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Bioengineering

माइक्रोवेकुल्चर में फील्डवाइज फ्लो का स्थानिक लौकिक विश्लेषण

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60493
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 1,2, 5, 5, 5, 5, 6, 1,2, 5
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

Summary

उच्च गति केशिका प्रवाह छवि दृश्यों से सूक्ष्म संवहनी प्रवाह की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमने स्टाफ (फील्डवाइज फ्लो का स्थानिक लौकिक विश्लेषण) सॉफ्टवेयर विकसित किया। पूर्ण छवि क्षेत्र में और समय के साथ, कर्मचारी प्रवाह वेग का मूल्यांकन करता है और मात्रात्मक विश्लेषण ों के लिए दृश्य और सारणीय उत्पादन के लिए रंग-कोडित स्थानिक मानचित्रों का एक अनुक्रम उत्पन्न करता है।

Abstract

अलग-अलग सेलुलर जरूरतों के जवाब में ऊतक और अंग परफ्यूजन को बनाए रखने में रक्त प्रवाह वेग और वितरण में परिवर्तन महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, माइक्रोसर्कुलेशन में दोषों की उपस्थिति कई विकृतियों के विकास में एक प्राथमिक संकेतक हो सकती है। ऑप्टिकल इमेजिंग में प्रगति ने इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) को एक व्यावहारिक दृष्टिकोण बनाया है, जो समय के साथ उच्च गति पर जीवित जानवरों में सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर पर इमेजिंग की अनुमति देता है। फिर भी, पर्याप्त ऊतक परफ्यूजन बनाए रखने के महत्व के बावजूद, केशिका प्रवाह में स्थानिक और लौकिक परिवर्तनशीलता शायद ही कभी प्रलेखित है । मानक दृष्टिकोण में, सीमित समय में इमेजिंग के लिए कम संख्या में केशिका खंडों को चुना जाता है। निष्पक्ष तरीके से केशिका प्रवाह की व्यापक मात्रा निर्धारित करने के लिए हमने फील्डवाइज फ्लो (स्टाफ) का स्थानिक लौकिक विश्लेषण विकसित किया, फिजी ओपन-सोर्स छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए एक मैक्रो। केशिकाओं के भीतर रक्त प्रवाह के पूर्ण क्षेत्रों के उच्च गति छवि दृश्यों का उपयोग करना, कर्मचारी ऐसी छवियों का उत्पादन करते हैं जो हर संवहनी खंड के लिए हर समय अंतराल के लिए काइमोग्राफ नामक समय के साथ गति का प्रतिनिधित्व करते हैं। kymographs से स्टाफ दूरी है कि लाल रक्त कोशिकाओं को समय के साथ कदम से वेग की गणना करता है, और रंग के एक अनुक्रम के रूप में वेग डेटा आउटपुट-दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सारणीबद्ध उत्पादन के लिए स्थानिक नक्शे कोडित । सामान्य माउस यकृत में, कर्मचारी लोबुलके के भीतर पेरिसेंट्रल और पेरिपोर्टल क्षेत्रों के बीच प्रवाह वेग में मात्रानिर्धारित गहन अंतर का विश्लेषण करता है। इससे भी अधिक अप्रत्याशित प्रवाह वेग में अंतर है जो सिनोसॉइड के बीच देखा जाता है जो साथ-साथ होते हैं और सेकंड में व्यक्तिगत संवहनी खंडों के भीतर देखे गए उतार-चढ़ाव होते हैं। स्टाफ एक शक्तिशाली नया उपकरण है जो केशिका प्रवाह की जटिल स्थानिक गतिशीलता की माप को सक्षम करके उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम है।

Introduction

माइक्रोवेकुल्चर शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बदलती परिस्थितियों में ऊतकों के प्रभावी perfusion सुनिश्चित करने । माइक्रोवैस्कुलर डिसफंक्शन दीर्घकालिक हृदय रुग्णता और मृत्यु दर, डिमेंशिया का विकास, और यकृत और गुर्दे दोनों की बीमारी सहित असंख्य स्थितियों से जुड़ा हुआ है और इस प्रकार जैव चिकित्सा जांच1,2,3,4,5की एक विस्तृत श्रृंखला में रुचि का एक प्रमुख कारक है। जबकि ऊतक परफ्यूजन का मूल्यांकन करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया गया है, केवल इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत केशिकाओं के स्तर पर रक्त प्रवाह की विशेषता के लिए आवश्यक लौकिक और स्थानिक संकल्प पर डेटा संग्रह को सक्षम बनाता है।

माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी में या तो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर के आंदोलन से या झिल्ली-अभेद्य फ्लोरोसेंट मार्कर (जैसे, फ्लोरोसेंट-लेबल ्ड्टिन या एल्बुमिन)6,7की पृष्ठभूमि के खिलाफ लाल रक्त कोशिकाओं के आंदोलन से कल्पना की जा सकती है। माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सतही कोशिका परतों में या या तो कॉन्फोकल या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गहराई से चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, केशिका प्रवाह दर ऐसी है कि लाल रक्त कोशिकाओं के पारित होने को आम तौर पर ६० फ्रेम/एस से कम गति पर नहीं पकड़ा जा सकता है । चूंकि अधिकांश लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल और मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप को पूर्ण छवि क्षेत्र को स्कैन करने के लिए 1-5 एस की आवश्यकता होती है, इसलिए इस गति को आम तौर पर केवल देखने के क्षेत्र को सीमित करके पूरा किया जा सकता है, कभी-कभी एक स्कैन लाइन8तक। चयनित केशिका खंडों (1) के लिए माप को सीमित करने की प्रक्रिया में चयन पूर्वाग्रह लागू करने की क्षमता है और (2) केशिका रक्त प्रवाह की दरों में स्थानिक और लौकिक विषमता को पकड़ने के लिए असंभव बनाता है। इसके विपरीत, वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (sCMOS) कैमरों9,10से लैस वाइडफील्ड डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 100 एफपीएस से अधिक की गति पर केशिका नेटवर्क की छवियों को एकत्र किया जा सकता है। ये सस्ती प्रणालियां, ठेठ जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में आम हैं, जो अनिवार्य रूप से लगातार पूरे दो-आयामी नेटवर्क में माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को छवि बनाती हैं। समस्या तो एक विश्लेषण दृष्टिकोण है कि बड़े पैमाने पर और जटिल छवि उच्च गति वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पन्न डेटासेट से सार्थक मात्रात्मक डेटा निकालने में सक्षम है खोजने में से एक बन जाता है ।

पूर्ण क्षेत्र प्रवाह डेटा के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए हमने स्टाफ, उपन्यास छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो उच्च गति11पर एकत्र की गई छवि श्रृंखला के पूरे माइक्रोस्कोप क्षेत्रों में माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह को लगातार माप सकता है। दृष्टिकोण विभिन्न प्रयोगात्मक प्रणालियों और इमेजिंग तौर-तरीकों की एक किस्म के साथ संगत है और स्टाफ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को इमेजजे12के फिजी कार्यान्वयन के लिए मैक्रो टूलसेट के रूप में लागू किया जाता है। सूक्ष्म संवहनी प्रवाह की कल्पना करने के लिए यहां उपयोग किया जाने वाला अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि पहले, केशिकाओं के भीतर लाल रक्त कोशिकाओं को छवि बनाने में सक्षम होने के लिए कुछ विपरीत प्रदान किया जाना चाहिए। हमारे अध्ययनों में, इसके विपरीत एक थोक फ्लोरोसेंट जांच द्वारा प्रदान किया जाता है जिसे लाल रक्त कोशिकाओं द्वारा बाहर रखा गया है। इसके बाद प्रवाह के वेग को लाल रक्त कोशिकाओं के विस्थापन से प्राप्त किया जा सकता है जो जीवित पशु8से अत्यधिक गति से एकत्र की गई छवियों में फ्लोरोसेंटी लेबल प्लाज्मा के भीतर नकारात्मक दाग के रूप में दिखाई देते हैं । फिर हम कर्मचारियों का उपयोग केमोग्राफ नामक समय के कई अंतरालों पर प्रत्येक केशिका खंड के साथ दूरी के भूखंड बनाने के लिए करते हैं, फिर किमोग्राफ13में मौजूद ढलानों का पता लगाते हैं, और उन ढलानों से माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह की दरों की गणना करते हैं। दृष्टिकोण इमेजिंग के लिए पहुँचा जा सकता है कि किसी भी केशिका बिस्तर से एकत्र छवियों पर लागू किया जा सकता है। यहां हम जिगर में रक्त प्रवाह के अध्ययन के लिए आईवीएम और कर्मचारियों के आवेदन का वर्णन करते हैं।

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Protocol

इंडियाना विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी गई और आयोजित किया गया, और जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआरसी गाइड का पालन किया गया ।

1. इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के लिए सर्जिकल तैयारी

नोट: यह एक जीवित रहने की सर्जरी नहीं है। एक बार धारा 1 "इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के लिए सर्जिकल तैयारी" शुरू हो जाने के बाद, धारा 2 "इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी" के पूरा होने तक काम को रोका नहीं जा सकता है।

  1. 9-10 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों को स्वीकार करें, कम से 4 दिनों के लिए और अध्ययन से पहले 16 घंटे के लिए तेजी से ।
  2. जानवर का वजन करें, 5% आइसोफ्लोरीन के साथ बेहोश करें और शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर रखें। 1-2 एल/मिन की ऑक्सीजन प्रवाह दर का उपयोग करें और 1-2% आइसोफ्लोरीन के साथ सेडनेशन बनाए रखें। टो चुटकी द्वारा सजगता की जांच करें। गुदा थर्मामीटर का उपयोग करतापमान की निगरानी। हृदय गति और श्वसन नेत्रहीन निगरानी करें।
  3. जब संज्ञाहरण स्थिर है, जुगुलर कैनुलेशन प्लेसमेंट और जिगर के जोखिम के लिए रिब पिंजरे के नीचे के क्षेत्र के लिए क्षेत्र दाढ़ी ।
  4. जुगलबंदी कैन्युलेशन के लिए, माउस के जबड़े के नीचे 1 सेमी लेफ्ट वेंट्रल चीरा 1-2 सेमी बनाएं। जुगलबंदी नस के आसपास के सभी वसा और प्रावरणी को दूर करें। रक्तस्राव को रोकने के लिए 06 सीवन स्ट्रिंग का उपयोग करके जुगलबंदी के पूर्वकाल के अंत को बंद करें।
    1. जुगलबंदी नस में एक छोटे से निक बनाओ और कैनुला स्लाइड (30 जी x 1/2 में, सुई), सुई धारक और पॉलीथीन ट्यूबिंग (०.०११ x ०.०२४ इंच2 एक Luer स्टब एडाप्टर से जुड़ी और ०.९% खारा से भरा) के बारे में 1 सेमी में, और 0-6 सीवन स्ट्रिंग का उपयोग कर जुगलबंदी के पीछे के अंत में सुरक्षित ।
  5. जुगलबंदी कैनुला का उपयोग करके 70 केडीए फ्लोरोसेइन डीएक्सटीन (खारा में 9 मिलीग्राम/एमएल समाधान के 0.1 मिलीग्राम के इंजेक्शन के माध्यम से 30 मिलीग्राम/किलो ग्राम की खुराक के लिए) वितरित करें।
  6. रिब पिंजरे के बीच में 1-2 सेमी, धड़ भर में 4-6 सेमी चीरा बनाकर इमेजिंग के लिए जिगर का पर्दाफाश करें।
  7. एक गीला (0.9% खारा में भिगोया) 2 x 2 इंच2 धुंध स्पंज बाएं पार्श्व जिगर पालि के नीचे रखें। 40 मिमी कवरस्लिप-तली हुई डिश की कांच की खिड़की की परिधि पर टेप रखें और टेप पर साइनोक्रिलेट चिपकने वाला लगाएं। कांच की प्लेट को जिगर में दबाएं और कॉटन इत्तला दे चुके एप्लीकेटर का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी के लिए ऊतक गति को कम करने के लिए टेप पर गोंद में धुंध को दबाएं।
  8. जानवर को माइक्रोस्कोप चरण में ले जाएं। इमेजिंग सत्र में जिगर नम रखने के लिए कवरस्लिप-तली डिश में बाँझ 0.9% खारा जोड़ें। मंच पर चढ़कर हीटिंग पैड के माध्यम से 36-37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें, एक हीटिंग पैड जानवर और एक उद्देश्य हीटर पर रखा गया।

2. इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी

  1. हाई-स्पीड इमेज कैप्चर में सक्षम वीडियो कैमरे से लैस उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर इंट्रावेटल माइक्रोस्कोप करें।
    नोट: यहां, एक ज़ेनन आर्क लैंप, फ्लोरेसिन-विशिष्ट उत्तेजना (480-500 एनएम) और उत्सर्जन (507-543 एनएम) फिल्टर, प्लान फ्लोर 20x, एए 0.75 पानी विसर्जन उद्देश्य, और एक उच्च गति sCMOS कैमरा का उपयोग किया गया था।
  2. न्यूनतम रोशनी का उपयोग करके केशिका रक्त प्रवाह विश्लेषण के लिए ब्याज के क्षेत्र का चयन करें।
  3. कैमरे के लिए एक्सपोजर टाइम काफी कम सेट करें ताकि 100 एफपीएस हासिल कर सके। लाल रक्त कोशिका छाया और वास्कुलचर की टोपोलॉजी को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए रोशनी स्तर सेट करें, जबकि फ्लोरोसेंट जांच की फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग से भी परहेज करें।
  4. 100 एफपीएस की दर से छवियां एकत्र करें। ~ 0.65 और ~ 1.3 माइक्रोन/पिक्सेल के बीच कैमरा पिक्सेल रेजोल्यूशन सेट करें। 512 x 512 और 1024 x 1024 पिक्सल के बीच फ्रेम साइज सेट करें। 8 और 16 बिट्स के बीच थोड़ा गहराई सेट करें। उच्चतम रिज़ॉल्यूशन, फ्रेम आकार और बिट गहराई का उपयोग करें जो अभी भी सिस्टम पर 100 एफपीएस छवि संग्रह की अनुमति देता है।
  5. समय श्रृंखला फ़ाइल (एस) को टीएफ फ़ाइलों के अनुक्रम के रूप में या देशी कैमरा/माइक्रोस्कोप प्रारूप के रूप में सहेजें यदि फिजी में बायो-फॉर्मेट14 देशी प्रारूप फ़ाइलें खोल सकते हैं।
  6. समय के साथ कई क्षेत्रों की छवि। 2 घंटे तक के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर माउस बनाए रखें इमेजिंग के अंत में माउस यूथानाइज करें।
    नोट: समय श्रृंखला की अवधि समय के अंतराल के लिए छवि की आवश्यकता को संतुलित करने पर आधारित होगी जो परिवर्तनशीलता को गले लगाती है, जबकि ऊतक की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करती है। समय श्रृंखला की अवधि भी फ़ाइल आकार विचारों से तय किया जा सकता है; 100 एफपीएस पर एकत्र की गई 1024 x 1024 पिक्सेल 16-बिट छवियों की 1 मिन टाइम श्रृंखला एक फ़ाइल उत्पन्न करेगी जो आकार में 12 जीबी है। फ़ाइल आकार विचार फ्रेम आकार और उपयोग की गई थोड़ी गहराई को भी निर्देशित कर सकते हैं। कर्मचारियों के भीतर कोई स्पष्ट आकार सीमा नहीं है।

3. फिजी में TrakEM2 का उपयोग कर के संवहनी नेटवर्क को परिभाषित करें

नोट: सेक्शन 3 में किसी भी बिंदु पर काम बचाने के बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

  1. फिजी को https://imagej.net/Fiji/Downloads से डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें।
    नोट: इस परियोजना के लिए फिजी के संस्करण 1.51n का उपयोग किया गया था, और https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip से डाउनलोड किया जा सकता है। ध्यान दें कि विंडोज पर, फिजी को उपयोगकर्ता स्थान में स्थापित किया जाना चाहिए न कि प्रोग्राम फ़ाइलों में।
  2. फाइल एंड जीटी; इम्पोर्ट एंड जीटी एंड इमेज सीक्वेंस का उपयोग करके फिजी में फिल्म की फाइल खोलें । श्वसन के बीच स्थिर छवियों से एक एकल छवि का चयन करें जहां संवहनी नेटवर्क की टोपोलॉजी देखना आसान है। इमेज एंड जीटी; डुप्लीकेट और डुप्लीकेट चयनित एकल छवि (स्टैक नहीं) चुनें और छवि को एक नए फ़ोल्डर में सहेजें। फ़ाइल या फ़ोल्डर नामों में रिक्त स्थान शामिल न करें।
  3. फ़ाइल और जीटी; न्यू एंड जीटी; ट्रैकईएम 2 (ब्लैंक)का चयन करके एक नई ब्लैंक ट्रैकईएम 2 परियोजना स्थापित करें। प्रोजेक्ट फ़ोल्डर के रूप में फिल्म से एकल छवि वाले नए फ़ोल्डर का चयन करें। ट्रैकईएम2 खिड़कियां खुल जाएंगी।
  4. मुख्य कार्य क्षेत्र में राइट-क्लिक करें और आयात और आयात छविका चयन करें । चरण 3.3 में सहेजी गई एकल छवि पर नेविगेट करें और इसका चयन करें।
  5. मुख्य कार्य क्षेत्र में फिर से राइट-क्लिक करें और डिस्प्ले एंड जीटी; ऑटोरीसाइज कैनवास/लेयर सेटका चयन करें । मुख्य कार्य खिड़की में बाएं क्लिक करें। छवि कार्य क्षेत्र भर जाएगा।
  6. छवि में उन क्षेत्रों का चयन करने के लिए जिनमें वैस्कुलर नेटवर्क होता है, ट्रैकईएम 2 में सेटअप क्षेत्र सूची चयन। छोटे TrakEM2 विंडो (टेम्पलेट, प्रोजेक्ट ऑब्जेक्ट्स, लेयर्स) में"• कुछ भी"पर सही क्लिक करें। नए बच्चे और gt; क्षेत्र सूची जोड़ें चुनें ।
  7. छोटे ट्रैकईएम 2 विंडो में,"प्रोजेक्ट ऑब्जेक्ट्स एंड जीटीएंड प्रोजेक्ट"पर"टेम्पलेट एंड जीटी; कुछ भी"खींचें। इसके बाद'प्रोजेक्ट ऑब्जेक्ट्स एंड जीटीएंडई)पर'टेम्पलेट एंड जीटी; कुछ भी एंड जी;• • एरिया लिस्ट'खींचें। 'प्रोजेक्टऑब्जेक्ट्स एंड जीटी; प्रोजेक्ट एंड कुछ भी"के तहत, • क्षेत्र सूची अब मौजूद होगी।
  8. जेड स्पेस टैबके तहत मुख्य ट्रैकईएम2 विंडो में, एक बार लेबल वाले क्षेत्र सूची बनाई गई थी। इसे चुनने के लिए क्लिक करें। मुख्य TrakEM2 खिड़की में भी तूलिका उपकरणका चयन करें । प्रेस शिफ्ट और ब्रश के लिए एक उपयुक्त आकार का चयन करने के लिए माउस पहिया रोल, उदाहरण के लिए, वास्कुलचर के व्यास से छोटा है । TrakEM2 सेटअप प्रेस कंट्रोल + एस चाबियां बचाने के लिए।
  9. तूलिका उपकरणका उपयोग कर संवहनी नेटवर्क पेंट करें । तूलिका उपकरण का उपयोग करते समय ऑल्ट को मिटाना। आउट-ऑफ-फोकस क्षेत्रों को शामिल न करें। नियंत्रण + एसका उपयोग कर अक्सर सहेजें।
  10. जब संवहनी नेटवर्क की लेबलिंग पूरी हो जाती है, तो मुख्य ट्रैकईएम2 विंडो में राइट-क्लिक करें और लेबल (टीआईएफ) के रूप में निर्यात और जीटी; एरियालिस्ट का चयन करें। पॉपअप विंडो में स्केल 100% और निर्यात सभी क्षेत्र सूचीका चयन करें । TrakEM2 खिड़कियां बंद करें और सहेजें परियोजनाके लिए हां चुनें।
  11. एरियालिस्ट की छवि खुलेगी और एक खाली काली छवि के रूप में दिखाई दे सकती है। मुख्य फिजी मेनू में छवि का चयन करें और gt; समायोजित करें और gt; चमक/इसके विपरीत। बी एंड सी विंडो में ऑटो बटन दबाते हैं और एरियालिस्ट दिखाई देगा। मुख्य फिजी मेनू में छवि और जीटी; लुकअप टेबल और इनवर्ट ल्यूटका चयन करें। सफेद पृष्ठभूमि पर काले लेबल की इस छवि को बचाओ और छवि बंद करो।
  12. फिजी में लेबल फ़ाइल खोलें। प्लगइन्स एंड जीटी; कंकाल और स्केलेनइज़का चयन करें। एक टिफ के रूप में कंकाल छवि को बचाओ। कर्मचारियों के प्रवाह विश्लेषण को चलाने के लिए आवश्यक इनपुट फ़ाइलों में से एक के रूप में skeleton.tif फ़ाइल का उपयोग करें। फ़ाइल को सहेजते समय, फ़ाइल नाम में रिक्त स्थान का उपयोग न करें।
  13. मैन्युअल रूप से कंकाल फ़ाइल को आवश्यकतानुसार संपादित करें, एक अंतर (पेंट टूलका उपयोग करके) उन स्थानों पर उदाहरण के लिए लाइन ड्राइंग में डालकर जहां वास्कुलचर में शाखाओं को कैप्चर नहीं किया गया है क्योंकि वे छवि विमान से बाहर जाते हैं।

4. स्टाफ विश्लेषण के लिए मूवी अनुक्रम तैयार

  1. फाइल एंड जीटी; ओपन या फाइल एंड जीटी; इम्पोर्ट एंड जीटी; इमेज सीक्वेंसका उपयोग करके फिजी में फिल्म की फाइल खोलें । प्रवाह विश्लेषण के लिए छवि अनुक्रम की एक समय अवधि का चयन करें (मिनट के लिए सेकंड हो सकता है, सैकड़ों से दसियों हजार फ्रेम) जहां ऊतक की स्थिति समय के साथ स्थिर बनी हुई है, सिवाय श्वसन के दौरान।
  2. शुरुआत और अंत फ्रेम के नंबरों में टाइप करके अनुक्रम के चयनित हिस्से को डुप्लिकेट और डुप्लीकेट चुनें। इमेज एंड जीटी; प्रॉपर्टीज के तहत इमेज स्पेटियल और टेम्पोरल कैलिब्रेशन चेक करें और जरूरत पड़ने पर सही करें। इमेज फ़ाइल को टीआईएफ (या असंदबाित AVI के रूप में) के रूप में सहेजें। इस movie.tif कर्मचारियों के विश्लेषण को चलाने के लिए एक इनपुट फ़ाइल के रूप में की जरूरत है । फाइल नाम में रिक्त स्थान शामिल न करें।

5. फिजी में स्टाफ मैक्रो स्थापित करें

नोट: (महत्वपूर्ण)फिजी फ़ोल्डर उपनिदेशकों के भीतर कई फ़ोल्डर्स में समान फ़ाइल नाम हैं, कुछ पूंजीकृत, कुछ नहीं। निश्चित रहें कि कर्मचारियों को स्थापित करते समय सही फ़ोल्डर का चयन किया जाता है।

  1. https://github.com/icbm-iupui/STAFF से स्टाफ मैक्रोन डाउनलोड करें।
  2. स्थापित करने के लिए, सबसे पहले फिजी फ़ोल्डर खोलें।
    1. विंडोज पर फ़ोल्डर पाते हैं जहां फिजी उपयोगकर्ता अंतरिक्ष में स्थापित किया जाता है, आमतौर पर डेस्कटॉप पर। मैकओएस पर एप्लीकेशंस फोल्डर में फिजी आइकन मिलते हैं, सही क्लिक करें और ओपनका चयन करें।
  3. फिजी फ़ोल्डर में, प्लगइन्स फ़ोल्डर खोलें। प्लगइन्स फोल्डर के अंदर, मैक्रोन फोल्डर खोलें। इस मैक्रोन फ़ोल्डर में स्टाफ.ijm कॉपी करें: फिजी \ प्लगइन्स \ मैक्रोन \ कर्मचारी.ijm।
  4. फिजी फ़ोल्डर में, प्लगइन्स फ़ोल्डर खोलें। इस प्लगइन्स फोल्डर में STAFF_Dir.जार कॉपी करें: फिजी \ प्लगइन्स \STAFF_Dir.जार।
  5. फिजी फ़ोल्डर में, मैक्रोफ़ोल्डर खोलें। इस मैक्रोन फोल्डर के अंदर ऑटोरन फोल्डर खोलें। इस ऑटोरन फ़ोल्डर में STAFF_Loader.ijm कॉपी करें: फिजी \मैक्रो\ऑटोRun \ STAFF_Loader.ijm।
  6. फिजी शुरू करें और मैक्रो इंस्टॉलेशन को सत्यापित करें। स्थापना को सत्यापित करने के लिए, प्लगइन्स और जीटी; मैक्रोकाचयन करें। ड्रॉपडाउन मेनू को सही ढंग से स्थापित किए जाने पर इसमें शामिल होंगे: ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट, कंकाल का विश्लेषण करें, समय अंतराल संपादित करें, प्रवाह का विश्लेषण करें और स्थानिक मानचित्र का उत्पादन करें।
  7. यदि ये आदेश मैक्रोन मेनू में मौजूद नहीं हैं, तो प्लगइन्स का चयन करें > मैक्रोन >इंस्टॉल करें, फिजी \ प्लगइन्स \ मैक्रोन फोल्डर खोलें, STAFF.ijm फ़ाइल का चयन करें, फिर ओके बटन पर क्लिक करें। आदेश अब प्लगइन्स एंड जीटी; मैक्रोन मेनू में दिखाई देने चाहिए ।

6. कर्मचारियों का उपयोग कर संवहनी प्रवाह की मात्रा

  1. एक नया प्रोजेक्ट बनाएं।
    1. प्लगइन्स एंड जीटी; मैक्रोस एंड जीटी; ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट का चयन करें और कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल बनाने या अपडेट करने के संकेतों का पालन करें।
    2. ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट मेनू से, प्रोजेक्ट डायरेक्टरी, इनपुट फाइल फोल्डर और इनपुट फाइल्स Movie.tif और Skeleton.tif पर नेविगेट करें और चुनें। जरूरत पड़ने पर ऑटो-आबादी वाले आउटपुट फाइल नाम संपादित करें।
    3. सबसे कम सेगमेंट लंबाई (20 माइक्रोन), अधिकतम गति मापी गई (2,000 माइक्रोन/एस) और अधिकतम गति मैप (1,000 माइक्रोन/एस) के लिए इनपुट मान।
      नोट: सबसे कम सेगमेंट लंबाई और फ्रेम प्रति सेकंड का उत्पाद अधिकतम प्रवाह गति देता है जिसे सैद्धांतिक रूप से मापा जा सकता है। साहित्य में सबसे अधिक केशिका प्रवाह गति 2,000माइक्रोन/एस 15के आसपास है . जिगर में, हमने देखा कि केशिका प्रवाह गति आम तौर पर औसत न ोंक-करीब 300 माइक्रोन/एस होती है और शायद ही कभी 1,000 माइक्रोन/एस से अधिक होती है।
    4. इमेज सीक्वेंस (इमेज मेटाडेटा या एक्सपेरिमेंटल नोट्स से) के लिए पिक्सल साइज और फ्रेम रेट के लिए वैल्यूज में टाइप करें। इन मूल्यों के लिए उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है। यदि छवियों में आवधिक पृष्ठभूमि तीव्रता झिलमिलाहट है तो झिलमिलाहट सुधार बॉक्स की जांच करें।
    5. डेटा के सर्वोत्तम दृश्य के लिए मापदंडों का चयन करें। लगभग 95% डेटा को शामिल करने के लिए मैप की गई अधिकतम गति का चयन करें ताकि डेटा को रंग पैमाने की पूरी श्रृंखला में मैप किया जा सके। कर्मचारियों को रंग पैमाने के उच्च गति अंत करने के लिए उच्च गति outliers नक्शे ।
  2. कंकाल का विश्लेषण करें।
    1. प्लगइन्स एंड जीटी; मैक्रोएंड जीटी; एनालाइजा कंकाल का चयन करें। कंकाल.टिफ फ़ाइल खुलेगी और ब्याज क्षेत्र (आरओआई) प्रबंधक खुलेगा और चलेगा।
      नोट: कंकाल का विश्लेषण प्रत्येक पिक्सेल को पड़ोसियों की संख्या के अनुसार एक अंत बिंदु पर, जंक्शन पर, या एक खंड के भीतर वर्गीकृत करता है। प्रत्येक खंड के लिए एक पहचान संख्या (आईडी नंबर), एक अंशांकित शाखा लंबाई और शाखा समाप्त होने के स्थानिक निर्देशांक दर्ज किए जाते हैं।
    2. कंकाल पर दिखाई देने के लिए सेगमेंट आईडीएस की प्रतीक्षा करें, आरओआई प्रबंधक में प्रदर्शित होने के लिए सेगमेंट सूची, और एक पॉपअप यह दर्शाता है कि कंकाल के लिए आरओआई प्रबंधक फ़ाइल सहेजी गई है। ओकेपर क्लिक करें ।
    3. सत्यापित करें कि श्वसन आंदोलनों के बीच, कंकाल पर रहता है जहां लाल रक्त कोशिकाओं केशिका के माध्यम से गुजरती है (जैसे, किनारे नहीं है और केशिका के बाहर नहीं) । फिल्म फ़ाइल खोलकर, फिल्म पर ओवरले के रूप में लेबल किए गए खंडों को प्रदर्शित करें, फिर खुली फिल्म पर आरओआई ज़िप फ़ाइल को खींचें। मढ़ा खंडों के साथ फिल्म खेलते हैं ।
  3. समय अंतराल का चयन करें।
    1. प्लगइन्स एंड जीटी; मैक्रोएंड जीटी का चयन करें; समय अंतराल चुनें। प्रतीक्षा करें जबकि मैक्रो फिल्म के लिए कुल समय से अधिक एक खंड से एक kymograph उत्पन्न करता है । इस केमोग्राफ से, उपयोगकर्ता विश्लेषण के लिए समय अंतराल का चयन करता है। जरूरत पड़ने पर केमोग्राफ का आकार बढ़ाने के लिए कंट्रोल ++ कीज का इस्तेमाल करें।
    2. आयत चयन उपकरण स्वचालित रूप से सक्रिय हो जाता है। हर बार अंतराल के आसपास एक आयत ड्रा। समय अंतराल लंबाई के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु श्वसन के बीच 1-2 एस अंतराल है, जो किमोग्राफ में क्षैतिज धुंधला क्षेत्रों के रूप में स्पष्ट है।
    3. समय अंतराल चयन रिकॉर्ड करने के लिए आरओआई प्रबंधक में टी कुंजी या ऐड बटन पर क्लिक करें। वांछित के रूप में कई समय अंतराल के लिए दोहराएं। काइमोग्राफ के ऊपर (या बाएं) से नीचे (या दाएं) तक चयन क्रमिक रूप से करें।
    4. समय अंतराल (3 से 4) की एक छोटी संख्या का चयन करके और सिर्फ उन अंतरालों के लिए विश्लेषण पूरा करके पैरामीटर विकल्पों (ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट से) का मूल्यांकन करें, क्योंकि फ्लो (अगला कदम) का विश्लेषण बड़े डेटासेट के लिए घंटों लग सकते हैं।
    5. हर बार अंतराल खिड़की के लिए एक आरओआई बनाने में ओके पर क्लिक करें जब किया जाता है। प्रोजेक्ट फोल्डरमें चयनित अंतराल ों को सहेजे जाने पर एक पॉपअप विंडो दिखाई देती है । ओकेपर क्लिक करें ।
  4. प्रवाह का विश्लेषण करें।
    1. प्लगइन्स > मैक्रोस > इको फ्लो और एनालाइज़ फ्लो पैरामीटर्स डायलॉग बॉक्स का चयन करें और ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट स्टेप में दर्ज मूल्यों को प्रदर्शित करें । यदि आवश्यक हो तो संपादित करें ओकेपर क्लिक करें।
    2. आउटपुट फ़ाइल नाम संवाद बॉक्स खुलता है और ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट स्टेप में दर्ज नामों को प्रदर्शित करता है। यदि आवश्यक हो तो संपादित करें ओकेपर क्लिक करें।
    3. एक संवाद बॉक्स यह पूछने पर खुलता है कि उपयोगकर्ता विश्लेषण शुरू करने के लिए तैयार है या नहीं। ओके पर क्लिक करें और विश्लेषण शुरू हो जाएगा। एक संवाद बॉक्स की प्रतीक्षा करें जो यह इंगित करने के लिए खुलता है कि फ्लो विश्लेषण कब पूरा हो गया है।
      नोट: समय की जरूरत प्रोसेसर की गति और डेटासेट के आकार पर निर्भर करता है।
    4. पुष्टि करें कि परिणाम फ़ाइलों को परियोजना फ़ोल्डर में .csv प्रारूप स्प्रेडशीट फ़ाइलों के रूप में संग्रहीत किया गया है।
      नोट: आउटपुट फ़ाइलों में शामिल हैं: segment_velocities.सीएसवी में वेग मूल्य होते हैं जिनमें प्रवाह दिशा का संकेत देने वाले सकारात्मक और नकारात्मक मूल्य होते हैं। न्यूनतम लंबाई से कम सेगमेंट का प्रतिनिधित्व करने वाली कोशिकाओं में टेक्स्ट शॉर्ट होता है। अधिकतम मापी गई गति से अधिक वेग मूल्यों वाली कोशिकाओं में टेक्स्ट आउट (आउटलियर के लिए) होते हैं। kym_ang सीएसवी में फिजी में दिशात्मक प्लगइन द्वारा मापा गया केमोग्राफ कोण शामिल हैं। good_fit.सीएसवी में प्रत्येक केमोग्राफ से मापा गया कोणों के वितरण के लिए एक वक्र के फिट की अच्छाई होती है। फिट (< 0.8) की खराब अच्छाई किसी सेगमेंट में छिपी हुई शाखा बिंदुओं, समय अंतराल के दौरान वेग में परिवर्तन, दीपक या कमरे की रोशनी झिलमिलाहट का संकेत दे सकती है।
    5. यह सत्यापित करने के लिए देखें कि segment_velocities.सीएसवी में कुछ आउट मान हैं। यदि बड़ी संख्या में आउट मान हैं, तो सत्यापित करें कि विश्लेषण करने के लिए न्यूनतम सेगमेंट लंबाई 15-20 माइक्रोन से कम नहीं है, फिर विश्लेषण प्रवाहको फिर से चलाना। यदि नए segment_velocities.csv में अभी भी आउट मूल्यों का एक बड़ा हिस्सा होता है, तो झिलमिलाहट सुधार बॉक्स की जांच करें, फिर फ्लो का विश्लेषणकरें।
  5. स्थानिक नक्शे का उत्पादन करें।
    1. प्लगइन्स एंड जीटी; मैक्रोएंड जीटी का चयन करें; प्रोडेक्ट स्पेशियल मैप और स्थानिक मानचित्र पैरामीटर विंडो खुले ंगे, जो ओपन-क्रिएट प्रोजेक्ट स्टेप में दर्ज मूल्यों को प्रदर्शित करेंगे। यदि आवश्यक हो तो संपादित करें, या ठीकचयन जारी रखें।
    2. प्रवाह वेग के स्थानिक नक्शे के एक लौकिक अनुक्रम के रूप में देखो रंग प्रवाह की गति का संकेत के साथ उत्पन्न होता है। आउटपुट हर बार अंतराल के लिए एक छवि के साथ एक .tif छवि ढेर के रूप में है। प्रवाह में स्थानिक और लौकिक भिन्नता की कल्पना करने के लिए .tif स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल करें। एक फिल्म के रूप में साझा करने के लिए एक AVI फ़ाइल (अधिकतम पोर्टेबिलिटी के लिए असंयत) के रूप में ढेर सहेजें।

7. कर्मचारियों के उत्पादन का उपयोग करमात्र विश्लेषण

  1. segment_velocities.सीएसवी फ़ाइल को स्प्रेडशीट या सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यक्रम में खोलें। इन मूल्यों में सकारात्मक या नकारात्मक संकेत है जो उस सेगमेंट के स्टार्ट/स्टॉप पॉइंट्स (सेगमेंट आरओआई फाइल में दर्ज) के सापेक्ष प्रवाह की दिशा को इंगित करता है।
  2. सभी वेग मूल्यों के पूर्ण मूल्यों वाला एक नया स्प्रेडशीट पृष्ठ बनाएं। इन मूल्यों का उपयोग समग्र औसत प्रवाह वेग की गणना करने के लिए करें, समय के साथ सभी संवहनी खंडों के लिए औसत प्रवाह वेग, समय के साथ प्रत्येक संवहनी खंड के लिए प्रवाह वेग, और वेग वितरण के हिस्टोग्राम बनाते हैं।
  3. पहले लेबल कंकाल में विशिष्ट प्रासंगिक खंडों को ढूंढकर और फिर इन चयनित खंडों पर विश्लेषण करके विशिष्ट रूपात्मक क्षेत्रों, या ब्याज के अन्य क्षेत्रों के आसपास मूल्यों की गणना करें।

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Representative Results

कर्मचारियों के विश्लेषण सेकंड से मिनट तक विस्तार समय की अवधि में पूरे माइक्रोस्कोप क्षेत्रों में सूक्ष्मसंस्कुलर वेग की एक पूरी जनगणना उत्पन्न करता है । प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1, चित्रा 2, चित्रा 3और चित्रा 4में प्रस्तुत कर रहे हैं । चित्रा 1 माउस के जिगर में माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क की एक समय श्रृंखला का एक उदाहरण दिखाता है, कंकाल छवि की पीढ़ी जिसका उपयोग माइक्रोवैस्कुलर प्रवाह की धुरी को परिभाषित करने के लिए किया जाता है, और क्वांटिफिकेशन के लिए पहचाने गए व्यक्तिगत संवहनी खंडों के कर्मचारी-जनित मानचित्र। स्टाफ तो कंकाल छवि का उपयोग करता है व्यक्तिगत खंडों में नीचे माइक्रोवैस्कुलर नेटवर्क को तोड़ने के लिए, तो प्रत्येक खंड के लिए kymographs की छवियां उत्पन्न करता है । ये छवियां उपयोगकर्ता को प्रदान की जाती हैं, साथ ही उपकरणों के साथ किमोग्राफ विश्लेषण(चित्र ा 2)के लिए उपयोग किए जाने वाले समय अंतराल की पहचान करने के लिए। स्टाफ तो कंकाल का उपयोग करता है, और उपयोगकर्ता की आपूर्ति समय अंतराल व्यक्तिगत खंड समय अंतराल में प्रत्येक खंड के kymograph तोड़ने के लिए । इसके बाद कर्मचारी प्रत्येक सेगमेंट-टाइम इंटरवल से काइमोग्राफ में प्रमुख कोण की पहचान करता है और .csv डेटा फ़ाइलों(चित्रा 3)के रूप में वेग माप प्रदान करता है और रंग-कोडित वेग मानचित्र छवियों(चित्र 4)के ढेर के रूप में। डेटा विश्लेषण पाइपलाइन की खोज का समर्थन करने के लिए, कर्मचारी सभी काइमोग्राफ कोण मापऔर अच्छाई-फिट मूल्यों वाली .CSv फाइलें भी प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: संवहनी कंकाल पैदा करना। (A)जीवित माउस के जिगर से एकत्र समय श्रृंखला छवियों से एक ही फ्रेम की मूल छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन.(बी)इमेज को पैनल ए में केंद्रीय नसों (सीवी) और पोर्टल ट्राइड्स (पीटी) के साथ दिखाया गया है, ताकि सिनसॉयड प्रवाह की मुख्य दिशाओं की पहचान की जा सके। (ग)सिनेसॉइड के ट्रैके2 विभाजन के ओवरले के साथ पैनल ए से छवि। (D)TrakEM2 विभाजन की बाइनरी छवि। (ई)TrakEM2 विभाजन का कंकालीकरण। (एफ)लेबल के साथ व्यक्तिगत संवहनी खंडों की स्टाफ आउटपुट छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Kymograph विश्लेषण। (A) चित्र 1Fमें दिखाए गए संवहनी खंडों की आवर्धित छवि । (ख)दो अंतर-श्वसन समय अंतराल पर एकत्र किए गए एक खंड से विशिष्ट केमोग्राफ। श्वसन की अवधि तीर के साथ नोट की जाती है। (ग)पैनल ए से 240, 252 और 254 खंडों के लिए केमोग्राफ. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: वेग डेटा विश्लेषण। (ए, बी) 19 समय अंतराल पर चार खंडों के वेग माप की तालिकाओं या तो दिशा(ए)के साथ वेग के रूप में या पूर्ण वेग(बी)के रूप में व्यक्त किया । (ग)हिस्टोग्राम पूरे 20 एस समयावधि में पूरे क्षेत्र में पूर्ण वेग मूल्यों का वितरण दिखा रहा है । (द)उन तीन खंडों के वेग का ग्राफ जिनकाकेमोग्राफ पूरे 20 एस अवधि में चित्रा 2 सी में दिखाए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: वेग नक्शा । (क) चित्र ा 1में दिखाए गए क्षेत्र के लिए एक समय अंतराल के लिए रंग कोडित वेग मानचित्र की कर्मचारियों की आउटपुट छवि । (ख)3डी वॉल्यूम के रूप में प्रस्तुत सभी समय अंतराल के लिए वेग मानचित्रों का समग्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, जिगर की इंट्राग्लइमेजिंग के दौरान गति को कम करना उन फिल्मों को पैदा करने के लिए आवश्यक है जो कर्मचारियों का उपयोग करके केशिका प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयोग करने योग्य हैं। डायाफ्राम की निकटता के कारण, श्वसन-प्रेरित गति की छोटी अवधि होती है, जिसमें सुरक्षित जिगर प्रत्येक सांस के बाद अपनी प्रारंभिक स्थिति में लौटता है। धुंध का उपयोग कर कवरस्लिप तली पकवान के खिलाफ शल्य चिकित्सा से उजागर जिगर को सुरक्षित करना, फिर उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नीचे से इमेजिंगश्वसन 16,17,18,19के बीच अंग को स्थिर करने का कार्य करता है। दूसरा, 100 एफपीएस की छवि अधिग्रहण गति की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है क्योंकि प्रवाह की गति जिसे मापा जा सकता है वह छवि अधिग्रहण की गति का एक कार्य है और उन क्षेत्रों की न्यूनतम लंबाई है जिनमें प्रवाह11मापा जाता है। तीसरा, एक उच्च गुणवत्ता वाले कंकाल का उत्पादन, संवहनी नेटवर्क के लाइन ड्राइंग प्रतिनिधित्व, कर्मचारियों का उपयोग कर केशिका प्रवाह वेग प्राप्त करने में अगला महत्वपूर्ण कदम है । कंकाल लाइन खंडों का विश्लेषण किया जा रहा है और छवि विमान से बाहर शाखाओं में बंटी संवहनी समय पाठ्यक्रम पर श्वसन के बीच वस्कुलन के मध्य के पास झूठ बोलना चाहिए की पहचान की जानी चाहिए । एक संवहनी खंड के साथ इन छिपी शाखाओं के स्थानों को फिल्म देखने, कामोग्राफ की जांच करके या उस सेगमेंट के लिए समय के साथ वेग मूल्यों की जांच करके अनुमानित किया जा सकता है। फिल्म को देखते हुए, इन संवहनी खंडों को या तो द्विदिशात्मक प्रवाह होने के रूप में देखा जाता है, जो अनदेखी शाखा के स्थान की ओर निकलता है या अभिसरण करता है, या संवहनी खंड के साथ उस बिंदु पर प्रवाह की गति में अचानक परिवर्तन होने के रूप में । छिपे हुए शाखा बिंदुओं के स्थान की पहचान केमोग्राफ में प्रवाह दिशा या वेग में परिवर्तन द्वारा उत्पादित कोण में परिवर्तन के स्थान के रूप में कीमोग्राफ में की जा सकती है। स्प्रेडशीट में, छिपे हुए शाखा स्थानों के साथ संवहनी खंड नकली रूप से दिशा (हस्ताक्षर) बदल सकते हैं या दो योगदान खंडों के मूल्यों के बीच बदल सकते हैं। यदि समय श्रृंखला में बहुत सारे शाखा बिंदु शामिल हैं जो छवि विमान से बाहर हैं, तो कर्मचारियों के विश्लेषण को मैन्युअल रूप से कंकाल को संपादित करने के बाद दोहराया जाना चाहिए, छूटे हुए शाखा बिंदुओं के स्थानों पर लाइन ड्राइंग में एक अंतर (पेंट टूल का उपयोग) रखकर।

हम छवि अधिग्रहण में एक आम मुद्दा है कि आम तौर पर किसी का ध्यान नहीं जाता है, लेकिन कर्मचारियों का उपयोग कर प्रवाह वेग को मापने पर एक मजबूत प्रभाव पड़ा खुला । छवि अधिग्रहण में, अस्थिरता या "झिलमिलाहट" एपीई-रोशनी दीपक प्रकाश स्रोत की तीव्रता में या माइक्रोस्कोप कमरे में क्षेत्र प्रकाश से हो सकता है। या तो स्रोत से, झिलमिलाहट की अवधि के साथ समय के साथ प्रकाश/अंधेरे बैंडिंग kymographs में शून्य कोण पर होता है । यदि शून्य कोण चोटी प्रमुख चोटी है, तो भले ही जहाज के माध्यम से लाल रक्त कॉर्पस्कल्स की गति द्वारा उत्पादित कोण जहां प्रवाह गति मापी जा रही है, मानव आंख के लिए स्पष्ट है, दिशात्मक प्लगइन शून्य चोटी पर एक वक्र फिट बैठता है और शून्य डिग्री के पास एक मूल्य की रिपोर्ट करता है, जिसके परिणामस्वरूप वेग माप ताहै जो अवास्तविक रूप से उच्च है। यहां तक कि अगर शून्य कोण चोटी प्रमुख चोटी नहीं है, यह दिशात्मक वक्र को प्रभावित करेगा इस तरह फिट है कि वेग की सूचना एक उच्च मूल्य की ओर स्थानांतरित कर दिया है । इस समस्या को दूर करने के लिए, कर्मचारी एक "झिलमिलाहट सुधार" विकल्प प्रदान करता है जो 0 डिग्री पर होने वाले पीक कोणों को अनदेखा करता है। इस संशोधन ने वेग क्वांटिफिकेशन को प्रभावित किए बिना दीपक झिलमिलाहट के प्रभावों को समाप्त कर दिया।

वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रवाह वेग प्राप्त करने की मुख्य सीमा यह है कि छवि अधिग्रहण मामूली वैकुलचर, या जेब्राफिश इंटरसेगमेंटल जहाजों या यकृत जैसे अंगों की सतही परतों जैसी पतली तैयारियों तक ही सीमित है या गुर्दे जिसे बाहरी किया जा सकता है।

प्रवाह मात्रा के मौजूदा तरीकों पर कर्मचारियों का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह संवहनी प्रवाह के स्थानिक और लौकिक पैटर्न का तेजी से और निष्पक्ष पता लगाने में सक्षम बनाता है । रैस्टर स्कैनिंग सिस्टम का उपयोग करके माइक्रोवैस्कुलर फ्लो डेटा का संग्रह और विश्लेषण आम तौरपर20, 21,22,23पर एकल उपयोगकर्ता चयनित केशिकाओं के माप तक सीमित होता है । 24,25,26क्षेत्रों में प्रवाह वेग निकालने के लिए विधियां मौजूद हैं, हालांकि इनमें से कोई भी दृष्टिकोण पूरे क्षेत्रों में विश्लेषण का समर्थन नहीं करता है और सभी श्रम गहन हैं। कर्मचारियों का उपयोग करना, एक डेटासेट के पूरे छवि क्षेत्र में समय के साथ हर केशिका खंड का विश्लेषण, दसियों हजार छवियों के साथ एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है। पूर्ण क्षेत्र संवहनी प्रवाह के एक भी डेटासेट के मैनुअल विश्लेषण में महीनों से वर्षों तक समय लगेगा। इस प्रकार, सामान्य प्रवाह के लक्षण वर्णन के लिए भी मैनुअल विश्लेषण अव्यावहारिक है और स्पष्ट रूप से कई उपचार समूहों की तुलना की अनुमति नहीं देता है।

वैस्कुलर प्रवाह के स्थानिक पैटर्न के कर्मचारियों की मात्रा में आसानी भविष्य के उपयोगकर्ताओं के लिए केशिका प्रवाह वेग पैटर्निंग पर प्रभाव के लिए संवहनी रूपात्मक टिप्पणियों को जोड़ने का अवसर प्रदान करती है। वेग पैटर्निंग प्रवाह करने के लिए पोत व्यास और नेटवर्क टोपोलॉजी के संवहनी आकृति विज्ञान उपायों के बीच संबंध को परिभाषित करके हम तब संवहनी आकृति विज्ञान से प्रवाह पैटर्न की भविष्यवाणी करने में सक्षम हो सकते हैं। इसी तरह, समय, स्थानीयकरण और प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की सीमा, विषाक्त जोखिम या रोग से ऊतक क्षति, या इंट्रासेलुलर परिवहन की स्थिति जैसी घटनाओं के साथ संवहनी संवर्यत प्रवाह पैटर्निंग और संवहनी आकृति विज्ञान न केवल देगा हमें स्वास्थ्य और रोग में प्रवाह पैटर्निंग और सेलुलर कार्य की बेहतर समझ है, लेकिन यह भी विशेष रूप से हानिकारक रोगविज्ञानी परिदृश्यों की पहचान करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धी हितों की रिपोर्ट ।

Acknowledgments

यहां प्रस्तुत अध्ययनों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच U01 GM1111243 और NIH NIDDK P30 DK079312) से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था । इंडियाना सेंटर फॉर बायोलॉजिकल माइक्रोस्कोपी में इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी अध्ययन किए गए। हम माइक्रोस्कोपी के साथ तकनीकी सहायता के लिए डॉ माल्गोर्जेटा कामॉका को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice Jackson Labs male 9-12 weeks old
Cannula Instech BTPE-10 Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches
CMOS camera Hamamatsu C11440-42U30 4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish Electron Microscopy Sciences WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran Thermo Fisher, Invitrogen D1822 Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge Fisher 22-415-504 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad Reptitherm RH-4 between mouse and stage
Heating pad Sunbeam 000732-500-000U over mouse
Inverted epifluorescence microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver Braun Aesculap GT420
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850
Luer stub adapter Fisher 14-826-19E Catheter adapter
Micro scissors Castro Viejo
Microscope objective Nikon Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle Fisher 30 G x1/2"
Needle holder Olsen-Hegar
Objective heater BioScience Tools MTC-HLS-025 Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer Braintree Scientific, INC TH-5A Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string Harvard Bioscience 723288 silk black suture, 6-0, spool

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References

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

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