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Medicine

ऑप्टोजेनेटिकल मॉडुलेटेड कार्डियोमायोसाइट गतिविधि का विद्युत मूल्यांकन

Published: March 5, 2020 doi: 10.3791/60490
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Institute for Experimental Cardiovascular Medicine, University Heart Center Freiburg-Bad Krozingen, Medical Center-University of Freiburg, 2Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

हम खरगोश कार्डियोमायोसाइट्स में GtACR1 सक्रियण के विद्युत प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम सेल अलगाव, खेती और एडेनोवायरल ट्रांसड्यूक्शन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करते हैं, और पैच-क्लैंप और कार्बन-फाइबर तकनीकों के साथ कार्यात्मक प्रयोगों पर।

Abstract

पिछले दो दशकों में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण दिल सहित उत्तेजनीय ऊतकों में सेल प्रकार विशिष्ट गतिविधि को मिलाने के लिए शक्तिशाली साधन के रूप में स्थापित किए गए हैं । जबकि Channelrhodopsin-2 (ChR2) कार्डियोमायोसाइट्स (मुख्यमंत्री) में झिल्ली क्षमता को ध्रुवीकृत करने के लिए एक आम उपकरण है, संभावित रूप से कार्रवाई क्षमता (एपी), सीएम गतिविधि के विश्वसनीय मुंह के लिए एक प्रभावी उपकरण गायब हो गया है। ऑप्टोजेनेटिक अवरोध के लिए एनियन चैनलोडोप्सिन (एसीआर) का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है। यहां, हम सुसंस्कृत खरगोश सीएम में गिलार्डिया थीटा से प्राकृतिक एसीआर GtACR1 को सक्रिय करने के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । प्राथमिक readouts इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और सीएम संकुचन की ऑप्टिकल ट्रैकिंग कर रहे हैं, दोनों प्रकाश उत्तेजना के विभिन्न पैटर्न लागू करते समय प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल में खरगोश के दिल से सीएम अलगाव, 4 दिनों तक कोशिकाओं की सीडिंग और विविधता, लाइट-गेटेड क्लोराइड चैनल के लिए एडेनोवायरस कोडिंग के माध्यम से ट्रांसड्यूक्शन, पैच-क्लैंप और कार्बन फाइबर सेटअप की तैयारी, डेटा संग्रह और विश्लेषण शामिल हैं। पूरे सेल विन्यास में पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करने से वास्तविक समय में प्रकाश-सक्रिय धाराओं (वोल्टेज-क्लैंप मोड, वी-क्लैंप) और एपी (वर्तमान-क्लैंप मोड, आई-क्लैंप) रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। पैच-क्लैंप प्रयोगों के अलावा, हम इंट्रासेलर परिवेश को परेशान किए बिना सीएम गतिविधि के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए संकुचन मापकाजाता है। ऐसा करने के लिए, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से कार्बन फाइबर का उपयोग करके प्रीलोडेड किया जाता है और सरकोवर लंबाई और कार्बन फाइबर दूरी में परिवर्तन ों को ट्रैक करके संकुचन दर्ज किए जाते हैं। डेटा विश्लेषण में आई-क्लैंप रिकॉर्डिंग से एपी अवधि का आकलन, वी-क्लैंप रिकॉर्डिंग से पीक धाराएं और कार्बन फाइबर मापन से बल गणना शामिल है। वर्णित प्रोटोकॉल को सीएम गतिविधि पर विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक एक्टुएटर के जैव भौतिक प्रभावों के परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता है, जो हृदय ऊतक और पूरे दिलों में ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों की मशीनी समझ के विकास के लिए एक शर्त है।

Introduction

सीएचआर-मध्यस्थता वाले फोटोकरंट्स को पहली बार यूनिकोशिलर ग्रीन शैवाल1,2के आईस्पॉट में दर्ज किया गया था । क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टी सीआर 1 और ChR2 की आनुवंशिक क्लोनिंग और हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति के तुरंत बाद, सीएचआर का उपयोग प्रकाश3,4द्वारा ज़ेनोपस ओसाइट्स और स्तनधारी कोशिकाओं में झिल्ली क्षमता को बदलने के लिए उपकरण के रूप में किया गया था। सेशन गैर-चयनात्मक सीएचआर कोशिकाओं की झिल्ली को आराम झिल्ली क्षमता के साथ डिपोलर करता है जो सीएचआर की उलटी क्षमता के लिए नकारात्मक है। इस प्रकार उनका उपयोग न्यूरॉन्स और सीएम सहित उत्तेजनीय कोशिकाओं में एपी को प्रकाश में लाने के लिए किया जा सकता है, जिससे ऑप्टिकल पेसिंग5,6की अनुमति मिल सकती है।

सीएचआर, लाइट-ड्रिवेन प्रोटॉन, क्लोराइड और सोडियम पंप7,8,9 के पूरक का उपयोग न्यूरोनल गतिविधि10,11,12को बाधित करने के लिए किया गया है। हालांकि, बाद की सीमाएं होती हैं, उच्च प्रकाश तीव्रता और निरंतर रोशनी की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक आयन अवशोषित फोटॉन के अनुसार ले जाया जाता है। 2014 में, Wietek एट अल और Berndt एट अल द्वारा दो स्वतंत्र अध्ययनों ने चैनल पोर13,14में म्यूटेशन के माध्यम से एसीआर में सीएचआर का संचालन करने वाले सीएचआर को बदलने का वर्णन किया। एक साल बाद क्रिप्टोफाइट गिलार्डिया थेटा (जीटीएसीआर)15में प्राकृतिक एसीआर की खोज की गई । जैसा कि इंजीनियर एसीआर ने अवशिष्ट के आचरण को दिखाया, उन्हें प्राकृतिक एसीआर द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, जिसकी विशेषता एक बड़े एकल चैनल चालन और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता15थी। जीटीएसीआर का उपयोग क्लोराइड16,17की उलटक्षमता की ओर झिल्ली क्षमता का ध्रुवीकरण करके न्यूरोनल गतिविधि को शांत करने के लिए किया गया था । गोवोरुनोवा एट अल. ने रैट वेंट्रिकुलर सीएम को GtACR1 लागू किया और कम प्रकाश तीव्रता के स्तर पर कुशल फोटोहिचक दिखाया जो प्रोटोन पंप आर्क18जैसे पहले उपलब्ध अवरोध उपकरणों को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं थे। हमारे समूह ने हाल ही में बताया कि सीएम का GtACR1-मध्यस्थता फोटोअवरोधध्रुवीकरण पर आधारित है और इसलिए, सीएम19की ऑप्टिकल पेसिंग के लिए GtACR1 का भी उपयोग किया जा सकता है ।

यहां, हम सुसंस्कृत खरगोश वेंट्रिकुलर सीएम पर GtACR1 फोटोएक्टिवेशन के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और मैकेनिकल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम पहले सेल अलगाव, पुलिया और ट्रांसड्यूक्शन का वर्णन करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रभाव पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके मापा जाता है। एक दी गई झिल्ली वोल्टेज पर हल्की मध्यस्थता वाली धाराओं का मूल्यांकन वी-क्लैंप मोड में किया जाता है। झिल्ली संभावित गतिशीलता को विद्युत या ऑप्टिकल रूप से पेसिंग सीएम (आई-क्लैंप मोड) के दौरान मापा जाता है। विद्युत रूप से ट्रिगर एपी के ऑप्टिकल अवरोध निरंतर प्रकाश आवेदन का उपयोग करपरीक्षण किया जाता है। यांत्रिक प्रभाव इमेजिंग के संयोजन में कार्बन फाइबर का उपयोग कर मापा जाता है सरकोमे लंबाई के ट्रैकिंग आधारित है । ऐसा करने के लिए, ऑप्टिकल रूप से तेज कोशिकाओं को विपरीत कोशिका सिरों के पास प्लाज्मा झिल्ली में दो कार्बन फाइबर संलग्न करके यांत्रिक रूप से प्रीलोड किया जाता है। ऑप्टिकल या इलेक्ट्रिकल पेसिंग के दौरान सरकोरे लंबाई में बदलाव दर्ज किए जाते हैं। अंत में, कोशिकाओं के विद्युत क्षेत्र उत्तेजना के दौरान फोटोसंकोच मापा जाता है, और उत्पन्न बलों का विश्लेषण किया जाता है।

प्रोटोकॉल में चित्रा 1में फ्लोचार्ट में दिखाए गए निम्नलिखित कदम शामिल हैं: खरगोश डीप एनेस्थीसिया, थिओपेनटल ओवरडोज इंजेक्शन, हार्ट एक्सिजन, लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन और ऊतक पाचन, कोशिकाओं को छोड़ने के लिए ऊतक का यांत्रिक विरक्तन, सीएम यील्ड का सूक्ष्म विश्लेषण, सीएम की विविधता, एडेनोवायरस टाइप 5 के साथ ट्रांस्क्शन, ऊष्मायन और कार्यात्मक प्रयोगों के बाद।

Figure 1
चित्रा 1: विद्युत और ऑप्टिकल रूप से तेज सीएम प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का फ्लोचार्ट। दिल खरगोशों से 9-10 सप्ताह पुराने उत्पादित कर रहे हैं, और हृदय ऊतक पचा रहा है, जबकि एक Langendorff सेटअप का उपयोग कर perfused जा रहा है । कोशिकाओं को यांत्रिक आंदोलन द्वारा जारी किया जाता है। सीएम यील्ड की गिनती माइक्रोस्कोप के नीचे होती है। सीएम सुसंस्कृत हैं, एडेनोवायरस प्रकार 5 के साथ ट्रांसड्यूस किए जाते हैं और कार्यात्मक प्रयोग ट्रांसड्यूक्शन के बाद 48-72 घंटे किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

सभी खरगोश प्रयोगों वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल जानवरों की सुरक्षा पर निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ में कहा दिशा निर्देश के अनुसार किया गया और Baden-Württemberg (Regierungspräsidium फ्रीबर्ग, एक्स-16/10R, जर्मनी) में स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित ) ।

1. सेल अलगाव के लिए समाधान

  1. निम्नलिखित आवश्यकताओं (तालिका 1)के पानी के साथ और तालिका 2में सूचीबद्ध आयनिक रचनाओं के अनुसार कोशिका अलगाव के लिए समाधान तैयार करें।
    नोट: CaCl2 और MgCl2 1 एम स्टॉक समाधान से जोड़ा जाता है ।
पानी की आवश्यकताएं
25 डिग्री सेल्सियस पर चालकता [μS/सेमी] 0.055
पाइरोजन [ईयू/एमसीएल] < 0.001
कण (आकार >0.22 μm) [1/mL] ♫ 1
कुल कार्बनिक कार्बन [पीपीबी] < 5
सूक्ष्मजीव [सीएफयू/एमसीएल] ♫ 1
RNase [एनजी/mL] < 0.01
DNase [एनजी/mL] < 4

तालिका 1: पानी की आवश्यकताएं।

शारीरिक खारा समाधान (1) कम कैल्शियम, उच्च पोटेशियम समाधान (2) एंजाइम समाधान (3) समाधान अवरुद्ध करना
नैल [एमएम] 137 137 137 137
केसीएल [एमएम] 4 14 14 14
हेप्स [एमएम] 10 10 10 10
क्रिएटिन [एमएम] 10 10 10 10
टॉरिन [एमएम] 20 20 20 20
ग्लूकोज [एमएम] 10 10 10 10
एमजीसीएल2 [एमएम] 1 1 1 1
एडेनोसाइन [एमएम] 5 5 5 5
एल-कार्निटाइन [एमएम] 2 2 2 2
CaCl2 [एमएम] 1 - 0.1 0.1
ना-हेपरिन [आईयू/एल] 5000 - - -
ईजीटीए [एमएम] - 0.096
कोलेजेनेज़ प्रकार 2, ३१५ U/mg [g/L] - - 0.6 -
Protease XIV [g/L] - - 0.03 -
गोजातीय सीरम एल्बुमिन [%] - - - 0.5
ओस्मोलैरिसिटी [mOsmol/L] 325 ± 5 345 ± 5 345 ± 5 345 ± 5

तालिका 2: मुख्यमंत्री अलगाव के लिए समाधान।

  1. पीएच 7.4 के सभी समाधानों को 37 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और ओस्मोलैरी की जांच करें।
    नोट: दिल के एक्सिजन से पहले एंजाइमों (कोलेजेनेज टाइप 2 और प्रोटीज़ XIV) को सीधे भंग करें। उपयोग करने से पहले सभी समाधानों को ऑक्सीजनित करें।

2. लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन सेटअप की तैयारी

नोट: प्रयुक्त सेटअप कस्टम-मेड है। जैसा कि चित्रा 2में दर्शाया गया है, सेटअप में तीन पानी जैकेट जलाशय (1-3), एक सर्पिल काउंटर-फ्लो हीट एक्सचेंजर (4) और एक पानी जैकेट वाले परफ्यूजन पोत (5) शामिल हैं।

Figure 2
चित्रा 2: खरगोश सेल अलगाव के लिए अनुकूलित लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन सेटअप। (1-3) (1) शारीरिक खारा समाधान, (2) कम कैल्शियम, उच्च पोटेशियम समाधान और (3) एंजाइम युक्त कार्डियोप्लेजिक समाधान के साथ पानी जैकेट जलाशयों । (4) सर्पिल काउंटर-फ्लो हीट एक्सचेंजर और (5) पानी जैकेट संग्रह टैंक । पानी जैकेट प्रणाली की आमद सर्पिल हीट एक्सचेंजर है (हीट एक्सचेंजर के अंत में परफ्यूजन कैनुला छोड़ने वाले समाधानों का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए), इसके बाद परफ्यूजन पोत और तीन जलाशय हैं। सभी समाधान ऑक्सीजनयुक्त (धराशायी रेखा) हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. हीट एक्सचेंज सिस्टम में 38 डिग्री सेल्सियस पर पानी प्रसारित करने के लिए पानी स्नान के पंप पर स्विच करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक सभी समाधानों को प्रीहीट करें।
    नोट: (4) के बहिर्गमन पर तापमान को नियंत्रित किया जाना चाहिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए।
  2. तीन जलाशयों को संबंधित समाधान से भरें और प्रत्येक पंक्ति (काले) को संबंधित समाधान के साथ धोएं। समाधान (1) का उपयोग करके हवा के बुलबुले के बिना अंत में मुख्य (नीली) लाइन भरें।
    नोट: पहले (10 मिन) और उपयोग के दौरान समाधान ऑक्सीजनेट करें। जलाशय (3) से कम कैल्शियम, उच्च पोटेशियम समाधान के साथ नल के लिए लाइन भरें।
  3. कैनुला में महाधमनी के चारों ओर दिल बांधने के लिए एक सीवन तैयार करें।

3. सेल अलगाव

  1. निम्नलिखित सीरिंज तैयार करें।
    1. सेडेशन/एनेस्थीसिया के लिए: मिक्स ०.५ एमएल/किलो शरीर का वजन एस्केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (25 मिलीग्राम/एमएल) और ०.२ एमएल/किलोग्राम शरीर का वजन जाइलाज़ीन हाइड्रोक्लोराइड (2%)।
    2. नैक सॉल्यूशन (0.9%) के 12 मिलील के साथ दो सीरिंज भरें।
    3. 0.9% नैल समाधान में भंग 12.5 मिलीग्राम/एमएल ना-थिओपेनटल के 6 मिलील तैयार करें।
    4. एक सिरिंज में एस्केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (25 मिलीग्राम/एमएल) का 0.2 एमएल भरें।
    5. 0.9% नैल समाधान (अंत एकाग्रता 1,000 आईयू/एमएल) के 1 एमएल में ना-हेपरिन (5,000 आईयू/एमएल) का पतला 0.2 एमएल।
  2. बेहोश/एनेस्थेटाइज खरगोश (9-10 सप्ताह, न्यूजीलैंड सफेद खरगोश, महिला या पुरुष, ~ 2 किलो) एस्केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और जाइलाज़ीन हाइड्रोक्लोराइड (चरण 3.1.1) के इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन के माध्यम से।
    नोट: खरगोशों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड करने के लिए कम से कम 10 सीन की आवश्यकता होती है; सटीक अवधि उनके शरीर के वजन पर निर्भर करती है। दक्षिणपंथी पलटा के नुकसान के साथ संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  3. जहां नसों का पता चलता है, वहां छाती और कान ों को शेव करें।
  4. कान की नस में एक लचीला कैनुला डालें, इसे टेप के साथ ठीक करें और इसे 0.9% नैल समाधान के साथ फ्लश करें।
  5. ना-हेपरिन समाधान के 1 mL नसों में इंजेक्ट करें और 0.9% नैल समाधान के साथ फ्लश करें।
  6. एस्केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड के 0.2 एमएल इंजेक्ट करें, 0.9% नैल समाधान के साथ फिर से फ्लश करें और एपनिया तक ना-थिओपेनटल इंजेक्ट करें।
    नोट: खरगोश पेडल वापसी पलटा का जवाब नहीं देना चाहिए।
  7. छाती को बाईं ओर खोलें और पेरिकार्डियम को हटा दें।
  8. जब दिल को एक्साइज किया जाता है तो टाइमर शुरू करें और शारीरिक नमकीन समाधान में दिल को दो बार धोएं।
    नोट: हृदय ऊतक को आकस्मिक क्षति को रोकने के लिए गोल सुझावों के साथ कैंची का उपयोग करें।
  9. शारीरिक खारा समाधान के साथ स्नान में महाधमनी का विवाह करें और सभी ऊतकों को समाधान में रखें। लैंगेंडोर्फ-परफ्यूजन सिस्टम (फिजिकलल लवकुश सॉल्यूशन (1), स्पीड 24 mL/min) पर स्विच करें ।
  10. दिल को लैंगेंडोर्फ-पेफ्यूजन सेटअप में स्थानांतरित करें, महाधमनी को परफ्यूज़ नोजल से जोड़ें, और महाधमनी के चारों ओर सीवन के साथ दिल को कैनुला (एंड लेफ्टिनेंट; 1 मिन) से कसकर बांधें।
    नोट: शारीरिक खारा समाधान के साथ कैनुला को पूर्व-भरें, सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले कैनुलेशन साइट से लैंगेंडोर्फ सेटअप तक परिवहन के दौरान कैनुला में प्रवेश न करें, बुलबुला मुक्त कनेक्ट करें।
  11. दिल को पर्फ्यूज करें जब तक कि सभी रक्त धोया न जाए (2-3 मिन)।
  12. कम कैल्शियम, उच्च पोटेशियम समाधान (2) पर स्विच करें। दिल की धड़कन और एंजाइम समाधान के लिए स्विच बंद कर दिया है के बाद 2 और मिन के लिए Perfuse।
  13. एंजाइम समाधान को पुनः प्रसारित करना शुरू करें, पाचन की शुरुआत से 2 मिन के बाद, जलाशय में वापस। पाचन के 5 मिन के बाद 16 mL/min करने के लिए गति में कमी।
  14. जब ऊतक नरम दिखाई देता है (पाचन का 40-50 टन), कैनुला से दिल काट और बाएं वेंट्रिकल अलग।
  15. यांत्रिक विजन द्वारा कोशिकाओं को छोड़ें (समाधान को अवरुद्ध करने में ऊतक को पकड़ने के लिए एक पिपेट और ऊतक को पकड़ने के लिए एक अच्छा संदंश के साथ ऊतक को धीरे से खींचना।
  16. एक जाल (1 मिमी2का ताकना आकार) और 22 x ग्राम (गुरुत्वाकर्षण त्वरण) पर 2 मिन के लिए अपकेंद्री के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
  17. नॉन-माइओसाइट्स वाले सुपरनेटेंट को हटा दें और समाधान को अवरुद्ध करने में सीएम को फिर से निलंबित करें।

4. सीएम की संस्कृति

नोट: बाँझ परिस्थितियों में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. पतला लैमिनिन (Engelbreth से-Holm-झुंड murine सारकोमा तहखाने झिल्ली, 1 मिलीग्राम/mL) 1:10 बाँझ फास्फेट बफर खारा में (Ca2 +/Mg 2 +के बिना+)१०० μg/mL की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
  2. तालिका 3में इंगित पूरक के साथ M199-मध्यम में संस्कृति माध्यम तैयार करें।
M199-मध्यम में सेल संस्कृति माध्यम
क्रिएटिन [एमएम] 5
एल-कार्निटाइन हाइड्रोक्लोराइड [एमएम] 2
टॉरिन [एमएम] 5
ना-पायरुवत [एमएम] 1
इंसुलिन (गोजातीय अग्न्याशय) [U/L] 0.25
साइटोसाइन-ए-डी-अरबीनोसाइड [एमएम] 0.01
Gentamycin [मिलीग्राम/mL] 0.05

तालिका 3: सेल संस्कृति माध्यम।

  1. बाँझ-फिल्टर समाधान (0.22 माइक्रोन) और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम जोड़ें।
  2. पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए ऑटोक्लेव कवरस्लिप ø 16 मिमी, मोटाई नंबर 0, उन्हें 100 μg/mL टुकड़े टुकड़े के साथ सीधे 100 μg/mL टुकड़े टुकड़े के साथ संवत् से पहले संजीदगी से पहले कोट करें।
  3. कार्बन फाइबर प्रयोगों के लिए, पाली के साथ पेट्री डिश सतह कोट (2-हाइड्रोक्सेथिल मेथेक्रिलेट) (पाली-हेमा, 0.12 ग्राम/95:5 EtOH: H20 में mL) और इसे जमना करते हैं ।
    नोट: कोशिकाओं को पाली-हेमा लेपित पेट्री व्यंजन के लिए 'छड़ी' नहीं है; यह सेल यांत्रिकी अध्ययन में उनके घर्षण-कम संकुचन के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. फिर से निलंबित होने के बाद सीएम ने (~10-15 मिन) तय कर दिया है, अधिस्थान हटा दें, और फिर संस्कृति माध्यम में सीएम को फिर से निलंबित करें ।
  5. १७,५०० कोशिकाओं/mL के लक्ष्य घनत्व पर एक Neubauer चैंबर और बीज के साथ सीएम की गिनती या तो लैमिनिन लेपित कवरस्लिप पर या पाली-हेमा लेपित पेट्री व्यंजन में ।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट सेल, 5% सीओ2 3-4 घंटे के लिए। कवरस्लिप वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) का आदान-प्रदान करें।
  7. 75 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर GtACR1-eGFP के लिए एडेनोवायरस (टाइप 5) कोडिंग जोड़ें और 48 घंटे के बाद कार्यात्मक प्रयोग शुरू करें।
    नोट: ट्रांसड्यूक्शन के बाद कोशिकाओं को अंधेरे में रखें। नीले या हरे रंग की रोशनी से सक्रिय प्रोटीन के साथ काम करते समय लाल रोशनी का उपयोग करें। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एडेनोवायरल डिलीवरी सिस्टम (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग एडेनोवायरल वेक्टर में GtACR1-eGFP एन्कोडिंग जीन को क्लोन करने के लिए किया जाता है। ब्याज का सम्मिलित, यहां GtACR1-eGFP, पीसीआर परिलक्षित और फिर एक में फ्यूजन क्लोनिंग प्रतिक्रिया में एक CMV प्रमोटर सहित एक adenoviral वेक्टर के साथ संयुक्त है । सीएमवी (ह्यूमन साइटोमेगालोवायरस) प्रमोटर का उपयोग आमतौर पर स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसजीन की अतिअभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया जाता है। ईजीएफपी एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो एकोरिया विक्टोरिया से प्राप्त होता है जिसमें अधिकतम 488 एनएम और 507 एनएम पर उत्सर्जन अधिकतम होता है। एडेनोवायरस (टाइप 5) को बाहरी रूप से चारिट-यूनीवर्सिटेत्स्मेडिजिन बर्लिन, इंस्टीट्यूट फ्यूर फार्माकोलोगी, बर्लिन, प्रो डॉ माइकल श्प में उत्पादित किया गया था।
    सावधानी: एडेनोवायरल ट्रांसड्यूक्शन को बीएसएल-2 सुरक्षा स्तर के काम के रूप में वर्गीकृत किया गया है, और उचित सुरक्षा उपायों की कानूनी रूप से आवश्यकता होती है।

5. कार्यात्मक प्रयोग

नोट: रिकॉर्डिंग एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जाता है। GtACR1 के सह सक्रियण से बचने के लिए कंडेनसर में एक लाल बैंड-पास फिल्टर (630/20 एनएम) द्वारा ट्रांसमिशन लाइट को फ़िल्टर करें।

  1. पैच-क्लैंप सेटअप
    1. एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर के संयोजन में एम्पलीफायर का उपयोग करें। वर्तमान और वोल्टेज डेटा रिकॉर्ड करने के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: रिकॉर्ड किए गए डेटा को 10 किलोवाट पर डिजिटाइज्ड किया जाता है और 5 किलोवाट पर फ़िल्टर किया जाता है।
  2. कार्बन फाइबर सेटअप
    1. ऑप्टिकल विपरीत में परिवर्तन पर नज़र रखने के द्वारा कार्बन फाइबर की स्थिति और सरकोमर लंबाई का पता लगाने के लिए एक कैमरे का उपयोग करें (कार्बन फाइबर गहरे रंग की संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं, जो स्ट्रेनेड सेल पैटर्न पर मढ़ा जाता है)। सेटअप का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 3में दिखाया गया है ।
      नोट: सरसेमे की लंबाई की गणना वास्तविक समय में स्ट्रीशन पैटर्न के पावर स्पेक्ट्रम के फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) का उपयोग करके की जाती है।

Figure 3
चित्रा 3: कार्बन फाइबर माप नप के लिए प्रायोगिक सेटअप का चित्रण योजना। (ड्राइंग पैमाने पर नहीं है)। एक कोशिका पर दो कार्बन फाइबर जुड़े होते हैं और उनकी स्थिति पीजो पोजिशनर द्वारा नियंत्रित होती है। तेज गेंदबाज विद्युत क्षेत्र उत्तेजना के लिए प्रयोग किया जाता है। बहु रंग एलईडी वस्तु विमान में कोशिकाओं की रोशनी के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के एपीफ्लोरेसेंस बंदरगाह में युग्मित कर रहे हैं। एलईडी पावर को एक समर्पित नियंत्रण बॉक्स के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है, जो डिजिटल-एनालॉग-कनवर्टर (डीएसी) के डिजिटल आउटपुट के माध्यम से डिजिटल दालों को प्राप्त करता है। डैक फ्लोरेसेंस सिस्टम इंटरफेस के साथ एनालॉग आउटपुट के माध्यम से संचार करता है। सेलुलर इमेजिंग के लिए एक ब्लैक एंड-व्हाइट कैमरा (245 लाइनों द्वारा 774 पिक्सल) सरकोमेयर लंबाई और कार्बन फाइबर झुकने को ट्रैक करने के लिए कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. समय पर रोशनी
    1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और एक बाहरी कस्टम-निर्मित एलईडी नियंत्रण बॉक्स के माध्यम से हल्के-गेटेड आयन चैनलों की सक्रियता के लिए प्रकाश प्रदान करें, जिसमें विभिन्न रंग के तीन एलईडी (460 एनएम, 525 एनएम, 640 एनएम, सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल (सामग्रीकी तालिका देखें) में उत्पन्न बाहरी समय से लाइव (टीटीएल) दालों के माध्यम से एलईडी के नियंत्रण की अनुमति देने के लिए नियंत्रण बॉक्स के लिए माइक्रोकंट्रोलर और ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) कोड को संशोधित करें। डिजिटल-एनालॉग-कनवर्टर के माध्यम से एलईडी कंट्रोल बॉक्स में टीटीएल दालें संचारित करें।
    3. एलईडी ड्राइव और जीयूआई के माध्यम से दालों की संख्या का चयन करें। जीयूआई से कमांड प्राप्त करने पर माइक्रोकंट्रोलर एक नए कोर पर एक प्रक्रिया शुरू करता है। इस प्रक्रिया में टीटीएल इनपुट के साथ-साथ जीयूआई से एक कंट्रोल स्विच सेट की लगातार जांच की जाएगी।
    4. जब टीटीएल इनपुट सकारात्मक होता है, तो माइक्रोकंट्रोलर एलईडी को चालू कर देता है और फिर टीटीएल इनपुट की जांच शुरू करता है। एक बार जब टीटीएल सिग्नल शून्य पर लौटता है, तो माइक्रोकंट्रोलर एलईडी बंद कर देता है और एक के द्वारा छोड़ी गई दालों की संख्या को कम कर देता है। यदि किसी भी बिंदु पर नियंत्रण स्विच गलत है या दालों की संख्या शून्य है, तो माइक्रोकंट्रोलर जीयूआई से एक नया आदेश प्राप्त होने तक इस प्रक्रिया को रोकता है।
    5. सीधे माइक्रोस्कोप के बैकपोर्ट में एलईडी जोड़े।
  2. ऑब्जेक्ट प्लेन में हल्की तीव्रता का निर्धारण
    1. एक चरण माइक्रोमीटर (उद्देश्य आवर्धन 40x, ए = 0.8 मिमी2)के साथ प्रबुद्ध क्षेत्र को मापें।
    2. एक ऑप्टिकल बिजली मीटर का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. प्रयोगों के लिए सेटिंग्स को परिभाषित करें: उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (525 एनएम), उद्देश्य आवर्धन (40x), उत्तेजना फिल्टर (530/20 एनएम) या दर्पण, और विभिन्न एलईडी-इनपुट वोल्टेज पर प्रकाश शक्ति [डब्ल्यू] को पढ़ें।
    4. प्रकाश की तीव्रता [डब्ल्यू/एमएम 2] को प्रकाशित क्षेत्र [मिमी2](यहां: 0.8 मिमी2)द्वारा विभाजित करके प्रकाश तीव्रता [डब्ल्यू/मिमी2]की गणना करें।
      नोट: चरण 5.6 में संबंधित प्रोटोकॉल के साथ वास्तविक प्रकाश शक्ति को मापने के लिए अगर 10 एमएस पहुंच और लंबी अवधि के छोटे प्रकाश पल्स अवधि निर्धारित मूल्य पकड़(पूरक चित्रा 1)की जांच करने के लिए ।
  3. पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए तैयारी
    1. पानी की आवश्यकताओं के लिए निम्नलिखित बाहरी और आंतरिक समाधान(तालिका 4; तालिका 1देखें) तैयार करें ।
    2. 300 ± 5 mOsmol/L Aliquot आंतरिक समाधान और दुकान पर -20 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ग्लूकोज के साथ ऑस्मोलारिटी समायोजित करें।
      नोट: रिकॉर्डिंग के दिन के लिए बर्फ पर आंतरिक समाधान रखें। कमरे के तापमान पर बाहरी समाधान रखें। यहां वर्णित पैच-क्लैंप समाधान पहले से इस्तेमाल किए गए समाधानों पर आधारित थे औरसीएल-एकाग्रता को कम, अधिक शारीरिक स्तर7में बदल दिया गया था। संबंधित ऑप्टोजेनेटिक एक्ट्युलेटर की आयन चयनात्मकता के लक्षण वर्णन के लिए, हम अतिरिक्त और इंट्रासेलर समाधान19में प्रमुख आयनों (जैसे, सीएल-,एनए+,के+,एच+)की सांद्रता को अलग करने का सुझाव देते हैं।
    3. पिपेट होल्डर से रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड उतार कर चांदी के तार से चांदी की क्लोराइड परत को बहुत बारीक सैंडपेपर से हटा दें।
      नोट: प्रत्येक मापने वाले दिन की शुरुआत में यह कदम उठाएं।
    4. तार को 1.5 वी बैटरी के सकारात्मक ध्रुव से कनेक्ट करें और 10 मिन के लिए सिल्वर क्लोराइड कोटिंग के लिए 3 एम केसीएल समाधान में विसर्जित करें।
      नोट: नकारात्मक ध्रुव 3 एम केसीएल समाधान में डूबे संदर्भ चांदी के तार से जुड़ा हुआ है।
    5. मापक कक्ष तैयार करें: मापने वाले कक्ष के फ्रेम पर सिलिकॉन तेल डालें और फ्रेम के शीर्ष पर एक कवरस्लिप (व्यास: 50 मिमी, मोटाई नंबर 0) रखें जिसे कक्ष सील कर दिया गया है।
    6. स्नान में संदर्भ चांदी/चांदी-क्लोराइड पैलेट इलेक्ट्रोड डालकर सिर के चरण से जोड़ें।
    7. सोडा लाइम ग्लास केशिकाओं (बाहरी व्यास: 1.55 मिमी, आंतरिक व्यास: 1.15 मिमी) से सोडा लाइम ग्लास केशिकाओं (बाहरी व्यास: 1.15 मिमी) से माइक्रोपाइपेट पुलर (सामग्री की तालिकादेखें) से 1.7 - 2.5 MΩ पैच पिपेट खींचें खींचें।
    8. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें और झिल्ली परीक्षण (15 एमएस, बेसलाइन 0 एमवी के लिए पल्स 10 एमवी) को समायोजित करें।
बाहरी स्नान समाधान आंतरिक पिपेट समाधान
नैल [एमएम] 140 -
केसीएल [एमएम] 5.4 11
CaCl2 [एमएम] 1 -
एमजीसीएल2 [एमएम] 2 2
ग्लूकोज [एमएम] 10 -
हेप्स [एमएम] 10 10
कश्मीर-एस्पार्टेट [एमएम] - 119
एमजी-एटीपी [एमएम] - 3
ईजीटीए [एमएम] - 10
पीएच 7.4 (नाओएच) 7.2 (कोह)
ओस्मोलैरिटी (ग्लूकोज के साथ समायोजित करें) [mOsmol/L] 300 ± 5 300 ± 5

तालिका 4: पैच-क्लैंप समाधान।

  1. पैच-क्लैंप माप के लिए प्रोटोकॉल
    1. -74 एमवी की होल्डिंग क्षमता पर वी-क्लैंप मोड में फोटोएक्टिवेशन प्रोटोकॉल रिकॉर्ड करें। 300 एमएस की हल्की दालों का इस्तेमाल करें।
      नोट: हम सुसंस्कृत मुख्यमंत्री की आराम झिल्ली क्षमता के करीब वी-क्लैंप रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने का सुझाव देते हैं (आई-क्लैंप में स्थापित; हमारे हाथों में-७९ एमवी और-७७ एमवी दोनों के लिए ट्रांसड्यूड और गैर-ट्रांसड्यूड सीएम19)। हौसले से अलग कोशिकाओं को -79 एमवी(पूरक चित्रा 2,तरल जंक्शन क्षमता के लिए सुधार के बाद सभी मूल्यों) की झिल्ली क्षमता आराम करने का मतलब दिखाते हैं।
    2. 0 पीए पर आई-क्लैंप मोड में रिकॉर्ड एपी।
      1. इलेक्ट्रिकल पेसिंग के लिए 10 एमएस की मौजूदा दालें इंजेक्ट करें (0 पीए से 10 एमएस के भीतर सेट वैल्यू तक रैंप), 0.25 हर्ट्ज और एपी को प्रकाश में लाने की दहलीज ढूंढें। 50% अधिक सीमा के वर्तमान इंजेक्शन द्वारा एपी रिकॉर्ड करें।
      2. ऑप्टिकल पेसिंग के लिए विश्वसनीय एपी प्रकाश में लाना करने के लिए न्यूनतम प्रकाश तीव्रता पर 10 एमएस, 0.25 हर्ट्ज की हल्की दालों का उपयोग करें।
    3. 0 पीए पर आई-क्लैंप मोड में फोटोसंकोच रिकॉर्ड करें। प्रकाश में लाना एपी के रूप में कदम ५.६.२.१ में वर्णित है और 4 mW/mm2 पर ६४ एस के लिए निरंतर प्रकाश लागू करने के बाद 15 विद्युत ट्रिगर एपी ।
      नोट: चित्रा 6एफ एक फोटोसंकोच प्रोटोकॉल दिखाता है जहां निरंतर प्रकाश उच्च वर्तमान इंजेक्शन लागू होते हैं। 1.5 गुना सीमा से शुरू (यहां: 0.7 nA) इंजेक्शन वर्तमान 0.1 nA (अंतिम स्तर: 2.2 nA) के चरणों में बढ़ा या गया था। सभी परीक्षण वर्तमान आयामों पर, निरंतर प्रकाश आवेदन एपी पीढ़ी को बाधित करता है।
      1. एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, प्रकाश आवेदन के बिना 64 एस के लिए विद्युत उत्तेजना को रोकें।
  2. पैच-क्लैंप प्रयोग
    नोट: अंधेरे में निम्नलिखित प्रयोग ों को करें (लाल बत्ती का उपयोग नीले/हरे रंग के प्रकाश-सक्रिय उपकरणों के लिए किया जा सकता है)।
    1. बाहरी समाधान के साथ कक्ष को मापने में कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप रखें और फ्लोरोसेंट सीएम का चयन करें।
      नोट: ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को बैंड-पास उत्तेजना फिल्टर (450 एनएम - 490 एनएम), 510 एनएम डिक्रोइक मिरर और 515 एनएम लांग-पास उत्सर्जन फिल्टर के संयोजन में नीले रंग के एलईडी (460 एनएम) का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। यदि अन्य फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग किया जाता है, तो इसी एलईडी और फ्लोरेसेंस फिल्टर सेट का उपयोग करें। यदि एक उच्च ट्रांसड्यूक्शन दक्षता प्राप्त की जाती है (हमारे हाथों में और Gt;gt;99% GtACR1 एडेनोवायरस के साथ), कार्यात्मक प्रयोगों से पहले eGFP फ्लोरेसेंस की जांच करने की कोई आवश्यकता नहीं है; यह संभावित GtACR1 पूर्व सक्रियण से बचा जाता है।
    2. आंतरिक समाधान के साथ पैच पिपेट भरें। सुनिश्चित करें कि टिप में कोई हवा बुलबुले नहीं हैं।
    3. पिपेट धारक को पिपेट संलग्न करें, आंतरिक समाधान में रिकॉर्डिंग सिल्वर-क्लोराइड लेपित चांदी के तार को डालें।
    4. सेल-संलग्न विन्यास तक पहुंचने के बाद, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में पूरे सेल मोड पर स्विच करें- 74 एमवी की होल्डिंग क्षमता के साथ। पूरे सेल विन्यास तक पहुंचने के लिए नकारात्मक दबाव को धीरे से लागू करके झिल्ली को तोड़ना। यह मापा क्षमता में तत्काल वृद्धि से संकेत मिलता है ।
    5. धारा 5.6 में वर्णित प्रोटोकॉल चलाएं।
  3. कार्बन फाइबर तकनीक
    1. कार्बन फाइबर का उत्पादन करें।
      1. निम्नलिखित मापदंडों के साथ ग्लास केशिकाओं का उपयोग करें: बाहरी व्यास: 2.0 मिमी, आंतरिक व्यास: 1.16 मिमी, लंबाई: 100 मिमी (सामग्री की तालिकादेखें)। एक माइक्रोपाइपेट पुलर का उपयोग करना, एक ही लंबाई के दो पिपेट (कुल टेपर लंबाई ~ 11 मिमी, चित्रा 5)में ~ 30 माइक्रोन के अंतिम आंतरिक व्यास के लिए कांच केशिका खींचो।
        नोट: पहले और दूसरे पुल के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स क्रमशः 85.2% (पुलर के अधिकतम उत्पादन के अनुपात में) और 49.0% हैं (फिलामेंट के पुलर, प्रकार और उम्र पर निर्भर करेगा)।
      2. 12 वी, 24 ए की सेटिंग्स का उपयोग करके स्वयं निर्मित माइक्रो फोर्ज के साथ 45 डिग्री तक पिपेट को मोड़ें (पिपेट झुकने सेटअप के विवरण के लिए चित्रा 4 देखें)।
        1. ओरिएंटेशन सर्कल (5) में लाल रेखा पर केशिका (2) को संरेखित करें, केशिका की स्थिति को स्थिर रखें ताकि झुकाव सर्कल (4.5 मिमी के त्रिज्या) के केंद्र के बाद मोड़ भाग की लंबाई हमेशा समान हो।
        2. शराबी (3) के साथ केशिका की नोक को नीचे धकेलकर केशिका को 45 डिग्री (हरी रेखा) तक मोड़ें और फिलामेंट (4) को गर्म करके बनाता है जब तक कि केशिका शराबी को हटाने के बाद भी 45 डिग्री कोण को कैप्चर नहीं करता।
      3. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत ग्लास केशिका के ठीक टिप में कार्बन फाइबर (प्रो जीन-येव्स ले गुएननेक से प्रदान) फिट करें। पकड़ बढ़ाने और फाइबर को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करने के लिए अंत में सॉफ्ट ट्यूबिंग के साथ ठीक संदंश का उपयोग करें।
        नोट: इन फाइबर माइक्रोस्ट्रक्चर की विशेषता है, जो फाइबर और कोशिकाओं के बीच संपर्क सतह को बढ़ाते हैं, जिससे20आसंजन में सुधार होता है।
      4. कार्बन फाइबर को 2 मिमी की लंबाई में काट लें और केशिका के सामने के खंड में फाइबर को ठीक करने के लिए सुपर गोंद (साइनोक्राइलेट) का उपयोग करें।
        नोट: फाइबर जितने लंबे समय तक होते हैं, उतना ही वे एक ही बल के आवेदन पर झुकते हैं।
    2. कार्बन फाइबर को कैलिब्रेट करें।
      1. 0.05 एमएन/वी की संवेदनशीलता और 0 - 0.5 एमएन (सामग्री की तालिकादेखें) की एक बल सीमा के साथ एक बल ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर कार्बन फाइबर को कैलिब्रेट करें।
        नोट: यह सेटअप "पुल" के बजाय संपीड़न को मापने के लिए कस्टम-मेड है।
      2. केशिका को कार्बन फाइबर के साथ एक धारक को संलग्न करें जो माइक्रोजोड़क और पीजो मोटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
      3. बल सेंसर के संपर्क में फाइबर की नोक रखें, लेकिन किसी भी बल का उत्पादन किए बिना और पीजो मोटर को सेंसर की ओर 10 माइक्रोन (60 माइक्रोन का कुल आंदोलन) के चरणों में स्थानांतरित करें और वाल्ट में मापा वोल्टेज(ई)पढ़ें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि बल ट्रांसड्यूसर कार्बन फाइबर के मुक्त अंत की बहुत टिप से संपर्क किया जाता है।
      4. इन मापों को तीन बार दोहराएं।
      5. प्रत्येक पीजो स्थिति के लिए बल की गणना करने के लिए फॉर्मूला 1 का उपयोग करें (पीजो मोटर चरणों के बीच मापा वोल्टेज काअंतर):

        नोट: बल ट्रांसड्यूसर की संवेदनशीलता ट्रांसड्यूसर के मॉडल पर निर्भर है (यहां: ०.०५ mN/V = ५० μN/V) । लाभ नियंत्रक पर सेट किया जा सकता है।
      6. पीजो स्थिति के खिलाफ बल [μN] प्लॉट करें। ढलान फाइबर कठोरता [μN/μm] से मेल खाती है ।
    3. करार सीएम का रिकॉर्ड फोर्स।
      नोट: अंधेरे में निम्नलिखित प्रयोग करें (लाल बत्ती का उपयोग नीले/हरे रंग की रोशनी-सक्रिय उपकरणों के लिए किया जा सकता है)।
      1. पॉली-हेमा के साथ मापक कक्ष की सतह को कोट कर दें। बाहरी स्नान समाधान के साथ मापने वाले कक्ष को भरें और कक्ष (चरण 4.9) में सुसंस्कृत सेल निलंबन की कुछ बूंदें डालें।
      2. स्टेज माइक्रोजोड़क के लिए कार्बन फाइबर के साथ केशिकाओं को संलग्न करें। छोटी हरी-हल्की दालों के आवेदन द्वारा संकुचन को प्रेरित करने की क्षमता की जांच करके GtACR1-व्यक्त सीएम का चयन करें। मापने वाले कक्ष की सतह के पास-क्षैतिज कार्बन फाइबर संरेखित करें।
      3. कोशिका की सतह पर पहले फाइबर को कम करें। सीएम के दूसरे छोर पर पहले फाइबर के समानांतर दूसरा फाइबर संलग्न करें। आदर्श संरेखण कोशिका धुरी के निकट लंबवत है।
        नोट: धीरे से नीचे की सतह पर सेल धक्का द्वारा फाइबर संलग्न करते हैं । दूसरा फाइबर संलग्न करने से पहले दबाव जारी करें। दूसरा फाइबर संलग्न करके कोशिका को न फैलाएं।
      4. दोनों फाइबर सेल पर संलग्न होने के बाद, फाइबर उठाएं, इसलिए सेल का कक्ष सतह से अब कोई संपर्क नहीं है और बिना किसी घर्षण के अनुबंध करने में सक्षम है।
      5. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में सरकोरेस को केंद्रित करें (सामग्री की तालिकादेखें) और फाइबर के बीच सरकोवर लेंथ ट्रैकिंग विंडो(चित्रा 7ए आई(3)सेट करें।
        नोट: जिसके परिणामस्वरूप FFT पावर स्पेक्ट्रम(चित्रा 7एक मैं (2)आदर्श एक तेज चोटी से पता चलता है, औसत sarcomere लंबाई का प्रतिनिधित्व ।
      6. एज डिटेक्शन मॉड्यूल का उपयोग करके फाइबर झुकने को ट्रैक करें। लाल और हरे रंग की खिड़की के साथ पता लगाने के क्षेत्रों को सेट करें और प्रकाश तीव्रता ट्रेस(चित्र7ए III)के पहले व्युत्पन्न पर एक सीमा (लाल और हरे रंग की क्षैतिज रेखा) को परिभाषित करें।
      7. 0.25 हर्ट्ज पर सेल को ऑप्टिकली गति देना शुरू करें (यदि संभव हो, तो तेजी से पेसिंग दरों की कोशिश करें) और सरकोवर लंबाई और फाइबर झुकने को ट्रैक करें।
        नोट: फाइबर धारक की स्थिति, एलईडी ट्रिगर और इलेक्ट्रिक उत्तेजना दालों को डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें)।
      8. कम से कम 15 ऑप्टिकली प्राप्त संकुचन रिकॉर्ड करने के बाद, क्षेत्र-कोशिका विद्युत रूप से उत्तेजित (सामग्री की तालिकादेखें)। दहलीज वोल्टेज के 1.5 गुना लागू करके संकुचन और रिकॉर्ड प्रकाश में लाना करने के लिए सीमा का पता लगाएं।
      9. अवरोध प्रोटोकॉल के लिए, संकुचन प्राप्त करने के लिए विद्युत उत्तेजनाओं को लागू करें और फिर 64 एस (विभिन्न प्रकाश तीव्रता पर) के निरंतर प्रकाश को बेनकाब करें।

Figure 4
चित्रा 4: पिपेट झुकने सेटअप। (1) केशिका की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए बाईं ओर माइक्रोजोड़क का उपयोग किया जाता है, और दाईं ओर एक दूसरे माइक्रोजोड़क का उपयोग इसे मोड़ने के लिए किया जाता है। (2) केशिका। (3) शराबी । (4) माइक्रोफोर्ज। (5) ओरिएंटेशन सर्कल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कार्बन फाइबर के साथ पिपेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
    नोट: प्रयोग के बाद तरल जंक्शन क्षमता के लिए सभी रिकॉर्ड और कमांड वोल्टेज को सही करें। उपकरण जंक्शन संभावित कैलकुलेटर (तालिका 4में बताए गए पैच-क्लैंप समाधानों के लिए: 21 डिग्री सेल्सियस पर 14.4 एमवी) द्वारा डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में तरल जंक्शन क्षमता निर्धारित करें। रिकॉर्ड/कमांड वोल्टेज से तरल जंक्शन क्षमता घटाएं।
    1. आई-क्लैंप एपी रिकॉर्डिंग के लिए, ऑप्टिकल पेसिंग बनाम इलेक्ट्रिकल पेसिंग की जांच करें। कस्टम-लिखित स्क्रिप्ट(पूरक सामग्री)के साथ 20 और 90% पुनर्ध्रुवीकरण पर एपी अवधि (एपी) की गणना करें। आराम झिल्ली क्षमता और एपी आयाम निर्धारित करें।
      नोट: एपीडी का निर्धारण के रूप में वांग के एट अल21 में वर्णित है . abf फ़ाइलों को लोड करने के लिए आम तौर पर निम्नलिखित लिंक के माध्यम से सुलभ है: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload। औसत एपीडी मूल्यों के लिए कम से कम 6 एपी.
    2. वी-क्लैंप फोटोएक्टिवेशन के लिए, जांच ें कि बेसलाइन 0 पीए पर है या नहीं। यदि बेसलाइन को शून्य पर समायोजित नहीं किया जाता है। -74 एमवी पर 300 एमएस हल्की दालों से शुरू हुए रिकॉर्ड किए गए वर्तमान का विश्लेषण करें। डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा स्थानांतरित करें और चोटी और औसत स्थिर वर्तमान निर्धारित करें।
  2. कार्बन फाइबर प्रयोग
    1. ऑप्टिकल पेसिंग के दौरान संकुचन रिकॉर्डिंग: डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में दर्ज डेटा लोड करें और कार्बन फाइबर झुकने और सरकोवर लंबाई परिवर्तन के बेसलाइन और अधिकतम को पढ़ें।
      नोट: एक स्थिर रिकॉर्डिंग के 10 संकुचन के लिए औसत मूल्य।
    2. सेल चौड़ाई को मापें और एक अंडाकार क्रॉस-सेक्शन(चित्रा 7बी II)मानते हुए सेल के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की गणना करें।
      नोट: एक अंडाकार के क्षेत्र के लिए फार्मूला एक = एक = a'b (फॉर्मूला 2) है जहां एक केंद्र से वर्टेक्स और बी की दूरी है केंद्र से सह-वर्टेक्स की दूरी है। हमारे मामले में यह एक = (सेल की चौड़ाई) /2 और बी = (सेल की मोटाई) /2 का मतलब है । निशिमुरा एट अल22 के अनुसार सीएम की मोटाई सेल की चौड़ाई का एक तिहाई होने का अनुमान लगाया जा सकता है ताकि एक = (1/2) चौड़ाई · (1/2) 'मोटाई = · (1/4) चौड़ाई · (1/3) चौड़ाई = (1/12) चौड़ाई2।
    3. अंत सिस्टोलिक बल (एफ) की गणना करें:
    4. अंत सिस्टोलिक सेल विरूपण (ईएसडी) की गणना करें:

      नोट: आगे संकुचन मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है: आराम सरकोवर लंबाई, पीक करने के लिए समय, समय के लिए ९०% छूट, आंशिक sarcomere छोटा, संकुचन और विश्राम के अधिकतम वेग (सॉफ्टवेयर अधिग्रहण मैनुअल देखें) ।

Representative Results

GtACR1-eGFP सुसंस्कृत खरगोश सीएम(चित्रा 6 डालने) में व्यक्त किया गया था और फोटोकरंट पैच-क्लैंप तकनीक के साथ मापा गया था । GtACR1 के फोटोएक्टिवेशन से पता चलता है -74 एमवी पर बड़ी आवक निर्देशित धाराएं। चित्रा 6में 4 mW/mm2 परएक चोटी वर्तमान(मैंपी)२४५ पीए है । एपी या तो विद्युत(चित्रा 6बी)या ऑप्टिकली(चित्रा 6सी)वर्तमान इंजेक्शन के साथ १.५ बार दहलीज, या 10 एमएस की छोटी depolarizing प्रकाश दालों, क्रमशः शुरू कर रहे थे । एपीडी मूल्यों का विश्लेषण करते हुए, विद्युत पुस्तक वाले सीएम 0.24 ± 0.08 एस के एपीडी 20 और 0.75 ± 0.17 एस के एपीडी 90 दिखाते हैं, जबकि ऑप्टिकली पुस्तक सीएम 0.31 ± 0.08 एस के एक एपीडी 20 और 0.81 ± 0.19 एस (एसई, एन = 5, एन = 2) के एक एपीडी 90 दिखाते हैं, यहां प्रस्तुत उदाहरण में एपीडी 20इलेक्ट्रिकल = 0.17 एस; एपीडी 20ऑप्टिकल = 0.27 एस और एपीडी 90इलेक्ट्रिकल = 0.61 एस; एपीडी 90ऑप्टिकल = 0.68 एस; चित्रा 6डी)। ऑप्टिकली पुस्तक सीएम एक धीमी एपी शुरुआत(चित्रा 6डी)दिखाते हैं । सीएम सक्रियण निरंतर रोशनी पर बाधित किया गया था (६४ एस के लिए, 4 mW/mm2)क्लोराइड की उलट क्षमता की दिशा में झिल्ली क्षमता ध्रुवीकरण द्वारा, यहां-५८ mV(चित्रा 6ई)। 1.5 गुना सीमा से उच्च वर्तमान इंजेक्शन एपी पीढ़ी(चित्रा 6एफ)प्रकाश में लाना नहीं है । उत्पन्न पीक बलों कार्बन फाइबर झुकने से निर्धारित किया गया(चित्रा 7बी, सी, ई)। सीएम ने ऑप्टिकल पेसिंग(चित्रा 7सी)के बाद इलेक्ट्रिकल पेसिंग(चित्रा 7बी)और 261 माइक्रोन/एमएम 2 पर 232 माइक्रोन/एमएम2 जेनरेट किए । लंबे समय तक हरी-हल्की दालें संकुचन को रोकती हैं(चित्रा 7ई)। 64 एस के लिए ऑप्टिकल अवरोध के बाद, पुनर्घटित संकुचन एक कम संकुचन बल उत्पन्न करते हैं, और खरगोश के सेमी से डायस्टोलिक कैल्शियम हानि को ध्यान में रखते हुए ~ 10 संकुचन (0.25 हर्ट्ज, चित्रा 7डीपर पेसिंग) के बाद बेसलाइन की ओर पुनर्जन्म मूल्य ों को ठीक किया जाता है।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि पैच-विद्युत और ऑप्टिकली पुस्तक/बाधित सीएम की रिकॉर्डिंग । (A)प्रतिनिधि फोटोकरंट-७४ एमवी पर ३०० एमएस, 4 mW/mm2की हल्की नब्ज का इस्तेमाल करते हुए । मैंपी चोटी वर्तमान इंगित करता है। इन्डालने से जीटीएसीआर1-ईजीएफपी पॉजिटिव सेल का पता चलता है। सीएमकी लाइट दालों का इस्तेमाल करते हुए 0 पीए पर रिप्रेजेंटेटिव एपीरिकॉर्डिंग 0 एमएस, 0.6 एए की वर्तमान रैंप का इस्तेमाल करते हुए सीएम ने 0 पीए पर रिकॉर्डिंगकी। (D)शीर्ष ग्राफ इलेक्ट्रिकली (ब्लू) और ऑप्टिकली (ग्रीन) सक्रिय सीएम के10 एपी के ओवरले को दर्शाता है । एपी झिल्ली क्षमता (डीवी/डीटी मैक्स) में अधिकतम परिवर्तन से गठबंधन किया गया । नीचे ग्राफ ऑप्टिकलऔर विद्युत ट्रिगर एपी(ईऑप्टिकल-ईइलेक्ट्रिकल)के बीच झिल्ली क्षमता के अंतर को दर्शाता है। (ई)विद्युत रूप से ट्रिगर एपी को 64 एस, 4 एमडब्ल्यू/एमएम2के निरंतर प्रकाश के तहत बाधित किया गया था । (एफ)एपी को निरंतर प्रकाश के तहत 1.5 गुना सीमा (0.1 एए से 2.2 एए तक) के चरणों में 0.7 एए से अधिक वर्तमान इंजेक्शन से बाधित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ऑप्टिकलऔर विद्युत पुस्तक/बाधित सीएम की कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि डेटा । (A)डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन। छवि (I) सरकोरे लंबाई की गणना के लिए खिड़की के साथ मापा सीएम से पता चलता है । सेल चौड़ाई नारंगी रंग में लेबल है। (1) प्रासंगिक आवृत्तियों की सीमा। (2) एफएफटी पावर स्पेक्ट्रम सेल पर सरकोवर स्पेसिंग की फ्रीक्वेंसी दिखाता है । औसत सरकोवर लंबाई की गणना पीक फ्रीक्वेंसी से की जाती है। (3) सरकोरे लेंथ ट्रैकिंग विंडो । (4) तीव्रता ट्रेस। (5) हैमिंग विंडो द्वारा गुणा तीव्रता ट्रेस खिड़की की तीव्रता ट्रेस है। योजना (II) सेल के अण्डाकार क्रॉस-सेक्शन को दिखाती है। नारंगी में चौड़ाई और धराशायी नीले रंग में मोटाई। छवि (III) संबंधित पता लगाने बक्से के साथ कार्बन फाइबर की स्थिति से पता चलता है, लाल और हरे रंग में सही में छोड़ दिया । (6) तीव्रता ट्रेस। (7) तीव्रता ट्रेस का पहला व्युत्पन्न (डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर मैनुअल देखें)। (ख)विद्युत रूप से प्राप्त संकुचन ों का प्रतिनिधि पता लगाते हैं । पैनल (I) सरकोमे यर लंबाई छोटा, पैनल (द्वितीय) दो कार्बन फाइबर के बीच की दूरी से पता चलता है । (C)ऑप्टिकली प्राप्त संकुचन (525 एनएम, 0.25 हर्ट्ज, 10 एमएस, 6 एमडब्ल्यू/एमएम2)के प्रतिनिधि ट्रेस। पैनल (I) सरकोमे यर लंबाई छोटा, पैनल (द्वितीय) दो कार्बन फाइबर के बीच की दूरी से पता चलता है । (D)एपी पीढ़ी के अवरोध के कारण ठहराव के बाद संकुचन 1 से 11 तक पीक फोर्स उत्पन्न की । (ई)निरंतर रोशनी (525 एनएम, 64 एस, 6 एमडब्ल्यू/एमएम2)के तहत संकुचन के ऑप्टिकल अवरोध का प्रतिनिधि पता लगाते हैं। पैनल (I) सरकोमे यर लंबाई छोटा, पैनल (द्वितीय) दो कार्बन फाइबर के बीच लंबाई से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक क्षेत्र
Acr एनियन चैनलोडोपसिन
एपी कार्रवाई की क्षमता
Apd कार्रवाई की संभावित अवधि
सीएफयू कॉलोनी बनाने की इकाई
Chr चैनलोडोपसिन
सेमी कार्डियोमायोसाइट
ईजीएफपी बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन
Esd अंत सिस्टोलिक सेल विरूपण
यूरोपीय संघ एंडोटॉक्सिन इकाइयां
F बल
Fft फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म
जीटीएसीआर गिलार्डिया थेटा एनियन चैनल्रोडोप्सिन
Gui ग्राफिकल यूजर इंटरफेस
आई-क्लैंप वर्तमान-क्लैंप
आइयू अंतरराष्ट्रीय इकाइयां
Moi संक्रमण की बहुलता
पाली-हेमा पाली (2-हाइड्रोक्सेथिल मेथेक्रिलेट)
वी-क्लैंप वोल्टेज-क्लैंप

तालिका 5: संक्षिप्त नामों की सूची।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: ऑप्टिकल बिजली मीटर के साथ प्रकाश तीव्रता माप। }4 एमडब्ल्यू/एमएम2पर 10 एमएस हल्की दालों का मापन । (ख) 4 mW/mm2पर 64 एस की निरंतर रोशनी का मापन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: हौसले से अलग हुए मुख्यमंत्री के गुण और संस्कृति में उनके संरचनात्मक अनुकूलन। (A)एपी एक हौसले से अलग सीएम की रिकॉर्डिंग (1.11 ± 0.34 एस के एपीडी 20, एपीडी 90 के 1.96 ± 0.32 एस, एन = 7, एन = 2)। मतलब -79.3 ± 0.8 एमवी (एन = 7, एन = 2) की झिल्ली क्षमता आराम। (ख)एक विद्युत पुस्तक हौसले से अलग सीएम की कार्बन फाइबर रिकॉर्डिंग। 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2) का मतलब पीक फोर्स। (ग)एक हौसले से अलग हुए मुख्यमंत्री (I) की कॉन्फोकल छवियां; संस्कृति में 48 घंटे बाद ट्रांसड्यूड (II) और ट्रांसड्यू (III) सीएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक सामग्री: एपीडी और आराम झिल्ली क्षमता निर्धारित करने के लिए MatLab स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

जबकि ऑप्टोजेनेटिक उपकरण एक गैर-आक्रामक तरीके से उत्तेजनीय सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के मॉड्यूलेशन को सक्षम करते हैं, उन्हें एक विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए सर्वोत्तम उपलब्ध उपकरण चुनने की अनुमति देने के लिए विभिन्न सेल प्रकारों (जैसे, सीएम) में पूरी तरह से लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। पैच-क्लैंप तकनीक सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का आकलन करने के लिए एक मानक विधि है। पूरे सेल विन्यास में, यह एक प्रकाश उत्तेजना के बाद प्लाज्मा झिल्ली या झिल्ली वोल्टेज में लौकिक परिवर्तन भर में फोटो सक्रिय धाराओं रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है/ विद्युत उत्तेजना के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर भी सीएम संकुचन को प्रभावित करता है। हम मायोसाइट्स की यांत्रिक गतिविधि पर ऑप्टिकल पूछताछ के प्रभावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए सरकोमेरे ट्रैकिंग और कार्बन फाइबर-असिस्टेड फोर्स माप का उपयोग करते हैं।

हम सीएम में हल्के गेटेड क्लोराइड चैनल, GtACR1 के बुनियादी प्रभावों को चित्रित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मॉडल प्रणाली के रूप में, हमने खरगोश के सीएम को चुना, क्योंकि उनकी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताएं (उदाहरण के लिए, एपी आकार और रिफ्रैक्टरी अवधि) कृंतक सीएम की तुलना में मानव सीएम में देखे गए लोगों के समान होती हैं। इसके अलावा, खरगोश सीएम को कई दिनों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो एडेनोवायरल डिलीवरी और GtACR1-eGFP की अभिव्यक्ति के लिए काफी लंबा है। विशेष रूप से, अलग-थलग पड़े मुख्यमंत्री समय के साथ संस्कृति में अपने संरचनात्मक गुणों को बदलते हैं, जिसमें सेल एंडिंग की पूर्णाहुति और क्रॉस-स्ट्रीशन, टी-ट्यूबलर सिस्टम और कैवेओला23,24का क्रमिक नुकसान शामिल है। इसके अनुरूप, सुसंस्कृत सीएम में कार्यात्मक परिवर्तन ों की सूचना दी गई है: आराम झिल्ली क्षमता का ध्रुवीकरण, एपी का दीर्घीकरण और सेलुलर सीए2 + हैंडलिंग में परिवर्तन। संस्कृति में सेलुलर रूपांतरों की समीक्षा के लिए, कृपया Louch एट अल25देखें । पूरक चित्रा 2 यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके सुसंस्कृत सीएम(चित्रा 6, चित्रा 7)में मनाए गए लोगों के साथ तुलना के लिए हौसले से अलग हुए सीएम के अनुकरणीय एपी और संकुचन माप को दर्शाता है।

पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग फोटोकरंट गुणों (जैसे, आयाम और काइनेटिक्स) के प्रत्यक्ष माप और उच्च लौकिक संकल्प पर झिल्ली क्षमता या एपी विशेषताओं में प्रकाश-प्रेरित परिवर्तन सक्षम करते हैं। हालांकि, इस तरह की रिकॉर्डिंग की कई सीमाएं हैं: सबसे पहले, साइटोसोल को पूरे सेल रिकॉर्डिंग में पिपेट समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जो आयनिक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट को नियंत्रित करने के लिए लाभप्रद है, लेकिन सेलुलर ऑर्गेनेल्स, प्रोटीन और अन्य यौगिकों को धोने का आंतरिक नुकसान है, इस प्रकार संभावित रूप से सेलुलर विद्युत प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है। दूसरे, गैर-शारीरिक रूप से लंबे ध्रुवीकरण (जैसे, हल्के-गेटेड आयन चैनलों के धीमे समय के स्थिरता) के परिणामस्वरूप अतिरिक्त आयन चैनलों की सक्रियता जैसे दुष्प्रभावों का आकलन करना मुश्किल है क्योंकि हमारी विधि केवल एपीडी में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति देती है, लेकिन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक कोशिका डिब्बों में आयनिक सांद्रता के प्रत्यक्ष मापन का संचालन नहीं करती है। यह फ्लोरोसेंट संकेतकों (जैसे, सीए 2+ सेंसर) या आयन-चयनात्मक इलेक्ट्रोड के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा लक्षण वर्णन में प्रकाश तीव्रता टिट्रेशन, पीएच-निर्भरता का निर्धारण, विभिन्न झिल्ली क्षमता ओं पर फोटोकरंट काइनेटिक्स, और दोहराव प्रकाश उत्तेजना के दौरान रिकवरी काइनेटिक्स शामिल हो सकते हैं।

पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के विपरीत, एकल-सेल बल माप उनके इंट्रासेलर परिवेश को प्रभावित किए बिना बरकरार मायोसाइट्स के सेलुलर संकुचन का विश्लेषण सक्षम करते हैं। आयन सांद्रता पर माध्यमिक प्रभाव (उदाहरण के लिए, सीए2 +)का अप्रत्यक्ष रूप से उत्पन्न बल आयाम और गतिशीलता (उदाहरण के लिए, संकुचन और विश्राम का अधिकतम वेग) का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जा सकता है; यहां विश्लेषण नहीं किया गया है)। कार्बन फाइबर तकनीक के साथ बल माप को स्वतंत्र रूप से अनुबंधित कोशिकाओं पर एक लाभ होता है क्योंकि वे पूर्व-भरी हुई कोशिकाओं में निष्क्रिय और सक्रिय बलों के बारे में सीधी जानकारी प्रदान करते हैं (यानी, उन स्थितियों में जो सीटू या वीवो सेटिंग्स में अधिक समान हैं)। सेलुलर संकुचन का विश्लेषण करते समय मैकेनिकल प्रीलोडिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि खिंचाव बल उत्पादन और विश्राम26,27को प्रभावित करता है।

ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण एकल सीएम और अक्षुण्ण हृदय ऊतक दोनों में सेलुलर झिल्ली क्षमता के स्थानिक रूप से सटीक हेरफेर की अनुमति देते हैं। शास्त्रीय रूप से, एक हल्के-गेटेड सेशन गैर-चयनात्मक चैनल, ChR2 का उपयोग झिल्ली क्षमता के ध्रुवीकरण के लिए किया गया है, जबकि झिल्ली हाइपरपोलीकरण के लिए हल्के चालित प्रोटोन और/या क्लोराइड पंपों का उपयोग किया गया था । ऑप्टोजेनेटिक एक्टूएटर के दोनों समूहों को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता होती है, क्योंकि ChR2 को आंतरिक रूप से कम एकल-चैनल चालन28 और प्रकाश-चालित पंपों द्वारा अवशोषित फोटॉन प्रति एक आयन का परिवहन किया जाता है। इसके अलावा, सीएम में ChR2 के लंबे समय तक सक्रियता ना+ और/या Ca2 + अधिभार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और प्रकाश चालित पंपों ट्रांस-sarcolemmal एच+ यासीएल-ढाल 29,30बदल सकते हैं । सीएम गतिविधि के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के लिए वैकल्पिक उपकरणों की तलाश में, हमने हाल ही में प्राकृतिक एनियन चैनलरोडोप्सिन GtACR1 का परीक्षण किया, जो ChR2 जैसे cation ChR की तुलना में एक बेहतर एकल चैनल आचरण और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता की विशेषता है। हमने पाया कि GtACR1 सक्रियण सीएम depolarizes और ऑप्टिकल पेसिंग और निषेध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रकाश पल्स समय और अवधि के आधार पर । सीएचआर के बजाय एसीआर का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ सीएल की अधिक नकारात्मक उलटक्षमता हो सकती है- एनए+की तुलना में, कृत्रिम रूप से शुरू की गई आयन धाराओं को कम करना। जैसा कि हमने पहले दिखाया है, GtACR1 के साथ ऑप्टिकल पेसिंग GtACR1 चैनल बंद होने के धीमे घटक के परिणामस्वरूप एपी दीर्घीकरण का कारण बन सकता है, जिसे तेजी से GtACR1 म्यूटेंट19का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। हालांकि, एपी दीर्घीकरण बहुत कम स्पष्ट है जब एक कम, अधिक शारीरिक इंट्रासेलुलर सीएल का उपयोगकर-एकाग्रता (चित्रा 6देखें) । इसके अलावा, लंबे समय तक रोशनी से जीटीए1-मध्यस्थता अवरोध गहरा झिल्ली ध्रुवीकरण में परिणाम देता है, जो फिर से माध्यमिक एनए+ और सीए2 + बाढ़ को सक्रिय कर सकता है, जिससे वोल्टेज-गेटेड चैनलों की गतिविधि में फेरबदल होता है। हमारे माप में, हम पाते हैं कि एपी और संकुचन पैरामीटर 1 मिनट के लिए प्रकाश-प्रेरित अवरोध के बाद 40 एस के भीतर बेसलाइन पर ठीक हो जाते हैं (कोप्टन एट अल 2018, चित्रा 6, चित्रा 7देखें)। हल्के-गेटेड के+ चैनल सीएम को झिल्ली क्षमता31को प्रभावित किए बिना सीएम को मुंह बंद करने के लिए एक शक्तिशाली विकल्प प्रदान करते हैं ।

भविष्य में हम कार्डियक गतिविधि को बाधित करने की उनकी क्षमता के लिए विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की मात्रात्मक तुलना करना चाहते हैं। इस उद्देश्य के लिए, हम एसीआर, ChR2 और लाल-स्थानांतरित सीएचआर वेरिएंट32सहित विभिन्न प्रकार के प्रकाश-गेटेड आयन चैनलों का परीक्षण करते हैं, साथ ही हेलोरोडोडोप्सिन या लाइट गेटेड एडेनेलइल साइक्लेस बीपीएसी जैसे पोटेशियम चैनल SthK (PAC-K)31के संयोजन में हाइपरपोलराइजिंग एक्टूएटर का परीक्षण करते हैं।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग सीएम के विद्युत गुणों के गहन लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। यह मुख्य रूप से अन्य प्रजातियों के सीएम और रोगग्रस्त मायोकार्डियम से अलग सीएम पर भी लागू होता है। ऑप्टिकल उत्तेजना एक विभिन्न आवृत्तियों पर सीएम गति करने के लिए अनुमति देता है, और कार्बन फाइबर संकुचन प्रयोगों के दौरान विभिन्न प्रीलोड का परीक्षण किया जा सकता है। एक दिलचस्प प्रयोग सबथ्रेसल ध्रुवीकरण के लिए कम तीव्रता वाली रोशनी का उपयोग करना होगा, आराम झिल्ली क्षमता में क्रमिक वृद्धि की नकल करने के लिए, जैसा कि रोग प्रगति के दौरान हृदय ऊतक रीमॉडलिंग के विकास के दौरान देखा जा सकता है। अंत में, कार्यात्मक माप को सीए2 + इमेजिंग के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि एक्सटॉ्शन-संकुचन युग्मन में आगे की अंतर्दृष्टि हो, या मुख्यमंत्री गतिविधि पर विभिन्न दवाओं के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए औषधीय हस्तक्षेप ों के साथ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए स्टेफनी पेरेस-फेलिज का शुक्रिया अदा करते हैं, डॉ जोनास विस्टेक (हम्बोल्ट-यूनिवर्सिटी, बर्लिन, जर्मनी) pUC57-GtACR1 प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए, प्रो डॉ माइकल Schupp (Charité-Universitätsmedizin बर्लिन, Institut für फार्माकोलोजी, बर्लिन) adenovirus उत्पादन के लिए और डॉ अनास्तासिया खोखलोवा (यूराल फेडरल यूनिवर्सिटी) को सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल और फिर से डिजाइन करने के लिए अपनी विशेषज्ञता साझा करने के लिए प्रदान करने के लिए परियोजना जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (SPP1926: SCHN 1486/1-1 द्वारा वित्त पोषित किया गया था; एमी-Noether फैलोशिप: SCHN1486/2-1) और ईआरसी एडवांस्ड ग्रांट कार्डियोनेक्ट ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction
Adeno-X Adenoviral System 3 CMV TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA
Aortic cannula Radnoti 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm
Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0151 Borosilicate Glass
Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm Samuel Findings, London, UK TSGBL3
Incubator New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland Galaxy 170S
Langendorff-perfusion set-up Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany Custom-made
Langendorff-pump Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland ISM444
Mesh: Nylon Monodur filter cloth Cadisch Precision Meshes Ltd 800 µm holes, 1 m wide
Neubauer chamber VWR International GmbH, Leuven, Belgium 717806
Rabbit, New Zealand White Charles River Strain Code: 052
Scissors Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BC774R Bauchdeckenschere ger. 18cm
Sterile filter, 0.22 µm Merck, Darmstadt, Germany SLGP033RB
Equipment - Patch-clamp
Amplfier AxonInstruments, Union City, CA, United States Axopatch 200B
Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 VWR International GmbH, Leuven, Belgium 631-0178 Borosilicate Glass
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, San José, CA, United States 1550A
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878 BZ:00
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Headstage AxonInstruments, Union City, CA, United States CV203BU
Interface Scientifica, Uckfield, UK 1U Rack, 352036
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control software Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PP-830
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
Motorised Micromanipulator Scientifica, Uckfield, UK PatchStar
Optical power meter Thorlabs, Newton, NJ, United States PM100D
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Silver wire A-M Systems, Sequim, WA, United States 787500 Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet
Soda lime glass capillaries Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark 160213 BRIS, ISO12772 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Equipment - Carbon fiber
Carbon fibers provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec BZ:00
Digitizer Axon Digidata Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States 1550B
Filter (530/20) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany 11513878
Filter (630/20) Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States 227155
Fluorescence System Interface IonOptix, Milton, MA United States FSI-800 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm
Force Transducer System Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada 406A
Glass capillaries for force measurements Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States GC200F-10
Interface National Instruments National Instruments, Budapest, Hungary BNC-2110
LED 525 nm Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States PT-120-G
LED control box Essel Research and Development, Toronto, Canada
LED control system custom-made
Microcontroller Parallax Inc., Rocklin, California, United States Propeller
Micropipette Puller Narishige Co., Tokyo, Japan PC-10
Microscope inverted Leica Microsystems, Wetzlar, Germany DMI4000B
MyoCam-S camera IonOptix, Dublin, Ireland
MyoCam-S camera Power IonOptix, Milton, MA, United States MCS-100
MyoPacer Field Stimulator IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States MYP100
Piezo Motor Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany E-501.00
Silicone Grease RS Components, Corby, UK 494-124
Software Axon pClamp Molecular Devices, San José, CA, United States Version 10.5
Software IonWizard IonOptix, Dublin, Ireland Version 6.6.10.125
Software MatLab2017 The MathWorks, Inc.
Stage micrometer Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK 1 mm
Chemicals
Adenosine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9251-100G
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A7030-50G
CaCl2 Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 21114-1L
L-Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C9500-25G
Collagenase type 2, 315 U/mg Worthington, Lakewood, NJ, USA LS004177
Creatine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C0780-50G
Cytosine-β-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States C1768-100MG
EGTA Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 3054.3
Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany PZN-07829486
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States F9665
Gentamycin 50 mg/mL Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA 15750-037
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States G7021-1KG
Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany PZN-03029843
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States H3375-1KG
Insulin (bovine pancreas) Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States I6634-50MG
K-aspartate Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A6558-25G
KCl VWR International GmbH, Leuven, Belgium 26764.260 1 mg/mL
KOH Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA 35113-1L
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States L2020-1MG
M199-Medium Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States M4530
Mg-ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States A9187-1G
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States 63069-500ML
NaCl Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK 10428420
NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 3200950
NaOH AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany A6579 without Ca2+/Mg2+
Na-pyruvat Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P2256-100MG
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States D1408-500ML
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma, Poole, UK 192066
Protease XIV from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States P5147-1G
Taurine Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States T0625-500G
Thiopental Inresa 0.5 g Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany PZN-11852249
Xylazine hydrochloride, Rompun 2% Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany PZN-01320422

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References

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Kopton, R. A., Buchmann, C., Moss, R., Kohl, P., Peyronnet, R., Schneider-Warme, F. Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity. J. Vis. Exp. (157), e60490, doi:10.3791/60490 (2020).

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