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras bacterianas. La pantalla de toxicidad se basa en un efecto tóxico en la levadura causado por la proteína efectora que interfiere con las vías biológicas del huésped, que a menudo se manifiesta como un defecto de crecimiento. La expresión de una biblioteca genómica de levadura se utiliza para identificar factores de huésped que suprimen la toxicidad de la proteína efectora bacteriana y así identificar proteínas en la vía a la que se dirige la proteína efector. Este protocolo contiene instrucciones detalladas tanto para las pantallas de toxicidad como para las pantallas supresoras. Estas técnicas se pueden realizar en cualquier laboratorio capaz de clonación molecular y cultivo de levadura y Escherichia coli.

Introduction

El primer informe de procedimientos similares a los aquí presentados caracterizó al efector de la Legionella pneumophila tipo IV SidD, una deAMPylase que modifica Rab11. Se utilizaron técnicas comparables para la caracterización de varios efectores L. pneumophila 1,2,3. El ensayo fue adaptado para caracterizar una proteína efectora Coxiella burnetii tipo IV4,y recientemente la utilidad de esta técnica se amplió para la caracterización de las proteínas de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis 5 .

Este protocolo se puede dividir en dos partes principales: 1) la pantalla de toxicidad de la levadura, en la que la proteína del efector bacteriano de interés se expresa en la levadura y los clones se examinan para detectar un fenotipo tóxico como lo demuestra un defecto de crecimiento, y 2) la pantalla supresora de levadura , en el que el fenotipo tóxico se suprime mediante la expresión de una biblioteca genómica de levadura en la cepa tóxica. Por lo tanto, la pantalla de toxicidad es una pantalla para fenotipos tóxicos que se manifiestan como defectos de crecimiento cuando el efector bacteriano de interés está sobreexpresado. Los clones tóxicos, transformados con éxito y la expresión del efector bacteriano, se seleccionan y guardan para el siguiente paso. El segundo paso importante consiste en sobreexpresar una biblioteca genómica de levadura parcialmente digerida en el clon de levadura tóxica. Los plásmidos que componen la biblioteca genómica de levadura sugerida para su uso en este protocolo llevan inserciones de 5 a 20 kb, generalmente correspondientes a 3 x 13 marcos de lectura abierta de levadura (ORF) de un tamaño medio de gen de 1,5 kb en todos los plásmidos, representando todo el genoma de levadura cubierto cubierto aproximadamente 10veces. Esta parte del ensayo se llama la pantalla supresora, ya que el objetivo es suprimir la toxicidad de la proteína efector bacteriana. Los posibles plásmidos supresores están aislados de la levadura, secuenciados y los ORF supresores identificados. La razón que subyace a la pantalla supresora es que la proteína del efector se une, interactúa y/o abruma los componentes de la vía huésped a la que se dirige, y que proporcionar esas proteínas huésped en exceso puede rescatar el efecto tóxico en la vía y, por lo tanto, el defecto de crecimiento. Por lo tanto, los ORF identificados que suprimen la toxicidad a menudo representan a múltiples participantes de una vía huésped. A continuación, se realizan experimentos ortogonales para verificar que el efector bacteriano interactúa de hecho con la vía implicada. Esto es especialmente necesario si se ha identificado un socio de unión como clathrin o actina, ya que estas proteínas están implicadas en una multitud de procesos de huésped. Otros experimentos pueden elucidar la función fisiológica de la proteína efector durante la infección. Las pantallas de toxicidad y supresor son también potentes herramientas para descifrar la función fisiológica de las proteínas efectoras bacterianas que no unen físicamente las proteínas huésped con afinidades suficientes para detectar por inmunoprecipitación o que interactúan con la host en interacciones enzimáticas de hit-and-run que pueden no ser detectados por una pantalla híbrida de levadura dos.

Aunque la pantalla supresora puede ser un método potente para revelar posibles interacciones fisiológicas entre las proteínas efectoras bacterianas y las vías del huésped, la proteína efectora bacteriana debe inducir un defecto de crecimiento en la levadura, de lo contrario usarlo en el pantalla supresor será de poca utilidad. Además, el fenotipo tóxico debe resultar en al menos un déficit de 2 a 3registros 10 en crecimiento o será difícil identificar supresores. Si se configura un laboratorio para el cultivo celular, el cribado de proteínas efectoras para la toxicidad en líneas celulares comunes como HeLa a menudo puede dar una idea de si vale la pena el esfuerzo para proceder con la pantalla de toxicidad de la levadura. La expresión ectópica de la proteína efector en las células de HeLa a veces resulta en toxicidad que se correlaciona muy fuertemente con la toxicidad en la cepa de levadura utilizada para estas pantallas4. Las características notables del estrés en las células de HeLa incluyen la pérdida de fibras de tensión, el desprendimiento celular de la placa y la condensación nuclear que indica apoptosis. Cualquier indicación visual de estrés en las células de HeLa hace que la proteína de interés sea un buen candidato para inducir un defecto de crecimiento en la levadura, que se replica namucho más rápidamente y por lo tanto son más sensibles a la perturbación de las vías esenciales.

Cabe señalar que la pantalla del supresor no siempre identifica a los socios de unión de host como supresores, pero todavía puede implicar componentes críticos de la(s) vía(s) del huésped(s) objetivo(es), lo que produce una visión holística de los procesos biológicos que está secuestrando el proteína efector bacteriana. En la superficie, esto parece contraintuitivo, porque proporcionar el socio de unión de la proteína efector en exceso se espera que rescate el defecto de crecimiento. En los esfuerzos por identificar vías dirigidas por la proteína efector C. trachomatis CT229 (CpoS), que se une a al menos 10 GTPases Rab diferentes durante la infección5, ninguno de los socios de unión de Rab suprimió la toxicidad de CT229. Sin embargo, se identificaron numerosos supresores involucrados en el tráfico de vesículas recubiertas de clathrin ( CCV), lo que llevó a seguir trabajando demostrando que el CT229 subvierte específicamente el tráfico de CCV dependiente de Rab. Del mismo modo, al investigar la proteína efector C. burnetii Cbu0041 (CirA) se identificaron varias Rho GTPases que rescataron el defecto de crecimiento de la levadura, y más tarde se encontró que CirA funciona como una proteína activadora GTPase (GAP) para RhoA4.

La utilidad de la pantalla supresora de levadura para esclarecer las vías del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas no se puede exagerar, y otros investigadores que intentan caracterizar las proteínas efectoras bacterianas intracelulares pueden beneficiarse en gran medida estas técnicas. Estos ensayos son de valor si las inmunoprecipitaciones y/o las pantallas híbridas de levadura dos no han encontrado un compañero de unión y pueden dilucidar qué vías son atacadas por la proteína efectora bacteriana. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la toxicidad y las pantallas supresoras para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas intracelulares, así como algunos de los obstáculos comunes experimentados al usar estos ensayos y sus soluciones correspondientes.

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Protocol

1. Preparación de medios y reactivos

NOTA: Las planchas deben prepararse antes del día del ensayo y son buenas durante 1 mes. Los medios y reactivos se pueden hacer en cualquier momento y son buenos durante 1 mes.

  1. Preparar 1 L de la solución de glucosa (10% p/v) disolviendo 100 g de D-(+)-glucosa en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Ajuste el volumen a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de almacenamiento de medios de 1 L.
  2. Preparar 1 L de la solución de galactosa (10% p/v) disolviendo 100 g de galactosa D-(+) en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Ajuste el volumen a 1 ml con agua destilada y filtre a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de almacenamiento de medios de 1.000 ml.
  3. Preparar 1 L de dextrosa de peptona de extracto de levadura (YPD) agar disolviendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de glucosa, y 20 g de agar en 1.000 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en baño de agua de 56oC hasta enfriar. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  4. Preparar 1 L de caldo YPD disolviendo 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona y 20 g de glucosa en 1.000 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min.
  5. Preparar el uracilo de glucosa de deserción sintética (SD) (Ura-). Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo, y 15 g de agar en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1. Mezcle bien girando suavemente o colóquelo en el plato de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  6. Preparar el uracilo de deserción sintética (SD) (Ura-) agar galactosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo, y 15 g de agar en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de galactosa preparada en el paso 1.2. Mezcle bien girando suavemente o colóquelo en la placa de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  7. Preparar el caldo de glucosa (Ura-) de ser desechado sintético (SD). Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y 1,9 g de suplemento de abandono sin uracilo en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, añadir 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1.
  8. Preparar el uracilo de deserción sintética (SD) (Ura-) leucina (Leu-) agar glucosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de la base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina y triptófano; 15 g de agar; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  9. Preparar el uracilo de abandono sintético (SD) (Ura-) leucina (Leu-) agar galactosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina y triptófano; 15 g de agar; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56oC hasta que la temperatura sea de 50 a 60 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de galactosa preparada en el paso 1.2. Mezcle bien girando suavemente o colocando en un plato de agitación. Vierta en placas de 100 mm utilizando 20 ml de soporte por placa.
  10. Preparar el uracilo de abandono sintético (SD) (Ura-) leucina (Leu-) caldo de glucosa. Para 1 L, disolver 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos; 1.9 g de suplemento de abandono sin uracilo, leucina, triptófano; y 0,076 g de triptófano en 800 ml de agua destilada. Autoclave durante 20 min y enfriar en un baño de agua de 56 o 60 oC hasta que la temperatura sea de 50 oC. Utilizando una pipeta serológica de 50 ml o un cilindro graduado estéril, agregue 200 ml de la solución de glucosa preparada en el paso 1.1.
  11. Preparar la solución de polietilenglicol (PEG). Añadir 50% p/v de polietilenglicol 3350 en agua destilada. Esterilice mediante autoclave.
  12. Preparar 1 M de acetato de litio (LiAc) disolviendo 10,2 g de acetato de litio deshidratado en 200 ml de agua destilada. Esterilice mediante autoclave.
  13. Preparen ADN esperma arenque. Diluir el ADN esperal de 10 mg/ml de arenque a 2 mg/ml utilizando agua destilada. Calentar a 100 oC durante 5 min y colocar inmediatamente sobre hielo durante 5 min.

2. Clonación del gen de interés en el plásmido de toxicidad por levaduras pYesNTA-Kan

NOTA: Actualmente, existen vectores de toxicidad por levaduras de variedad disponibles tanto comercial como académicamente. La pantalla supresora de levadura se puede utilizar junto con muchos de estos vectores siempre que el plásmido que expresa la proteína efector de interés utiliza una selección de deserción que no sea uracilo y un marcador antibiótico distinto de BlaR. Este trabajo utilizó un vector pYesNTA modificado4,5 que incluye un casete de resistencia a la kanamicina para un cribado más fácil para posibles supresores. El esquema de clonación debe permitir que la proteína del efector esté en marcada con el promotor De y His-Tag. La proteína de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis CT229 se utilizó como prueba de principio para estos ensayos.

  1. Utilice PCR para amplificar CT229 de C. trachomatis GENómico DNA siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando las imprimaciones CT229 +1 Kpn F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) y CT229 XhoI R (CCCTCGAGTTTTTTACGGGATGCC). Utilice las siguientes condiciones de PCR: (1) 98 oC durante 30 s; (2) 98 oC para 10 s, 55 oC para 30 s, 72 oC durante 2 min; (3) repita el paso 2 para un total de 25x; (4) 72 oC durante 10 min; y (5) 4 oC de retención.
  2. Analizar 5 l del producto PCR en un gel de agarosa del 1%(Figura 1).
  3. Purificar los 45 s de ADN restantes utilizando un kit de purificación de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Digerir los 50 s de inserto de PCR purificado y pYesNTA-Kan(Figura 2) durante 1 h a 37 oC en un baño de agua utilizando KpnI-HF y XhoI-HF.
    NOTA: Para pYesNTA-Kan, digerir 5 g de plásmido utilizando 5 ml de KpnI-HF, 5 ml de XhoI-HF y 6 l de tampón en un volumen total de 60 l. Para la plaquita, digerir la totalidad de 50 ml del producto PCR purificado utilizando 2 ml de KpnI-HF, 2 ml de XhoI-HF y 6 ml de tampón.
  5. Ejecuta todo el digerido plásmido en un gel de agarosa del 1%. Realizar la purificación del plásmido digerido utilizando un kit de extracción de gel siguiendo las instrucciones del fabricante.
  6. Purificar el inserto de PCR digerido usando un kit de purificación de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Clonar la plaquita en pYesNTA-Kan utilizando 2 l de pYesNTA-Kan (paso 2.5), 2 ml de tampón de ligadosa de ADN, 1 l de ligatasa T4 y 15 ml de inserción (paso 2.6). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  8. Añadir toda la reacción de clonación a 50 s de células competentes de E. coli y realizar la reacción de transformación.
  9. Placar toda la reacción de transformación en una placa LB que contiene 100 g/ml de carbenicilina.
  10. Inocular 10 ml de la LB que contiene 100 g/ml de carbenicilina con tres colonias individuales. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 150 rpm.
  11. Aísle el plásmido utilizando un kit miniprep plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante.
  12. Secuenciar los plásmidos aislados utilizando imprimaciones específicas de genes (paso 2.1).

3. Probar la proteína de interés para la toxicidad en la levadura

  1. Racha Saccharomyces cerevisiae W303 en el agar YPD (paso 1.3) para obtener colonias aisladas. Incubar a 30oC durante 24 h.
  2. Inocular 10 ml de caldo YPD (paso 1.4) con una sola colonia de la placa de agar (paso 3.1). Incubar a 30oC con agitación a 150 rpm durante la noche.
  3. Añadir 0,5 ml del cultivo nocturno a 10 ml de caldo YPD (paso 1.4) e incubar a 30oC con agitación a 150 rpm durante 4 h.
    1. Pellet los 10 ml de cultivo a 3.000 x g durante 10 min a 4oC.
    2. Resuspenda el pellet en 1 ml de agua estéril, transfiera al tubo de microcentrífuga y el pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    3. Resuspenda el pellet en 1 ml de acetato de litio de 1 mM (LiAc) y pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    4. Repita el LiAc wash 2x.
    5. Retire el lavado. Resuspender el pellet en 2,4 ml de 50% PEG 3350. Añadir 360 ml de 1M de LiAc, 500 ml de 2 mg/ml de ADN espermés de arenque y 400 l de agua estéril.
      NOTA: Esto es suficiente para 20 transformaciones.
    6. Añadir 180 l de la mezcla de transformación del paso 3.3.5 a un tubo de microcentrífuga que contenga 5 ml de ADN plásmido pYesNTA-Kan CT229 (100-500 ng) del paso 2.12.
    7. Incubar en un baño de agua a 30oC durante 30 min.
    8. Incubar en un baño de agua a 42oC durante 30 min.
    9. Pellet a 3.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
    10. Retire la mezcla de transformación con la pipeta. Resuspenda el gránulo en 100 ml de agua estéril. Placa de la transformación en SD Ura- agar con glucosa (paso 1.5).
    11. Incubar placas a 30oC durante 48 h.
  4. Inocular 5 ml de SD Ura- caldo que contiene glucosa (paso 1.7) con una sola colonia de la placa. Incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm. Incluir levadura transformada con el vector solo como un control negativo.
    1. Añadir 180 l de agua estéril a 5 pocillos de una placa de 96 pocillos (A2-A6).
    2. Vortex el cultivo de la noche para mezclar.
    3. Añadir 180 l de levadura al primer pozo (A1). Diluir en serie 1:10 (seis muestras en total, incluidas las sin diluir).
    4. Usando una pipeta multicanal, detecte 5 ml de cada dilución en las placas de agar SD Ura- glucosa (paso 1.5) y Ura- galactosa (paso 1.6). Incubar a 30oC durante 48 h.
  5. Evaluar la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efector de interés cultivada en los medios que contienen galactosa con el crecimiento de la levadura expresando el vector solo.
  6. Confirme la expresión de la proteína de fusión His-tag por western blotting.

4. Transformar la levadura tóxica con la biblioteca genómica de levaduras

  1. Inocular 100 ml de SD Ura- caldo de glucosa (paso 1.7) utilizando 1 ml del stock del paso 3.4. Incubar durante 16 x 24 h a 30oC con agitación a 150 rpm. Colocar 900 ml de SD Ura- caldo de glucosa a 30 oC durante la noche para precalentar los medios.
  2. Agregue los 100 ml completos del cultivo nocturno al matraz de 1 L precalentado. Incubar durante 4 x 5 h a 30oC con agitación a 150 rpm.
    1. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 10 min a 4oC.
    2. Descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet en 250 ml de agua estéril. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 5 min a 4oC.
    3. Descarta el sobrenadante. Resuspender el pellet en 250 ml de 1 mM de LiAc. Pellet el cultivo a 6.000 x g durante 5 min a 4oC.
    4. Retire El LiAc y resuspenda el pellet en 9,6 ml de 50% PEG 3350. Añadir 1,44 ml de 1M LiAc, 2 ml de ADN esperequino de arenque de 2 mg/ml, 50 g de la biblioteca genómica pYep13 (ATCC 37323). Ajuste el volumen a 15 ml con agua estéril. Mezclar suavemente por inversión.
    5. Incubar en un baño de agua a 30oC durante 30 min.
    6. Añadir 750 l de dimetil sulfóxido (DMSO) para mejorar la eficiencia de transformación. Incubar en un baño de agua a 42oC durante 30 min. Mezclar por inversión suave cada 10 min.
    7. Pellet la levadura a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de agua estéril. Pellet a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    9. Resuspender el pellet en 8 ml de agua estéril.
    10. Para determinar la eficiencia de transformación, diluir 1:10 y placa 100 l de cada dilución en SD Ura- Leu- agar glucosa (paso 1.8).
    11. Placa 200 l de la muestra en placas SD Ura- Leu- agar galactosa (paso 1.9). Utilice 50 placas en total.
    12. Incubar a 30oC durante 48 o 96 h o hasta que aparezcan las colonias.
      NOTA: Las colonias generalmente aparecen en placas de agar glucosa a 48-72 h y placas de agar galactosa a 72-96 h.
  3. Colonias de parches (posibles rescates) en SD Ura- Leu- agar galactosa (paso 1.9) para expandir y hacer stock. Incubar a 30oC durante 24oC 48h.
  4. Inocular 5 ml de SD Ura- Leu- caldo de glucosa (paso 1.10) utilizando la parte del parche. Incubar durante la noche a 26oC con agitación a 150 rpm.
    1. Añadir 180 l de agua estéril a 5 pocillos de una placa de 96 pocillos (A2-A6).
    2. Vortex el cultivo de la noche para mezclar.
    3. Añadir 180 l de levadura al primer pozo (A1). Diluir en serie 1:10 (seis muestras en total, incluidas las sin diluir).
    4. Usando una pipeta multicanal, detecte 5 ml de cada dilución en SD Ura- glucosa y SD Ura- placas de agar galactosa. Incluya el efector tóxico solo como control.
    5. Incubar a 30oC durante 48 h.
  5. Compare el crecimiento de la levadura expresando el efector tóxico solo con la levadura que contiene los supresores potenciales. Proceder únicamente con supresores potenciales que tienen toxicidad disminuida en comparación con la levadura que expresa el efector solo.

5. Identificar y confirmar los supresores

  1. Inocular 5 ml de SD Ura- Leu- caldo de glucosa (paso 1.10) con 100 ml de levadura del paso 4.4 e incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm.
    1. Pellet la levadura a 3.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Deseche suavemente el sobrenadante con una pipeta.
    2. Aísle el plásmido con un kit miniprep de plásmido de levadura siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Transforme el plásmido aislado en las células competentes de E. coli y placa toda la transformación en el agar LB con 100 g/ml de carbenicilina. Incubar a 37oC durante 24 h.
  3. Inocular 10 ml de caldo LB que contenga 100 g/ml de carbenicilina, con tres colonias de la placa e incubar a 37oC durante la noche con agitación a 150 rpm.
    1. Cultivos de pellets a 3.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Aísle el plásmido utilizando un kit miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Retransforme la levadura tóxica con los plásmidos aislados del paso 5.3.1 siguiendo los pasos de la parte 3 del protocolo.
    1. Inocular 5 mL de SD Ura- Leu- caldo de glucosa con una colonia de la placa de transformación. Incubar durante la noche a 30oC con agitación a 150 rpm.
    2. Spot on Ura- Leu- agar glucosa y galactosa para confirmar la supresión de la toxicidad.
  5. Secuencia utilizando imprimaciones pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) y pYep13 R (TGATGCCCCCCACGATGC) para identificar ORFs de levadura.

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Representative Results

Antes de que se pueda realizar la pantalla supresora de levadura real, la proteína efector de interés debe ser probada para la toxicidad en la levadura. Esto se logra expresando la proteína de interés en la levadura bajo el control de un promotor inducible de galactosa. El crecimiento de la glucosa (condiciones no inductivas) debe compararse primero para garantizar que la toxicidad se deba específicamente a la expresión de la proteína de interés y no sea un defecto general. Como se muestra en la Figura 3,la toxicidad se manifiesta como colonias más pequeñas y/o crecimiento reducido. Una disminución de 2 o 3 registros en el crecimiento de levadura es ideal para las pantallas supresoras de levadura.

Como se muestra en la Figura 4,la pantalla de toxicidad y supresor se puede realizar en ocho pasos utilizando los métodos descritos en la sección de protocolo. El gen de interés se clona en un vector adecuado1,y las construcciones resultantes se transforman en levadura para evaluar la toxicidad. Este estudio utilizó CT229 como el gen de interés y pYesNTA-Kan como vector. Además, la expresión de la proteína de fusión His-tagged fue confirmada por la hincha occidental. Idealmente, se debe observar una reducción de 2 o 3 log en levaduras cultivadas en medios que contienen galactosa. Si la proteína de interés es tóxica para la levadura(Figura 3 y Figura 4), la pantalla supresora se puede llevar a cabo transformando la cepa tóxica con la biblioteca genómica de levadura pYep13. Los transformadores se enchapan en agar glucosa para determinar la eficiencia de transformación y el agar galactosa para identificar posibles supresores. Usando este protocolo, se logró una eficiencia de transformación mínima de 5 x 105 con un total de 10 a 250 colonias en agar galactosa. Parcheo de estas colonias en SD Ura- Leu- agar galactosa (Figura 4) ayudó en la identificación de verdaderos supresores, porque muchos falsos positivos no crecerán cuando se parchean. Aquí, se aplicaron parches a 50 colonias y se obtuvieron ocho clones que suprimieron la toxicidad del efector(Figura 4). Supresores de detección en SD Ura- Leu- agar galactosa se hizo para confirmar la supresión de la toxicidad. Como se muestra en la Figura 4,pSup1 y pSup 2 suprimieron la toxicidad de la proteína del efector, mientras que pSup3 no lo hizo. Por lo tanto, pSup3 se descartó. Los plásmidos fueron posteriormente aislados de los supresores y transformados en E. coli para aumentar el rendimiento del plásmido. El plásmido puede entonces ser retransformado en la levadura tóxica para confirmar que el plásmido aislado definitivamente suprime la toxicidad del efector(Figura 4). Mientras que la mayoría de los plásmidos aislados deben rescatar la toxicidad, ocasionalmente se obtiene un plásmido que no suprime la toxicidad cuando se transforma en la cepa de levadura tóxica. Estos plásmidos se descartan, y sólo deben secuenciarse aquellos que suprimen la toxicidad tras la retransformación.

El plásmido aislado contendrá múltiples ORFs de levadura4. Para identificar cuál es el verdadero supresor, cada ORF puede ser clonado individualmente y expresado en la cepa de levadura tóxica como se describió anteriormente1,2,3,4.

Figure 1
Figura 1: Amplificación pcR del gen objetivo. CT229 de Chlamydia trachomatis serovar L2 fue PCR amplificado a partir de ADN genómico. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa del 1% teñido con bromuro de etidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: mapa plásmido pYesNTA-Kan. El gen objetivo de interés se clonó en el sitio de clonación múltiple (MCS) de pYesNTA-Kan. Kanamycin se utilizó para la selección en E. coli y la deserción de uracil se utilizó para la selección en S. cerevisiae. La expresión de la proteína de fusión con etiquetas His fue verificada por la hincha occidental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos de toxicidad por levaduras. Las proteínas efectoras de interés se clonaron en pYesNTA-Kan. Los plásmidos verificados por secuencia se transformaron en S. cerevisiae y los transformadores se diluyeron en serie y se detectaron en Ura- glucosa y agar de galactosa para evaluar la toxicidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Visión general de la pantalla supresora de levadura. El gen objetivo de interés se clonó en pYesNTA-Kan y los plásmidos se transformaron en S. cerevisiae. Los transformadores se diluyeron en serie y se detectaron en Ura- agar glucosa y galactosa para evaluar la toxicidad. Para identificar la vía a la que apunta la proteína efector tóxico, la cepa de levadura que expresa la proteína tóxica se transformó con una biblioteca genómica de levadura. Las colonias fueron parcheadas en Ura- Leu- agar galactosa y manchadas para evaluar la toxicidad. Los plásmidos se aislaron de aquellos que suprimen la toxicidad de la proteína efector. Los plásmidos se transformaron en la cepa de levadura tóxica para confirmar que el plásmido aislado es un supresor. Los plásmidos de los supresores se secuenciaron para identificar los ORF de levadura presentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe los procedimientos paso a paso para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas utilizando una pantalla de toxicidad y supresor de levadura modificada. La cepa de levadura utilizada, S. cerevisiae W303, es auxotravófica tanto para uracilo como para leucina. La auxotrofia Uracil de la cepa se utiliza para seleccionar levaduras portadoras de la proteína de interés en el vector pYesNTA-Kan, mientras que la auxotrofia de leucina se utiliza para seleccionar para el vector de la biblioteca genómica de levadura pYep13. Los plásmidos de la biblioteca genómica de levadura llevan 3 a 13 ORF, por lo que cada ORF debe clonarse individualmente en el vector p415-ADH6 o un vector similar y retransformarse en la levadura tóxica para identificar cuál es el verdadero supresor. Es típico identificar varios supresores que representan una vía biológica huésped. Los supresores a veces pueden ser socios de unión directa de la proteína bacteriana de interés, pero no siempre.

Generar clones de levadura que llevan la proteína bacteriana de interés en pYesNTA-Kan es el primer paso importante y se debe tener mucho cuidado para preservar la integridad de estos clones tan pronto como sea posible porque hay una fuerte selección negativa para la levadura que transporta tóxicos proteínas, incluso sin inducción intencional de galactosa, y pueden perder el plásmido. Ocasionalmente hay pérdida de plásmido incluso cuando la levadura se mantiene bajo selección en medios de abandono. Se ha notificado previamente un método para disminuir la aparición de pérdida de plásmido mediante la linealización del vector e integración dentro del genoma de levadura1.

Un inconveniente importante de estas técnicas es que la pantalla supresora sólo produce datos significativos si la sobreexpresión de la proteína efector bacteriana desencadena un defecto de crecimiento observable y consistente en la levadura. La dificultad principal en este método es cuando no se identifican supresores. Es difícil determinar si una falla en la identificación de los supresores se debe a razones biológicas o problemas técnicos. Desde una perspectiva biológica, podría haber varias causas: la proteína de interés podría ser tan tóxica que las proteínas de la biblioteca genómica no son capaces de suprimir significativamente la toxicidad, la vía objetivo puede ser incapaz de rescate, o numerosas co-expresadas factores pueden ser necesarios para superar el efecto tóxico. Abordar la explicación biológica es un reto, ya que hay muchas variables indefinidas que diseccionar. Debido a que existe un protocolo establecido, explorar las explicaciones técnicas es un enfoque mucho más manejable. Desde un punto de vista técnico, una falla en la identificación de los supresores es probablemente el resultado de la baja eficiencia de transformación de la biblioteca genómica de levadura. Este protocolo utiliza la biblioteca genómica digerida parcialmente ATCC S. cerevisiae AB320 en pYEp13. Otras bibliotecas pueden ser suficientes, así como otros vectores, pero este protocolo utiliza específicamente la biblioteca ATCC y no hay estudios publicados actualmente que informen de bibliotecas alternativas o fuentes vectoriales. Se recomienda encarecidamente que la cobertura del genoma de la levadura sea de al menos 10 veces, o que la subrepresentación pueda obstaculizar la identificación de los supresores. La disminución de la eficiencia de transformación puede reducir estos números por debajo de 1x. Por lo tanto, partes del genoma de la levadura no pueden estar representadas en la pantalla del supresor. La baja eficiencia de transformación puede deberse a muchos problemas, incluidos los malos reactivos o la mala preparación de la biblioteca. Este método se adhiere en gran medida al método de transformación DMSO/LiAc presentado por primera vez por Hill et al.7. Se recomienda comprar y preparar el nuevo DMSO, 50% PEG y ADN esperma de arenque fresco para las transformaciones y utilizarlos exclusivamente para estos ensayos para disminuir la contaminación o degradación de la calidad de los reactivos. DMSO es altamente higroscópico y absorbe el agua de la atmósfera fácilmente. Por lo tanto, se recomienda hacer muchas alícuotas de uso individual para evitar la apertura repetida de la tapa de un recipiente y la exposición a la atmósfera. El ADN esperequino de arenque de alta calidad se puede almacenar a -20 oC y permanece apto para su uso durante varios años, aunque se debe preparar una preparación fresca a partir de la población para cada transformación. Una vez hervido y enfriado, el ADN espermeado de arenque no debe ser rehervido o reutilizado, por lo que es mejor eliminar sólo lo que se necesita y evitar hacer más de lo necesario para la transformación actual. La atención al detalle puede mejorar en gran medida la eficiencia de transformación de la levadura y mejorar las posibilidades de identificar un supresor.

Teniendo en cuenta que el vector pYep13 de levadura lleva 3 a 13 ORF de levadura diferentes, reducir el número de plásmidos falsos positivos es primordial para identificar supresores. La levadura puede tomar y albergar múltiples copias de vectores similares, mientras que la sabiduría general asociada con la incompatibilidad de plásmidos tradicionalmente dicta que E. coli sólo mantiene un tipo de plásmido con el mismo origen de replicación (ORI) a la vez, aunque no siempre es así. Esto puede convertirse en un problema importante al intentar identificar candidatos supresores. Si se identifican clones de levadura supresor, los plásmidos se extraerán y se retransformarán en E. coli para su propagación y posterior secuenciación para su identificación. Una vez que el plásmido supresor candidato ha sido aislado y retransformado en E. coli, se recomienda encarecidamente que se recojan al menos cinco colonias de E. coli para la secuenciación, porque es posible que los clones individuales diferentes plásmidos. Dado que E. coli sólo debe ser capaz de propagar un plásmido a la vez, si el aislamiento de levadura produce múltiples plásmidos, diferentes clones de E. coli en la placa deben llevar sólo uno de ellos a la vez. Por lo tanto, la selección de cinco colonias basadas en la eficiencia normal de transformación en E. coli debe mostrar si los clones llevan los mismos plásmidos o diferentes. Si surgen múltiples plásmidos después de la secuenciación de los plásmidos de E. coli,entonces cada uno debe transformarse en el clon de levadura tóxica y evaluado para el rescate del defecto de crecimiento. Además, incluso si sólo se identifica un solo plásmido supresor, se recomienda la retransformación del rigor y la reproducibilidad del plásmido en el clon tóxico.

El ensayo supresor de levadura es un experimento muy grande y el tiempo y los materiales adecuados deben planificarse en consecuencia. Este protocolo contiene muchos detalles que deben cumplirse estrictamente y se recomienda que el investigador que lleva a cabo estos ensayos lea cuidadosamente y observe el protocolo en su totalidad antes de iniciar un ensayo. Este es un procedimiento multipartito que incluye bacterias y levaduras que necesitan ser cultivadas a diferentes temperaturas. El aislamiento de plásmidos de la levadura a veces puede ser difícil debido a su pared celular resistente y el uso de DMSO ayuda a lograr una mayor eficiencia de transformación.

Una de las mayores ventajas de la pantalla de toxicidad y supresor de levadura es que el efector bacteriano no necesita unirse físicamente a los sustratos del huésped durante un tiempo apreciable para detectar la vía putativa dirigida. Sólo un pequeño puñado de estudios han reportado el uso de esta o una técnica similar1–5. Sin embargo, hay informes de técnicas que identifican las vías del huésped y muchas técnicas para detectar socios de unión de proteínas efectoras bacterianas. Kramer y otros informaron de un nuevo enfoque de biología de sistemas para identificar vías dirigidas por proteínas efectoras bacterianas8. La técnica utilizó una colección de cepas de eliminación haploide de S. cerevisiae para detectar mutantes sensibles al efector Shigella Osp4. Usando esta técnica, Osp4 se vinculó a la regulación de la señalización MAPK y la atenuación de la inmunidad innata en las células huésped. Las dos pantallas híbridas de levadura automatizadas basadas en arreglos de discos ahora pueden identificar rápidamente los socios de unión de efectos bacterianos putativos mediante el cribado de muchos al mismo tiempo contra millones de proteínas anfitrionas9. Del mismo modo, las inmunoprecipitaciones de alto rendimiento junto con la espectrometría de masas se están utilizando para identificar en masa socios de unión putativa de familias enteras de proteínas efectoras bacterianas10. Si bien muchos de estos estudios pueden acelerar el calendario de caracterización de proteínas efector, rara vez proporcionan información sobre qué procesos fisiológicos se están manipulando y cuál es el resultado holístico de estas interacciones. Por lo tanto, técnicas como la toxicidad de la levadura y la pantalla supresora son esenciales para iluminar los procesos celulares que son manipulados por estas proteínas efectoras. En algún momento, las observaciones que identifican socios de unión o vías dirigidas por proteínas efectoras bacterianas deben volver a los modelos de infección celular para determinar si estos hallazgos in vitro se mantienen en escenarios fisiológicamente relevantes. La manipulación genética de patógenos intracelulares obligatorios como C. trachomatis ha sido un obstáculo importante hasta hace poco11–15 y la generación de mutantes específicos del sitio para estudiar las proteínas efectoras no fue posible. Sin embargo, en los últimos años se ha producido una revolución en la generación de mutantes clamidiatos, complementandolos y sobreexpresando proteínas diana. Estos avances recientes han mejorado en gran medida el valor de la información derivada de estudios utilizando pantallas de toxicidad y supresores, ya que ahora es posible pasar de la levadura directamente a la infección para sondear la validez de los resultados.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Agradecemos a Shelby Andersen, Abby McCullough y Laurel Woods por su ayuda con estas técnicas. Este estudio fue financiado con fondos de startups del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Iowa a Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

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References

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Genética Número 152 proteína efectorabacteriana supresor de levadura función de proteína efector pantallas de levadura Chlamydia trachomatis,proteína de efector secretado tipo III identificación de vías
Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras
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Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

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