Summary
Для количественной оценки микрососудистого потока из высокоскоростных капиллярных последовательностей капиллярного потока мы разработали программное обеспечение STAFF (пространственный временный анализ потока Fieldwise Flow). Через полное поле изображения и с течением времени STAFF оценивает скорость потока и генерирует последовательность цветных пространственных карт для визуализации и таблического вывода для количественного анализа.
Abstract
Изменения в скорости кровотока и распределении имеют жизненно важное значение для поддержания перфузии тканей и органов в ответ на различные клеточные потребности. Кроме того, появление дефектов в микроциркуляции может быть основным показателем в развитии множественных патологий. Достижения в области оптической визуализации сделали интравитальной микроскопии (IVM) практический подход, позволяющий изображения на клеточном и субклеточном уровне у живых животных на высокой скорости с течением времени. Тем не менее, несмотря на важность поддержания адекватного перфузии тканей, пространственная и височная изменчивость капиллярного потока редко документируется. В стандартном подходе небольшое количество сегментов капилляров выбираются для визуализации в течение ограниченного времени. Для всесторонней количественной оценки капиллярного потока беспристрастным образом мы разработали пространственный временный анализ потока Fieldwise (STAFF), макрос для программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом FIJI. Используя высокоскоростные последовательности изображений полных полей кровотока в капиллярах, STAFF производит изображения, которые представляют движение с течением времени, называемые kymographs для каждого интервала времени для каждого сосудистого сегмента. Из kymographs STAFF вычисляет скорости с расстояния, которое красные кровяные клетки движутся с течением времени, и выводит данные о скорости как последовательность цветных пространственных карт для визуализации и табличных выходных данных для количественного анализа. В нормальных печени мыши, STAFF анализирует количественные глубокие различия в скорости потока между перицентральных и перипортаранных регионов в пределах lobules. Еще более неожиданными являются различия в скорости потока видели между синусоиды, которые бок о бок и колебания видели в отдельных сосудистых сегментов в течение нескольких секунд. STAFF является мощным новым инструментом, способным обеспечить новые идеи, позволяя измерения сложной пространственно-временной динамики капиллярного потока.
Introduction
Микроваскулатура играет важную роль в физиологии, обеспечивая эффективную перфузию тканей в изменяющихся условиях. Микрососудистая дисфункция связана с множеством заболеваний, включая длительную сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность, развитие деменции, а также заболевания печени и почек и, таким образом, является ключевым фактором интереса в широком диапазоне биомедицинских исследований1,2,3,4,5. В то время как для оценки перфузии тканей используются многочисленные методы, только интравитальная микроскопия позволяет собирать данные в височном и пространственном разрешении, необходимом для характеристики кровотока на уровне отдельных капилляров.
Микрососудистый поток может быть визуализирован в флуоресценционной микроскопии либо движением флуоресцентных микросфер, либо движением красных кровяных телец на фоне мембранно-непроницаемых флуоресцентных маркеров (например, флуоресцентно маркированных экстран или альбумина)6,7. Микрососудистый поток можно изображениять в поверхностных слоях клеток с помощью широкоугольной микроскопии, или на глубине с помощью конфокальной или многофотонной микроскопии. Тем не менее, скорость капиллярного потока такова, что прохождение красных кровяных телец, как правило, не может быть захвачен о скорости менее 60 кадров/с. Поскольку большинство лазерных сканирования конфокальных и мультифотонных микроскопов требуют 1-5 с для сканирования полного поля изображения, эта скорость, как правило, может быть достигнуто только путем ограничения поля зрения, иногда одной линии сканирования8. Процесс ограничения измерений отдельными сегментами капилляров (1) может привести к смещению выбора и (2) делает невозможным фиксацию пространственной и временной неоднородности в темпах капиллярного кровотока. В отличие от этого, изображения капиллярных сетей могут быть собраны со скоростью, превышающей 100 кадров в секунду с помощью широкоугольных цифровых микроскопов, оснащенных научными дополнительными полупроводниковыми камерами оксида металла (sCMOS)9,10. Эти недорогие системы, распространенные в типичных биомедицинских лабораториях, позволяют образовать микрососудистый поток по всей двумерной сети, по существу непрерывно. Таким образом, проблема заключается в поиске аналитического подхода, способного извлекать значимые количественные данные из массивных и сложных наборов данных изображений, генерируемых высокоскоростной видеомикроскопией.
Для анализа данных полного потока мы разработали STAFF, новое программное обеспечение для анализа изображений, которое может непрерывно измерять микрососудистый поток по всему микроскопу полей серии изображений, собранных на высокой скорости11. Этот подход совместим с различными экспериментальными системами и методами визуализации, а программное обеспечение для анализа изображений STAFF реализовано в качестве макроинструмента для реализации FIJI ImageJ12. Основополагающий принцип, используемый здесь для визуализации микрососудистого потока, заключается в том, что во-первых, необходимо обеспечить некоторый контраст, чтобы иметь возможность изображения красных кровяных телец в капиллярах. В наших исследованиях контраст обеспечивается объемным флуоресцентным зондом, который исключается красными кровяными тельцами. Скорость потока может быть количественно от смещения красных кровяных телец, которые появляются как отрицательное пятно в флуоресцентно помечены плазмы в изображениях, собранных на высокой скорости из живого животного8. Затем мы используем STAFF, чтобы сделать участки расстояния вдоль каждого сегмента капилляров в течение нескольких интервалов времени, называемых kymographs, затем обнаружить склоны, присутствующие в kymographs13, и с этих склонов вычислить скорость микрососудистого потока. Этот подход может быть применен к изображениям, собранным с любой капиллярной кровати, которые могут быть доступны для визуализации. Здесь мы описываем применение IVM и STAFF к изучению кровотока в печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами Комитета по уходу за животными и использованию Университета Индианы, а также в соответствии с руководством NRC по уходу и использованию животных.
1. Хирургическая подготовка к интравитальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не операция на выживание. После начала раздела 1 "Хирургическая подготовка к внутривитой микроскопии" работы не могут быть приостановлены до завершения раздела 2 "Интравитальной микроскопии".
- Акклиматизировать 9-10 недельный мужчина C57BL/6 мышей, по крайней мере 4 дня и быстро в течение 16 ч до исследований.
- Взвесьте животное, степенный с 5% изолюран и место на грелку для поддержания температуры тела. Используйте скорость потока кислорода 1-2 л/мин и поддерживайте седканацию с изофлураном 1-2%. Проверьте рефлексы по ноге щепотку. Мониторинг температуры с помощью ректального термометра. Контролировать частоту сердечных приступов и дыхания визуально.
- Когда анестезия стабильна, брить области для размещения яремной каниляции и области ниже грудной клетки для воздействия печени.
-
Для яремной канистры сделайте 1 см левый вентральный разрез на 1-2 см ниже челюсти мыши. Очистите от всех жира и фасции окружающих яремной вены. Свяжите передний конец яремной с помощью 06 шов строки для предотвращения кровотечения.
- Сделать крошечный ник в яремной вены и слайд канюли (30 G х 1'2 дюйма, игла), держатель иглы и полиэтиленовой трубки (0,011 х 0,024 дюйма2 прилагается к Luer заглушка адаптер и заполнены 0,9% солевой) примерно в 1 см, и обеспечить в задней части jugular с помощью 0-6 су.
- Использование яремной канюли доставить 70 kDa фторесцеин dextran (до дозы 30 мг/кг через инъекцию 0,1 мл 9 мг/мл раствора в солей).
- Выставляют печень для визуализации, делая разрез 4-6 см по пересчету туловищ, на 1-2 см ниже середины грудной клетки.
- Поместите мокрый (пропитанный 0,9% солевой раствор) 2 х 2 дюйма2 марлевой губки ниже левой боковой доли печени. Поместите ленту на периферию стеклянного окна 40 мм покрывало-дном блюдо и нанесите цианоакрилат клей на ленту. Прижмите стеклянную пластину к печени и с помощью хлопка наконечником аппликаторов нажмите марлю в клей на ленте, чтобы свести к минимуму движение ткани для микроскопии.
- Переместите животное на стадию микроскопа. Добавить стерильные 0,9% сольника в покрывало дном блюдо, чтобы сохранить печень влажной на протяжении всего сеанса визуализации. Поддерживайте температуру на уровне 36–37 градусов по Цельсию с помощью установленных на сцене грелковых колодок, а также объективного обогревателя.
2. Интравитальной микроскопии
- Выполните интравитальную микроскопию на перевернутом эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном видеокамерой, способной к высокоскоростной съемке изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались ксеноновая дуговая лампа, флуоресцентное возбуждение (480-500 нм) и эмиссионные (507-543 нм) фильтры, План Fluor 20x, N.A. 0.75 цель погружения воды, и высокоскоростная камера sCMOS. - Выберите область интереса для анализа капиллярного кровотока с использованием минимального освещения.
- Установите время экспозиции достаточно коротким для камеры, чтобы иметь возможность приобрести 100 кадров в секунду. Установите уровень освещения, чтобы четко визуализировать тени красных кровяных телец и топологию сосуды, избегая при этом фототоксичности и фотоотбеления флуоресцентного зонда.
- Сбор изображений со скоростью 100 кадров в секунду. Установите разрешение пикселей камеры между 0,65 и 1,3 мкм/пикселем. Установите размер кадра между 512 x 512 и 1024 x 1024 пикселями. Установите глубину бита между 8 и 16 битами. Используйте максимальное разрешение, размер кадра и глубину бита, которая по-прежнему позволяет сбор изображений в системе на 100 кадров в секунду.
- Сохранить файл временных рядов (ы) в виде последовательности файлов TIF или в качестве родного формата камеры/микроскопа, если Bio-Formats14 в FIJI может открыть файлы родного формата.
- Изображение нескольких областей с течением времени. Поддерживайте мышь на стадии микроскопа до 2 ч. Эвтанизировать мышь в конце изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность временных рядов будет основываться на балансировании необходимости изображения в течение интервала времени, который охватывает изменчивость, не влияя на жизнеспособность ткани. Продолжительность временных рядов также может быть продиктована соображениями размера файла; 1 мин время серии 1024 х 1024 пиксель 16-битных изображений, собранных на 100 кадров в секунду будет генерировать файл, который 12 ГБ в размере. Соображения размера файла могут также диктовать размер кадра и используемую глубину бита. В STAFF нет явных ограничений по размеру.
3. Определить сосудистую сеть с использованием TrakEM2 в FIJI
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после сохранения работы в любой момент в разделе 3.
- Скачать и установить FIJI из https://imagej.net/Fiji/Downloads.
ПРИМЕЧАНИЕ: Версия 1.51n Фиджи была использована для этого проекта, и может быть загружена с https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Обратите внимание, что на Windows, FIJI должны быть установлены в пространстве пользователя, а не в файлах программы. - Откройте файл фильма в FIJI с помощью файла (ru) открыть или с помощью файла (ru) импортное изображение . Выберите одно изображение из стабильных изображений между дыханием, где топология сосудистой сети легко увидеть. Выберите изображение и дублируйте выбранное единое изображение (не стек) и сохраните изображение в новой папке. Не включайте пробелы в именах файлов или папок.
- Настройка нового пустого проекта TrakEM2, выбрав файл (gt; Новый йgt; TrakEM2 (пустой). Выберите новую папку, содержащую одно изображение из фильма в качестве папки проекта. Откроются окна TrakEM2.
- Право нажмите кнопку в основной области работы и выбрать Импорт Перейдите к одному изображению, сохраненному в шаге 3.3, и выберите его.
- Правый щелчок в основной области работы снова и выберите Дисплей Слева щелкните в главном рабочем окне. Изображение заполняет рабочую область.
- Чтобы выбрать области на изображении, которые содержат сосудистую сеть, выберите область установки в TrakEM2. В меньшем окне TrakEM2 (Template, Project Objects, Layers) справа щелкните по "- что угодно. Выберите Добавить нового ребенка
- В меньшем TrakEM2 окно, перетащите "Шаблон "gt; что-нибудь" на "Проект объектов (проект) ". Затем перетащите "Template ( В соответствии с "Проект объектов (проект объектов) и проекта , что-нибудь", список области теперь будет присутствовать.
- В главном окне TrakEM2 под вкладкой пространства ,бар помечены список площадей был создан. Нажмите, чтобы выбрать его. В главном окне TrakEM2 также выберите инструмент для кисти. Нажмите Shift и рулон мыши колесо, чтобы выбрать соответствующий размер для кисти, например, меньше, чем диаметр сосуды. Для сохранения TrakEM2 настройки управления прессом s s ключей.
- Краска сосудистой сети с помощью кисти инструмент. Чтобы стереть alt при использовании кисть инструмент. Не включайте в них внефокусные регионы. Сохранить часто с помощью управления и S.
- Когда маркировка сосудистой сети завершена, правое нажатие кнопки в главном окне TrakEM2 и выберите Экспорт (Gt; AreaLists в качестве этикеток (tif). В всплывающем окне выберите Шкала 100% и Экспорт Все области списка. Закройте окна TrakEM2 и выберите "да" для проекта Save.
- Изображение AreaLists откроется и может отображаться как пустое черное изображение. В главном меню FIJI выберите изображение (gt; Отрегулируйте) и яркость/контраст. В окне B и C нажмите кнопку автоматической и AreaList станет видимым. В главном меню FIJI выберите Изображение Сохраните это изображение черных меток на белом фоне и закройте изображение.
- Откройте файл меток в FIJI. Выберите Плагины Сохранить скелетонизированное изображение как tif. Используйте файл skeleton.tif в качестве одного из входных файлов, необходимых для выполнения анализа потока STAFF. При сохранении файла не используйте пробелы в имени файла.
- Ручно отображайте файл скелета по мере необходимости, поместив зазор (с помощью инструмента краски)в чертеж линии, например, в местах, где ветви в сосуде не были захвачены, потому что они выходят из плоскости изображения.
4. Подготовьте последовательность фильма для анализа STAFF
- Откройте файл фильма в FIJI с помощью файла (ru) открыть или файл (Rugt; Импорт) и «Импорт» (Импорт) и «Изображение». Выберите период времени последовательности изображений для анализа потока (может быть секунд до минут, сотни до десятков тысяч кадров), где положение ткани остается стабильным с течением времени, за исключением во время дыхания.
- Выберите изображение и дублируйте выбранную часть последовательности, набрав в номерах начальных и конечных кадров. Проверьте пространственную и временную калибровку изображения под изображением и правильно, если это необходимо. Сохранить файл изображения в виде TIF (или в виде несжатого AVI). Этот movie.tif необходим в качестве входиного файла для запуска анализа STAFF. Не включайте пробелы в имени файла.
5. Установка STAFF Macros в FIJI
ПРИМЕЧАНИЕ: (Важно) Несколько папок в подзаделках FIJI имеют аналогичные имена файлов, некоторые капитализированы, некоторые нет. Будьте уверены, что при установке STAFF выбираются правильные папки.
- Скачать макросы STAFF с https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
Для установки сначала откройте папку FIJI.
- На Windows найти папку, где FIJI установлен в пользовательском пространстве, чаще всего на рабочем столе. На MacOS найти значок FIJI в папке Приложений, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Open.
- В папке FIJI откройте папку плагинов. Внутри папки плагинов откройте папку Macros. Копирование STAFF.ijm в эту папку Макрос: Фиджи плагины-Макрос-STAFF.ijm.
- В папке FIJI откройте папку плагинов. Копирование STAFF_Dir.jar в эту папку плагинов: Фиджи STAFF_Dir.jar.
- В папке FIJI откройте папку макросов. Внутри этой папки макросов откройте папку AutoRun. Копирование STAFF_Loader.ijm в эту папку AutoRun: Фиджи-макрос-AutoRun STAFF_Loader.ijm.
- Запустите FIJI и проверьте макроустановку. Для проверки установки, выберите Плагины При правильном установке меню выпадения будет включать в себя: Open-Create Project, Анализ скелета, отсеивание временных интервалов, анализ потока и создание пространственной карты.
- Если эти команды не присутствуют в меню Macros, выберите Плагины , выберите Плагины, которые будут удалены, макрос (Macros; Macros) и установите,откройте папку Fiji'plugins-Macros, выберите файл STAFF.ijm, а затем нажмите кнопку OK. Команды теперь должны отображаться в меню Plugins.
6. Количественная сосудистая подача с использованием STAFF
- Создайте новый проект.
- Выберите Плагины ( и Макрос; Open-Create Project и следуйте подсказкам для создания или обновления файла конфигурации.
- Из меню Open-Create Project перейдите на каталог проекта, файл ввода и файлы ввода Movie.tif и Skeleton.tif. При необходимости отсваивай имена автоматически заполненных выходных файлов.
- Значения входных значений для кратчайшей длины сегмента (20 мкм), максимальной скорости (2000 мкм/с) и максимальной скорости на карте (1000 мкм/с).
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт кратчайшей длины сегмента и кадров в секунду дает максимальную скорость потока, которая теоретически может быть измерена. Самые высокие скорости потока капилляров, зарегистрированные в литературе, составляют около 2000 мкм/с15. В печени, мы заметили, что скорость капиллярного потока обычно в среднем около 300 мкм / с и редко превышает 1000 мкм / с. - Введите значения для размера пикселей и частоты кадров для последовательности изображений (из метаданных изображений или экспериментальных заметок). Эти значения требуют пользовательского ввода. Проверьте flicker Коррекция поле, если изображения имеют периодическое фоновое интенсивность мерцание.
- Выберите параметры для наилучшей визуализации данных. Выберите максимальную скорость, отображаемую, чтобы включить около 95% данных, чтобы данные отображались по всему диапазону цветовой шкалы. STAFF отображает высокоскоростные выбросы до высокоскоростного конца цветовой шкалы.
- Проанализируйте скелет.
- Выберите Плагины (ru) и Макрос (Макрос) и анализируйте скелет. Файл skeleton.tif откроется, а менеджер Region of Interest (ROI) откроется и заработает.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ скелета классифицирует каждый пиксель по количеству соседей как на конечной точке, на стыке или в сегменте. Для каждого сегмента записывается идентификационный номер (идентификационный номер), откалиброванная длина ветви и пространственные координаты концов ветки. - Подождите, пока в скелете появятся идентиматозные идентизаты, список сегментов появится в менеджере ROI и всплывающее окно, указывающее на сохранение файла roI Manager для скелета. Нажмите OK.
- Убедитесь, что между движениями дыхания скелет остается там, где красные кровяные тельца проходят через капилляр (например, не край и не за пределами капилляра). Отображение помеченных сегментов в качестве наложения на фильм, открыв файл фильма, а затем перетаскивание ФАЙЛа застежки-коды ROI на открытый фильм. Воспроизведение фильма с сегментами наложенных.
- Выберите Плагины (ru) и Макрос (Макрос) и анализируйте скелет. Файл skeleton.tif откроется, а менеджер Region of Interest (ROI) откроется и заработает.
- Выберите временные интервалы.
- Выберите Плагины (Rugts) и Макрос (Макрос) и Выберите временные интервалы. Подождите, пока макрос генерирует kymograph из одного сегмента за общее время для фильма. Из этого kymograph пользователь выбирает временные интервалы для анализа. Используйте клавиши Управления и управления, чтобы при необходимости увеличить размер kymograph.
- Инструмент выбора прямоугольника автоматически активируется. Нарисуйте прямоугольник вокруг каждого интервала времени. Хорошей отправной точкой для длины временной интервала является интервал 1-2 с между дыханием, которые проявляются как горизонтальные размытые области в kymograph.
- Нажмите клавишу T или кнопку Добавить в менеджере roI для записи выбора интервала времени. Повторите на столько временных интервалов, сколько пожелает. Делайте выделения последовательно сверху (или слева) внизу (или справа) кимографа.
- Оцените выбор параметров (от Open-Create Project) путем выбора небольшого количества временных интервалов (3-4) и завершения анализа только для этих интервалов, так как анализ потока (следующий шаг) может занять часы для больших наборов данных.
- Нажмите OK в Сделать рентабельность инвестиций для каждого временного интервала окна, когда сделано. Всплывающее окно появляется при сохранении выбранных интервалов в project Folder. Нажмите OK.
- Анализ потока.
- Выберите Плагины , макроси и анализ потока и анализ потока Параметры диалог окно открывается и отображает значения, введенные в Open-Create проекта шаг. Оторите при необходимости нажмите OK.
- Открывается окно диалога «Имена вывода файлов» и отображает имена, введенные в шаг проекта Open-Create. Оторите при необходимости нажмите OK.
- Открывается диалоговая будка с вопросом, готов ли пользователь начать анализ. Нажмите OK и начнется анализ. Подождите диалоговую будку, которая откроется, чтобы указать, когда анализ потока будет завершен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое время зависит от скорости процессора и размера набора данных. - Подтвердите, что файлы результатов хранятся как файлы электронной таблицы формата .csv в Project Folder.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выводные файлы включают: segment_velocities.csv содержит значения скорости, которые имеют положительные и отрицательные значения, указывающие направление потока. Ячейки, представляющие сегменты меньше минимальной длины, содержат текст SHORT. Клетки со значениями скорости, превышают максимальную измеренную скорость, содержат текст OUT (для выброса). kym_ang.csv содержит углы kymograph, измеренные плагином Directionality в FIJI. good_fit.csv содержит доброту припадка кривой к распределению углов, измеренных с каждого kymograph. Плохая доброта подгонки (Злт; 0,8) может указывать на скрытые точки ветви в сегменте, изменение скорости во время интервала времени, лампу или мерцание света в помещении. - Проверьте, что segment_velocities.csv содержит несколько значений OUT. Если существует большое количество значений OUT, убедитесь, что минимальная длина сегмента для анализа не менее 15-20 мкм, а затем повторно провести анализ потока. Если новый segment_velocities.csv по-прежнему содержит большую долю значений OUT, то проверьте поле коррекции мерцания, затем перезапустите Анализ потока.
- Продукция пространственных карт.
- Выберите Плагины , макалёрские макросы, и создайте пространственную карту, и откроется окно параметров пространственной карты, отображая значения, введенные в шаг проекта Open-Create. Отображйте при необходимости или продолжайте выбирать OK.
- Смотреть, как временная последовательность пространственных карт скорости потока генерируется с цветом, указывающим скорость потока. Выход в виде стека изображений .tif с одним изображением для каждого интервала времени. Прокрутите стек .tif, чтобы визуализировать пространственные и временные изменения потока. Сохранить стек в виде файла AVI (несжатый для максимальной переносимости) для совместного использования в качестве фильма.
7. Количественный анализ с использованием результатов STAFF
- Откройте файл segment_velocities.csv в электронной таблице или программе статистического анализа. Эти значения имеют положительный или отрицательный признак, указывающий направление потока относительно точек начала/остановки этого сегмента (записанного в файле ROI сегмента).
- Сделайте новую страницу электронной таблицы, содержащую абсолютные значения всех значений скорости. Используйте эти значения для расчета общей средней скорости потока, средней скорости потока для всех сосудистых сегментов с течением времени, скорости потока для каждого сосудистого сегмента с течением времени, и сделать гистограммы распределения скорости.
- Рассчитайте значения вокруг конкретных морфологических регионов или других регионов, представляющих интерес, сначала найдя конкретные соответствующие сегменты в маркированном скелете, а затем выполнив анализы по выбранным сегментам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ STAFF генерирует полную перепись микрососудистых скоростей по всем полям микроскопа в течение периодов времени, простирающихся от секунд до минут. Результаты представления представлены на рисунке 1, рисунке 2, рисунке 3и рисунке 4. На рисунке 1 показан пример временных рядов микрососудистой сети в печени мыши, генерации скелетизированного изображения, которое используется для определения оси микрососудистого потока, и картой отдельных сосудистых сегментов, идентифицированных для количественной оценки. STAFF затем использует скелетированное изображение, чтобы разбить микрососудистую сеть на отдельные сегменты, а затем генерирует изображения kymographs для каждого сегмента. Эти изображения предоставляются пользователю вместе с инструментами для определения временных интервалов, которые будут использоваться для анализа кимографа(рисунок 2). ЗАТЕМ STAFF использует скелет, и пользовательские временные интервалы, чтобы разбить kymograph каждого сегмента на отдельные интервалы времени сегмента. STAFF затем определяет преобладающий угол в kymograph от каждого интервала времени сегмента и обеспечивает измерения скорости как файлы данных .csv(рисунок 3)и в виде стопок цветных изображений карты скорости (Рисунок 4). Для поддержки исследования конвейера анализа данных STAFF также предоставляет файлы .csv, содержащие все измерения угла kymograph и значения доброты.
Рисунок 1: Создание сосудистого скелета. (A) Оригинальное изображение одного кадра из временных рядов изображений, собранных из печени живой мыши. Шкала бар No 100 мкм. (B) Изображение показано в панели С центральными венами (CV) и портал триады (PT) указано, чтобы определить основные направления синусоидного потока. (C) Изображение из панели А с наложением TrakEM2 сегментации синусоидов. (D) Двоичное изображение сегментации TrakEM2. (E) Скелетизация сегментации TrakEM2. (F) STAFF выходное изображение отдельных сосудистых сегментов с этикетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анализ kymograph. (A) Увеличенное изображение сосудистых сегментов показано на рисунке 1F. (B) Типичный kymograph из одного сегмента, собранных в течение двух межреспираторных интервалов времени. Периоды дыхания отмечаются стрелками. (C) Kymographs для сегментов 240, 252 и 254 с панели А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ данных скорости. (A, B) Таблицы измерений скорости четырех сегментов в течение 19 временных интервалов, выраженных либо как скорость с направлением(A) или как абсолютная скорость (B). (C) Гистограмма, показывающая распределение абсолютных значений скорости по всему полю в течение всего периода 20 с. (D) График скоростей трех сегментов, чьи kymographs показаны на рисунке 2C в течение всего периода 20 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Карта скорости. (A) STAFF выходное изображение закодированной карты скорости для одного интервала времени для поля, показанного на рисунке 1. (B) Композит ына данных о скорости для всех временных интервалов, представленных в виде 3D тома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе есть несколько критических шагов. Во-первых, минимизация движения во время интравитета изображения печени имеет важное значение для создания фильмов, которые могут использоваться для анализа капиллярного потока с помощью STAFF. Из-за близости диафрагмы, короткие периоды дыхания индуцированного движения происходят, с обеспеченной печени возвращаются в исходное положение после каждого дыхания. Обеспечение хирургически подвергаются печени против покрывало-дном блюдо с помощью марли, а затем изображения снизу с помощью перевернутого микроскопа служит для обездвиживания органа между дыханием16,17,18,19. Во-вторых, скорость приобретения изображения 100 кадров в секунду настоятельно рекомендуется, потому что скорость потока, которые могут быть измерены, зависит от скорости приобретения изображения и минимальной длины сегментов, в которых поток измеряется11. В-третьих, производство высококачественного скелета, линии рисования представления сосудистой сети, является следующим важным шагом в получении капиллярных скоростей потока с помощью STAFF. Сегменты линии скелета должны лежать вблизи средней точки сосуды между дыханием в течение времени, которое анализируется, и следует определить сосудистое ветвление из плоскости изображения. Расположение этих скрытых ветвей вдоль сосудистого сегмента можно сделать вывод, просмотрев фильм, путем изучения kymograph или изучения значений скорости с течением времени для этого сегмента. Просмотр фильма, эти сосудистые сегменты рассматриваются либо как имеющие двунаправленный поток, исходящих от или сходящихся к месту невидимой ветви, или как имеющие резкое изменение скорости потока в этой точке вдоль сосудистого сегмента. Расположение скрытых точек ветви может быть определено в kymographs как расположение изменения угла, которое производится в результате изменения направления потока или скорости. В электронной таблице сосудистые сегменты со скрытыми местами ветки могут ложно менять направление (знак) или изменять значения двух сегментов. Если временные ряды включают в себя слишком много точек ветвей, которые находятся вне плоскости изображения, анализ STAFF следует повторить после ручного редактирования скелета, поместив пробел (с помощью инструмента краски) в чертеже линии в местах пропущенных точек ветви.
Мы обнаружили общую проблему в приобретении изображения, которая обычно остается незамеченной, но оказала сильное влияние на измерение скорости потока с помощью STAFF. В приобретении изображения, нестабильность или "мерцание" в интенсивности эпи-освещения лампы источника или от освещения области в комнате микроскопа может произойти. Из любого источника, свет / темные полосы с течением времени с периодом мерцание происходит под нулевым углом в kymographs. Если нулевой пик угла является основным пиком, то даже если угол, производимый движением красных кровяных телец через сосуд, где измеряется скорость потока, очевиден для человеческого глаза, плагин направленности подходит кривой к нулевому пику и сообщает значение очень близко к нулю градусов, в результате чего измерения скорости, которые нереально высоки. Даже если пик с нулевым углом не является основным пиком, он будет влиять на кривую направленности, которая подходит таким образом, что скорость, о котором сообщается, смещается в более высокое значение. Для решения этой проблемы STAFF предоставляет опцию «Коррекция мерцания», которая игнорирует пиковые углы, возникающие при 0. Эта модификация устранила эффекты мерцания лампы, не влияя на количественные значения скорости.
Основное ограничение получения скорости потока с помощью широкоугольной микроскопии заключается в том, что приобретение изображения ограничивается тонкими препаратами, такими как сусора мезентерия, или межсегментные сосуды зебры или поверхностные слои органов, таких как печень или почки, которые могут быть экстерьеризированы.
Существенным преимуществом использования STAFF по сравнению с существующими методами количественной оценки потока является то, что он позволяет быстро и беспристрастно выявлять пространственные и временные паттерны сосудистого потока. Сбор и анализ данных микрососудистого потока с помощью систем сканирования raster, как правило, ограничиваются измерениями одного пользователя выбранных капилляров в товремя, 20,21,22,23. Существуют методы для извлечения скорости потока по полям24,25,26,однако ни один из этих подходов не поддерживает анализ по всем полям, и все они являются трудоемкими. С помощью STAFF в течение дня может быть проведен анализ каждого сегмента капилляров по всему полю изображений набора данных с десятками тысяч изображений. Ручной анализ даже одного набора данных полнополевого сосудистого потока займет от нескольких месяцев до нескольких лет. Таким образом, ручной анализ нецелесообразен даже для характеристики нормального потока и явно не позволяет сравнивать несколько групп лечения.
Простота персонал количественной оценки пространственно-временной модели сосудистого потока дает возможность для будущих пользователей связать сосудистых морфологических наблюдений с воздействием на капиллярный поток скорости модели. Определив взаимосвязь между сосудистыми морфологией мер диаметров сосудов и топологии сети для моделирования скорости потока, мы можем затем предсказать структуру потока из сосудистой морфологии. Аналогичным образом, сопоставление шаблона сосудистого потока и сосудистой морфологии с такими событиями, как время, локализация и степень инфильтрации иммунных клеток, повреждение тканей от токсичного воздействия или болезни, или состояние внутриклеточного переноса, не только даст нам лучшепонять о структуре потока и клеточной функции в области здравоохранения и болезней, но также обеспечит основу для выявления особенно вредных патофизиологических сценариев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Исследования, представленные здесь, были поддержаны финансированием со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH U01 GM11243 и NIH NIDDK P30 DK079312). Интравитальной микроскопии исследования были проведены в Индиане Центр биологической микроскопии. Мы благодарим доктора Малгожата Камока за техническую помощь в микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
