Elektrowetting-basierte digitale Mikrofluidic ist eine Technik, die eine spannungsgetriebene Änderung des scheinbaren Kontaktwinkels eines Mikroliter-Volumentröpfchens nutzt, um seine Manipulation zu erleichtern. Die Kombination mit funktionalisierten Magnetperlen ermöglicht die Integration mehrerer Laboreinheiten zur Probenvorbereitung und Identifizierung von Krankheitserregern mittels Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Elektrobenetzung ist der Effekt, durch den der Kontaktwinkel eines Tröpfchens, das einer Oberflächenladung ausgesetzt ist, verändert wird. Elektrowetten-on-dielectric (EWOD) nutzt die dielektrischen Eigenschaften von dünnisolatorfolien, um die Ladungsdichte zu erhöhen und damit den Elektronässeing-Effekt zu steigern. Das Vorhandensein von Ladungen führt zu einer elektrisch induzierten Ausbreitung des Tröpfchens, die eine gezielte Manipulation über eine hydrophobe Oberfläche ermöglicht. Hier zeigen wir das EWOD-basierte Protokoll zur Probenverarbeitung und -detektion von vier Kategorien von Antigenen unter Verwendung einer automatisierten Oberflächenbetätigungsplattform über zwei Varianten einer Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Methode. Der ELISA wird an magnetischen Perlen mit immobilisierten Primärantikörpern durchgeführt, die ausgewählt werden können, um auf ein bestimmtes Antigen zu zielen. Ein mit HRP konjugierter Antikörper bindet an das Antigen und wird zur Quantifizierung der erfassten Krankheitserreger mit H2O2/Luminol vermischt. Es wurden Test-Abschlusszeiten zwischen 6 und 10 min erreicht, während winzige Mengen an Reagenzien verwendet wurden.
Die vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, die automatisierte Probenvorbereitung für ELISA mit quantitativer Detektion von Antigenen mit EWOD-basiertem Ansatz mit digitaler Mikrofluidik (DMF) und magnetophoretischer Trennung zu erleichtern. Es wurde für mehrere biologische Anwendungen nachgewiesen, dass DMF in Kombination mit Magnetophorese eine interessante Alternative zu Flüssigkeitshandhabungsanwendungen ist1. Genauer gesagt ist der Nachweis von Krankheitserregern in vielen Sektoren ein impliziter Aspekt, von der Gesundheitsversorgung2 über die Landwirtschaft bis hin zur Umwelt3,4 bis zur nationalen Sicherheit5. Eine Detektionstechnologie, die in der Lage ist, die Bedrohungen durch Krankheitserreger zu beheben, muss einen hohen Durchsatz (z. B. kurze Testzeit), Effizienz (niedrige Nachweisgrenze – LoD – und hohe Empfindlichkeit) und Spezifität (auf den Zielpathogentyp) aufweisen, damit sie funktionsfähig ist6.
Zuvor wurde Das EWOD-basierte DMF erfolgreich für Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), den Nachweis eines antibiotikaresistenten Erregers (Methicillin-resistente Staphylococcus aureaus oder MRSA), M.pneumonia und C.albicans mit einem Low-Budget-, Printed-Circuit-Board-Chip und Magnetophorese7implementiert. Die Technik wurde auch für den Nachweis von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Mutationen durch Pyrosequencierung und chemilumineszierenden Nachweisangewendet 8. EWOD-basierte Plattformen erweitern ihre Funktionalität auch auf Immunoassay-Anwendungen und ermöglichen so die gleichzeitige Probenwiederherstellung und -erkennung innerhalb einer einzigen, integrierten Plattform. So wurde beispielsweise ein einziges EWOD-Chip-Design mit einer DMF-Plattform für Point-of-Care-Tests sowohl für perlenbasierte Immunoassays von Herztroponin I aus einer Vollblutprobe als auch als separates Experiment RT-PCR für MRSA-Erkennung2erfolgreich demonstriert. Dieser Chip verwendet Ölfüller, der die Verdunstung der Tröpfchen verhindert und die zuverlässige automatisierte Manipulation von Nanoliter-Volumen erleichtert. Vielseitige Bioanwendungen wurden mit der Implementierung ähnlicher DMF-Ansätze untersucht, die quantitative homogene und heterogene Immunoassays9,10 einschließlich Der Entwicklung von Experimenten (DoE) für die Assay-Parameteroptimierung11abdecken.
Trotz ihrer offensichtlichen Vorteile, die Intensivierung aufgrund von winzigen Arbeitsvolumina zu verarbeiten, kann eine ölgefüllte DMF-Plattform eine Herausforderung darstellen und erfordert ein gewisses Maß an Know-how, um zu arbeiten. Ölgefüllte Systeme, da sie versiegelte Komponenten benötigen, sind nicht ideal für bestimmte Anwendungen vor Ort, bei denen die Transportfähigkeit des Systems wichtig ist. Darüber hinaus wäre ein ölbasiertes System sehr schwierig, wenn nicht gar unmöglich, für bestimmte Anwendungen zu verwenden, wobei die Trockenmaterialsammlung auf einer Oberfläche, wie von Zhao und Cho12vorgeschlagen, Jönsson-Niedziéka et al.13und Foat et al.14. Im Gegensatz dazu sind ölfreie Systeme einfach zu integrieren und haben den Vorteil, dass sie eine einfache Chip-zu-Chip-Probenübersetzung bieten. Aus diesen Gründen wurde die vorgeschlagene Methode entwickelt, um einen EWOD-basierten Immunoassay auf DMF bereitzustellen, der kein Öl erfordert, was den Betrieb des Geräts effektiv vereinfacht.
In diesem Beitrag berichten wir über die Verwendung einer maßgeschneiderten, freistehenden, vollautomatischen DMF-Plattform für Immunoassays und erarbeiten das Protokoll für den schnellen Nachweis von Biomolekülen, nämlich: Proteine, vegetative Bakterien, bakterielle Sporen und Viren. Die Kombination von EWOD-Chip mit magnetischen Partikeln zur automatisierten Probenvorbereitung und Immunpräzipitation wurde bereits mit einer zusätzlichen Off-Line-MS-Messung15demonstriert. Kürzlich wurde die In-Field-Diagnostik gegen Masern und Röteln IgG in der abgelegenen Bevölkerung Kenias durch die Wheeler-Gruppe16nachgewiesen. Sowohl Wheeler es als auch unser System sind transportabel, in sich geschlossen, vollautomatisiert mit mitgelieferten On-Chip-, Echtzeit-Chemilumineszenzmessungen gehören wohl zu den fortschrittlichsten DMF-Biodetektionssystemen.
Die beiden Systeme wurden für sehr unterschiedliche Anwendungen entwickelt. Wheelers System zielt auf Biomarker ab, um biomedizinische Diagnostik an Patienten zu ermöglichen, während unser Biodetektionssystem auf verteidigungsbasierter Anforderung für den direkten Nachweis von Zuvor aus der Luft beprobten Krankheitserregern basiert. Die Ähnlichkeit zwischen beiden ist das zugrunde liegende Prinzip der Tröpfchenbetätigung, das das breite Spektrum lebensbeeinflussender Sektoren zeigt, die die EWOD-basierte Technologie beeinflussen kann. Nämlich könnten die DMF-basierte Erkennungsplattform und das zugehörige EWOD-System wichtige Auswirkungen auf die Gesundheit (biomedizinische Diagnostik) finden; militärischer und ziviler Schutz (Bedrohungserkennung); Agrartechnologie (Pflanzenüberwachung) und Arbeitssicherheit (kontrollierte Umweltüberwachung)
Die Leistung unserer DMF-Plattform wird anhand des vollautomatischen Nachweises von humanem Serumalbumin (HSA, einem Kugelprotein), Escherichia coli (E. coli, einem vegetativen Bakterium), Bacillus atrophaeus (BG, einer bakteriellen Sporen) und MS2 (ein Bakteriophagenvirus) bewertet. Noch wichtiger ist, dass die vorgeschlagene DMF-Methode in dem Sinne äußerst vielseitig ist, dass die Capture-Antikörper ausgetauscht werden könnten, um den Nachweis anderer Antigene zu erreichen, die sich von den vier in diesem Artikel berücksichtigten unterscheiden. Die DMF-Plattform könnte eine mögliche Anwendung aufbauen, die auf aptamer Biosensing basiert, bei der die Magnetperlen spezifische Aptamer zur Erfassung und/oder Detektion von Nukleotiden tragen. Die Konstruktion und Realisierung der verschiedenen Komponenten, die die integrierte, vollständig in sich geschlossene DMF-Plattform bilden, einschließlich des Hochspannungs-Wellenformgenerators und der Antriebselektronik, wird an anderer Stelle offenbart6.
Das EWOD-Immunoassay-Protokoll ist flexibel und kann je nach Reagenztyp, Stabilität und Nutzungsanforderungen, die durch das Assay-Protokoll definiert sind, eine Vielzahl von Laboreinheitenoperationen (z. B. Capture-Antigen, Mischen, Inkubation, Perlenextraktion, Waschen) umfassen. Als Beweis des Prinzips werden im aktuellen Artikel zwei Immunoassay-Protokolle berücksichtigt, die die Implementierung von acht oder zehn LUOs (Abbildung 4) mit dem beschriebenen EWOD-Chip zeigen. Eine solche Miniaturisierung verdient durch den Mikroliter, diskrete Volumen von Reagenzien/Analyt, die die Wirksamkeit des ELISA erhöhen, indem sowohl der Verbrauch von Reagenzien, die pro Operation benötigte Zeit, im Wesentlichen die gesamte Versuchszeit (6 bis 10 min). Darüber hinaus wird der Assay automatisiert mit zeitweiser Manipulation der Tröpfchen, was Variationen verringert und die Präzision des Immunoassays17verbessert. In seinem derzeitigen Format beinhaltet das Experiment die manuelle Handhabung von Tröpfchen zu Beginn jedes Assays, was ein Punkt für die weitere Diskussion im nächsten Abschnitt ist.
Ein wichtiger Schritt in der aktuellen DMF-Methode ist das Dosieren der Tröpfchen auf der Oberfläche des EWOD-Chips. Typischerweise wird eine Mikropipette mit einer Einwegspitze verwendet, um das genaue Volumen zu messen und zu laden. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Tröpfchen und der geladenen Oberfläche der Einwegspitze kann es jedoch schwierig werden, das Tröpfchen auf der hydrophoben Oberfläche der Betätigungsplatte immobilisieren zu lassen. Dadurch kann das Tröpfchen nach der Außenfläche der Spitze nach oben schießen, anstatt auf der Platte zu verbleiben. Um dies zu vermeiden, muss die Mikropipette in einer aufrechten Position, senkrecht zur Spanoberfläche gehalten werden, ohne sie zu berühren, dann kann das Tröpfchen auf das Ladepad abgegeben werden, indem es mit der Oberfläche in Berührung gebracht wird. Wenn das Tröpfchen an der Pipettenspitze klebt, geben Sie es an die Lagerlösung zurück, tauschen Sie die Spitze aus und legen Sie ein frisches Tröpfchen wieder auf. In einer Weiterentwicklung des aktuellen Proof-of-Concept-Systems kann eine automatische Lieferung von Tröpfchen ins Auge gefasst werden.
Ein weiterer kritischer Schritt, bevor der Test ausgeführt wird, ist das Schließen des Deckels der parallelen Plattenbaugruppe. Wie bereits im Protokoll erwähnt, muss der Deckel auf die Betätigungsplatte geschoben werden. Die hydrophobe Oberfläche des Deckels verhindert die Verzerrung und Verschiebung der Tröpfchen, die auf der Betätigungsplatte sitzen. Um die reibungslose Bewegung des Tröpfchens zu gewährleisten, wird dringend empfohlen, eine makellose Betätigungsplatte, die korrekte Beladung der Tröpfchen und die Spanmontage zu verwenden. Wiederverwendbarkeit der Betätigungsplatten ist möglich; Die Anzahl der Zyklen hängt jedoch von den Betätigungsspannungen (Abbildung 3) und der Analyt-/Reagenzablagerung auf der Oberfläche ab, auch biofouling genannt. Die vorgestellte Plattform nutzte chrombedruckten EWOD-Chip, der bei einer Betriebsspannung von 120 V bis zu viermal bei Betriebsspannung von 120 V und der Zwischenplattenreinigung nach jedem Experiment zuverlässig wiederverwendet werden konnte. Die Platten wurden recycelt, um die Kosten pro Experiment zu reduzieren, indem die biofoulierte amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle) die biofoulierte amorphe Fluorpolymere(Materialtabelle)dekontaminieren (die Oberfläche mit unverdünntem Reinigungsmittel vor gründlicher Spülung reinigen) und eine frische auf der Platte verfälschten. Das Recycling von Betätigungsplatten erfordert jedoch eine manuelle Handhabung, kostspielige Reagenzien (amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle))und spezielle Ausrüstungen (Spincoater). Alternative EWOD-Chips werden erfolgreich mit kostengünstigen Substraten wie Papier19, Acetatfolien oder Leiterplatten (PCB)20,21untersucht. Solche Einweg-Verbrauchsmaterialien können eine zuverlässige und erschwingliche Nutzung der DMF-Plattform ermöglichen und Mittel bereitstellen, um das Biofouling-Problem zu umgehen.
Biofouling ist die Hauptbeschränkung von EWOD für biologische Anwendungen22,23. Frühere Studien über DMF haben zwei Mechanismen identifiziert, die zur Biofouling beitragen, nämlich passive Adsorption aufgrund hydrophober Wechselwirkungen und eine elektrostatisch getriebene Adsorption, die sich manifestiert, wenn ein elektrisches Feld angewendet wird24. Die Ergebnisse im aktuellen Artikel stimmen mit dieser Theorie überein, da dokumentiert wurde, dass die Wiederverwendbarkeit der Betätigungsplatte bei hohen Betätigungsspannungen abnimmt. Eine mögliche Erklärung ist, dass Proteine leicht auf Fluorpolymer-beschichteten (Teflon-ähnlichen) Oberflächen adsorbieren und sich schneller auf gefoult im Vergleich zu unberührten Oberflächen aggregieren24. Infolgedessen sind proteinbezogene Assays auf DMF schwer zu quantifizieren und können einen Verlust an Analyt, Kreuzkontamination und verminderter Präzision erfahren17. Das Worst-Case-Szenario ist, wenn eine kritische Menge an Proteinadsorbs das Gerät nutzlos macht. Um das Biofouling zu minimieren, wurden verschiedene Ansätze untersucht, von der Minimierung der Verweilzeit des Tröpfchens auf dem Chip über die Beschichtungen23bis hin zu Additiven (d.h. Tensiden oder Pluronsäure) in die mit Biomaterial beladenen Tröpfchen6,22. Daher ist ein wichtiger Aspekt des Immunoassay-Assays auf EWOD die Wahl von Anti-Biofouling-Strategien, die mit dem jeweiligen Protokoll kompatibel sind.
Die automatisierte DMF-Plattform wurde entwickelt, um einen einzelnen Sandwich-ELISA-Test pro Lauf durchzuführen und dabei Mikroliter-Volumen sowohl für Reagenzien als auch für Analyt zu verwenden. Bei Bedarf gibt es herkömmliche Sandwich-ELISA-Kits auf Basis vorbeschichteter 96-Well- oder 384-Well-Platten, die in Kombination mit Zusätzlichenlaborgeräten zu einem höheren Durchsatz pro Durchlauf führen; Nur auf der Grundlage des Reagenzienpreises betragen die ungefähren Kosten pro Test/Bohrung 6.04 USD (580 USD/96) bzw. 0.33 USD (2×580 USD/384). Damit sind die herkömmlichen ELISA-Methoden ideal für eine große Anzahl von Proben, die typischerweise von geschultem fachkund-at-Personal in zentralen Laboreinrichtungen verarbeitet werden. An abgelegenen Orten ergab die detaillierte Kostenanalyse von ELISA für die Umweltüberwachung jedoch, dass bei der Aufnahme der Kapitalkosten (d. h. Der Betriebskosten des Labors, der wiederkehrenden Kosten, des Probentransports, des Verbrauchs und des Personals) der tatsächliche Preis pro ELISA 60 USD betrug, wovon 34 USD für Lieferungen pro Stichprobe25waren. Im Gegensatz dazu ist die vorgeschlagene DMF-Plattform tragbar, erfordert eine minimale Schulung für den Betrieb und kann mit vorbeschichteten Perlen in wenigen Minuten eine Proben-zu-Antwort-Analyse liefern. So kann die vorgestellte Technologie an bedarfsorientierten Standorten eingesetzt werden und Analysen ergänzen, die sonst in zentralen Labors verfügbar sind.
Im repräsentativen Ergebnisbereich wurde die automatisierte DMF-Immunoassay-Plattform zum direkten Nachweis von Krankheitserregern zur Abwehranwendung eingesetzt. Andere mögliche Anwendungen für die DMF-Plattform umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, biodiagnostic, kontinuierliche Überwachung und automatisierte Probenahme. Potenziell könnte sich das DMF auf verschiedene Sektoren auswirken, von der Versorgung mit Gesundheitsanwendungen für personalisierte Gesundheitsversorgung über die kontrollierte Umweltüberwachung zum Schutz von Patienten vor der in der Luft befindlichen Hospital Acquired Infection bis hin zum Pflanzenüberwachungssystem für die Landwirtschaft und Lebensmittelproduktion.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten den Beitrag unserer Kollegen von der Microfluidic & Microengineering Research Group für ihre Arbeit an der mechanischen Konstruktion und Systemintegration würdigen. Die Autoren danken Dstl Porton Down für ihre unschätzbare Unterstützung und finanziellen Beitrag, für vergangene und laufende Projekte, die die DMF-Technologie und ihre Anwendungen weiterentwickeln.
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |