Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.
Abstract
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden optogenetische Werkzeuge als potente Mittel etabliert, um zelltypspezifische Aktivität in erregbarem Gewebe, einschließlich des Herzens, zu modulieren. Während Channelrhodopsin-2 (ChR2) ein gängiges Werkzeug zur Depolarisierung des Membranpotenzials in Kardiomyozyten (CM) ist, fehlt möglicherweise ein wirksames Werkzeug zur zuverlässigen Silencing von CM-Aktivitäten. Es wurde vorgeschlagen, Anionenkanalrhodopsine (ACR) zur optogenetischen Hemmung zu verwenden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen der Aktivierung der natürlichen ACR GtACR1 von Guillardia theta in kultivierten Kaninchen CM. Primäre Auslesungen sind elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen und optische Verfolgung von CM-Kontraktionen, die beide unter Anwendung verschiedener Muster der Lichtstimulation durchgeführt werden. Das Protokoll umfasst die CM-Isolierung vom Kaninchenherz, das Säen und Kultivieren der Zellen für bis zu 4 Tage, die Transduktion über adenovirus-Codierung für den lichtverzerten Chloridkanal, die Vorbereitung von Patch-Clamp- und Carbonfaser-Setups, die Datenerfassung und -analyse. Mit der Patch-Clamp-Technik in ganzzelliger Konfiguration kann man lichtaktivierte Ströme (im Spannungsklemmenmodus, V-Klemmung) und AP (Stromklemmenmodus, I-Klemme) in Echtzeit aufzeichnen. Zusätzlich zu Patch-Clamp-Experimenten führen wir Kontraktilitätsmessungen zur funktionellen Beurteilung der CM-Aktivität durch, ohne das intrazelluläre Milieu zu stören. Dazu werden Zellen mechanisch mit Kohlefasern vorbelastet und Kontraktionen werden aufgezeichnet, indem Änderungen der Sarcomere-Länge und des Kohlenstofffaserabstandes nachverfolgt werden. Die Datenanalyse umfasst die Bewertung der AP-Dauer aus I-Klemmenaufzeichnungen, Spitzenströmen aus V-Klemmenaufzeichnungen und Kraftberechnung aus Kohlefasermessungen. Das beschriebene Protokoll kann auf die Prüfung biophysikalischer Wirkungen verschiedener optogenetischer Aktoren auf die CM-Aktivität angewendet werden, eine Voraussetzung für die Entwicklung eines mechanistischen Verständnisses optogenetischer Experimente im Herzgewebe und im ganzen Herzen.
Introduction
ChR-vermittelte Fotoströme wurden zuerst im Augenfleck der einzelligen Grünalgen1,2aufgezeichnet. Bald nach dem genetischen Klonen und der heterologen Expression von Chlamydomonas reinhardtii ChR1 und ChR2 wurden ChR als Werkzeuge verwendet, um das Membranpotenzial in Xenopus-Oozyten und Säugetierzellen durch Licht3,4zu verändern. Kation nicht-selektive ChR depolarisieren die Membran von Zellen mit einem ruhenden Membranpotential, das negativ auf das Umkehrpotenzial von ChR ist. Sie können somit verwendet werden, um AP in erregbaren Zellen zu entlocken, einschließlich Neuronen und CM, so dass optisches Tempo5,6.
Ergänzend zu Kation ChR, lichtbetriebene Proton, Chlorid und Natriumpumpen7,8,9 wurden verwendet, um neuronale Aktivität zu hemmen10,11,12. Letztere haben jedoch Einschränkungen, die hohe Lichtintensitäten und eine anhaltende Beleuchtung erfordern, da ein Ion pro absorbiertem Photon transportiert wird. Im Jahr 2014 beschrieben zwei unabhängige Studien von Wietek et al. und Berndt et al. die Umwandlung von kationleitender ChR in ACR über Mutationen in der Kanalpore13,14. Ein Jahr später wurden natürliche ACR im Kryptophyten Guillardia theta (GtACR)15entdeckt. Da die konstruierte ACR eine Restkationsleitfähigkeit zeigte, wurden sie durch natürliche ACR ersetzt, die sich durch eine große einkanalige Leitfähigkeit und eine hohe Lichtempfindlichkeit15auszeichneten. GtACR wurden verwendet, um neuronale Aktivität zum Schweigen zu bringen, indem das Membranpotential in Richtung des Umkehrpotentials von Chlorid16,17polarisiert wurde. Govorunova et al. wandtegten GtACR1 auf kultivierte Rattenventrikuläre CM an und zeigten eine effiziente Photohemmung bei niedriger Lichtintensität, die nicht ausreichte, um zuvor verfügbare Hemmwerkzeuge wie die Protonenpumpe Arch18zu aktivieren. Unsere Gruppe berichtete kürzlich, dass die GtACR1-vermittelte Photoinhibition von CM auf Depolarisation basiert und dass GtACR1 daher auch für optisches Tempo von CM19verwendet werden kann.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der elektrophysiologischen und mechanischen Auswirkungen der GtACR1-Photoaktivierung auf kultivierte Kaninchenventrikuläre CM vor. Wir beschreiben zunächst die Zellisolation, Kultivierung und Transduktion. Elektrophysiologische Effekte werden mit Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen gemessen. Lichtvermittelte Ströme bei einer bestimmten Membranspannung werden im V-Klemmmodus bewertet. Die Membranpotentialdynamik wird beim elektrisch- oder optisch-temporierenden CM (I-Clamp-Modus) gemessen. Die optische Hemmung des elektrisch ausgelösten AP wird mit einer dauerhaften Lichtanwendung getestet. Mechanische Effekte werden mit Kohlefasern in Kombination mit der bildgebenden Verfolgung der Sarcomere-Länge gemessen. Dazu werden optisch bewegsame Zellen mechanisch vorbelastet, indem zwei Kohlefasern an der Plasmamembran in der Nähe gegenüberliegender Zellenden befestigt werden. Sarcomere Längenänderungen werden während des optischen oder elektrischen Tempos aufgezeichnet. Schließlich wird die Photoinhibition während der elektrischen Feldstimulation der Zellen gemessen und erzeugte Kräfte analysiert.
Das Protokoll enthält die folgenden Schritte im Flussdiagramm in Abbildung 1:Kaninchentiefanästhesie, Thiopental-Überdosis-Injektion, Herzexzision, Langendorff-Perfusion und Gewebeverdauung, mechanische Dissoziation des Gewebes zur Freisetzung von Zellen, mikroskopische Analyse der CM-Ausbeute, Kultivierung von CM, Transduktion mit Adenovirus Typ 5, gefolgt von Inkubation und funktionellen Experimenten.
Abbildung 1: Flussdiagramm des Protokolls, das verwendet wird, um elektrisch und optisch beweglich CM zu erhalten. Herzen werden von Kaninchen entfernt, die 9-10 Wochen alt sind, und Herzgewebe wird verdaut, während es mit einem Langendorff-Setup durchnässt wird. Zellen werden durch mechanische Sergung freigesetzt. Die CM-Ausbeute wird unter dem Mikroskop gezählt. CM werden kultiviert, mit Adenovirus Typ 5 transduziert und funktionelle Experimente werden 48-72 Stunden nach der Transduktion durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Alle Kaninchenversuche wurden gemäß den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments über den Schutz von Tieren durchgeführt, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und von den lokalen Behörden in Baden-Württemberg genehmigt (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Deutschland).
1. Lösungen für die Zellisolierung
- Bereiten Sie die Lösungen für die Zellisolierung mit Wasser der folgenden Anforderungen (Tabelle 1) und entsprechend den in Tabelle 2aufgeführten ionengesetzten Zusammensetzungen vor.
HINWEIS: CaCl2 und MgCl2 werden aus 1 M Lagerlösungen hinzugefügt.
| Wasserbedarf | |
| Leitfähigkeit [S/cm] bei 25 °C | 0.055 |
| Pyrogen [EU/ml] | < 0,001 |
| Partikel (Größe > 0,22 m) [1/ml] | Nr. 1 |
| Organischer Kohlenstoff insgesamt [ppb] | < 5 |
| Mikroorganismen [CFU/mL] | Nr. 1 |
| RNase [ng/mL] | < 0,01 |
| DNase [ng/mL] | < 4 |
Tabelle 1: Wasserbedarf.
| Physiologische Salzlösung (1) | Kalziumarm, kaliumreiche Lösung (2) | Enzymlösung (3) | Blockierlösung | |
| NaCl [mM] | 137 | 137 | 137 | 137 |
| KCl [mM] | 4 | 14 | 14 | 14 |
| HEPES [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Kreatin [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Taurin [mM] | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Glukose [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| MgCl2 [mM] | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Adenosin [mM] | 5 | 5 | 5 | 5 |
| L-Carnitin [mM] | 2 | 2 | 2 | 2 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - | 0.1 | 0.1 |
| Na-Heparin [I.E./L] | 5000 | - | - | - |
| EGTA [mM] | - | 0.096 | ||
| Kollagenase Typ 2, 315 U/mg [g/L] | - | - | 0.6 | - |
| Protease XIV [g/L] | - | - | 0.03 | - |
| Rinderserumalbumin [%] | - | - | - | 0.5 |
| Osmolarität [mOsmol/L] | 325 x 5 | 345 x 5 | 345 x 5 | 345 x 5 |
Tabelle 2: Lösungen für die CM-Isolierung.
- Stellen Sie alle Lösungen auf pH 7,4 bei 37 °C ein und überprüfen Sie die Osmolarität.
HINWEIS: Lösen Sie die Enzyme (Collagenase Typ 2 und Protease XIV) direkt vor der Herzexzision. Sauerstoffieren Sie alle Lösungen vor der Verwendung.
2. Vorbereitung des Langendorff-Perfusions-Setups
HINWEIS: Das verwendete Setup ist maßgefertigt. Wie in Abbildung 2dargestellt, besteht das Setup aus drei wasserummantelten Reservoirs (1-3), einem spiralförmigen Gegenstromwärmetauscher (4) und einem wasserummantelten Perfusionsgefäß (5).
Abbildung 2: Langendorff-Perfusionseinrichtung optimiert für die Isolierung von Kaninchenzellen. (1-3) Wassermantelreservoirs mit (1) physiologischer Salzlösung, (2) kalziumarmer, hoher Kaliumlösung und (3) enzymhaltiger kardioplegischer Lösung. (4) Spiral-Gegenstrom-Wärmetauscher und (5) wasserummantelter Sammelbehälter. Der Zufluss des Wassermantelsystems ist der Spiralwärmetauscher (Temperatur der Lösungen, die die Perfusionskanüle am Ende des Wärmetauschers verlassen, sollte konstant bei 37 °C sein), gefolgt vom Perfusionsgefäß und den drei Reservoirs. Alle Lösungen sind mit Sauerstoff versorgt (gestrichelte Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Schalten Sie die Pumpe des Wasserbades ein, um Wasser bei 38 °C im Wärmeaustauschsystem zu zirkulieren, und erhitzen Sie alle Lösungen auf 37 °C.
HINWEIS: Die Temperatur am Abfluss von (4) muss bei 37 °C gesteuert und konstant sein. - Füllen Sie die drei Reservoirs mit der jeweiligen Lösung und waschen Sie jede Linie (schwarz) mit der entsprechenden Lösung. Füllen Sie die Hauptlinie (blau) am Ende ohne Luftblasen mit Lösung (1).
HINWEIS: Sauerstoffieren Sie die Lösungen vor (10 min) und während der Anwendung. Füllen Sie die Linie vom Reservoir (3) zum Wasserhahn mit niedriger Kalzium- und Kaliumlösung. - Bereiten Sie eine Naht vor, um das Herz um die Aorta an der Kanüle zu binden.
3. Zellisolation
- Bereiten Sie die folgenden Spritzen vor.
- Für Sedierung/Anästhesie: Mischen Sie 0,5 ml/kg Körpergewicht Esketaminhydrochlorid (25 mg/ml) und 0,2 ml/kg Körpergewicht Xylazinhydrochlorid (2 %).
- Füllen Sie zwei Spritzen mit 12 ml NaCl-Lösung (0,9%).
- Bereiten Sie 6 ml von 12,5 mg/ml Na-Thiopental vor, gelöst in 0,9% NaCl-Lösung.
- 0,2 ml Esketaminhydrochlorid (25 mg/ml) in einer Spritze füllen.
- Verdünnen Sie 0,2 ml Na-Heparin (5.000 I.E./ml) in 1 ml 0,9% NaCl-Lösung (Endkonzentration 1.000 I.E./ml).
- Sedate/Anästhesisieren Vonkaninchen (9-10 Wochen, neuseeländisches weißes Kaninchen, weibchen oder männlich, 2 kg) durch intramuskuläre Injektion von Esketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid (Schritt 3.1.1).
HINWEIS: Kaninchen benötigen mindestens 10 min, um vollständig beästhetisiert zu werden; Die genaue Dauer hängt von ihrem Körpergewicht ab. Bestätigen Sie die Anästhesie mit dem Verlust des Rechtenreflexes. - Rasieren Sie die Brust und die Ohren, wo sich die Venen befinden.
- Setzen Sie eine flexible Kanüle in die Ohrvene ein, fixieren Sie sie mit Klebeband und spülen Sie sie mit 0,9% NaCl-Lösung.
- Injizieren Sie 1 ml Na-Heparin-Lösung intravenös und bündig mit 0,9% NaCl-Lösung.
- 0,2 ml Esketaminhydrochlorid injizieren, mit 0,9% NaCl-Lösung wieder spülen und Na-Thiopental bis Apnoe injizieren.
HINWEIS: Kaninchen sollten nicht auf den Pedalentzugsreflex reagieren. - Öffnen Sie die Brust auf der linken Seite und entfernen Sie das Perikard.
- Starten Sie den Timer, wenn das Herz ausgeschnitten wird, und waschen Sie das Herz zweimal in physiologischer Salzlösung.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Schere mit runden Spitzen, um versehentliche Schäden am Herzgewebe zu verhindern. - Die Aorta in einem Bad mit physiologischer Salzlösung ankern und das gesamte Gewebe in Lösung halten. Schalten Sie das Langendorff-Perfusionssystem ein (physiologische Salzlösung (1), Geschwindigkeit 24 ml/min).
- Übertragen Sie das Herz auf die Langendorff-Perfusionseinrichtung, verbinden Sie die Aorta mit der Perfusatedüse und binden Sie das Herz fest mit der Naht um die Aorta an die Kanüle (< 1 min).
HINWEIS: Füllen Sie die Kanüle mit physiologischer Salzlösung vor, stellen Sie sicher, dass beim Transport von der Kanüle zum Langendorff-Setup keine Luftblasen in die Kanüle gelangen, verbinden Sie blasenfrei. - Durchdringen Sie das Herz, bis das ganze Blut ausgewaschen ist (2-3 min).
- Wechseln Sie zu einer kalziumarmen, kaliumreichen Lösung (2). Perfuse für 2 weitere min, nachdem das Herz aufgehört hat zu schlagen und auf Enzymlösung umzuschalten.
- Beginnen Sie mit der Umwälzung der Enzymlösung nach 2 min ab Verdauungsbeginn zurück in das Reservoir. Verringern Sie die Geschwindigkeit auf 16 ml/min nach 5 min Der Verdauung.
- Wenn das Gewebe weich erscheint (40-50 min der Verdauung), schneiden Sie das Herz von der Kanüle und trennen Sie die linke Herzkammer.
- Lösen Sie Zellen durch mechanische Dissoziation (sanft das Gewebe mit einer Pipette und einer feinen Zange auseinander ziehen, um das Gewebe zu halten) in der blockierenden Lösung.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Netz (Porengröße 1 mm2) und Zentrifuge für 2 min bei 22 x g (Gravitationsbeschleunigung).
- Entfernen Sie den Überstand, der Nicht-Myozyten enthält, und setzen Sie CM in der Blockierlösung erneut aus.
4. Kultivierung von CM
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen aus.
- Laminin (aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Murine-Sarkom-Kellermembran, 1 mg/ml) 1:10 in steriler Phosphat-gepufferter Saline (ohne Ca2+/Mg2+)bis zu einer Endkonzentration von 100 g/ml verdünnen.
- Bereiten Sie Kulturmedium in M199-Medium mit den Ergänzungen wie in Tabelle 3angegeben.
| Zellkulturmedium in M199-Medium | |
| Kreatin [mM] | 5 |
| L-Carnitinhydrochlorid [mM] | 2 |
| Taurin [mM] | 5 |
| Na-Pyruvat [mM] | 1 |
| Insulin (Rinderbauch) [U/L] | 0.25 |
| Cytosin--D-Arabinofuranosid [mM] | 0.01 |
| Gentamycin [mg/ml] | 0.05 |
Tabelle 3: Zellkulturmedium.
- Steril-Filter-Lösung (0,22 m) und 5% Fetal Rinderserum hinzufügen.
- Für Patch-Clamp-Experimente Autoklaven-Abdeckungen mit einer Stärke von 16 mm, Dicke Nr. 0, beschichten Sie sie direkt vor der Kultivierung mit 100 g/ml Laminin.
- Für Kohlefaserexperimente die Petrischalenoberfläche mit Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA, 0,12 g/ml in 95:5 EtOH:H20) beschichten und erstarren lassen.
HINWEIS: Zellen "kleben" nicht an poly-HEMA beschichteten Petrischalen; dies ist entscheidend für ihre reibungsfreie Kontraktion in zellmechanischen Studien. - Nachdem sich CM erneut suspendiert hat (10-15 min), entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie CM dann im Kulturmedium erneut aus.
- Count CM mit einer Neubauer-Kammer und Samen mit einer Zieldichte von 17.500 Zellen/ml entweder auf lamininbeschichteten Abdeckungen oder in poly-HEMA beschichteten Petrischalen.
- Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C, 5%CO2 für 3-4 Stunden. Tauschen Sie das Medium (37 °C) der deckscheinfesten Samenzellen aus.
- Fügen Sie Adenovirus (Typ 5) Codierung für GtACR1-eGFP bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 75 und starten Sie funktionelle Experimente nach 48 Stunden.
HINWEIS: Nach der Transduktion halten Sie die Zellen im Dunkeln. Verwenden Sie rote Beleuchtung, wenn Sie mit blauen oder grünen lichtaktivierten Proteinen arbeiten. Ein kommerziell erhältliches adenovirales Abgabesystem (siehe Tabelle der Materialien) wird verwendet, um die Gene, die GtACR1-eGFP kodieren, in den adenoviralen Vektor zu klonen. Der Einsatz von Interesse, hier GtACR1-eGFP, wird PCR verstärkt und dann mit einem adenoviralen Vektor einschließlich eines CMV-Promotors in einer IN-Fusion Cloning-Reaktion kombiniert. Der CMV-Promotor (humanes Zytomegalievirus) wird häufig verwendet, um eine Überexpression von Transgenen in Säugetierzellen zu fördern. eGFP ist ein verbessertes grünes fluoreszierendes Protein aus Aequorea victoria mit einem Anregungsmaximum von 488 nm und einem Emissionsmaximum von 507 nm. Das Adenovirus (Typ 5) wurde extern an der Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, Prof. Dr. Michael Schupp, produziert.
VORSICHT: Die adenovirale Transduktion ist als BSL-2-Sicherheitsstufe kategorisiert, und geeignete Sicherheitsmaßnahmen sind gesetzlich vorgeschrieben.
5. Funktionelle Experimente
HINWEIS: Die Aufnahmen werden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Filtern Sie das Getriebelicht mit einem roten Bandpassfilter (630/20 nm) im Kondensator, um eine Koaktivierung von GtACR1 zu vermeiden.
-
Patch-Clamp-Setup
- Verwenden Sie einen Verstärker in Kombination mit einem Analog-Digital-Wandler. Verwenden Sie eine Datenerfassungssoftware, um Strom- und Spannungsdaten aufzuzeichnen (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Die aufgezeichneten Daten werden bei 10 kHz digitalisiert und mit 5 kHz gefiltert.
- Verwenden Sie einen Verstärker in Kombination mit einem Analog-Digital-Wandler. Verwenden Sie eine Datenerfassungssoftware, um Strom- und Spannungsdaten aufzuzeichnen (siehe Tabelle der Materialien).
-
Carbonfaser-Setup
- Verwenden Sie eine Kamera, um Die Position von Kohlefasern und Sarcomere-Länge zu erkennen, indem Sie Veränderungen des optischen Kontrasts nachverfolgen (Kohlenstofffasern erscheinen als dunklere Strukturen, die auf dem gestreiften Zellmuster überlagert sind). Eine schematische Darstellung des Setups ist in Abbildung 3dargestellt.
HINWEIS: Die Sarcomere-Länge wird in Echtzeit mit einer schnellen Fourier-Transformation (FFT) des Leistungsspektrums des Striationsmusters berechnet.
- Verwenden Sie eine Kamera, um Die Position von Kohlefasern und Sarcomere-Länge zu erkennen, indem Sie Veränderungen des optischen Kontrasts nachverfolgen (Kohlenstofffasern erscheinen als dunklere Strukturen, die auf dem gestreiften Zellmuster überlagert sind). Eine schematische Darstellung des Setups ist in Abbildung 3dargestellt.
Abbildung 3: Schema, das den Versuchsaufbau für Kohlefasermessungen darstellt. (Zeichnung ist nicht maßstabsgetreu). Zwei Kohlefasern sind an einer Zelle befestigt und ihre Position wird durch einen Piezo-Positionierer gesteuert. Der Schrittmacher wird zur elektrischen Feldstimulation eingesetzt. Mehrfarbige LEDs werden in den Epifluoreszenzport des invertierten Mikroskops gekoppelt, um Zellen in der Objektebene zu erleuchten. Die LED-Stromversorgung erfolgt über eine spezielle Steuerbox, die digitale Impulse über den digitalen Ausgang des Digital-Analog-Wandlers (DAC) empfängt. Der DAC kommuniziert über analogen Ausgang mit der Fluoreszenzsystemschnittstelle. Eine Schwarz-Weiß-Kamera (774 Pixel x 245 Zeilen) für die zelluläre Bildgebung ist mit dem Computer verbunden, um Sarcomere-Länge und Kohlefaserbiegen zu verfolgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Zeitgezeitende Beleuchtung
- Bereitstellung von Licht für die Fluoreszenzmikroskopie und Aktivierung von lichtverkabelten Ionenkanälen über eine externe, kundenspezifische LED-Steuerbox, bestehend aus drei LEDs unterschiedlicher Farbe (460 nm, 525 nm, 640 nm, siehe Tabelle der Materialien).
- Ändern Sie den Mikrocontroller und den GUI-Code (Gui) für die Steuerbox, um die Steuerung der LED über externe Time-to-Live-Impulse (TTL) zu ermöglichen, die in Datenerfassungssoftwareprotokollen generiert werden (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie TTL-Impulse über den Digital-Analog-Wandler an die LED-Steuerbox.
- Fahren Sie die LED und wählen Sie die Anzahl der Impulse über die GUI. Nach Dem Empfang des Befehls von der GUI startet der Mikrocontroller einen Prozess auf einem neuen Kern. Dabei werden der TTL-Eingang sowie ein von der GUI eingestellter Steuerschalter kontinuierlich überprüft.
- Wenn der TTL-Eingang positiv ist, schaltet der Mikrocontroller die LED ein und setzt dann die Überprüfung des TTL-Eingangs fort. Sobald das TTL-Signal auf Null zurückkehrt, schaltet der Mikrocontroller die LED aus und reduziert die Anzahl der Impulse, die um eins übrig bleiben. Wenn der Steuerschalter zu irgendeinem Zeitpunkt falsch ist oder die Anzahl der Impulse Null ist, stoppt der Mikrocontroller diesen Prozess, bis ein neuer Befehl von der GUI empfangen wird.
- Koppeln Sie die LEDs direkt in den Hinteranschluss des Mikroskops.
- Bestimmung der Lichtintensität in der Objektebene
- Messen Sie den beleuchteten Bereich mit einem Bühnenmikrometer (Objektivvergrößerung 40x, A = 0,8 mm2).
- Verwenden Sie einen optischen Leistungsmesser (siehe Materialtabelle).
- Definieren Sie die Einstellungen für die Experimente: Anregungswellenlänge (525 nm), Objektivvergrößerung (40x), Anregungsfilter (530/20 nm) oder Spiegel, und lesen Sie die Lichtleistung [W] bei verschiedenen LED-Eingangsspannungen aus.
- Berechnen Sie die Lichtintensität [W/mm2], indem Sie die Lichtleistung [W] durch die beleuchtete Fläche [mm2] (hier: 0,8 mm2) dividieren.
HINWEIS: Messen Sie die tatsächliche Lichtleistung mit den entsprechenden Protokollen in Schritt 5.6, um zu überprüfen, ob kurze Lichtimpulsdauern von 10 ms Reichweite und lange Dauern den eingestellten Wert halten (Zusatzabbildung 1).
- Vorbereitung für Patch-Clamp-Experimente
- Bereiten Sie die folgenden externen und internen Lösungen vor (Tabelle 4; für Wasserbedarf siehe Tabelle 1).
- Stellen Sie die Osmolarität mit Glukose auf 300 x 5 mOsmol/L ein. Aliquot die interne Lösung und lagern Sie bei -20 °C.
HINWEIS: Halten Sie die interne Lösung für den Tag der Aufnahme auf Eis. Halten Sie die externe Lösung bei Raumtemperatur. Die hier beschriebenen Patch-Clamp-Lösungen basierten auf zuvor eingesetzten Lösungen und dieCl-Konzentration wurde auf niedrigere, physiologischere Stufen7geändert. Für die Charakterisierung der Ionenselektivität des jeweiligen optogenetischen Aktors schlagen wir vor, die Konzentrationen von Hauptionen (z.B. Cl-, Na+, K+, H+) in den extra- und intrazellulären Lösungen19zu variieren. - Nehmen Sie die Aufnahmeelektrode aus dem Pipettenhalter und entfernen Sie die Silberchloridschicht aus dem Silberdraht mit sehr feinem Schleifpapier.
HINWEIS: Machen Sie diesen Schritt zu Beginn jedes Messtages. - Schließen Sie den Draht an den positivpol einer 1,5-V-Batterie an und tauchen Sie 10 min in 3 M KCl-Lösung für Silberchloridbeschichtung ein.
HINWEIS: Der Negative Pol ist mit einem Referenz-Silberdraht verbunden, der in die 3 M KCl-Lösung eingetaucht ist. - Bereiten Sie die Messkammer vor: Setzen Sie Siliziumfett auf den Rahmen der Messkammer und legen Sie einen Abdeckzettel (Durchmesser: 50 mm, Dicke Nr. 0) auf die Oberseite des Rahmens, dass die Kammer versiegelt ist.
- Legen Sie eine Referenz-Silber/Silberchlorid-Pelletelektrode in das Bad und verbinden Sie sie mit der Kopfstufe.
- Ziehen Sie 1,7 - 2,5 M" Patchpipetten aus Sodakalkglaskapillaren (Außendurchmesser: 1,55 mm, Innendurchmesser: 1,15 mm) mit einem Mikropipette-Zieher (siehe Materialtabelle).
- Starten Sie die Datenerfassungssoftware und passen Sie den Membrantest an (Puls 10 mV für 15 ms, Basiswert 0 mV).
| Externe Badlösung | Interne Pipettenlösung | |
| NaCl [mM] | 140 | - |
| KCl [mM] | 5.4 | 11 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - |
| MgCl2 [mM] | 2 | 2 |
| Glukose [mM] | 10 | - |
| HEPES [mM] | 10 | 10 |
| K-Aspartat [mM] | - | 119 |
| Mg-ATP [mM] | - | 3 |
| EGTA [mM] | - | 10 |
| Ph | 7.4 (NaOH) | 7.2 (KOH) |
| Osmolarität (mit Glukose einstellen) [mOsmol/L] | 300 x 5 | 300 x 5 |
Tabelle 4: Patch-Clamp-Lösungen.
- Protokolle für Patch-Clamp-Messungen
- Zeichnen Sie das Photoaktivierungsprotokoll im V-Klemmenmodus bei einem Haltepotential von -74 mV auf. Verwenden Sie Lichtimpulse von 300 ms.
HINWEIS: Wir empfehlen die Durchführung von V-Klemmaufnahmen in der Nähe des ruhenden Membranpotentials von kultiviertem CM (in I-Klemmung; in unseren Händen zwischen -79 mV und -77 mV sowohl für transduced und non-transduced CM19). Frisch isolierte Zellen weisen ein mittleres ruhendes Membranpotential von -79 mV auf (Zusatzabbildung 2, alle Werte nach Korrektur für flüssiges Anschlusspotential). - AP im I-Klemmenmodus bei 0 pA aufzeichnen.
- Für elektrisches Tempo, injizieren Stromimpulse von 10 ms (Rampe von 0 pA auf den eingestellten Wert innerhalb von 10 ms), 0,25 Hz und finden Sie den Schwellenwert, um AP zu entlocken. Zeichnen Sie AP durch Stromeinspritzungen von 50% mehr als den Schwellenwert.
- Verwenden Sie für optisches Tempo Lichtimpulse von 10 ms, 0,25 Hz bei minimaler Lichtintensität, um zuverlässige AP zu entlocken.
- Fotohemmung im I-Klemmenmodus bei 0 pA aufzeichnen. Entlocken Sie AP, wie in Schritt 5.6.2.1 beschrieben, und wenden Sie anhaltendes Licht für 64 s bei 4 mW/mm2 nach 15 elektrisch ausgelöstem AP an.
HINWEIS: Abbildung 6F zeigt ein Photoinhibitionsprotokoll, bei dem bei anhaltendem Licht höhere Strominjektionen angewendet werden. Ab dem 1,5-fachen des Schwellenwerts (hier: 0,7 nA) wurde der injizierte Strom in Schritten von 0,1 nA erhöht (Endstufe: 2,2 nA). Bei allen getesteten Stromamplituden hemmte eine anhaltende leichte Anwendung die AP-Generierung.- Als Steuerungsexperiment die elektrische Stimulation für 64 s ohne Lichtanwendung anhalten.
- Zeichnen Sie das Photoaktivierungsprotokoll im V-Klemmenmodus bei einem Haltepotential von -74 mV auf. Verwenden Sie Lichtimpulse von 300 ms.
- Patch-Clamp-Experimente
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Experimente im Dunkeln durch (rotes Licht kann für blau/grüne lichtaktivierte Werkzeuge verwendet werden).- Legen Sie Dendeckel mit Zellen in die Messkammer mit externer Lösung und wählen Sie fluoreszierenden CM.
HINWEIS: eGFP-positive Zellen können mit einer blauen LED (460 nm) in Kombination mit einem Bandpass-Erregungsfilter (450 nm - 490 nm), einem 510 nm dichroitischen Spiegel und einem 515 nm Langpass-Emissionsfilter nachgewiesen werden. Wenn andere Fluoreszenz-Tags verwendet werden, verwenden Sie entsprechende LED- und Fluoreszenzfiltersätze. Wenn eine hohe Transduktionseffizienz erreicht wird (in unseren Händen >99% mit dem GtACR1-Adenovirus), besteht keine Notwendigkeit, die eGFP-Fluoreszenz vor den funktionellen Experimenten zu überprüfen; Dies vermeidet eine mögliche GtACR1-Voraktivierung. - Füllen Sie die Patchpipeette mit interner Lösung. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spitze befinden.
- Befestigen Sie die Pipette am Pipettenhalter und setzen Sie den Aufnahme-Silberchlorid-beschichteten Silberdraht in die interne Lösung ein.
- Nach Erreichen der zellgebundenen Konfiguration wechseln Sie in der Datenerfassungssoftware in den Ganzzellenmodus mit einem Haltepotenzial von -74 mV. Zerreißen Sie die Membran, indem Sie sanft Unterdruck ausüben, um auf die Ganzzellkonfiguration zuzugreifen. Dies wird durch eine sofortige Erhöhung der gemessenen Kapazität angezeigt.
- Führen Sie die in Abschnitt 5.6 beschriebenen Protokolle aus.
- Legen Sie Dendeckel mit Zellen in die Messkammer mit externer Lösung und wählen Sie fluoreszierenden CM.
- Kohlefasertechnik
- Produzieren Sie Kohlefasern.
- Verwenden Sie Glaskapillaren mit den folgenden Parametern: Außendurchmesser: 2,0 mm, Innendurchmesser: 1,16 mm, Länge: 100 mm (siehe Materialtabelle). Ziehen Sie die Glaskapillare mit einem Mikropipette-Zieher in zwei Pipettes gleicher Länge (Gesamtverjüngungslänge 11 mm, Abbildung 5)bis zu einem endgültigen Innendurchmesser von 30 m.
HINWEIS: Die Einstellungen für den ersten und zweiten Zug sind 85,2% (Verhältnis zur maximalen Leistung des Abziehers) bzw. 49,0% (hängt von Abzieher, Typ und Alter des Filaments ab). - Biegen Sie die Pipetten bis zu 45° mit einer selbst gebauten Mikroschmiede mit Einstellungen von 12 V, 24 A (details details zum Pipettenbiegeaufbau siehe Abbildung 4).
- Richten Sie die Kapillare (2) auf der roten Linie im Orientierungskreis (5) aus, halten Sie die Positionierung der Kapillare konstant, so dass die Länge des Biegeteils nach der Mitte des Orientierungskreises immer gleich ist (Radius 4,5 mm).
- Biegen Sie die Kapillare bis zu 45° (grüne Linie) durch Drücken der Spitze der Kapillare mit dem Bieger (3) und schmieden Sie durch Aufheizen des Filaments (4), bis die Kapillare den 45°-Winkel erfasst, auch nachdem der Bieger entfernt wurde.
- Die Kohlefasern (von Prof. Jean-Yves Le Guennec) in die feine Spitze der Glaskapillare unter einem Stereomikroskop einbauen. Verwenden Sie feine Zangen mit weichen Schläuchen am Ende, um den Grip zu erhöhen und das Risiko einer Beschädigung der Fasern zu verringern.
HINWEIS: Diese Fasern zeichnen sich durch Mikrostrukturen aus, die die Kontaktfläche zwischen Fasern und Zellen erhöhen und dadurch die Haftungverbessern 20. - Schneiden Sie die Kohlefasern auf einer Länge von 2 mm und verwenden Sie Superkleber (Cyanoacrylat), um die Faser am vorderen Teil der Kapillare zu befestigen.
HINWEIS: Je länger die Fasern sind, desto mehr biegen sie sich bei Anwendung der gleichen Kraft.
- Verwenden Sie Glaskapillaren mit den folgenden Parametern: Außendurchmesser: 2,0 mm, Innendurchmesser: 1,16 mm, Länge: 100 mm (siehe Materialtabelle). Ziehen Sie die Glaskapillare mit einem Mikropipette-Zieher in zwei Pipettes gleicher Länge (Gesamtverjüngungslänge 11 mm, Abbildung 5)bis zu einem endgültigen Innendurchmesser von 30 m.
- Kalibrieren Sie Kohlefasern.
- Kalibrieren Sie die Kohlefasern mit einem Kraftaufnehmer mit einer Empfindlichkeit von 0,05 mN/V und einem Kraftbereich von 0 - 0,5 mN (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Dieses Setup wurde maßgeschneidert, um die Komprimierung anstelle von "Pull" zu messen. - Befestigen Sie die Kapillare mit der Kohlefaser an einem Halter, der von einem Mikromanipulator und einem Piezomotor gesteuert wird.
- Setzen Sie die Spitze der Faser in Kontakt mit dem Kraftsensor, aber ohne Kraft zu erzeugen und bewegen Sie den Piezomotor in Schritten von 10 m (Gesamtbewegung von 60 m) in Richtung des Sensors und lesen Sie die gemessene Spannung (E) in Volt aus.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kraftaufnehmer von der Spitze des freien Endes der Kohlefaser kontaktiert wird. - Wiederholen Sie diese Messungen dreimal.
- Verwenden Sie Die Formel 1, um die Kraft für jede Piezoposition zu berechnen(
Differenz der gemessenen Spannung zwischen den Piezomotorschritten):
HINWEIS: Die Empfindlichkeit des Kraftwandlers hängt vom Modell des Messumformers ab (hier: 0,05 mN/V = 50 N/V). Die Verstärkung kann am Controller eingestellt werden. - Zeichnen Sie die Kraft [N] gegen die Piezoposition. Die Steigung entspricht der Fasersteifigkeit [N/m].
- Kalibrieren Sie die Kohlefasern mit einem Kraftaufnehmer mit einer Empfindlichkeit von 0,05 mN/V und einem Kraftbereich von 0 - 0,5 mN (siehe Materialtabelle).
- Aufzeichnungskraft des Vertrags abschlusses von CM.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Experimente im Dunkeln durch (rotes Licht kann für blau/grün lichtaktivierte Werkzeuge verwendet werden).- Beschichten Sie die Oberfläche der Messkammer mit Poly-HEMA. Füllen Sie die Messkammer mit externer Badlösung und legen Sie einige Tropfen der kultivierten Zellsuspension in die Kammer (Schritt 4.9).
- Kapillaren mit Kohlefasern am Bühnenmikromanipulator befestigen. Wählen Sie GtACR1-exezierenden CM, indem Sie die Fähigkeit überprüfen, Kontraktionen durch DieAnwendung kurzer grüner Lichtimpulse zu induzieren. Richten Sie die Kohlefasern nahezu horizontal an der Oberfläche der Messkammer aus.
- Senken Sie die erste Faser auf die Zelloberfläche. Befestigen Sie die zweite Faser parallel zur ersten Faser am anderen Ende des CM. Die ideale Ausrichtung ist nahe senkrecht zur Zellachse.
HINWEIS: Befestigen Sie die Faser, indem Sie die Zelle vorsichtig auf die untere Oberfläche drücken. Lassen Sie den Druck los, bevor Sie die zweite Faser befestigen. Dehnen Sie die Zelle nicht, indem Sie die zweite Faser anbringen. - Nachdem beide Fasern an der Zelle befestigt sind, heben Sie die Fasern an, so dass die Zelle keinen Kontakt mehr zur Kammeroberfläche hat und sich reibungsfrei zusammenziehen kann.
- Fokussieren Sie die Sarkome in der Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle) und legen Sie das Sarcomere-Längenverfolgungsfenster (Abbildung 7AI (3)) zwischen den Fasern fest.
HINWEIS: Das resultierende FFT-Leistungsspektrum (Abbildung 7A I (2)) zeigt idealerweise einen scharfen Peak, der die durchschnittliche Sarcomere-Länge darstellt. - Spurfaserbiegen mit dem Kantenerkennungsmodul. Legen Sie die Erfassungsbereiche mit dem roten und grünen Fenster fest und definieren Sie einen Schwellenwert (rote und grüne horizontale Linie) an der ersten Ableitung der Lichtintensitätsspur (Abbildung 7A III).
- Beginnen Sie, die Zelle optisch bei 0,25 Hz zu beschleunigen (wenn möglich, versuchen Sie schnellere Temporaten) und verfolgen Sie Sarcomere-Länge und Faserbiegen.
HINWEIS: Faserhalterposition, LED-Trigger und elektrische Stimulationsimpulse werden über die Datenerfassungssoftware gesteuert (siehe Materialtabelle). - Nach der Aufzeichnung von mindestens 15 optisch ausgelösten Kontraktionen, feldstimulieren Sie die Zelle elektrisch (siehe Tabelle der Materialien). Finden Sie den Schwellenwert, um Kontraktionen auszulösen und aufzuzeichnen, indem Sie das 1,5-fache der Schwellenspannung anwenden.
- Für das Hemmungsprotokoll elektrische Reize anwenden, um Kontraktionen auszulösen und dann nachhaltigem Licht von 64 s (bei verschiedenen Lichtintensitäten) auszusetzen.
- Produzieren Sie Kohlefasern.
Differenz der gemessenen Spannung zwischen den Piezomotorschritten):
Abbildung 4: Rohrleitungsbiegeaufbau. (1) Der Mikromanipulator auf der linken Seite wird verwendet, um die Position der Kapillare zu steuern, und ein zweiter Mikromanipulator auf der rechten Seite wird verwendet, um sie zu biegen. (2) Kapillare. (3) Bender. (4) Mikroschmiede. (5) Orientierungskreis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Pipette mit Kohlefaser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Datenanalyse
-
Patch-Clamp-Aufnahmen
HINWEIS: Korrigieren Sie alle aufgezeichneten und Befehlsspannungen für das Flüssigkeitsknotenpotential nach dem Experiment. Bestimmen Sie das Flüssigkeitsknotenpotenzial in der Datenerfassungssoftware mit Hilfe des Werkzeuganschlusspotentialrechners (für die angegebenen Patch-Clamp-Lösungen in Tabelle 4: 14,4 mV bei 21 °C). Subtrahieren Sie das Flüssigkeitsknotenpotential von der aufgezeichneten/Befehlsspannung.- Überprüfen Sie bei I-Clamp AP-Aufnahmen das elektrische Tempo im Vergleich zum optischen Tempo. Berechnen Sie die AP-Dauer (APD) bei 20 und 90% Repolarisation mit einem benutzerdefinierten Skript (Ergänzendes Material). Bestimmen Sie das Restmembranpotential und die AP-Amplitude.
HINWEIS: Bestimmen Sie die APD wie in Wang K. et al.21 beschrieben Das Skript zum Laden von .abf-Dateien ist allgemein über den folgenden Link zugänglich: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Durchschnittliche APD-Werte für mindestens 6 AP. - Überprüfen Sie bei der V-Klemmen-Photoaktivierung, ob die Basislinie bei 0 pA liegt. Wenn nicht die Basislinie auf Null angepasst wird. Analysieren Sie den aufgezeichneten Strom, der durch 300 ms Lichtimpulse bei -74 mV ausgelöst wird. Übertragen Sie die Daten an die Datenanalysesoftware und bestimmen Sie den Spitzen- und Durchschnittsstrom.
- Überprüfen Sie bei I-Clamp AP-Aufnahmen das elektrische Tempo im Vergleich zum optischen Tempo. Berechnen Sie die AP-Dauer (APD) bei 20 und 90% Repolarisation mit einem benutzerdefinierten Skript (Ergänzendes Material). Bestimmen Sie das Restmembranpotential und die AP-Amplitude.
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Kohlefaserexperimente
- Kontraktionsaufzeichnungen während des optischen Tempos: Laden Sie die aufgezeichneten Daten in die Datenerfassungssoftware und lesen Sie die Grundlinie und Maxima der Kohlefaserbiegung und der Sarcomere-Längenänderungen aus.
HINWEIS: Durchschnittswerte für 10 Kontraktionen einer stabilen Aufzeichnung. - Messen Sie die Zellenbreite und berechnen Sie die Querschnittsfläche der Zelle unter der Annahme eines elliptischen Querschnitts (Abbildung 7B II).
ANMERKUNG: Die Formel für den Bereich einer Ellipse ist A = , formel 2), wobei a der Abstand vom Zentrum zum Scheitelpunkt und b der Abstand vom Zentrum zum Ko-Vertex ist. In unserem Fall bedeutet dies a = (Breite der Zelle)/2 und b = (Dicke der Zelle)/2. Nach Nishimura et al.22 kann die Dicke von CM auf ein Drittel der Zellbreite geschätzt werden, so dass A = (1/2)-Breite (1/2)-Dicke = (1/4)-Breite (1/3)-Breite = (1/12)-Breite2. - Berechnen Sie die endsystolische Kraft (F):
- Berechnen Sie die endsystolische Zellverformung (ESD):
HINWEIS: Weitere kontraktile Parameter können analysiert werden: ruhende Sarkome-Länge, Zeit bis zum Höhepunkt, Zeit bis 90% Entspannung, fraktionierte Sarcomere-Verkürzung, maximale Kontraktions- und Entspannungsgeschwindigkeit (siehe Software-Erfassungshandbuch).
- Kontraktionsaufzeichnungen während des optischen Tempos: Laden Sie die aufgezeichneten Daten in die Datenerfassungssoftware und lesen Sie die Grundlinie und Maxima der Kohlefaserbiegung und der Sarcomere-Längenänderungen aus.
Representative Results
GtACR1-eGFP wurde in kultiviertem Kaninchen CM(Abbildung 6 Einsatz) ausgedrückt und Photoströme wurden mit der Patch-Clamp-Technik gemessen. Die Photoaktivierung von GtACR1 zeigt große nach innen gerichtete Ströme bei -74 mV. In Abbildung 6beträgtein Spitzenstrom (IP) bei 4 mW/mm2 245 pA. AP wurden entweder elektrisch (Abbildung 6B) oder optisch (Abbildung 6C) mit Stromeinspritzungen 1,5-facher Schwellenwert oder kurze depolarisierende Lichtimpulse von 10 ms ausgelöst. Analyse von APD-Werten, elektrisch beschleunigtes CM zeigt eine APD 20 von 0,24 x 0,08 s und eine APD 90 von 0,75 x 0,17 s, in der Erwägung, dass die cm optisch eine APD 20 von 0,31 x 0,08 s und eine APD 90 von 0,81 x 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, im hier vorgestellten Beispiel APD 20elektrisch = 0,17 s) aufweisen; APD 20optisch = 0,27 s und APD 90elektrisch = 0,61 s; APD 90optisch = 0,68 s; Abbildung 6D). Optisch temporierte CM zeigen einen langsameren AP-Beginn (Abbildung 6D). Die CM-Aktivierung wurde bei anhaltender Beleuchtung (für 64 s, 4 mW/mm2) durch Polarisieren des Membranpotentials in Richtung des Umkehrpotentials von Chlorid, hier -58 mV (Abbildung 6E) gehemmt. Höhere Strominjektionen als das 1,5-fache des Schwellenwerts entlocken keine AP-Generierung (Abbildung 6F). Die erzeugten Spitzenkräfte wurden durch Kohlefaserbiegen ermittelt (Abbildung 7B,C,E). Der CM erzeugte 232 N/mm2 bei elektrischem Tempo (Abbildung 7B) und 261 N/mm2 nach optischem Tempo (Abbildung 7C). Verlängerte Grünlichtimpulse hemmen Kontraktionen (Abbildung 7E). Nach der optischen Hemmung für 64 s erzeugen wiederkehrende Kontraktionen eine geringere kontraktile Kraft, und die Kraftwerte erholen sich nach 10 Kontraktionen (Tempo bei 0,25 Hz, Abbildung 7D)entsprechend dem diastolischen Kalziumverlust von Kaninchen CM.
Abbildung 6: Repräsentative Patch-Clamp-Aufnahmen von elektrisch und optisch beschleunigtem/gehemmter CM. (A) Repräsentativer Fotostrom bei -74 mV mit einem Lichtimpuls von 300 ms, 4 mW/mm2. IP zeigt den Spitzenstrom an. Die Einfügung zeigt eine GtACR1-eGFP-positive Zelle. (B) Repräsentative AP-Aufzeichnung bei 0 pA mit einer Stromrampe von 10 ms, 0,6 nA, um die CM elektrisch zu beschleunigen. (C) Repräsentative AP-Aufnahme bei 0 pA mit Lichtimpulsen von 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Das obere Diagramm zeigt die Überlagerung des10. AP des elektrisch (blauen) und optisch (grünen) aktivierten CM. AP wurden durch die maximale Veränderung des Membranpotentials (dV/dt max) ausgerichtet. Das untere Diagramm zeigt den Unterschied des Membranpotentials zwischen optisch und elektrisch ausgelöstem AP (Eoptisch-Eelektrisch). (E) Elektrisch ausgelöste AP wurden unter Dauerlicht von 64 s, 4 mW/mm2gehemmt. (F) AP werden durch höhere Strominjektionen als das 1,5-fache des Schwellenwerts (von 0,7 nA in Schritten von 0,1 nA bis 2,2 nA) bei dauerem Licht gehemmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative Daten aus Kohlenstofffaseraufzeichnungen von optisch und elektrisch beschleunigtem/gehemmter CM. (A) Anzeige in der Datenerfassungssoftware. Bild (I) zeigt den gemessenen CM mit dem Fenster zur Berechnung der Sarcomere-Länge. Die Zellenbreite ist orange gekennzeichnet. (1) Bereich der relevanten Frequenzen. (2) Das FFT-Leistungsspektrum zeigt die Frequenz des Sarcomere-Abstands auf der Zelle an. Die durchschnittliche Sarcomere-Länge wird aus der Spitzenfrequenz berechnet. (3) Sarcomere Länge Tracking-Fenster. (4) Intensitätsspur. (5) Die Mitnenspur multipliziert mit einem Hamming-Fenster ist die Fensterintensitätsspur. Schema (II) zeigt den elliptischen Querschnitt der Zelle. Breite in Orange und Dicke in gestricheltem Blau. Bild (III) zeigt die Position der Kohlefasern mit den entsprechenden Detektionsboxen, links in rot und rechts in Grün. (6) Intensitätsspur. (7) Erste Ableitung der Intensitätsverfolgung (siehe Handbuch zur Datenerfassungssoftware). (B) Repräsentative Spur von elektrisch ausgelösten Kontraktionen. Panel (I) zeigt die Sarcomere-Länge verkürzung, Panel (II) den Abstand zwischen den beiden Kohlefasern. (C) Repräsentative Spur von optisch ausgelösten Kontraktionen (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) zeigt die Sarcomere-Länge verkürzung, Panel (II) den Abstand zwischen den beiden Kohlefasern. (D) Erzeugte Spitzenkraft von Kontraktion 1 bis 11 nach einer Pause, die durch Hemmung der AP-Generierung verursacht wurde. (E) Repräsentative Spur der optischen Hemmung von Kontraktionen bei anhaltender Beleuchtung (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) zeigt die Sarcomere-Länge verkürzung, Panel (II) die Länge zwischen den beiden Kohlefasern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Eine | Bereich |
| Acr | Anionenkanalrhodopsin |
| Ld | Aktionspotenzial |
| Apd | Aktionspotenzialdauer |
| Cfu | Kolonie bildende Einheit |
| Chr | Channelrhodopsin |
| Cm | Kardiomyozyten |
| eGFP | verbessertes grünes fluoreszierendes Protein |
| Esd | End-systolische Zellverformung |
| Eu | Endotoxin-Einheiten |
| F | Kraft |
| Fft | schnelle Fourier-Transformation |
| GtACR | Guillardia theta anion channelrhodopsin |
| Gui | grafische Benutzeroberfläche |
| I-Klemme | Stromklemme |
| Ie | internationale Einheiten |
| Moi | Vielzahl der Infektionen |
| poly-HEMA | poly(2-hydroxyethyl methacrylat) |
| V-Klemme | Spannungsklemme |
Tabelle 5: Liste der Abkürzungen.
Ergänzende Abbildung 1: Lichtintensitätsmessungen mit optischem Leistungsmesser. (A) Messung von 10 ms Lichtimpulsen bei 4 mW/mm2. (B) Messung der Dauerbeleuchtung von 64 s bei 4 mW/mm2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2: Eigenschaften von frisch isoliertem CM und deren strukturelle Anpassung in der Kultur. (A) AP-Aufnahme eines frisch isolierten CM (APD 20 von 1,11 x 0,34 s, APD 90 von 1,96 x 0,32 s, n = 7, N = 2). Mittleres ruhendes Membranpotential von -79,3 x 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Karbonfaseraufzeichnung eines elektrisch geeisten frisch isolierten CM. Mittlere Spitzenkraft von 205 x 78 n/mm2 (n = 7, N = 2). (C) Konfokale Bilder eines frisch isolierten CM (I); unumsprodigen (II) und transduced (III) CM nach 48 Stunden in kultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzendes Material: MatLab-Skript zur Bestimmung des APD- und Ruhemembranpotenzials. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Während optogenetische Werkzeuge die Modulation der erregbaren Zellelektrophysiologie auf nicht-invasive Weise ermöglichen, benötigen sie eine gründliche Charakterisierung in verschiedenen Zelltypen (z. B. CM), damit man das beste verfügbare Werkzeug für ein spezifisches experimentelles Design auswählen kann. Die Patch-Clamp-Technik ist eine Standardmethode zur Beurteilung der zellulären Elektrophysiologie. In der Ganzzellkonfiguration ermöglicht es, photoaktivierte Ströme über die Plasmamembran oder zeitliche Veränderungen der Membranspannung nach Lichtstimulation/Hemmung aufzuzeichnen. Optogenetische Manipulation der elektrischen Anregung wirkt sich auch auf CM Kontraktionen. Wir verwenden Sarcomere-Tracking und Kohlefaser-unterstützte Kraftmessungen, um die Auswirkungen optischer Verhöre auf die mechanische Aktivität von Myozyten zu quantifizieren.
Wir beschreiben ein Protokoll, um die grundlegenden Effekte eines lichtverorgattenden Chloridkanals, GtACR1, in CM zu charakterisieren. Als Modellsystem haben wir uns für Kaninchen CM entschieden, da ihre elektrophysiologischen Eigenschaften (z. B. AP-Form und feuerfeste Periode) denen ähneln, die im menschlichen CM beobachtet wurden, näher als Nagetier CM. Darüber hinaus kann Kaninchen CM für mehrere Tage kultiviert werden, lang genug für adenovirale Lieferung und Expression von GtACR1-eGFP. Insbesondere isolierte CM ändern ihre strukturellen Eigenschaften in der Kultur im Laufe der Zeit, einschließlich Rundung von Zellendenden und allmählichen Verlust der Kreuz-Striation, T-tubular System undCaveolae 23,24. In diesem Einklang wurden funktionelle Veränderungen in kultivierten CM berichtet: Depolarisation des ruhenden Membranpotentials, Verlängerung des AP und Veränderungen in der zellulären Ca2+ Handhabung. Für eine Überprüfung der zellulären Anpassungen in der Kultur, siehe Louch et al.25. Ergänzende Abbildung 2 zeigt beispielhafte AP- und Kontraktionsmessungen von frisch isoliertem CM zum Vergleich mit denen, die in kultiviertem CM beobachtet wurden (Abbildung 6, Abbildung 7) unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls.
Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen direkte Messungen von Photostromeigenschaften (z. B. Amplituden und Kinetik) und lichtinduzierten Veränderungen des Membranpotentials oder der AP-Eigenschaften bei hoher zeitlicher Auflösung. Solche Aufnahmen haben jedoch mehrere Einschränkungen: Erstens wird das Zytosol durch die Pipettenlösung in Ganzzellaufnahmen ersetzt, was vorteilhaft ist, ionische elektrochemische Gradienten zu kontrollieren, aber den intrinsischen Nachteil des Auswaschens von Zellorganellen, Proteinen und anderen Verbindungen hat, wodurch sich die zellulären elektrischen Reaktionen potenziell auswirken. Zweitens sind Nebenwirkungen wie die Aktivierung zusätzlicher Ionenkanäle infolge einer nicht physiologisch langen Depolarisation (z. B. langsame Zeitkonstanten von lichtgated Ionenkanälen) schwer einzuschätzen, da unsere Methode es nur ermöglicht, Veränderungen in APD zu erkennen, aber keine direkten Messungen der ionenförmigen Konzentrationen in elektrophysiologisch relevanten Zellkompartimen durchzuführen. Dies könnte mit Fluoreszenzindikatoren (z. B. Ca2+-Sensoren) oder ionenselektiven Elektroden erfolgen. Weitere Charakterisierungen können Lichtintensitätstitrationen, Bestimmung der pH-Abhängigkeit, photoaktuelle Kinetik an verschiedenen Membranpotentialen und Erholungskinetik bei sich wiederholender Lichtstimulation sein.
Im Gegensatz zu Patch-Clamp-Aufnahmen ermöglichen einzellige Kraftmessungen die Analyse zellulärer Kontraktionen intakter Myozyten, ohne ihr intrazelluläres Milieu zu beeinträchtigen. Sekundäre Auswirkungen auf Ionenkonzentrationen (z.B. Ca2+)können indirekt durch Bestimmung der erzeugten Kraftamplitude und Dynamik (z.B. maximale Kontraktions- und Entspannungsgeschwindigkeit; hier nicht analysiert) beurteilt werden. Kraftmessungen mit der Kohlefasertechnik haben einen Vorteil gegenüber frei kontrahierenden Zellen, da sie direkte Informationen über passive und aktive Kräfte in vorbelasteten Zellen liefern (d. h. bei Bedingungen, die eher den In-situ- oder in-vivo-Einstellungen ähneln). Mechanische Vorspannung ist besonders wichtig bei der Analyse der zellulären Kontraktilität, da Dehnung wirkt sich auf Kraftproduktion und Entspannung26,27.
Optogenetische Ansätze ermöglichen eine raumzeitlich präzise Manipulation des Zellmembranpotentials, sowohl in einzelm CM als auch im intakten Herzgewebe. Klassischerweise wurde ChR2, ein lichtverorsender Kationen-Nicht-selektiver Kanal, zur Depolarisation des Membranpotentials verwendet, während lichtbetriebene Protonen- und/oder Chloridpumpen für die Membranhyperpolarisation verwendet wurden. Beide Gruppen von optogenetischen Aktuatoren erfordern hohe Expressionsniveaus, da ChR2 durch eine intrinsisch niedrige einkanalige Leitfähigkeit28 gekennzeichnet ist und lichtbetriebene Pumpen maximal ein Ionen pro absorbiertem Photon transportieren. Darüber hinaus kann eine längere Aktivierung von ChR2 in CM zu Einer Überlastung von Na+ und/oder Ca2+ führen, und lichtbetriebene Pumpen können transsarkolimmales H+ oder Cl- Gradienten29,30ändern. Auf der Suche nach alternativen Werkzeugen zur optogenetischen Kontrolle der CM-Aktivität haben wir vor kurzem das natürliche Anionenkanalrhodopsin GtACR1 getestet, das sich durch eine überlegene einkanalige Leitfähigkeit und eine höhere Lichtempfindlichkeit im Vergleich zu Kation ChR wie ChR2 auszeichnet. Wir fanden heraus, dass die GtACR1-Aktivierung CM depolarisiert und je nach Lichtimpuls-Timing und -Dauer für optisches Tempo und Hemmung verwendet werden kann. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von ACR anstelle von kation ChR könnte das negativere Umkehrpotential von Clsein - im Vergleich zu Na+, um künstlich eingeführte Ionenströme zu reduzieren. Wie wir bereits gezeigt haben, kann optisches Tempo mit GtACR1 aufgrund der langsamen Komponente des GtACR1-Kanalverschlusses zu einer AP-Verlängerung führen, die durch den Einsatz schnellerer GtACR1-Mutationen19überwunden werden könnte. Die AP-Verlängerung ist jedoch bei Verwendung einer niedrigeren, physiologischeren intrazellulärenCl-Konzentration viel weniger ausgeprägt (siehe Abbildung 6). Darüber hinaus führt die GtACR1-vermittelte Hemmung durch längere Ausleuchtung zu einer tiefgreifenden Membrandepolarisation, die wiederum den sekundären Na+ und Ca2+ Zustrom aktivieren und damit die Aktivität von spannungsgebundenen Kanälen verändern könnte. In unseren Messungen stellen wir fest, dass sich AP- und Kontraktionsparameter nach einer lichtinduzierten Hemmung für 1 min auf Basislinie von 40 s erholen (siehe Kopton et al. 2018, Abbildung 6, Abbildung 7). Lichtgeorte K+ Kanäle bieten eine potente Alternative zum Silencing CM, ohne das CM-Ruhemembranpotential31zu beeinträchtigen.
In Zukunft möchten wir verschiedene optogenetische Werkzeuge quantitativ vergleichen, um ihre Fähigkeit zur Hemmung der Herzaktivität zu haben. Zu diesem Zweck testen wir eine Vielzahl von lichtverkabelten Ionenkanälen, einschließlich ACR, ChR2 und rot verschiebbaren ChR-Varianten32, sowie hyperpolarisierende Aktuatoren wie Halorhodopsin oder die lichtgated adenylyl cyclase bPAC in Kombination mit dem Kaliumkanal SthK (PAC-K)31.
Das hier vorgestellte Protokoll kann zur tiefen Charakterisierung der elektromechanischen Eigenschaften von CM verwendet werden. Es gilt hauptsächlich auch für CM von anderen Arten, und CM isoliert von krankem Myokard. Die optische Stimulation ermöglicht es, CM bei unterschiedlichen Frequenzen zu beschleunigen, und verschiedene Vorspannungen können bei Kohlefaserkontraktionsexperimenten getestet werden. Ein interessantes Experiment wäre die Verwendung von Beleuchtung mit geringer Intensität für die subschwellige Depolarisation, um eine allmähliche Zunahme des ruhenden Membranpotentials nachzuahmen, wie bei der Entwicklung des Herzgewebeumbaus während der Krankheitsprogression beobachtet werden kann. Schließlich könnten funktionelle Messungen mit Ca2+ Imaging kombiniert werden, um weitere Einblicke in die Anregungs-Kontraktionskopplung zu erhalten, oder mit pharmakologischen Interventionen, um die Auswirkungen verschiedener Medikamente auf die CM-Aktivität zu bewerten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Stefanie Perez-Feliz für die hervorragende technische Unterstützung, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-Universität, Berlin, Deutschland) für die Bereitstellung des pUC57-GtACR1-Plasmids, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) für die Adenovirus-Produktion und Dr. Anastasia Khokhlova (Ural-Bundesuniversität) für den Austausch ihrer Expertise zur Verbesserung des Zellisolationsprotokolls und zur Neugestaltung der Pipette. Das Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether Stipendium: SCHN1486/2-1) und das ERC Advanced Grant CardioNECT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
| Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
| Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
| Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
| Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
| Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
| Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
| Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
| Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
| Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
| Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
| Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
| Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
| Equipment - Patch-clamp | |||
| Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
| Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
| Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
| Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
| Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Equipment - Carbon fiber | |||
| Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
| Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
| Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
| Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
| MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
| Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Chemicals | |||
| Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
| CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
| L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
| Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
| Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
| Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
| Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
| Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
| K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
| KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
| KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
| M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
| NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
| NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
| NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
| Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
| Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
| Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |
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