Summary
Elektrovåd-baserede digitale mikrofluidic er en teknik, der udnytter en spændingsdrevet ændring i den tilsyneladende kontaktvinkel af en mikroliter-volumen dråbe for at lette sin manipulation. Ved at kombinere dette med funktionaliserede magnetiske perler kan integration en af flere laboratorieenheder operationer for prøve forberedelse og identifikation af patogener ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay (ELISA).
Abstract
Elektrofugter er den virkning, hvorved kontaktvinklen på en dråbe, der udsættes for en overfladeladning, ændres. Elektrowetting-on-dielectric (EWOD) udnytter de dielektriske egenskaber af tynde isolatorfilm for at forbedre ladningstætheden og dermed øge elektrowettingeffekten. Tilstedeværelsen af ladninger resulterer i en elektrisk induceret spredning af dråbe, som tillader målrettet manipulation på tværs af en hydrofob overflade. Her demonstrerer vi EWOD-baseret protokol for prøvebehandling og påvisning af fire kategorier af antigener ved hjælp af en automatiseret overfladeaktiveringsplatform via to variationer af en Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metoder. ELISA udføres på magnetiske perler med immobiliserede primære antistoffer, som kan vælges til at målrette et bestemt antigen. Et antistof konjugeret til HRP binder sig til antigenet og blandes med H2O2/Luminol til kvantificering af de tilfangetagne patogener. Assay færdiggørelsestider på mellem 6 og 10 min blev opnået, mens små mængder af reagenser blev udnyttet.
Introduction
Den foreslåede metode har til formål at lette automatiseret prøveforberedelse til ELISA med kvantitativ påvisning af antigener ved hjælp af EWOD-baseret tilgang med digital mikrofluidik (DMF) og magnetophoretisk adskillelse. Det er blevet påvist for flere biologiske anvendelser, at DMF i kombination med magnetophoresis er et interessant alternativ til væskehåndtering applikationer1. Mere specifikt er påvisning af patogener et implicit aspekt i mange sektorer, lige fra sundhedspleje2 til landbrug og miljø3,4 til national sikkerhed5. En detektionsteknologi, der kan håndtere truslerne fra patogener, skal have et højt gennemløb (f.eks. kort analysetid), effektivitet (lav detektionsgrænse – LoD – og høj følsomhed) og specificitet (til målpatogentypen), for at den kan være funktionel6.
Tidligere, EWOD-baserede DMF er blevet gennemført med succes for Reverse Transskription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), påvisning af en antibiotika-resistent patogen (Methicillin-resistente Staphylococcus aureaus eller MRSA), M.pneumonia og C.albicans ved hjælp af et lavt budget, print-print-print-print chip og magnetophoresis7. Teknikken blev også anvendt til påvisning af deoxyribonucleic syre (DNA) mutationer gennem pyrosequencing og chemiluminescerende detektion8. EWOD-baserede platforme udvider også deres funktionalitet til immunassayapplikationer, hvilket muliggør samtidig prøvegenvinding og påvisning af alle inden for en enkelt, integreret platform. For eksempel, en enkelt EWOD-chip design blev påvist med succes med en DMF platform for point-of-care test for både perle-baserede immunassays af hjerte troponin I fra en fuldblodsprøve og som et separat eksperiment RT-PCR for MRSA påvisning2. Denne chip udnytter olie fyldstof, som forhindrer fordampning af dråberne og letter pålidelig automatiseret manipulation af nanoliter mængder. Alsidige bioapplikationer blev undersøgt med gennemførelsen af lignende DMF-tilgange, der dækker kvantitative homogene og heterogene immunassays9,10 herunder design af eksperimenter (DoE) undersøgelser for analyse parameter optimering11.
På trods af dens åbenlyse fordele ved at behandle intensivering på grund af minimale arbejdsmængder kan en oliefyldt DMF-platform være udfordrende og kræver en vis grad af ekspertise for at fungere. Oliefyldte systemer, fordi de kræver forseglet komponent, er ikke ideelle til sikker anvendelse i marken, hvor systemets transportbarhed er vigtig. Desuden ville et oliebaseret system være meget vanskeligt, hvis ikke umuligt at anvende til visse specifikke anvendelser, der udnytter indsamling af tørt materiale på en overflade som foreslået af Zhao og Cho12, Jönsson-Niedziółka et al.13og Foat et al.14. I modsætning hertil er oliefrie systemer enkle at integrere og har den fordel, at de giver nem chip-to-chip-prøveoversættelse. Af disse grunde blev den foreslåede metode udviklet til at give en EWOD-baseret immunassay på DMF, som ikke ville kræve olie, effektivt at forenkle enhedens drift.
I dette bidrag rapporterer vi om brug af en skræddersyet, fritstående, fuldt automatiseret DMF-platform til immunassays, og vi uddyber protokollen for hurtig påvisning af biomolekyler, nemlig: proteiner, vegetative bakterier, bakteriesporer og vira. Kombinationen af EWOD-chip med magnetiske partikler til automatiseret prøveforberedelse og immunudfældning er allerede blevet påvist med en yderligere off-line MS-måling15. For nylig, in-field diagnostiske mod mæslinger og røde hunde IgG er blevet påvist i fjerntliggende nordvestlige Kenyas befolkning af Wheeler gruppe16. Både Wheeler's og vores system, er transportable, selvstændig, fuldautomatisk med inkluderet on-chip, real-time chemilumineescerende målinger er velsagtens blandt de mest avancerede DMF biodetektionssystemer til rådighed.
De to systemer er designet med meget forskellige applikationer i tankerne. Wheelers system er rettet mod biomarkør for at tillade biomedicinsk diagnostik på patienter, mens vores biodetektionssystem er bygget op omkring forsvarskrav til direkte påvisning af patogen, der tidligere blev udtaget fra luft. Ligheden mellem de to er det underliggende princip om droplet aktivering, som viser den brede vifte af livspåvirkende sektorer, at EWOD-baserede teknologi kan påvirke. Nemlig, dMF-baserede detektionsplatform og tilhørende EWOD-system kunne finde vigtige konsekvenser i sundhed (biomedicinsk diagnostiske); militær og civil beskyttelse (trusselsafsløring) Landbrugsteknologi (afgrødeovervågning) og arbejdssikkerhed (kontrolleret miljøovervågning)
Udførelsen af vores DMF platform vurderes mod fuldautomatisk påvisning af humanserum albumin (HSA, en kugleformet protein), Escherichia coli (E. coli, en vegetativ bakterier), Bacillus atrophaeus (BG, en bakteriel spore) og MS2 (en bakteriofhage virus). Endnu vigtigere er, den foreslåede DMF-metode er yderst alsidig i den forstand, at fange antistoffer kunne udveksles til at målrette påvisning af andre antigener forskellig fra de fire, der betragtes i denne artikel. Sidestepping antistof-baserede sensing helt, DMF platform kunne bygge til en potentiel anvendelse baseret på aptamer biosensing, hvor de magnetiske perler bære specifikke aptamers til fangst og / eller påvisning af nukleotider. Udformningen og realiseringen af de forskellige komponenter, der udgør den integrerede, helt selvstændig DMF platform, herunder højspænding bølgeform generator og drev elektronik oplyses andetsteds6.
Protocol
1. Indledende skridt, der er nødvendige for analysen
BEMÆRK (VIGTIGT): Alle indledende trin skal udføres i et sterilt miljø for at undgå kontaminering. Natriumazid bør ikke anvendes til opbevaring, da det ville hæmme aktiviteten af det peberrodsperoxidase (HRP) enzym.
- Forbered løbebuffer (100 mM HEPES, pH 7.5), ved hjælp af (4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ethanesulfonsyre, og tilsæt Tween 80 til en koncentration på 0,01% (v/v).
- Immobilisere de primære antistoffer (opsamlingsantistoffer) på overfladen af de NHS-aktiverede magnetiske mikroperler ved at følge den protokol, som leverandøren har fremlagt. Kort sagt omfatter magnetic IP/co-IPKit(Table of Materials)protokollen følgende trin.
- Aliquot 0,2 ml perler (2 mg) i et plastrør og fjern supernatantet.
- Vask perlerne ved at tilføje 1 ml iskold 1 mM HCl.
- Bind det valgte antistof (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyklonal, Rbanti-E.coli MRE 162 polyclonal eller gede anti-MS2 polyklonal), 40 μg/ml i 67 mM Borrate Buffer, kovalent til perlerne i 1 time med omrystning ved 37 °C. Tabel 1 indeholder en liste over alle antistoffer, der anvendes sammen med den aktuelle protokol og antigenpatogenerne6.
- Vask de ubundne antistoffer to gange med 0,8 ml Elution Buffer.
- Forsnøj reaktionen med 1 ml dæmpningsbuffer i 1 time.
- Vask perlerne én gang med modificeret borratebuffer og én gang med IP Lysis/Wash Buffer.
- Ophæng perlerne i 0,5 ml IP Lysis/Wash Buffer, og opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt til brug.
BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater kobles et nyt parti mikroperler til antistofferne dagen før EWOD-isolationen og ELISA on-chip. Mikroperlerne, der er koblet til det primære antistof, kan dog opbevares ved 4 °C op til en måned. Hvis der opstår agglomeration, skal du trykke på hætteglasset for at bryde bundfaldet og suspendere perlerne i opløsningen igen. - Bloker mikroperlerne med det tilkoblede antistof natten over ved hjælp af den endelige koncentration 4 mg/ml for mikroperlerne i en Blocker Casein (1% w/v) i 100 mM fosfatbuffered saltvand (PBS).
BEMÆRK: Blokeringstrinnet udføres altid dagen før biodetektionsanalysen. - Adskil perlerne fra Blocker Casein ved hjælp af en magnet og fjern supernatantet.
- Ophæng igen i 1 ml kørebuffer og blandes i 1 min.
- Adskil perlerne ved hjælp af magneten og fjern supernatanten.
- Gentag ovenstående vasketrin (1.2.10 og 1.2.11) to gange.
BEMÆRK: Tre vasketrin er tilstrækkelige til at reducere sammenvoksningen af perlerne til overfladen og til at lette den frie bevægelighed for dråben. - Opslæm perlerne i løbebufferen igen med en koncentration på 2,5 mg/ml. Denne opløsning af mikroperler er klar til brug med EWOD-chippen.
- Der fremstilles en opløsning af neutravidin-konjugeret peberrodperoxidase (HRP) og det sekundære biotinylated antistof til en endelig koncentration for hver af 1 μg/ml i løbebuffer (anvendes til BG-detektion6).
BEMÆRK: For at målrette antigenerne (tabel 1) blev forskellige koncentrationer af sekundært biotiteret antistof, der spænder fra 0,5 til 4,0 μg/ml, testet med succes. - Bland lige store mængder af Luminol med hydrogenperoxidopløsning lige før du kører analysen
BEMÆRK: Luminol anvendes til at kvantificere antallet af bindende hændelser baseret på HRP-enzymet, der er bundet covalently til det sekundære antistof, som er rettet mod antigenet (f.eks. patogen). Men, forskellige rapportering molekyle og strategier kan bruges til påvisning17 i stedet for chemiluminescence og Luminol.
2. Fremstilling og overfladebehandling af EWOD-spånkomponenterne
BEMÆRK: EWOD-spånen består af en aktiveringsplade med mønstrede kromelektroder, der kan skifte den tilsyneladende kontaktvinkel på en dråbe og en dækplade for at definere dråbernes højde.
- Tegn designet af elektroderog stik i 2D ved hjælp af standard CAD-software. Medtag også affaldsindsamlingsblokken med dimensioner på 5 x 5 mm2 til opbevaring af de anvendte opløsningsmidler (figur 1).
BEMÆRK: For at manipulere dråberne bruger vi 47 elektroder, hver med dimensioner på 1,7 x 1,7 mm2. Denne elektrodestørrelse rummer dråbevolumener fra 1,5 μL til 3 μL (for et hul på 500 μm). 1,5 μL er, når der arbejdes med et hul på 500 μm, den mindste dråbestørrelse, der kan aktiveres. Det svarer nogenlunde til dråbe (forventet) kontur, der afgrænses til den firkantede pude. Der er dog ingen teoretisk grænse i anden størrelse end forårsaget af væskekroppens modstand (friktion). Ikke desto mindre anbefales det, at volumenikke overstiger 3 μL for pålidelig aktivering ved hjælp af et 500 μm mellemrum. Elektroderne er behandlet af 48-kanals elektronik.
BEMÆRK: Pudernes konstruktionsdimensioner og -størrelser kan variere afhængigt af de tilsigtede mængder og laboratorieenhedens operationer (LUOs), der omfatter protokollen. - Send designtegningen til en maskeproduktionstjeneste til udskrivning af krommasken på et glassubstrat. Tykkelsen af kromlaget er 100 nm.
BEMÆRK: Kromlaget på fotomasken, der bruges som underlag for EWOD-chippen, er pr. definition uigennemsigtigt. Udformningen af hver af vores elektroder omfatter et gitterlayout for at sikre semi-gennemsigtighed. - Skær pladen til størrelse 56 x 56 mm2 med en præcision CNC Terning / skæring sav.
- Stick afdækningstape over de elektriske kontakter for at isolere dem i løbet af de to belægningtrin.
- Pladens kromglasplade anlbes med et dielektrisk lag ved at deponere 6 μm Parylen-C på overfladen. Gorham-processen18 anvendes med 7,4 g DPX-C i et Parylendedepositionsystem (Materialetabel).
- Spin-coat amorfe fluorpolymerer ( Tabel overmaterialer)ved hjælp af en spin-coater ved 1500 omdrejninger i 30 s oven på pladen og bages ved 140 °C i 30 min.
BEMÆRK: Dette gør overfladen hydrofob. Man kan validere, om belægningen er blevet deponeret med succes ved at placere en dråbe vand på overfladen. Kontaktvinklen mellem dråbe og plade skal være i området 110º. - Fjern afdækningsbåndet fra de elektriske kontakter.
- Spin-coat amorfe fluorpolymerer ( Tabel overmaterialer)ved hjælp af en spin-coater ved 1500 omdrejninger i 30 s oven på 4-i silicium wafer og bage det ved 140 °C i 30 min.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at både aktuations- og dækpladernes overflader er hydrofobiske for at lette en jævn bevægelse af de diskrete dråber under analysen.
3. Lastning, samling og drift af EWOD-chippen på DMF-platformen
BEMÆRK: EWOD-spånen fungerer ved hjælp af parallelpladekonfiguration med et præcist defineret mellemrum 0,5 mm mellem aktiveringspladen og den ledende, jordede dækplade. Denne sandwichsamling er beskrevet i den aktuelle sektion.
- Fjern låget fra DMF-platformen6, og placer det på bænken.
BEMÆRK: Et mørkt Faraday burkammer er nødvendigt for at forhindre omstrejfende lys og elektromagnetisk interferens under detektionen. Der er ingen interlock på låget, derfor platformen giver os mulighed for at observere dråber bevægelse. - Anbring en ren aktiveringsplade på den roterende fase, krom opad. Pladen skal justeres med det øverste venstre hjørne af den forsænkede fase(figur 2A).
- Fastgør aktiveringspladen fra toppen ved hjælp af panelet med de 47 kontaktstifter. Dette sikrer pladen på plads og letter tilpasningen til kontaktstifterne.
- Læg 0,5 mm shim og 2 mm polymethylmethacrytat (PMMA) separator på det roterende trin for at skabe et kontrolleret mellemrum mellem aktiveringen og dækpladerne.
BEMÆRK: Eventuelt kan vægeningspapir placeres på affaldsbortskaffelsespladen, før dråberne blev formegetnde før næste trin. Som analysen skrider frem, er affaldet direkte absorberes i papiret, der kan fjernes i slutningen af analysen. - Læg dråberne på de foreslåede læsserampe(figur 1).
- Aliquot fire 2,5-μL dråber fra løbebufferen på B-, A-, R-, E-denoted puder, en dråbe på hver pude.
- Aliquot 2,5 μL Luminol:H2O2 (1:1, v/v) opløsning på d-mærket pude.
- Aliquot 2,5 μL Neutravidin konjugeret til HRP (1 μg/ml) på F-betegnet pude.
- Aliquot 2,5 μL biotinylated sekundært antistof (1 μg/ml) på den g-betegnede pude.
- Aliquot 2,5 μL mikroperler med konjugeret primært antistof (2,5 mg/ml) går ind på I-betegnet pude.
- Aliquot 2,5 μL af den ukendte prøve på C-betegnet pude.
BEMÆRK: Det foreslåede indlæsningsmønster er kun ét eksempel på et eksperimentelt layout, men belastningsmønstret kan ændres, så det passer til brugernes behov, så længe disse ændringer svarer til den sekvens, der er defineret i softwaren (Supplerende fil 1).
- Placer dækpladen på riggens overflade, ud over det runde fordybningsområde, og skub den sideværts ind i fordybningen og oven på aktiveringspladen (figur 2B).
- Sæt den permanente magnet oven på dækpladen, og fastgør den ved at skubbe de to låse (figur 2C).
- Drej etapen med 180° og undersøg visuelt, hvis de lastede dråber stadig er på plads (figur 1C).
BEMÆRK: Man skal være i stand til øjeæblet placeringen og formen af dråber gennem den gennemsigtige fase og bagsiden af aktiveringspladen(figur 2D). Analysen er klar til at køre, hvis runde dråber kunne ses på toppen af lastning elektrode puder. I tilfælde af, at en dråbe er fordrevet, kan man fjerne magneten og dækpladen, og derefter genvinde den fordrevne dråbe med en ren pipette og placere den igen på læssepladen. - Kontroller, at indlæsningspositionen for hver dråbe svarer til den programmerede aktiveringssekvens i softwaren (se Supplerende fil 1 for at få oplysninger om softwaren).
BEMÆRK: For visuelt at kunne kontrollere dråbernes position skal fotodetektoren afmonteres (figur 2D). - Placer fotodetektoren, der screenes "kan" i åbningen på den roterende scene.
BEMÆRK: Fotodetektionssystemet drejer sig om en fotodiode, som har et stort samlingsområde (10 x 10 mm2)for at maksimere lyssamlingen uden yderligere optik samt en transimpedansforstærker for at minimere støj6. Men systemet er ekstremt følsomt og kan indsamle minutter signaler. For at reducere støjniveauet blev der implementeret en række elektronikbaserede strategier (f.eks. blev fotodetektionssystemet beskyttet ved at sætte det i et Faraday-bur, et metalkabinet kendt som en screenet "dåse"). - Tilslut kablet til fotodetektoren, der er screenet "can".
BEMÆRK: Når EWOD-chippen er justeret med fotodetektoren, er DMF-platformen helt samlet og er nu klar til at fungere. - Placer låget over DMF-platformen, og start programsekvensen ved hjælp af softwaregrænsefladen, der er udviklet på University of Hertfordshire.
BEMÆRK: Yderligere software bruges til at læse og registrere luminescens fra dråbesom funktion af tid i en CSV-fil (se supplerende fil 2).- Sørg for, at den programmerede sekvens (se Supplerende fil 1)hurtige meddelelser vises på grænsefladen for at informere operatøren om, at "Luminol-dråberden er klar til at indsamle de ekstraherede magnetiske perler" eller "Detektionsfaldet er klar til at blive flyttet til detektionsstedet." I begge tilfælde skal bekræftelse fra operatøren fortsætte med sekvensen.
4. Drift i visuel tilstand (Valgfrit til optimering af protokoller)
BEMÆRK: Hvis det ønskes, for at visualisere hver dråbe-baseret operation, kan analysen betjenes ved at springe trin 3.10-3.12 og erstatte dem ved følgende operationer.
- Start programsekvensen ved hjælp af softwaregrænsefladen.
BEMÆRK: Dråbebevægelsen kan observeres under drift i visuel tilstand, hvilket er nyttigt under protokoloptimering. For det første for at kontrollere reproducerbarheden af den magnetiske separationsoperation. For eksempel, hvis mængden af anvendte perler er for lav, vil den magnetiske adskillelse ikke forekomme, vice versa, hvis mængden af perler er for høj, kan dråben blive immobiliseret af perlepellet. For det andet, at fastslå pålideligheden af en ny analyse som nogle dråbe formulering kan forårsage aktivering værdiforringelse, der kan påvises ved observation. - Monter fotodetektoren screenet "kan" ind i slidsen på den roterende fase, når du bliver bedt om det.
- Tilslut kablet til fotodetektoren, der screenes "kan", ved at indsætte stifterne i stikkontakten.
- Placer låget over DMF-platformen, og fortsæt analysen.
BEMÆRK: Brug den ekstra software til at læse og registrere luminescens fra dråbesom funktion af tid i en CSV-fil (se Supplerende fil 2)
5. Fjernelse af flydende affald og rengøring af spån
FORSIGTIG: Sørg for, at udstyret er slukket og frakoblet strømkilder (computer, hoved) før rengøring. Bær handsker, en laboratoriekittel og beskyttelsesbriller beskyttelsesglas (PPE), når du fjerner biologiske prøver fra chippen!
- For at få adgang til elektroderne og de anvendte opløsningsmidler på aktiveringspladen skal du åbne DMF-perronlåget og rotere fase 180°.
- Tag magnethuset af, fjern magneten fra den roterende scene, og placer den på bænken.
- Fjern dækpladen, siliciumwaferen, fra slidsen med et par pincet, skyl den med DI-vand, tør den med trykluft og læg den i en petriskål, hvor waferen kan opbevares og genbruges.
- Brug en mikropipette til at flytte det flydende affald fra puden uden at røre overfladen.
- Rengør overfladen ved at transportere væsken af aktiveringspladen ved hjælp af absorberende papir (filtermateriale).
BEMÆRK: At holde overfladen intakt vil øge levetiden af aktiveringspladen, der tillader flere anvendelser. - Rengør aktiveringspladen ved forsigtigt at feje elektrodernes overflade med en ren DI-vanddråbe ved hjælp af en ren pipette. Fjern derefter dråben med vægepapir (filtermateriale).
FORSIGTIG: Bortskaf væv, papir, pipetter og handsker, der er forurenet med biologisk materiale, i skraldespanden. - Brug aktiveringspladen til en anden analyse, eller fjern den fra DMF-platformen til opbevaring eller genbrug.
Representative Results
Aktiveringspændingspåvirkning blev undersøgt for at belyse, hvad de optimale forhold var for at udføre analyserne. En dråbe fra bufferen blev kørt ved forskellige aktiveringsspændinger, og dens bevægelse blev registreret. Resultaterne viste (figur 3) en korrelation mellem den gennemsnitlige kvadrataktiverende spænding (Vrms)og den gennemsnitlige hastighed. En aktiveringsplades levetid blev imidlertid reduceret, da der blev anvendt høje værdier for Vrms. Baseret på disse resultater blev 105 Vrms valgt som standardaktiveringsspænding, 120 Vrms viste sig at fungere bedst for H2O2/Luminol-dråberden og 165 Vrms blev implementeret til ekstraktionsLUO. Disse spændinger indgik i den automatiserede programmeringssekvens (supplerende fil 1).
To immunassays (figur 4) blev testet med succes ved hjælp af EWOD-chippen med DMF-platformen til fire forskellige patogener (tabel 1). EWOD-chippen lettede den fortløbende bevægelse af dråberne fra læsseramperne til blandeområdet og til sidst til affaldet. Der var to grundlæggende LUOs, der blev gentaget i hele protokollen for at fuldføre ELISA. Den første var ekstraktionen LUO; kort beskrevet her, droplet indeholder de suspenderede perler blev kørt til adskillelse site i midten af blandingzone, magneten blev aktiveret automatisk at nærme sig chippen og samle de magnetiske perler i en pellet (Figur 5). Dernæst blev dråbefaldet flyttet mod affaldspuden, hvilket efterlod perlerne på aktiveringspladen og afsluttede dermed ekstraktionen LUO. Blanding var den næste nøgle LUO, der fandt sted på EWOD-chippen. Analysanden med en ukendt koncentration af patogener blev flyttet over på perlerne ved at elektrowetting. Derefter blev perlerne ophængt ved at flytte dråbelet med de klumpede perler over blandeområdet (10 puder i alt). Disse to LUOs var afgørende, da de lettede en miniaturiseret, hurtig og reproducerbar prøvebehandling med på hinanden følgende påvisning af patogenerne i 6 til 10 min. Figur 6 viser den komplette sekvens af LUOs fra en immunassay udført med EWOD-chippen.
For at opfylde de ønskede automatiseringsniveauer kunne der indføres variationer i protokollen. For eksempel blev perlerne adskilt fra den antigenudtømte dråbe, som derefter blev overført til affaldspuden, og gentog den grundlæggende ekstraktionsLUO. På dette stadium kan protokollen forgrene sig afhængigt af, om detektionsantistoffet allerede blev konjugeret over for HRP, og som i alt effektivt anvender otte LUOs til påvisning af de forskellige antigener (figur 7A-C). I disse tilfælde blev dråbelet med detektionsantistoffet bragt til perlerne og derefter blandet ved aktivering. Alternativt kan detekteringsantistoffet bindes til konjugatet Neutravidin-HRP fortløbende på EWOD-chippen, da det blev påvist til kvantificering af E. coli (figur 7D). Begge protokoller, den otte- og titrins ELISA (figur 4),gav reproducerbar påvisning af antigener.
Inkubationstider og konjugatkoncentrationer blev varieret for på forsøgsvis at finde de optimale betingelser for analysen (figur 7A). Det konstateredes, at inkubationstiden på 160 s og konjugatkoncentrationen på 2 μg/ml opnåede det bedste signal-til-støjforhold med en 36% forøgelse af signalstyrken og stort set ingen ændring i baggrundsstøjniveauet. Alle de tal og data , der blev anvendt i sektionen for repræsentative resultater , blev ændret fra et tidligere værk6.
| Primær / Capture antistof | Detektionsantistof | Antigen |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241) | Hest Radisk Peroxidase (HRP) mærkede anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438) | Human Serum Albumin (HSA, Abcam) |
| Rb anti-BG polyklonale | Biotinylated Rb anti-BG polyklonale | B. globigii (BG) sporer |
| Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal | Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE polyklonal | E. coli MRE 162 |
| Ged anti-MS2 polyklonal | Biotinylated Rb anti-MS2 polyklonal | MS2 bakteriofage virus |
Tabel 1: Antigener og antistoffer, der er testet med denne protokol. Der blev anvendt fire typer patogenantigener til at demonstrere EWOD-chippens egenskaber med DMF-platformen.
Figur 1: Design af EWOD-pladen. (a) Skematisk notation af EWOD-aktiveringspladen med stik (firkanter, top), der er forbundet (linjer) med elektroderne (firkanter, bund). Hver blok tildeles et nummer og kan behandles fra softwarekoden (Supplerende fil 1). De læsseelektrodepuder er markeret med pile og betegnes med et stort bogstav over eller under hver pude. Et centralt element for DMF-platformen er blandingszonen bestående af ti puder (nr. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Som en visuel vejledning er blandingszonen markeret med et rødt rektangel. b) Mikrograf af pudernes mikrogitterdesign. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Komponenter og nøglefaser for den digitale mikrofluidiske system (DMF) samling. (A) Fastgør EWOD-aktiveringspladen, anbring shim'et på den roterende fase, og lad dråberne blive ladt. (B) Placer dækpladen. C) Monter magnetkabinettet, fastgør låsene, og drej trin180°. (D) Den automatiserede magnet peger nedad. Undersøg placeringen og formen af dråberne, kontroller, at printkort (PCB) stifter er justeret med kontakterne på EWOD-chippen, tilslut fotodetektoren og placer den i fotodetektorstikket. Når du har tilsluttet styreelektronikken til en computer, er systemet klar til at køre analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gentagen brug af aktiveringspladerne og indvirkningen på aktiveringsspændingen. Den gennemsnitlige hastighed for et slip fra løbebufferen afbildes som funktion af aktiveringsspændingen (blå cirkler) og standardafvigelsen fra tre uafhængige målinger (N = 3). Her indikerer antallet af analyser pr. plade (grå bjælker) øget forfald af overfladen ved højere spændinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Diagram over de immunassays, der er testet med EWOD. Hver cirkel i dette diagram repræsenterer et volumen på 2,5 μL, der er indlæst på EWOD-chippen. Den første protokol (til venstre) viser otte LUOs ved hjælp af forblandet antistof-HRP konjugat; mens den anden protokol omfatter ti LUOs, separat tilsætning af det biotonerede detektionsantistof, perleekstraktion og på hinanden følgende binding af Neutravidin-HRP-konjugat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Magnetisk perleudsugning. Denne proces er opdelt i (a-c) aktivering af dråbemed de suspenderede magnetiske perler til den magnetiske adskillelse site i midten af blandezonen (pad Nr. 33), (d, e) magneten bevæger sig i position med fokus perlerne, (f, g, h) perler holdes på plads af den magnetiske kraft, mens dråbeer aktiveres væk af EWOD mod affaldspuden (pad nr. 41). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Komplet immunassaysekvens ved hjælp af EWOD, der viser reagenserne, prøvelastningen og laboratorieenhedens operationer. Hver række indeholder en sekvens af prøvebilleder fra de karakteristiske handlinger på en dråbe. Operationerne er opdelt i kolonner. Blanding udføres ikke for perlerne i suspension, præsenteret af en sort brudt linje. Dråberetninger er angivet med blå pile, perlerne er fremhævet i et af billederne af en orange pil. Den grå boks (nederste højre hjørne) adskiller de to billeder, der repræsenterer bevægelse og position i detektionsområdet, den brudte cirkel fremhæver detektionsområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Kalibreringskurver fra immunassays udført på EWOD-chip med DMF-platformen. Som tidligere rapporteret6 er udgangsspændingerne (mV) versus koncentrationer vist for: (A) Human serum albumin, anvendes til at undersøge virkningen af konjugatantistofkoncentrationen [C] og inkubationstiden, tinc, målt fra blanding af perlerne med kendt analysand til ekstraktionluoen, (B) B. atrophaeus (BG), der viser immunoassayens reproducerbarhed, (C) MS2 bakteriopimmunassay og (D) ten-LUOs-protokolresultaterne for E. coli. Forkortelser: kolonidannende enheder (cfu), plaque-dannende enheder (pfu), antal uafhængige forsøg (N), laboratorieenhed operation (LUO). Figur ændret fra tidligere publikation6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Komplet sekvens til at køre DMF platform for automatiseret ELISA assay med Neutravidin-HRP som konjugat. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende fil 2: GUI for chemiluminescensmålingen og et eksempel fra en måling med softwaren vises. Klik her for at hente denne fil.
Discussion
EWOD-immunassayprotokollen er fleksibel og kan omfatte et forskelligt antal laboratorieenheders operationer (f.eks. opsamlingsantigen, blanding, inkubation, perleekstraktion, vask) afhængigt af reagenstype, stabilitet og brugskrav, der er defineret i analyseprotokollen. Som et principbevis overvejes to immunoassayprotokoller i den nuværende artikel, der viser gennemførelsen af otte eller ti LUOs(figur 4) med den beskrevne EWOD-chip. En sådan miniaturisering fortjener mikroliter, diskrete mængder reagenser/analysand, der øger ELISA's effektivitet ved at reducere både forbruget af reagenser, den tid, der kræves pr. operation, i det væsentlige den samlede forsøgstid (6 til 10 min). Endvidere, analysen er automatiseret med tidsberegnet manipulation af dråberne, som nedsætter variationer og forbedrer præcisionen af immunassay17. I sit nuværende format indebærer eksperimentet manuel håndtering af dråber i begyndelsen af hver analyse, hvilket er et punkt for yderligere diskussion i næste afsnit.
Et kritisk skridt i den nuværende DMF metode er at dispensere dråberne på overfladen af EWOD chip. Typisk bruges en mikropipette med engangsspids til at måle den nøjagtige volumen og indlæse den. Det kan dog blive en udfordring at immobilisere dråben på den hydrofobe overflade af aktiveringspladen på grund af interaktioner mellem dråbeog den ladede overflade af engangsspidsen. Som et resultat, kan dråbe skyde op efter den ydre overflade af spidsen i stedet for at forblive på pladen. For at undgå dette skal mikropipette holdes i opretstående stilling, vinkelret på spånoverfladen uden at røre ved den, og derefter kan dråben dispenseres på læsserampen ved at bringe den i kontakt med overfladen. Hvis dråbepinden klæber til pipettespidsen, skal du returnere den til børsløsningen, udskifte spidsen og gendeponere en frisk dråbe. I en videreudvikling af det nuværende proof-of-concept-system kan der overvejes automatisk levering af dråbe.
Et andet kritisk skridt, før du kører analysen, er at lukke låget af den parallelle plade samling. Som tidligere nævnt i protokollen skal låget skubbes oven på aktiveringspladen. Lågets hydrofobe overflade forhindrer forvrængning og forskydning af de dråber, der sidder på aktiveringspladen. For at sikre en jævn bevægelse af dråben anbefales det på det kraftigste at bruge uberørt aktiveringsplade, korrekt belastning af dråberne og spånsamlingen. Det er muligt at genbruge aktiveringspladerne. Antallet af cyklusser afhænger dog af aktiveringsspændingerne (figur 3) og analytten/reagensen, der aflejres på overfladen, også kaldet biofouling. Den præsenterede platform udnyttede kromtrykt EWOD-chip, som kunne genbruges pålideligt til på hinanden følgende målinger op til fire gange ved driftsspænding på 120 V og mellemliggende pladerensning efter hvert eksperiment. Pladerne blev genbrugt for at reducere omkostningerne pr. forsøg ved at dekontaminere (børste overfladen med ufortyndet rengøringsmiddel før grundigskylning) de biofouled amorfe fluorpolymerer (Materialetabel)belægning og spin-belægning en frisk oven på pladen. Genvindingspladegenbrug kræver dog manuel håndtering, dyre reagenser (amorfe fluorpolymerer (materialetabel))og specialiseret udstyr (spin-coater). Alternative EWOD-chips undersøges med succes med omkostningseffektive underlag såsom papir19, acetatfilm eller trykte kredsløb (PCB)20,21. Sådanne engangsforbrugsstoffer kan lette pålidelig og økonomisk overkommelig brug af DMF-platformen og kan give midler til at omgå biofouling-problemet.
Biofouling er den vigtigste begrænsning af EWOD for biologiske anvendelser22,23. Tidligere undersøgelser af DMF har identificeret to mekanismer, der bidrager til biofouling, nemlig passiv adsorption på grund af hydrofobe interaktioner, og en elektrostatisk drevet adsorption manifesterer sig, når et elektrisk felt anvendes24. Resultaterne i den aktuelle artikel er i overensstemmelse med denne teori, da det blev dokumenteret aktivering plade genanvendelighed falder ved høj aktivering spændinger. En mulig forklaring er, at proteiner adsorb let på Fluoropolymer-belagte (Teflon-lignende) overflader, og de samles hurtigere på fouled i forhold til uberørte overflader24. Som følge heraf er proteinrelaterede analyser på DMF svære at kvantificere og kan opleve tab af analysand, krydskontaminering og formindsket præcision17. Det værst tænkelige scenario er, når en kritisk mængde af protein adsorber dermed gøre enheden ubrugelig. For at minimere biofouling, forskellige tilgange er blevet undersøgt fra at minimere opholdstiden for dråben på chippen, gennem belægninger23,til tilsætningsstoffer (dvs. overfladeaktive stoffer eller pluroonsyre) i biomateriale-laden dråber6,22. Derfor et vigtigt aspekt af immunassay assay på EWOD er at vælge anti-biofouling strategier, der er forenelige med den specifikke protokol ved hånden.
Den automatiserede DMF-platform er designet til at udføre en enkelt sandwich ELISA-test pr. kørsel, mens der anvendes mikrolitervolumen til både reagenser og analysand. Når det er påkrævet, findes konventionelle sandwich ELISA kits baseret på forbelagte 96-brønd eller 384-brøndplader, der i kombination med hjælpelaboratorieudstyr resulterer i højere gennemløb pr. kørsel; baseret på reagenspris, er de omtrentlige omkostninger pr. analyse/brønd 6,04 USD (580 USD/96) og 0,33 USD (2×580 USD/384). Dette gør de konventionelle ELISA-metoder ideelle til et stort antal prøver, der typisk behandles af uddannet teknisk personale på centraliserede laboratoriefaciliteter. På fjerntliggende steder viste elisa's detaljerede omkostningsanalyse for miljøovervågning imidlertid, at da kapitalomkostningerne (dvs. laboratoriedriftsomkostninger, tilbagevendende omkostninger, prøvetransport, forsyninger og personale) blev medtaget, var den faktiske pris pr. ELISA på 60 USD, hvoraf 34 USD var til levering pr. stikprøve25. I modsætning hertil er den foreslåede DMF platform bærbar, kræver minimal uddannelse til at fungere og med pre-belagte perler kan give prøve-til-svar analyse på få minutter. Derfor kan den præsenterede teknologi anvendes til point-of-need steder og supplere analyser, der ellers findes i centraliserede laboratorier.
I afsnittet med repræsentative resultater blev den automatiserede DMF-immunassayplatform brugt til direkte påvisning af patogener til forsvarsanvendelse. Andre mulige anvendelser af DMF-platformen omfatter, men er ikke begrænset til, biodiagnostisk, kontinuerlig overvågning og automatiseret prøveudtagning. Potentielt DMF kunne påvirke forskellige sektorer fra punkt-of-pleje til personlig sundhedspleje, samt kontrolleret miljøovervågning til beskyttelse af patienter fra luftbårne Hospital Erhvervet Infektion, til afgrøde overvågningssystem for landbrug og fødevareproduktion.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende bidraget fra vores kolleger fra Microfluidic & Microengineering Research Group for deres arbejde med mekanisk design og systemintegration. Forfatterne vil gerne takke Dstl Porton Down for deres uvurderlige støtte og finansielle bidrag til tidligere og igangværende projekter, der videreudvikler DMF-teknologien og dens anvendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
| Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
| Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
| B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
| CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
| Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
| E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
| Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
| Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
| Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
| MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
| Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
| Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
| Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
| Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
| SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
| Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
| Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
| SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
| Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |
References
- Kokalj, T., Pérez-Ruiz, E., Lammertyn, J. Building bio-assays with magnetic particles on a digital microfluidic platform. New Biotechnology. 32 (5), 485-503 (2015).
- Sista, R., et al. Development of a digital microfluidic platform for point of care testing. Lab on a Chip. 8 (12), 2091-2104 (2008).
- Starodubov, D., et al. Compact USB-powered mobile ELISA-based pathogen detection: design and implementation challenges. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies VIII. 8024, 80240 (2011).
- Delattre, C., et al. Macro to microfluidics system for biological environmental monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 36 (1), 230-235 (2012).
- Gooding, J. J. Biosensor technology for detecting biological warfare agents: Recent progress and future trends. Analytica Chimica Acta. 559 (2), 137-151 (2006).
- Coudron, L., et al. Fully integrated digital microfluidics platform for automated immunoassay; A versatile tool for rapid, specific detection of a wide range of pathogens. Biosensors and Bioelectronics. 128, 52-60 (2019).
- Hua, Z., et al. Multiplexed Real-Time Polymerase Chain Reaction on a Digital Microfluidic Platform. Analytical Chemistry. 82 (6), 2310-2316 (2010).
- Zou, F., et al. real-time chemiluminescent detection of DNA mutation based on digital microfluidics and pyrosequencing. Biosensors and Bioelectronics. 126, 551-557 (2019).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital microfluidic magnetic separation for particle-based immunoassays. Analytical Chemistry. 84 (20), 8805-8812 (2012).
- Vergauwe, N., et al. A versatile electrowetting-based digital microfluidic platform for quantitative homogeneous and heterogeneous bio-assays. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (5), (2011).
- Choi, K., et al. Automated digital microfluidic platform for magnetic-particle-based immunoassays with optimization by design of experiments. Analytical Chemistry. 85 (20), 9638-9646 (2013).
- Zhao, Y., Cho, S. K. Microparticle sampling by electrowetting-actuated droplet sweeping. Lab on a Chip. 6 (1), 137-144 (2006).
- Jonsson-Niedziołka, M., et al. EWOD driven cleaning of bioparticles on hydrophobic and superhydrophobic surfaces. Lab on a Chip. 11 (3), 490-496 (2011).
- Foat, T. G., et al. A prototype personal aerosol sampler based on electrostatic precipitation and electrowetting-on-dielectric actuation of droplets. Journal of Aerosol Science. 95, 43-53 (2016).
- Seale, B., et al. Digital Microfluidics for Immunoprecipitation. Analytical Chemistry. 88 (20), 10223-10230 (2016).
- Ng, A. H. C., et al. A digital microfluidic system for serological immunoassays in remote settings. Science Translational Medicine. 10 (438), 6076-6088 (2018).
- Wild, D., Davies, C. Immunoassay fundamentals. The Immunoassay Handbook: Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. , 1-26 (2013).
- Gorham, W. F. A New, General Synthetic Method for the Preparation of Linear Poly-p-xylylenes. Journal of Polymer Science Part A-1: Polymer Chemistry. 4 (12), 3027-3039 (1966).
- Soum, V., et al. Affordable fabrication of conductive electrodes and dielectric films for a paper-based digital microfluidic chip. Micromachines. 10 (2), (2019).
- Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. Low-cost, rapid-prototyping of digital microfluidics devices. Microfluidics and Nanofluidics. 4 (4), 349-355 (2008).
- Jain, V., Devarasetty, V., Patrikar, R. Study of Two-Dimensional Open EWOD System using Printed Circuit Board Technology. Global Journal of Researches in Engineering: Electrical and Electronics Engineering. 17 (6), (2017).
- Luk, V. N., Mo, G. C. H., Wheeler, A. R. Pluronic additives: A solution to sticky problems in digital microfluidics. Langmuir. 24 (12), 6382-6389 (2008).
- Latip, E. N. A., et al. Protein droplet actuation on superhydrophobic surfaces: A new approach toward anti-biofouling electrowetting systems. RSC Advances. 7 (78), 49633-49648 (2017).
- Yoon, J. Y., Garrell, R. L. Preventing biomolecular adsorption in electrowetting-based biofluidic chips. Analytical Chemistry. 75 (19), 5097-5102 (2003).
- Dalvie, M. A., et al. Cost analysis of ELISA, solid-phase extraction, and solid-phase microextraction for the monitoring of pesticides in water. Environmental Research. 98 (1), 143-150 (2005).
