Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet

Published: March 5, 2020 doi: 10.3791/60490
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, University Heart Center Freiburg-Bad Krozingen, Medical Center-University of Freiburg, 2Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

Vi præsenterer en protokol til evaluering af de elektromekaniske virkninger af GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocytter. Vi giver detaljerede oplysninger om celleisolation, dyrkning og adenoviral transduktion og om funktionelle eksperimenter med patch-clamp og kulfiberteknikker.

Abstract

I løbet af de sidste to årtier, optogenetiske værktøjer er blevet etableret som potente midler til at modulere celle-type specifik aktivitet i overgearet væv, herunder hjertet. Mens Channelrhodopsin-2 (ChR2) er et fælles værktøj til at depolarisere membranpotentialet i kardiomyocytter (CM), har der potentielt manglet handlingspotentialer (AP), et effektivt værktøj til pålidelig hæmning af CM-aktivitet. Det er blevet foreslået at bruge anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetiske hæmning. Her beskriver vi en protokol til vurdering af virkningerne af at aktivere den naturlige ACR GtACR1 fra Guillardia theta i kultiveret kanin CM. Primære udlæsninger er elektrofysiologiske patch-clamp optagelser og optisk sporing af CM sammentrækninger, begge udføres samtidig med at anvende forskellige mønstre af lys stimulation. Protokollen omfatter CM isolation fra kanin hjerte, såning og dyrkning af cellerne i op til 4 dage, transduktion via adenovirus kodning for lys-gated chlorid kanal, udarbejdelse af patch-clamp og kulfiber opsætninger, dataindsamling og analyse. Ved hjælp af patch-clamp teknik i hele celle konfiguration gør det muligt at registrere lys-aktiverede strømme (i spænding-clamp mode, V-clamp) og AP (nuværende-clamp mode, I-clamp) i realtid. Ud over patch-clamp eksperimenter, gennemfører vi kontraktilitet målinger for funktionel vurdering af CM aktivitet uden at forstyrre det intracellulære miljø. For at gøre dette, celler er mekanisk forudindlæste ved hjælp af kulfibre og sammentrækninger registreres ved at spore ændringer i sarcomere længde og kulfiber afstand. Dataanalyse omfatter vurdering af AP-varighed en e-type fra I-clamp-optagelser, spidsbelastningsstrømme fra V-clamp-optagelser og kraftberegning ud fra kulfibermålinger. Den beskrevne protokol kan anvendes til afprøvning af biofysiske virkninger af forskellige optogenetiske aktuatorer på CM aktivitet, en forudsætning for udviklingen af en mekanistisk forståelse af optogenetiske eksperimenter i hjertevæv og hele hjerter.

Introduction

ChR-medieret fotostrømme blev først registreret i eyespot af encellede grønne alger1,2. Kort efter genetisk kloning og heterolog ekspression af Chlamydomonas reinhardtii ChR1 og ChR2, ChR blev brugt som redskaber til at ændre membranpotentiale i Xenopus oocytter og pattedyrceller ved lys3,4. Kation ikke-selektiv ChR depolarisere membranen af celler med en hvilende membran potentiale, der er negativ til tilbageførsel potentiale ChR. De kan således bruges til at fremkalde AP i ophidselige celler, herunder neuroner og CM, så optisk pacing5,6.

Som supplement til kation ChR, lysdrevet proton, chlorid og natrium pumper7,8,9 er blevet brugt til at hæmme neuronal aktivitet10,11,12. Sidstnævnte har dog begrænsninger, der kræver høje lysintensiteter og vedvarende belysning, da en ion transporteres pr. absorberet foton. I 2014 beskrev to uafhængige undersøgelser af Wietek et al. og Berndt et al. omdannelsen af kationledende ChR til ACR via mutationer i kanalen pore13,14. Et år senere, naturlige ACR blev opdaget i cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som manipuleret ACR viste resterende kation ledningsevne, blev de erstattet af naturlige ACR, karakteriseret ved en stor enkelt-kanals ledningsevne og høj lysfølsomhed15. GtACR blev anvendt til at lukke munden på neuronal aktivitet ved at polarisere membranpotentialet i retning af kloridstilbageførselspotentiale16,17. Govorunova et al. anvendt GtACR1 til kultiveret rotte ventrikulær CM og viste effektiv fotoinhibition ved lav lysintensitet niveauer, der ikke var tilstrækkelige til at aktivere tidligere tilgængelige hæmning værktøjer, såsom proton pumpe Arch18. Vores gruppe for nylig rapporteret, at GtACR1-medieret fotoinhibition af CM er baseret på depolarisering, og at GtACR1 også kan bruges, derfor til optisk pacing af CM19.

Her præsenterer vi en protokol til undersøgelse af de elektrofysiologiske og mekaniske virkninger af GtACR1 fotoaktivering på kultiveret kanin ventrikulær CM. Vi beskriver først celleisolation, dyrkning og transduktion. Elektrofysiologiske effekter måles ved hjælp af hele celle patch-clamp optagelser. Lysmedierede strømme ved en given membranspænding vurderes i V-clamp-tilstand. Membran potentielle dynamik måles, mens elektrisk eller optisk pacing CM (I-clamp mode). Optisk hæmning af elektrisk udløst AP testes ved hjælp af vedvarende lysapplikation. Mekaniske effekter måles ved hjælp af kulfibre i kombination med billedbaseret sporing af sarcomere længde. For at gøre dette, optisk paceable celler er mekanisk præinstalleret ved at knytte to kulfibre til plasmamembranen nær modsatte celleender. Sarcomere længde ændringer registreres under optisk eller elektrisk pacing. Endelig måles fotoinhibition under elektrisk feltstimulation af cellerne, og genererede kræfter analyseres.

Protokollen omfatter følgende trin, der er vist i rutediagrammet i figur 1:kanindyb anæstesi, thiopental overdosisinjektion, hjerteexcision, Langendorff-perfusion og vævsfordøjelse, mekanisk dissociation af vævet til frigivelse af celler, mikroskopisk analyse af CM-udbytte, dyrkning af CM, transduktion med adenovirustype 5 efterfulgt af inkubation og funktionelle eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over den protokol, der anvendes til at opnå elektrisk og optisk tempofyldt CM. Hjerter er fjernet fra kaniner 9-10 uger gammel, og hjertevæv er fordøjet, mens der gennemtrænges ved hjælp af en Langendorff setup. Celler frigives ved mekanisk omrøring. CM-udbyttet tælles under et mikroskop. CM dyrkes, transduceret med adenovirus type 5 og funktionelle eksperimenter udføres 48-72 timer efter transduktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle kaninforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og godkendt af de lokale myndigheder i Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Tyskland).

1. Løsninger til celleisolation

  1. Opløsningerne til celleisoleringen fremstilles med vand af følgende krav (tabel 1) og i overensstemmelse med de ioniske sammensætninger , der er anført i tabel 2.
    BEMÆRK: CaCl2 og MgCl2 tilsættes fra 1 M lageropløsninger.
Vandbehov
Ledningsevne [μS/cm] ved 25 °C 0.055
Pyrogen [EU/ml] kr.
Partikel (størrelse > 0,22 μm) [1/ml] ≤ 1
Organisk kulstof i alt [ppb] < 5
Mikroorganismer [CFU/ml] ≤ 1
RNase [ng/mL] < 0,01
DNase [ng/mL] < 4

Tabel 1: Vandbehov.

Fysiologisk saltvandsopløsning (1) Lavt calciumindhold, høj kaliumopløsning (2) Enzymopløsning (3) Blokeringsløsning
NaCl [mM] 137 137 137 137
KCl [mM] 4 14 14 14
HEPES [mM] 10 10 10 10
Kreatin [mM] 10 10 10 10
Taurin [mM] 20 20 20 20
Glucose [mM] 10 10 10 10
MgCl2 [mM] 1 1 1 1
Adenosin [mM] 5 5 5 5
L-carnitin [mM] 2 2 2 2
CaCl2 [mM] 1 - 0.1 0.1
Na-Heparin [IE/L] 5000 - - -
EGTA [mM] - 0.096
Kollagentype 2, 315 U/mg [g/L] - - 0.6 -
Protease XIV [g/L] - - 0.03 -
Kvæg serum albumin [%] - - - 0.5
Osmolaritet [mOsmol/L] 325 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 345 ± 5

Tabel 2: Løsninger til cm-isolation.

  1. Alle opløsninger justeres til pH 7.4 ved 37 °C, og der kontrolleres osmolaritet.
    BEMÆRK: Enzymerne (Collagenase type 2 og Protease XIV) opløses direkte før hjerteexcision. Iltalle opløsninger før brug.

2. Forberedelse af Langendorff-perfusion setup

BEMÆRK: Den anvendte opsætning er skræddersyet. Som vist i figur 2består opsætningen af tre vandkappede reservoirer (1-3), en spiral modstrømsvarmeveksler (4) og en vandkappeperfusionsbeholder (5).

Figure 2
Figur 2: Langendorff-perfusion setup optimeret til kanincelleisolation. (1-3) Vandkappede reservoirer med (1) fysiologisk saltvandsopløsning, (2) lavt calciumindhold, høj kaliumopløsning og (3) enzymholdigt kardioplegikisk opløsning. (4) Spiral counter-flow varmeveksler og (5) vandkappe deopsamlingstank. Tilstrømningen af vandkappesystemet er spiralvarmeveksleren (temperaturen af opløsninger, der efterlader perfusionskanylen for enden af varmeveksleren, skal være konstant ved 37 °C), efterfulgt af perfusionsbeholderen og de tre reservoirer. Alle opløsninger er iltet (stiplet linje). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Tænd for pumpen i vandbadet for at cirkulere vand ved 38 °C i varmevekslingssystemet, og forvarm alle opløsninger til 37 °C.
    BEMÆRK: Temperaturen ved udstrømningen af (4) skal styres og konstant ved 37 °C.
  2. Fyld de tre beholdere med den pågældende opløsning og vask hver linje (sort) med den tilsvarende opløsning. Fyld hovedlinjen (blå) i slutningen uden luftbobler ved hjælp af opløsning (1).
    BEMÆRK: Iltopløsningerne før (10 min) og under brug. Fyld linjen fra reservoir (3) til hanen med lavt calcium, høj kaliumopløsning.
  3. Forbered en sutur til at binde hjertet omkring aorta på kanylen.

3. Celleisolation

  1. Klargør følgende sprøjter.
    1. For sedation/anæstesi: Bland 0,5 ml/kg kropsvægt esketaminhydrochlorid (25 mg/ml) og 0,2 ml/kg kropsvægt xylazine hydrochlorid (2%).
    2. Der fyldes to sprøjter med 12 ml NaCl-opløsning (0,9 %).
    3. 6 ml 12,5 mg/ml Na-thiopental, opløst i 0,9% NaCl-opløsning.
    4. Fyld 0,2 ml esketaminhydrochlorid (25 mg/ml) i en sprøjte.
    5. 0,2 ml Na-heparin (5.000 IE/ml) fortyndes i 1 ml 0,9% NaCl-opløsning (slutkoncentration 1.000 IE/ml).
  2. Bedøve/bedøve kaniner (9-10 uger, New Zealand hvid kanin, hun- eller han, ~2 kg) via intramuskulær injektion af esketamin hydrochlorid og xylazine hydrochlorid (trin 3.1.1).
    BEMÆRK: Kaniner skal have mindst 10 min. afhænger af deres kropsvægt. Bekræft anæstesi med tabet af righting refleks.
  3. Barber brystet og ørerne, hvor venerne er placeret.
  4. Sæt en fleksibel kanyle ind i ørevenen, fastgør den med tape, og skyl den med 0,9% NaCl-opløsning.
  5. Injicer 1 ml Na-heparinopløsning intravenøst og skyl med 0,9% NaCl-opløsning.
  6. Injicer 0,2 ml esketamin hydrochlorid, skyl igen med 0,9% NaCl-opløsning og injicer Na-thiopental indtil apnø.
    BEMÆRK: Kanin ender ikke med at reagere på pedalens tilbagetrækningsrefleks.
  7. Åbn brystet i venstre side og fjern pericardium.
  8. Start timeren, når hjertet er fjernet og vask hjertet to gange i fysiologisk saltvandsopløsning.
    BEMÆRK: Brug en saks med runde spidser for at forhindre utilsigtet beskadigelse af hjertevæv.
  9. Kannure aorta i et bad med fysiologisk saltvandsopløsning og holde alt væv i opløsning. Tænd for Langendorff-perfusionssystemet (fysiologisk saltvandsopløsning (1), hastighed 24 ml/min.
  10. Overfør hjertet til Langendorff-perfusion setup, tilslut aorta til perfusat dysen, og stramt binde hjertet med sutur omkring aorta til kanyle (< 1 min).
    BEMÆRK: Fyld kanylen på forhånd med fysiologisk saltvandsopløsning, sørg for, at der ikke kommer luftbobler ind i kanylen under transporten fra kanyleringsstedet til Langendorff-opsætningen, og tilslut boblefri.
  11. Perfuse hjertet, indtil alt blod er vasket ud (2-3 min).
  12. Skift til lavt calciumindhold, høj kaliumopløsning (2). Perfuse i 2 minutter mere efter hjertet er holdt op med at slå og skifte til enzymopløsning.
  13. Start recirkulerende enzymopløsningen, efter 2 minutter fra fordøjelsesstart, tilbage i reservoiret. Sænk hastigheden til 16 ml/min. efter 5 min fordøjelse.
  14. Når vævet ser blødt ud (40-50 min fordøjelse), skær hjertet af kanylen og adskille venstre hjertekammer.
  15. Slip celler ved mekanisk dissociation (forsigtigt trække fra hinanden vævet med en pipette og en fin pincet til at holde vævet) i blokering løsning.
  16. Cellesuspensionen filtreres gennem en maske (porestørrelse på 1 mm2) og centrifugeres i 2 min ved 22 x g (gravitationel acceleration).
  17. Fjern supernatanten, der indeholder ikke-myocytter, og ophæng CM igen i blokeringsopløsning.

4. Dyrkning af CM

BEMÆRK: Udfør følgende trin under sterile forhold.

  1. Fortyndet laminin (fra Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom kældermembran, 1 mg/ml) 1:10 i sterilt fosfat buffered saltvand (uden Ca2+/Mg2+) til en endelig koncentration på 100 μg/ml.
  2. Foreklar kulturmediet i M199-Medium med de tillæg, der er angivet i tabel 3.
Cellekulturmedium i M199-Medium
Kreatin [mM] 5
L-carnitinhydrochlorid [mM] 2
Taurin [mM] 5
Na-Pyruvat [mM] 1
Insulin (kvægbugspytkirtel) [U/L] 0.25
Cytosin-β-D-arabinofuranoside [mM] 0.01
Gentamycin [mg/ml] 0.05

Tabel 3: Cellekulturmedium.

  1. Steril filteropløsning (0,22 μm) og tilsættes 5% føtal kvægserum.
  2. Til patch-clamp-forsøg autoklavedæksel slæber ø 16 mm, tykkelse nr.
  3. For kulfiber eksperimenter, pels petriskåloverflade med poly (2-hydroxyethyl methacrylat) (poly-HEMA, 0,12 g/ml i 95:5 EtOH: H20) og lad det størkne.
    BEMÆRK: Celler ikke 'stick' til poly-HEMA belagt petriskåle; dette er afgørende for deres friktion-mindre sammentrækning i celle mekanik undersøgelser.
  4. Efter re-suspenderet CM har afviklet (~ 10-15 min), fjerne supernatant, og derefter suspendere CM i kultur medium.
  5. Tæl CM med et Neubauer kammer og frø med en måltæthed på 17.500 celler/ml enten på lamininbelagte coverslips eller i poly-HEMA belagte petriskåle.
  6. Inkuber celler ved 37 °C, 5% CO2 i 3-4 timer. Der udveksles mellemmediet (37 °C) af coverslip-såede celler.
  7. Der tilsættes adenovirus (type 5) kodning for GtACR1-eGFP ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 75 og start funktionelle eksperimenter efter 48 timer.
    BEMÆRK: Efter transduktion holde cellerne i mørke. Brug rød belysning, når du arbejder med blå eller grønne lysaktiverede proteiner. Et kommercielt tilgængeligt adenoviralt fremføringssystem (se Materialetabel)bruges til at klone de gener, der koder GtACR1-eGFP, til den adenovirale vektor. Indsatsen af interesse, her GtACR1-eGFP, er PCR forstærket og derefter kombineret med en adenoviral vektor, herunder en CMV promotor i en IN-Fusion Kloning reaktion. DEN CMV (human cytomegalovirus) promotor er almindeligt anvendt til at drive overekspression af transgener i pattedyr celler. eGFP er et forbedret grønt fluorescerende protein fra Aequorea victoria med en excitation på 488 nm og en emission maksimum på 507 nm. Adenovirus (type 5) blev eksternt produceret på Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp.
    FORSIGTIG: Adenoviral transduktion er kategoriseret som BSL-2 sikkerhedsniveau arbejde, og passende sikkerhedsforanstaltninger er juridisk påkrævet.

5. Funktionelle eksperimenter

BEMÆRK: Optagelser udføres ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop. Der filtreres transmissionslampen med et rødt båndpasfilter (630/20 nm) i kondensatoren for at undgå samaktivering af GtACR1.

  1. Patch-clamp opsætning
    1. Brug en forstærker i kombination med en analog-til-digital konverter. Brug en software til dataindsamling til at registrere strøm- og spændingsdata(se Materialetabel ).
      BEMÆRK: De registrerede data digitaliseres ved 10 kHz og filtreres ved 5 kHz.
  2. Opsætning af kulfiber
    1. Brug et kamera til at opdage kulfiber position og sarcomere længde ved at spore ændringer i optisk kontrast (kulfibre vises som mørkere strukturer, overlejret på tværs nittet celle mønster). En skematisk repræsentation af opsætningen er vist i figur 3.
      BEMÆRK: Sarcomere længde beregnes i realtid ved hjælp af en hurtig Fourier transformering (FFT) af effektspektret af rilleringsmønsteret.

Figure 3
Figur 3: Skema, der viser eksperimentel opsætning til kulfibermålinger. (Tegningen er ikke i stor skala). To kulfibre er fastgjort på en celle, og deres position styres af en piezo positioner. Paceren bruges til elektrisk feltstimulering. Flerfarvede LED'er kobles til den omvendte mikroskops epifluorescensport til belysning af celler i objektplanet. LED-effekt styres via en dedikeret kontrolboks, som modtager digitale impulser via den digitale udgang fra den digitale-analog-konverter (DAC). DAC kommunikerer via analog udgang med fluorescenssystemets grænseflade. En sort-hvid kamera (774 pixels med 245 linjer) for cellulære billeddannelse er forbundet til computeren for at spore sarcomere længde og kulfiber bøjning. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Tidsforsoning
    1. Giv lys til fluorescensmikroskopi og aktivering af lyslukkede ionkanaler via en ekstern specialbygget LED-kontrolboks, der består af tre lysdioder af forskellig farve (460 nm, 525 nm, 640 nm, se Materialetabel).
    2. Rediger mikrocontrolleren og den grafiske brugergrænsefladekode (GUI) for kontrolboksen for at tillade styring af LED'en via eksterne TTL-impulser (Time to Live), der genereres i softwareprotokoller til dataindsamling (se Materialetabel). Overfør TTL-impulser til LED-kontrolboksen via den digitale analog-konverter.
    3. Drive LED og vælge antallet af impulser via GUI. Når du modtager kommandoen fra GUI mikrocontrolleren starter en proces på en ny kerne. I denne proces vil TTL-indgangen samt en kontrolkontakt, der er indstillet fra GUI'en, løbende blive kontrolleret.
    4. Når TTL-indgangen er positiv, tænder mikrocontrolleren LED'en og genoptager derefter kontrollen af TTL-indgangen. Når TTL-signalet vender tilbage til nul, slukker mikrocontrolleren FOR LED'en og reducerer antallet af impulser, der efterlades af én. Hvis kontrolkontakten på noget tidspunkt er falsk, eller antallet af impulser er nul, stopper mikrocontrolleren denne proces, indtil der modtages en ny kommando fra GUI'en.
    5. Par direkte led'erne ind i mikroskopets baghavn.
  2. Bestemmelse af lysintensitet i objektplanet
    1. Det belyste område måles med et fasemikrometer (målforstørrelse 40x, A = 0,8 mm2).
    2. Brug en optisk effektmåler (se Materialetabel).
    3. Definer indstillingerne for forsøgene: excitation bølgelængde (525 nm), objektiv forstørrelse (40x), excitation filter (530/20 nm) eller spejl, og aflæs lyset magt [W] på forskellige LED-indgang spændinger.
    4. Lysintensiteten [W/mm2]beregnes ved at dividere lyseffekten [W] med det oplyste område [mm2] (her: 0,8 mm2).
      BEMÆRK: Mål den faktiske lyseffekt med de respektive protokoller i trin 5.6 for at kontrollere, om korte lysimpulsvarigheder på 10 ms rækkevidde og lange varigheder holder den indstillede værdi (Supplerende figur 1).
  3. Forberedelse til patch-clamp eksperimenter
    1. Bevar følgende eksterne og interne opløsninger (tabel 4; for vandbehov se tabel 1).
    2. Osmolariteten justeres med glukose til 300 ± 5 mOsmol/L. Aliquot den interne opløsning, og opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Hold den interne opløsning på is en dag, hvor optagelsen blev optaget. Hold den eksterne opløsning ved stuetemperatur. De her beskrevne patch-clamp opløsninger var baseret på tidligere anvendte opløsninger og Cl- koncentrationblev ændret til lavere, mere fysiologiske niveauer7. For karakterisering af ionselektiviteten af den respektive optogenetiske aktuator foreslår vi at variere koncentrationerne afstørre ioner(f.eks.
    3. Tag optageelektroden af fra pipetteholderen, og fjern sølvkloridlaget fra sølvtråden med meget fint sandpapir.
      BEMÆRK: Gør dette trin i begyndelsen af hver måledag.
    4. Tilslut ledningen til den positive pol på et 1,5 V batteri og nedsænkes i 3 M KCl-opløsning til sølvkloridbelægning i 10 min.
      BEMÆRK: Den negative pol er forbundet med en referencesølvtråd nedsænket i 3 M KCl-opløsningen.
    5. Klargør målekammeret: Sæt siliciumfedt på målekammerets ramme, og anbring en dækslæbe (diameter: 50 mm, tykkelse nr. 0) på toppen af den ramme, som kammeret er forseglet.
    6. Sæt en reference sølv / sølv-chlorid pellet elektrode i badet og forbinde den med hovedet scenen.
    7. Træk 1,7 - 2,5 MΩ lappe pipetter fra soda lime glas kapillærer (ydre diameter: 1,55 mm, indre diameter: 1,15 mm) med en mikropipette puller (se Tabel af materialer).
    8. Start dataindsamlingssoftwaren, og juster membrantesten (puls 10 mV for 15 ms, baseline 0 mV).
Ekstern badopløsning Intern pipetteopløsning
NaCl [mM] 140 -
KCl [mM] 5.4 11
CaCl2 [mM] 1 -
MgCl2 [mM] 2 2
Glucose [mM] 10 -
HEPES [mM] 10 10
K-Aspartate [mM] - 119
Mg-ATP [mM] - 3
EGTA [mM] - 10
Ph 7.4 (NaOH) 7.2 (KOH)
Osmolaritet (justere med glukose) [mOsmol/L] 300 ± 5 300 ± 5

Tabel 4: Patch-clamp-løsninger.

  1. Protokoller til patch-clamp målinger
    1. Optag fotoaktiveringsprotokollen i V-clamp-tilstand med et holdepotentiale på -74 mV. Brug lysimpulser på 300 ms.
      BEMÆRK: Vi foreslår at udføre V-clamp optagelser tæt på hvilemembranen potentiale kulturbeherskede CM (etableret i I-clamp; i vores hænder mellem -79 mV og -77 mV både for transduceret og ikke-transduceret CM19). Friskisolerede celler viser et gennemsnitligt hvilemembranpotentiale på -79 mV (Supplerende figur 2, alle værdier efter korrektion for potentiale for væskejunction).
    2. Optag AP i I-clamp mode på 0 pA.
      1. For elektrisk pacing, injicere strømimpulser på 10 ms (rampe fra 0 pA til den indstillede værdi inden for 10 ms), 0,25 Hz og finde tærsklen til at fremkalde AP. Optag AP ved nuværende injektioner på 50% mere end tærsklen.
      2. Til optisk pacing bruge lysimpulser på 10 ms, 0,25 Hz ved den minimale lysintensitet til at fremkalde pålideligAP.
    3. Optag fotoinhibition i I-clamp mode ved 0 pA. Elicit AP som beskrevet i trin 5.6.2.1 og anvende vedvarende lys til 64 s ved 4 mW/mm2 efter 15 elektrisk udløst AP.
      BEMÆRK: Figur 6F viser en fotohæmningsprotokol, hvor der under vedvarende lys anvendes højere strøminjektioner. Fra 1,5 gange tærsklen (her: 0,7 nA) blev den injicerede strøm forhøjet i trin på 0,1 nA (slutniveau: 2,2 nA). Ved alle testede strømamplitder hæmmede vedvarende lysapplikation AP-generering.
      1. Som et kontroleksperiment skal elektrisk stimulering på pause i 64 sekunder uden lyspåføring.
  2. Patch-clamp eksperimenter
    BEMÆRK: Udfør følgende eksperimenter i mørke (rødt lys kan bruges til blå/grønt lysaktiverede værktøjer).
    1. Placer dæksel med celler i målekammeret med ekstern opløsning og vælg fluorescerende CM.
      BEMÆRK: eGFP-positive celler kan påvises ved hjælp af en blå LED (460 nm) i kombination med et bånd-pass excitationfilter (450 nm - 490 nm), et 510 nm dichroic spejl og et 515 nm long-pass emissionsfilter. Hvis der anvendes andre fluorescerende mærkater, skal du bruge tilsvarende LED- og fluorescensfiltersæt. Hvis der opnås en høj transduktionseffektivitet (i vores hænder >99% med GtACR1 adenovirus), er der ingen grund til at kontrollere eGFP fluorescens før de funktionelle eksperimenter; Derved undgås potentiel gtacr1-forhåndsaktivering.
    2. Fyld plasterpipette med intern opløsning. Sørg for, at der ikke er luftbobler i spidsen.
    3. Fastgør pipetten til pipetten, isætning af optagelsen sølv-chlorid belagt sølv tråd i den interne løsning.
    4. Når du har nået den celletilsluttede konfiguration, skal du skifte til helcelletilstand i dataindsamlingssoftwaren med et holdepotentiale på -74 mV. Brud membranen ved forsigtigt at anvende undertryk for at få adgang til hele cellekonfigurationen. Dette indikeres af en øjeblikkelig stigning i den målte kapacitans.
    5. Kør de protokoller, der er beskrevet i afsnit 5.6.
  3. Kulfiber teknik
    1. Producere kulfibre.
      1. Brug glaskapillærer med følgende parametre: ydre diameter: 2,0 mm, indvendig diameter: 1,16 mm, længde: 100 mm (se Materialetabel). Ved hjælp af en mikropipettetrækker trækkes glaskapillariet i to pipetter af samme længde (den samlede koniske længde ~11 mm, figur 5) til en endelig indre diameter på ~30 μm.
        BEMÆRK: De indstillinger, der anvendes til første og andet træk, er henholdsvis 85,2 % (i forhold til pullerens maksimale ydelse) og 49,0 % (afhænger af glødetrådens puller, type og alder).
      2. Bøj pipetterop til 45° med en selvfremstillet mikrosmedje ved hjælp af indstillingerne 12 V, 24 A (se figur 4 for nærmere oplysninger om pipettebøjningsopsætningen).
        1. Juster kapillær (2) på den røde linje i orienteringscirklen (5), hold kapillærkonstantens placering, så længden af bøjningsdelen altid er den samme efter midten af orienteringscirklen (radius på 4,5 mm).
        2. Bøj kapillæren op til 45° (grøn linje) ved at skubbe kapillærens spids ned med benderen (3) og smede ved opvarmning af glødetråden (4), indtil kapillæren fanger 45°-vinklen, selv efter at benderen er fjernet.
      3. Monter kulfibrene (leveret fra professor Jean-Yves Le Guennec) i den fine spids af glaskapillariet under et stereomikroskop. Brug fine pincet med bløde slanger i slutningen for at øge grebet og mindske risikoen for at beskadige fibrene.
        BEMÆRK: Disse fibre er kendetegnet ved mikrostrukturer, som øger kontaktoverfladen mellem fibre og celler, hvilket forbedrer vedhæftning20.
      4. Skær kulfibre ne i en længde på 2 mm og brug super lim (cyanoacrylat) til at fastgøre fiberen til den forreste del af kapillær.
        BEMÆRK: Jo længere fibrene er, jo mere de bøjer ved anvendelse af den samme kraft.
    2. Kalibrer kulfibre.
      1. Kalibrer kulfibrene ved hjælp af en krafttransducer med en følsomhed på 0,05 mN/V og et kraftområde på 0 - 0,5 mN (se Materialetabel).
        BEMÆRK: Denne opsætning er skræddersyet til at måle komprimering i stedet for "pull".
      2. Fastgør kapillær med kulfiber til en holder, der styres af en mikromanipulator og en piezo motor.
      3. Sæt spidsen af fiberen i kontakt med kraftsensoren, men uden at fremføre nogen kraft, og flyt piezomotoren i trin på 10 μm (samlet bevægelse på 60 μm) mod sensoren og aflæs den målte spænding (E) i Volt.
        BEMÆRK: Sørg for, at krafttransduceren kontaktes af selve spidsen af kulfiberens frie ende.
      4. Gentag disse målinger tre gange.
      5. Brug Formel 1 til at beregne kraften for hver piezoposition (ΔΕ-forskellen i målt spænding mellem piezomotortrinnene):

        BEMÆRK: Krafttransducerens følsomhed afhænger af transducerens model (her: 0,05 mN/V = 50 μN/V). Gevinsten kan indstilles til controlleren.
      6. Kraften [μN] afbildes mod piezopositionen. Hældningen svarer til fiberstivheden [μN/μm].
    3. Optag kraft af ordregivende CM.
      BEMÆRK: Udfør følgende eksperimenter i mørke (rødt lys kan bruges til blå/ grønt lysaktiverede værktøjer).
      1. Coat overfladen af målekammeret med poly-HEMA. Fyld målekammeret med ekstern badopløsning og sæt et par dråber af den kultiverede cellesuspension i kammeret (trin 4.9).
      2. Fastgør kapillærer med kulfibre til scenen mikromanipulator. Vælg GtACR1-udtryk for CM ved at kontrollere muligheden for at fremkalde sammentrækninger ved anvendelse af korte impulser med grønt lys. Juster kulfibrene næsten vandret til målekammerets overflade.
      3. Sænk den første fiber på celleoverfladen. Fastgør den anden fiber parallelt med den første fiber i den anden ende af CM. Den ideelle justering er næsten vinkelret på celleaksen.
        BEMÆRK: Fastgør fiberen ved forsigtigt at skubbe cellen til bundoverfladen. Slip trykket, før du monterer den anden fiber. Stræk ikke cellen ved at fastgøre den anden fiber.
      4. Efter begge fibre er fastgjort på cellen, løft fibrene, så cellen ikke har nogen kontakt til kammerets overflade længere og er i stand til at trække sig sammen uden friktion.
      5. Fokus sarcomeres i dataindsamling software (se Tabel af materialer)og indstille sarcomere længde tracking vindue (Figur 7AI (3)) mellem fibrene.
        BEMÆRK: Resulterende FFT-effektspektrum (figur 7A I (2)) viser ideelt set en skarp top, der repræsenterer den gennemsnitlige sarcomerelængde.
      6. Spor fiber bøjning ved hjælp af kantdetdetekteringsmodulet. Indstil detektionsområderne med det røde og grønne vindue, og definer en tærskel (rød og grøn vandret linje) ved det første afledte af lysintensitetssporingen (figur 7A III).
      7. Start til optisk tempo cellen på 0,25 Hz (hvis det er muligt, så prøv hurtigere pacing satser) og spor sarcomere længde og fiber bøjning.
        BEMÆRK: Fiberholderposition, LED-udløser og elektriske stimuleringsimpulser styres via dataindsamlingssoftwaren (se Materialetabel).
      8. Efter optagelse af mindst 15 optisk fremkaldte sammentrækninger, felt-stimulere cellen elektrisk (se Tabel over materialer). Find tærsklen for at fremkalde sammentrækninger og registrere ved at anvende 1,5 gange af tærskelspændingen.
      9. For hæmning protokol, anvende elektriske stimuli at fremkalde sammentrækninger og derefter udsætte for vedvarende lys på 64 s (ved forskellige lysintensiteter).

Figure 4
Figur 4: Pipette bøjning setup. (1) Mikromanipulatoren på venstre side bruges til at styre kapillærens position, og en anden mikromanipulator til højre bruges til at bøje den. (2) Kapillær. (3) Bender. (4) Mikroforge. (5) Orienteringcirkel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Pipettermed kulfiber. Klik her for at se en større version af dette tal.

6. Analyse af data

  1. Patch-clamp optagelser
    BEMÆRK: Ret alle registrerede og kommandospændinger for væskekrydsets potentiale efter forsøget. Bestem potentialet for væskekryds i dataindsamlingssoftwaren ved hjælp af værktøjskrydsets potentielle regnemaskine (for de angivne patch-clamp-løsninger i tabel 4:14,4 mV ved 21 °C). Træk væskejunction-potentialet fra den registrerede/kommandospænding.
    1. For I-clamp AP optagelser, kontrollere elektrisk pacing versus optisk pacing. Beregn AP-varigheden (APD) ved 20 og 90 % repolarisering med et brugerdefineret script (Supplerende materiale). Bestemme hvilemembranpotentiale og AP amplitude.
      BEMÆRK: Bestem APD som beskrevet i Wang K. et al.21 Scriptet til at indlæse .abf filer er generelt tilgængelig via følgende link: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Gennemsnitlige APD-værdier for mindst 6 AP.
    2. For V-clamp fotoaktivering skal du kontrollere, om baseline er ved 0 pA. Hvis ikke justere baseline til nul. Analysér den registrerede strøm udløst af 300 ms lysimpulser på -74 mV. Overfør dataene til dataanalysesoftware, og bestem den højeste og gennemsnitlige stationære strøm.
  2. Kulfiber eksperimenter
    1. Sammentrækningsoptagelser under optisk pacing: Indlæs de registrerede data i dataindsamlingssoftwaren, og læs baseline og maksima af kulfiberbøjningen og sarcomere-længden ændres.
      BEMÆRK: Gennemsnitsværdier for 10 sammentrækninger af en stabil optagelse.
    2. Del cellebredden måles, og tværsnitsområdet i cellen beregnes under forudsætning af et elliptisk tværsnit (figur 7B II).
      BEMÆRK: Formlen for området for en ellipse er A = π·a·b (Formel 2), hvor a er afstanden fra midten til knudepunktet og b er afstanden fra midten til co-vertex. I vores tilfælde betyder det en = (bredden af cellen)/2 og b = (tykkelse af cellen)/2. Ifølge Nishimura et al.22 kan mCM's tykkelse anslås til at være en tredjedel af cellebredden, således at A = π· (1/2)·bredde· (1/2)·tykkelse = π· (1/4)·bredde· (1/3)·bredde = π· (1/12)·bredde2.
    3. Beregn den endesystoliske kraft (F):
    4. Beregn deformationen af endesystoliske celler (ESD):

      BEMÆRK: Yderligere kontraktile parametre kan analyseres: hvile sarcomere længde, tid til at toppe, tid til 90% afslapning, fraktioneret sarcomere afkortning, maksimal hastighed af sammentrækning og afslapning (se software erhvervelse manual).

Representative Results

GtACR1-eGFP blev udtrykt i kultiveret kanin-CM(Figur 6-skær), og fotostrømme blev målt med plaster-clamp-teknikken. Fotoaktivering af GtACR1 viser store indadrettede strømme på -74 mV. I figur 6eren spidsstrøm (IP) ved 4 mW/mm2 2 245 pA. AP blev udløst enten elektrisk (Figur 6B) eller optisk (Figur 6C) med strøminjektioner, der var 1,5 gange tærsklen, eller korte depolariserende lysimpulser på henholdsvis 10 ms. Analyse af APD-værdier, elektrisk tempo CM viser en APD 20 på 0,24 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,75 ± 0,17 s, cm med optisk tempo viser en APD 20 på 0,31 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, i det her præsenterede eksempel APD 20elektrisk = 0,17 s; APD 20optisk = 0,27 s og APD 90elektrisk = 0,61 s; APD 90optisk = 0,68 s; Figur 6D). Optisk tempo CM viser en langsommere AP debut (Figur 6D). CM-aktivering blev hæmmet ved vedvarende belysning (for 64 s, 4 mW/mm2) ved at polarisere membranpotentialet mod klorids tilbageførselspotentiale her -58 mV (figur 6E). Højere strøminjektioner end 1,5 gange tærsklen fremkalder ikke AP-generering (figur 6F). Genererede spidsbelastninger blev bestemt ud fra kulfiberbøjning (Figur 7B,C,E). Cm'et genererede 232 μN/mm2 ved elektrisk pacing (figur 7B) og 261 μN/mm2 efter optisk pacing (figur 7C). Langvarige grønlysimpulser hæmmer sammentrækninger (Figur 7E). Efter optisk hæmning i 64 s genererer tilbagevendende sammentrækninger en lavere kontraktilekraft, og kraftværdier genvindes mod baseline efter ~ 10 sammentrækninger (pacing ved 0,25 Hz, Figur 7D) i overensstemmelse med diastolisk calciumtab fra kanin-CM.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative patch-clamp-optagelser af elektrisk og optisk tempo/hæmmet CM. (A) Repræsentativ fotostrøm ved -74 mV med en lysimpuls på 300 ms, 4 mW/mm2. IP angiver spidsstrømmen. Indsatsen viser en GtACR1-eGFP-positiv celle. (B) Repræsentant AP optagelse på 0 pA ved hjælp af en nuværende rampe på 10 ms, 0,6 nA til elektrisk tempo CM. (C) Repræsentant AP optagelse på 0 pA ved hjælp af lysimpulser på 10 ms, 0,4 mW /mm2. (D) Topgrafen viser overlejringen af den 10th AP af elektrisk (blå) og optisk (grøn) aktiveret CM. AP blev justeret af den maksimale ændring i membranpotentiale (dV/ dt max). Nederste graf viser forskellen mellem membranpotentiale mellem optisk og elektrisk udløst AP (Eoptisk-Eelektrisk). (E) Elektrisk udløst AP blev hæmmet under vedvarende lys på 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP hæmmes af højere strøminjektioner end 1,5 gange tærsklen (fra 0,7 nA i trin på 0,1 nA til 2,2 nA) under vedvarende lys. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative data fra kulfiberoptagelser af optisk og elektrisk tempo/hæmmet CM. (A) Display i dataacquisition software. Billede (I) viser det målte CM med vinduet til beregning af sarcomerelængde. Cellebredden er mærket med orange. 1) Rækkevidde af relevante frekvenser. (2) FFT-effektspektrum viser hyppigheden af sarcomereafstanden på cellen. Den gennemsnitlige sarcomere længde beregnes ud fra peak frekvens. (3) Sarcomere længde tracking vindue. (4) Intensitetspor. (5) Intensiteten spor ganget med en Hamming vindue er windowed intensitet spor. Skema (II) viser cellens elliptiske tværsnit. Bredde i orange og tykkelse i stiplet blå. Billede (III) viser placeringen af kulfibre med de respektive detektionsbokse, venstre i rødt og højre i grøn. (6) Intensitetspor. (7) Første afledte af intensitet spor (se dataindsamling software manual). (B)Repræsentative spor af elektrisk fremkaldte sammentrækninger. Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) afstanden mellem de to kulfibre. (C) Repræsentativt spor af optisk fremkaldte sammentrækninger (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) afstanden mellem de to kulfibre. (D) Genereret peak kraft fra sammentrækning 1 til 11 efter en pause forårsaget af hæmning af AP generation. (E) Repræsentativt spor af optisk hæmning af sammentrækninger under vedvarende belysning (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) længden mellem de to kulfibre. Klik her for at se en større version af dette tal.

A Område
Acr anion kanalrhodopsin
Ap handlingspotentiale
Apd handling potentiel varighed
Cfu koloni danneenhed
Chr channelrhodopsin
Cm kardiomyocyte
eGFP forbedret grønt fluorescerende protein
Esd ende systolisk celledeformation
Eu endotoksinenheder
F Kraft
Fft hurtig Fourier transformering
GtACR delte et link. Guillardia theta anion channelrhodopsin
Gui grafisk brugergrænseflade
I-klemme strømklemme
Ie internationale enheder
Moi mangfoldighed af infektion
poly-HEMA poly(2-hydroxyethyl methacrylat)
V-klemme spænding-klemme

Tabel 5: Liste over forkortelser.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: Lysintensitetsmålinger med optisk effektmåler. (A) Måling af 10 ms lysimpulser ved 4 mW/mm2. (B) Måling af vedvarende belysning på 64 s ved 4 mW/mm2. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 2
Supplerende figur 2: Egenskaber af frisk isoleret CM og deres strukturelle tilpasning i kultur. (A) AP-registrering af et nyisoleret CM (APD 20 af 1,11 ± 0,34 s, APD 90 på 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Gennemsnitligt hvilemembranpotentiale på -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Kulfiberregistrering af et friskisoleret CM i elektrisk tempo. Gennemsnitlig maksimalkraft på 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). c) Konfokale billeder af et nyisoleret CM (I) (II) og transduceret (III) CM efter 48 timer i kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende materiale: MatLab script til at bestemme APD og hvile membran potentiale. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Mens optogenetiske værktøjer muliggør modulering af ophidsende celleelektrofysiologi på en ikke-invasiv måde, har de brug for grundig karakterisering i forskellige celletyper (f.eks. CM), så man kan vælge det bedste tilgængelige værktøj til et specifikt eksperimentelt design. Plaster-clamp-teknikken er en standardmetode til vurdering af cellulær elektrofysiologi. I hele cellekonfigurationen gør det muligt at optage fotoaktiverede strømme på tværs af plasmamembranen eller tidsmæssige ændringer i membranspændingen efter lysstimulering/hæmning. Optogenetic manipulation af elektrisk excitation påvirker også CM sammentrækninger. Vi bruger sarcomere tracking og kulfiber-assisteret kraft målinger til at kvantificere virkningerne af optisk forhør på den mekaniske aktivitet af myocytter.

Vi beskriver en protokol til at karakterisere de grundlæggende virkninger af en lys-gated chlorid kanal, GtACR1, i CM. Som modelsystem valgte vi kanin-CM, da deres elektrofysiologiske egenskaber (f.eks. AP-form og ildfast periode) ligner dem, der observeres i humant CM, tættere end gnaver-CM. Desuden kan kanin CM dyrkes i flere dage, længe nok til adennoviral levering og udtryk for GtACR1-eGFP. Især isolerede CM ændre deres strukturelle egenskaber i kultur over tid, herunder afrunding af celleendelser og gradvis tab af cross-striation, T-rørformede system og caveolae23,24. I overensstemmelse med dette, funktionelle ændringer er blevet rapporteret i kulturbeherdet CM: depolarisering af hvilemembranen potentiale, forlængelse af AP og ændringer i cellulære Ca2 + håndtering. For gennemgang af cellulære tilpasninger i kultur, se Louch et al.25. Supplerende figur 2 viser eksemplariske AP- og sammentrækningsmålinger af friskisoleret CM til sammenligning med dem, der er observeret i dyrket CM (Figur 6, figur 7) ved hjælp af den fremlagte protokol her.

Patch-clamp-optagelser med hele celler muliggør direkte målinger af fotostrømsegenskaber (f.eks. amplituder og kinetik) og lysinducerede ændringer i membranpotentialet eller AP-egenskaber ved høj tidsmæssig opløsning. Men sådanne optagelser har flere begrænsninger: For det første erstattes cytosolen af pipetteopløsningen i helcelleoptagelser, hvilket er fordelagtigt at kontrollere ioniske elektrokemiske gradienter, men har den iboende ulempe ved at vaske cellulære organeller, proteiner og andre forbindelser, hvilket potentielt påvirker cellulære elektriske reaktioner. For det andet er bivirkninger som aktivering af yderligere ionkanaler som følge af ikke-fysiologisk lang depolarisering (f.eks. langsomme tidskonstanter af lyslukkede ionkanaler) vanskelige at vurdere, da vores metode kun gør det muligt at registrere ændringer i APD, men ikke at foretage direkte målinger af ioniske koncentrationer i elektrofysiologisk relevante cellerum. Dette kan gøres med fluorescerende indikatorer (f.eks Ca2+ sensorer) eller ionselektive elektroder. Yderligere karakterisering kan omfatte lysintensitettitreringer, bestemmelse af pH-afhængighed, fotostrømskinetik ved forskellige membranpotentialer og genfindingskinetik under gentagen lysstimulering.

I modsætning til patch-clamp optagelser, encellede kraft målinger muliggøre analyse af cellulære sammentrækninger af intakte myocytter uden at påvirke deres intracellulære miljø. Sekundære virkninger på ionkoncentrationer (f.eks.Ca. 2+) kan indirekte vurderes ved at bestemme genereret kraftamplitude og dynamik (f.eks. maksimal hastighed for sammentrækning og afslapning; her ikke analyseret). Kraftmålinger med kulfiberteknikken har en fordel i forhold til frit ordregivende celler, da de giver direkte oplysninger om passive og aktive kræfter i forudindlæste celler (dvs. under forhold, der er mere lig in situ- eller in vivo-indstillingerne). Mekanisk forladning er især vigtigt, når man analyserer cellulære kontraktilitet, som stretch påvirker kraft produktion og afslapning26,27.

Optogenetiske tilgange giver mulighed for spatiotemporally præcis manipulation af cellulære membran potentiale, både i enkelt CM og intakt hjertevæv. Klassisk er ChR2, en lysgated kation ikke-selektiv kanal, blevet anvendt til depolarisering af membranpotentialet, mens lysdrevne proton- og/eller kloridpumper blev anvendt til membranhyperpolarisering. Begge grupper af optogenetiske aktuatorer kræver høje udtryksniveauer, da ChR2 er kendetegnet ved en iboende lav single-channel ledningsevne28 og lysdrevne pumper transporterer maksimalt en ion pr. absorberet foton. Desuden kan langvarig aktivering af ChR2 i CM føre til Na+ og/ eller Ca2+ overbelastning, og lysdrevne pumper kan ændre trans-sarcolemmal H+ eller Cl- gradienter29,30. På jagt efter alternative værktøjer til optogenetisk kontrol af CM aktivitet, vi for nylig testet den naturlige anion channelrhodopsin GtACR1, karakteriseret ved en overlegen single-kanals ledningsevne og højere lysfølsomhed i forhold til kation ChR såsom ChR2. Vi fandt, at GtACR1 aktivering depolarizes CM og kan bruges til optisk pacing og hæmning, afhængigt af lyset puls timing og varighed. En yderligere fordel ved at bruge ACR i stedet for kation ChR kunne være den mere negative vending potentiale Cl- sammenlignet med Na+, reducere kunstigt indførte ionstrømme. Som vi tidligere har vist, optisk pacing med GtACR1 kan føre til AP forlængelse som følge af den langsomme komponent af GtACR1 kanal lukning, som kunne overvindes ved hjælp af hurtigere GtACR1 mutanter19. Men AP forlængelse er langt mindre udtalt, når du bruger en lavere, mere fysiologisk intracellulære Cl- koncentration (se figur 6). Desuden resulterer GtACR1-medieret hæmning ved langvarig belysning i dyb membrandepolarisering, som igen kunne aktivere sekundær Na+ og Ca2+ tilstrømning, hvorved aktiviteten af spændingslukkede kanaler ændres. I vores målinger finder vi, at AP og sammentrækningsparametre ne kommer sig til baseline inden for 40 s efter en let induceret hæmning i 1 min (se Kopton et al. 2018, figur 6, figur 7). Lysgatede K+ kanaler er et potent alternativ til lyddæmpning af CM uden at påvirke cm'ets hvilemembranpotentiale31.

I fremtiden vil vi gerne kvantitativt sammenligne forskellige optogenetiske værktøjer for deres potentiale til at hæmme hjerteaktivitet. Til dette formål tester vi en række lys-gated ion kanaler, herunder ACR, ChR2 og rød-flyttet ChR varianter32,samt hyperpolariserende aktuatorer såsom halorhodopsin eller lyset gated adenylyl cyclase bPAC i kombination med kalium kanalen SthK (PAC-K)31.

Den her præsenterede protokol kan bruges til dybdegående karakterisering af de elektromekaniske egenskaber af CM. Det gælder hovedsagelig også for CM fra andre arter, og for CM isoleret fra syge myocardium. Optisk stimulation giver en til tempo CM ved forskellige frekvenser, og forskellige preloads kan testes under kulfiber sammentrækning eksperimenter. Et interessant eksperiment ville være at bruge lav intensitet belysning til subthreshold depolarisering, at efterligne gradvis stigning i hvilemembranen potentiale, som kan observeres under udviklingen af hjertevæv remodeling under sygdomsprogression. Endelig kan funktionelle målinger kombineres med Ca2+ billeddannelse for yderligere indsigt i excitation-sammentrækningskobling eller med farmakologiske indgreb for at vurdere virkningerne af forskellige lægemidler på CM-aktivitet.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Stefanie Perez-Feliz for fremragende teknisk bistand, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) for at levere pUC57-GtACR1 plasmid, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) for adenovirus produktion og Dr. Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) for at dele sin ekspertise til at forbedre cellen isolation protokol og re-design pipette bending setup. Projektet blev finansieret af Den Tyske Forskningsfond (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether stipendium: SCHN1486/2-1) og ERC Advanced Grant CardioNECT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
Aortic cannula Radnoti 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0151 Borosilicate Glass
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm Samuel Findings, London, UK TSGBL3
Incubator New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland Galaxy 170S
Langendorff-perfusion set-up Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany Custom-made
Langendorff-pump Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland ISM444
Mesh: Nylon Monodur filter cloth Cadisch Precision Meshes Ltd 800 µm holes, 1 m wide
Neubauer chamber VWR International GmbH, Leuven, Belgium 717806
Rabbit, New Zealand White Charles River Strain Code: 052
Scissors Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BC774R Bauchdeckenschere ger. 18cm
Sterile filter, 0.22 µm Merck, Darmstadt, Germany SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier AxonInstruments, Union City, CA, United States Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0178 Borosilicate Glass
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, San José, CA, United States 1550A
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878 BZ:00
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Headstage AxonInstruments, Union City, CA, United States CV203BU
Interface Scientifica, Uckfield, UK 1U Rack, 352036
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control software Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PP-830
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
Motorised Micromanipulator Scientifica, Uckfield, UK PatchStar
Optical power meter Thorlabs, Newton, NJ, United States PM100D
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Silver wire A-M Systems, Sequim, WA, United States 787500 Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet
Soda lime glass capillaries Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark 160213 BRIS, ISO12772 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Equipment - Carbon fiber
Carbon fibers provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec BZ:00
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States 1550B
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Fluorescence System Interface IonOptix, Milton, MA United States FSI-800 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Force Transducer System Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada 406A
Glass capillaries for force measurements Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States GC200F-10
Interface National Instruments National Instruments, Budapest, Hungary BNC-2110
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control box Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Microcontroller Parallax Inc., Rocklin, California, United States Propeller
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PC-10
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
MyoCam-S camera IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S camera Power IonOptix, Milton, MA, United States MCS-100
MyoPacer Field Stimulator IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States MYP100
Piezo Motor Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany E-501.00
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software IonWizard IonOptix, Dublin, Ireland Version 6.6.10.125
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Chemicals
Adenosine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9251-100G
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A7030-50G
CaCl2 Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 21114-1L
L-Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C9500-25G
Collagenase type 2, 315 U/mg Worthington, Lakewood, NJ, USA LS004177
Creatine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C0780-50G
Cytosine-β-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C1768-100MG
EGTA Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 3054.3
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany PZN-07829486
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States F9665
Gentamycin 50 mg/mL Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA 15750-037
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States G7021-1KG
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany PZN-03029843
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States H3375-1KG
Insulin (bovine pancreas) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States I6634-50MG
K-aspartate Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A6558-25G
KCl VWR International GmbH, Leuven, Belgium 26764.260 1 mg/mL
KOH Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 35113-1L
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States L2020-1MG
M199-Medium Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States M4530
Mg-ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9187-1G
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States 63069-500ML
NaCl Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK 10428420
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
NaOH AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany A6579 without Ca2+/Mg2+
Na-pyruvat Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P2256-100MG
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States D1408-500ML
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma, Poole, UK 192066
Protease XIV from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P5147-1G
Taurine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States T0625-500G
Thiopental Inresa 0.5 g Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany PZN-11852249
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany PZN-01320422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harz, H., Hegemann, P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas. Nature. 351, 489-491 (1991).
  2. Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature. 271, 476-478 (1978).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  7. Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium. Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).
  8. Schobert, B., Lanyi, J. K. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).
  9. Inoue, K., et al. A light-driven sodium ion pump in marine bacteria. Nature Communications. 4, 1678 (2013).
  10. Han, X., et al. A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).
  11. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  12. Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2. Scientific Reports. 8, 9316 (2018).
  13. Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).
  14. Berndt, A. Structure-Guided Transformation. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).
  15. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  16. Mohamed, G. A., et al. Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins. BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).
  17. Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing. Scientific Reports. 7, 13823 (2017).
  18. Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics. Scientific Reports. 6, 33530 (2016).
  19. Kopton, R. A., et al. Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels. Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).
  20. Peyronnet, R., et al. Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).
  21. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
  22. Nishimura, S., et al. Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).
  23. Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).
  24. Burton, R. A. B., et al. Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation. Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).
  25. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  26. Janssen, P. M., Hunter, W. C. Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction. The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).
  27. Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).
  28. Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  29. Schneider-Warme, F., Ravens, U. Using light to fight atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).
  30. Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
  31. Bernal Sierra, Y. A., et al. Potassium channel-based optogenetic silencing. Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).
  32. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).

Tags

Medicin Naturlig anion channelrhodopsin GtACR1 Guillardia theta hjerte kardiomyocytter optogenetik handling potentiale hjerte elektrofysiologi kulfiber teknik kontraktilitet kraft måling mekanik
Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss,… More

Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss, R., Kohl, P., Peyronnet, R., Schneider-Warme, F. Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity. J. Vis. Exp. (157), e60490, doi:10.3791/60490 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter